УДК 581.1:581.2:575.1:633.4

ФИТОФТОРОЗ КАРТОФЕЛЯ КАК МОДЕЛЬ КОЭВОЛЮЦИИ В СИСТЕМЕ ПАТОГЕН РАСТЕНИЕ-ХОЗЯИН

© 2015 г. Э. Е. Хавкин

Государственное научное учреждение Всероссийский институт сельскохозяйственной биотехнологии Российской сельскохозяйственной академии, Москва

Поступила в редакцию 31.10.2014 г.

Впечатляющие успехи молекулярно-генетических исследований Phytophthora infestans и генов устойчивости к этому патогену у культурных и дикорастущих видов Solanum сделали фитофтороз картофеля продуктивной экспериментальной моделью “гонки вооружений”  быстрой совместной эволюции патогена, оомицета P. infestans, и растения-хозяина Solanum. Механизмы такой коэволюции обсуждаются в связи с новыми сведениями о происхождении стародавних и современных форм P. infestans и культурного картофеля. Основное внимание в лекции уделено функциональной организации генов вирулентности патогена и генов расоспецифичной устойчивости растения и молекулярным взаимодействиям продуктов этих генов: RxLR эффекторов патогена и CC-NB-LRR рецепторных киназ растения. Знания о молекулярных механизмах взаимодействия P. infestans и картофеля служат основой для создания долговременной устойчивости к фитофторозу: в частности, новые технологии эффекторомики позволяют обнаружить перспективные гены устойчивости в генетических коллекциях Solanum, охарактеризовать эти гены и ускорить их вовлечение в процесс селекции. 

----------------------------------

Сокращения: AVR  эффектор (от avirulence factor); Avr gene  гены (а)вирулентности (avirulence gene); CC-NB-LRR kinase  рецепторная киназа, содержащая coiled coil домен, нуклеотид-связывающий домен и домен, богатый содержащими лейцин повторами; ETI  эффектор-инициируемый иммунитет (от effector-triggered immunity); ipi/IPI  ген/эффектор (от in-planta induced); PAMP  набор молекул, связанных с патогенами (от pathogen-associated molecular pattern); PTI  PAMP-инициируемый иммунный ответ (от PAMP-triggered immunity); PR белки  белки, связанные с патогенезом (от pathogenesis-related proteins); QTL  локусы количественных признаков; R genes  гены устойчивости (resistance genes); Rpi genes  гены устойчивости к Phytophthora infestan; RxLR  эффекторы патогена, содержащие характерную последовательность аминокислотных остатков: аргининлюбой остаток аминокислотылейцинаргинин.

Адрес для корреспонденции: Хавкин Эмиль Ефимович. 127550 Москва, ул. Тимирязевская, 42. Институт сельскохозяйственной биотехнологии. Факс: (499) 9770947; электронная почта: emil.khavkin@gmail.com

Ключевые слова: Phytophthora infestans  Solanum  фитофтороз картофеля  CC-NB-LRR рецепторные киназы  R гены устойчивости к фитофторозу  Avr гены  RxLR эффекторы  эволюция генома

 

ВВЕДЕНИЕ

 

Потери урожая картофеля в Европе во второй половине 1840-х годов, одной из причин которых стала сильнейшая эпифитотия картофеля, привели к голодной смерти и эмиграции миллионов европейцев. Сильнее других пострадала Ирландия, где преобладала монокультура картофеля, поэтому фитофтороз во всем мире связывают с “Великим ирландским голодом” (Great Irish Famine, Irish Potato Famine). С изучения этой болезни, вызываемой оомицетом Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, ведет свое начало фитопатология как наука. Несмотря на постоянное совершенствование химических и агротехнических методов защиты и значительные успехи селекции, фитофтороз остается самой серьезной агрономической, экономической и социальной проблемой картофелеводства: глобальный экономический ущерб от этой болезни, по самой осторожной оценке, превышает 35 млрд. долларов США в год [1, 2]. Сегодня эта проблема особенно обострилась в связи с появлением чрезвычайно агрессивных генотипов P. infestans, поражающих те сорта картофеля, которые до недавних пор отличались долговременной устойчивостью к фитофторозу [3, 4].

Ключ к победе над фитофторозом – в установлении эволюционных механизмов, определяющих поразительную скорость возникновения новых патотипов P. infestans, и в выяснении молекулярных процессов, лежащих в основе патогенеза и устойчивости растений. Молекулярно-генетические исследования P. infestans и взаимодействия этого патогена с растениями Solanum мотивированы, прежде всего, практическими задачами картофелеводства. Однако недавние заметные успехи этих исследований сделали патосистему P. infestansкартофель популярной моделью для изучения “гонки вооружений”  быстрой коэволюции патогена и растения-хозяина. Важными вехами в истории этих исследований стали (1) картирование и полное секвенирование геномов P. infestans [5] и культурного картофеля [6]; (2) клонирование “орудий” взаимодействия патогена и растения: в первую очередь, генов вирулентности P. infestans и генов устойчивости картофеля к этому патогену; (3) исследование продуктов этих генов  эффекторов патогена и рецепторных киназ растения, распознающих эти эффекторы; и (4) использование генов вирулентности как аналитического инструмента в исследованиях фитофтороза [710]. 

Лекция опирается по преимуществу на публикации последнего времени. Более ранние работы, как правило, отражены в цитируемых здесь обзорах.

 

ОБЩАЯ КАРТИНА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПАТОГЕНА C РАСТЕНИЕМ-ХОЗЯИНОМ

 

При фенотипическом анализе устойчивость растения традиционно делят на специфичную и неспецифичную по отношению к генотипу (расе) патогена, хотя на практике их часто трудно разграничить [11, 12]. Расоспецифичная устойчивость как ответ на заражение начинается с реакции узнавания патогена, которая определяется индивидуальными особенностями взаимодействующих молекул патогена и растения. Изучая генетические закономерности взаимодействия рас патогена с генами устойчивости растения, Flor [13] обнаружил, что отсутствие болезнетворного действия является доминантным признаком. На этом основании гены, определяющие (а)вирулентность патогена, были названы Avr (avirulence) генами. В терминах молекулярной генетики предложенную Flor концепцию “ген-на-ген” можно представить как взаимодействие продуктов индивидуальных Avr генов патогена с индивидуальными генами устойчивости растения, которые иногда называют major genes и обычно обозначают как R (resistance) или Rpi (resistance to Phytophthora infestans) гены. Распознавание патогена расоспецифичной системой эффекторкиназа (когда взаимодействуют, соответственно, продукты Avr гена патогена и R гена устойчивости растения) запускает в растении неспецифичный по отношению к патогену сигнальный каскад, приводящий к генерализированной защитной реакции. Такая защитная реакция замедляет развитие патогена или уничтожает его в результате программированной клеточной смерти вместе с “оккупированными” патогеном клетками растения (реакция сверхчувствительности; hypersensitive response).

В отличие от качественной расоспецифичной устойчивости, которую определяют индивидуальные R гены, расонеспецифичную устойчивость часто называют полигенной, или количественной. Она проявляется уже при проникновении патогена в апопласт клетки; в основе апопластической устойчивости лежит образование в растении активных форм кислорода, быстрое накопление гидролитических ферментов и других белков, которые подавляют рост и распространение патогена (PR белки, pathogenesis-related proteins), или синтез токсичных для патогена фитоалексинов, фенольных соединений и гликоалкалоидов. Другими способами противостоять болезни служат изменение скорости развития растения, позволяющее уйти от массового поражения, усиленное развитие покровных тканей растений, препятствующее их колонизации патогеном, и ускорение транспорта низкомолекулярных антимикробных метаболитов растения и каллозы к местам проникновения патогена. По определению гены, отвечающие за все эти признаки, не являются расоспецифичными [11, 12]. 

Наглядным примером тому, как ненадежно определение расонеспецифичной устойчивости на основании фенотипической реакции, служит история дикорастущего картофеля S. bulbocastanum. Устойчивость этого вида картофеля к широкому спектру рас P. infestans долгое время считали расонеспецифичной, пока не было показано, что она основана на расоспецифичных взаимодействиях с патогенном, по меньшей мере четырех индивидуальных R генов. Два таких гена обладают широкой расовой специфичностью, но, как было показано позже, преодолеваются новыми штаммами P. infestans [7]. 

Современные представления о взаимодействии патогенов с растениями представлены популярной zigzag моделью, описывающей две линии обороны, или два типа иммунитета, которым соответствуют разные стратегии распознавания патогенов. При вторжении патогена на первую линию обороны в растении индуцируются трансмембранные апопластные рецепторы, которые опознают апопластные эффекторы: разнообразные по природе молекулы, связанные с патогенами (PAMPs, pathogen-associated molecular patterns), включая синтезируемые патогенами элиситоры (суперсемейство консервативных по своему строению внеклеточных белков) и эндогенные элиситоры растительного происхождения, возникающие в процессе колонизации, как, например, фрагменты клеточной стенки или кутикулы самого растения. Внеклеточные PAMPs опознаются соответствующими pattern recognition рецепторами. Один из таких рецепторов элиситора был недавно клонирован из S. microdontum; подобные рецепторы встречаются только у клубненосных видов Solanum секции Petota, но лишены видовой специфичности и поэтому могут, по-видимому, обеспечивать долговременную устойчивость к широкому спектру рас P. infestans [14]. Неспецифичный (basal) PAMP-инициируемый иммунный ответ (PTI, PAMP-triggered immunity) растения препятствует дальнейшему распространению патогена, включая проникновение в цитоплазму оккупированных клеток. 

Тем не менее, патоген может преодолеть PTI, выделяя специфичные факторы вирулентности (цитоплазматические эффекторы), которые могут индуцировать в растении вторую, более специфичную линию обороны, если они распознаются специфичными цитоплазматическими рецепторами  NB-LRR киназами; эти киназы определяют другой тип иммунитета  эффектор-инициируемый иммунитет (ETI, effector-triggered immunity). Этот тип иммунитета часто приводит к программируемой смерти клеток, которая проявляется как реакция сверхчувствительности. Заключительная фаза взаимодействия в самом общем виде описывает эволюцию и диверсифицирующую селекцию патогена: наиболее приспособленными и успешными оказываются те генотипы P. infestans, которые утратили неэффективные Avr гены (и, следовательно, не распознаются ETI) и приобрели новые Avr гены, делающие их вирулентными. Для адаптации растение должно противопоставить новым эффекторам новые NB-LRR киназы; в противном случае растение легко поражается патогеном [1517].

Поскольку не всегда удается строго разграничить элиситоры и эффекторы, два типа иммунитета, PTI и ETI, которые представлены двумя вариантами защитного ответа, образуют неразрывную общность, различные проявления которой определяются природой индуктора и рецептора, внешними условиями, в которых происходит заражение растений, и “полем битвы” в клетках и тканях растения [18]. 

Недавно Pritchard и Birch [19] предприняли попытку заменить объяснительную zigzag модель динамической предсказательной моделью иммунной системы, которая охватывает более широкий круг природных взаимодействий растений с микроорганизмами, учитывает внешние биотические и абиотические факторы и позволяет объяснить интегративный и по большей части стохастический характер PTI и ETI, что ставит под сомнение правомочность бытующей сейчас концепции двух типов иммунитета [18]. Другие характеристики модели, предложенной Pritchard и Birch,  это временные и физические шкалы эволюционных событий. В то время, как zigzag модель представляет большинство молекулярных процессов как единичное взаимодействие растения с одним или несколькими биотрофными патогенами, утрата и/или приобретение эффекторов происходят на самом деле под давлением отбора на уровне популяции и в течение достаточно долгого времени. И даже если мы описываем эволюционные процессы на уровне популяции, необходимо учитывать, что молекулярные процессы узнавания могут происходить лишь в части атакованных патогеном клеток. Конечно эти тесно переплетенные процессы нельзя описать количественно. Взамен Pritchard и Birch [19] предлагают простую качественную модель, сохраняющую основные положения zigzag модели, но улучшают ее, включая параметры, характеризующие многие черты “реальной” патосистемы и зависимость размножения патогена от синтеза питательных веществ растением-хозяином. В модель вводится большой набор белков-эффекторов (возможно, с иными функциями, например, способствующими росту патогена) и соответствующих NB-LRR киназ; она учитывает конкуренцию за ресурсы и топографию взаимодействия патогенрастениехозяин, например мобильность патогена, расположение клеток в тканях растения и влияние внешней среды. 

В случае фитофтороза картофеля наиболее подробно исследованы те Avr гены P. infestans, которые отвечают за цитоплазматические эффекторы; их основной функцией является подавление сигнальной системы, которая запускает неспецифичную общую защитную реакцию растения и приводит к реакции сверхчувствительности. В природных популяциях P. infestans и Solanum признаки вирулентности и устойчивости присущи лишь некоторым клонам. Растение устойчиво, если хотя бы одному из многочисленных Avr генов данного штамма P. infestans соответствует специфичный R ген растения Solanum. Такому RxLR эффектору соответствует CC-NB-LRR киназа растения, которая распознает этот эффектор по типу взаимодействия лиганд-рецептор и запускает реакцию сверхчувствительности. Поэтому такая устойчивость является одновременно расоспецифичной по отношению к патогену  и ген-специфичной по отношению к растению [7]. (Название RxLR эффектора указывает на характерную последовательность аминокислотных остатков: аргинин  любой остаток аминокислоты  лейцин  аргинин, а термин CC-NB-LRR киназа означает, что в составе такого белка присутствует coiled coil домен, нуклеотид-связывающий домен и домен, богатый содержащими лейцин повторами.)

На обобщенной meta-QTL карте генома Solanum лишь небольшую часть многочисленных локусов, связанных с устойчивостью к P. infestans, удалось отождествить с R генами расоспецифичной устойчивости, уже охарактеризованными по строению и функции [20]. Другим важным источником сведений о строении CC-NB-LRR генов устойчивости к фитофторозу и их положении на генетической карте служат результаты поиска характерных нуклеотидных фрагментов в аннотированной последовательности генома S. phureja [21]. Среди остальных QTLs на обобщенной карте [20], вероятно, много генов расонеспецифичной устойчивости Идентификации таких генов способствует сравнение транскриптом в листьях устойчивых и пораженных растений картофеля, в том числе с помощью высокоразрешающей технологии SuperSAGE (serial analysis of gene expression) [22, 23]. Так, среди генов, экспрессия которых заметно усиливается в ответ на поражение картофеля P. infestans, найдены гены, участвующие в синтезе жасмоната  важнейшей сигнальной системы защитной реакции [23, 24]; гены липоксигеназы и пероксидазы [25], которые участвуют в характерном для защитной реакции окислительном взрыве (oxidative burst); гены PR белков и фитоалексинов [23, 26].

 

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СВИДЕТЕЛЬСТВА ЭВОЛЮЦИИ КУЛЬТУРНОГО КАРТОФЕЛЯ И ПАТОГЕНА P. infestans

 

Дикорастущие клубненосные сородичи картофеля (Solanum секция Petota) обитают в горных долинах Северной и Южной Америки от юго-запада США до северной Аргентины и еще южнее, на прибрежных равнинах Центрального и Южного Чили. По всей видимости, картофель был впервые одомашнен в Андах в южном Перу около 10 000 лет назад, а высокогорные плато Мексики стали вторичным центром происхождения этой культуры. Молекулярный анализ старых гербарных образцов Solanum и современных генетических коллекций показал, что с конца 16 века в Европе и Северной Америке возделывался картофель, происходивший из Анд, но в начале 19 века эти формы исчезают, и их место занимают генотипы, происходящие с чилийской равнины. Высокая восприимчивость чилийского картофеля к фитофторозу объясняет эпидемию 18451849 гг. [27]. Изучение митохондриальных гаплотипов P. infestans в гербарных образцах растений картофеля, собранных до и после этой эпидемии, показало, что эту эпидемию, по-видимому, вызвал гаплотип Ia, а гаплотип Ib появился лишь в начале 20 века. Когда митохондриальный и ядерный геномы P. infestans сравнили в гербарных образцах картофеля 19 века и у изолятов P. infestans, собранных на старых и новых генотипах картофеля, оказалось, что гаплотип Ia можно соотнести с уникальным генотипом HERB-1. Он доминировал еще в течение 50 лет после исторической эпифитотии, а затем был замещен за пределами Мексики родственным, но возникшим независимо от HERB-1 генотипом US-1. Последний преобладал до последней четверти 20 века, когда за пределами Мексики появились генотипы P. infestans с типом спаривания A2. Сопоставление последовательностей ДНК P. infestans, выделенных из гербарных экземпляров картофеля, собранных в 1845 г. в Бельгии и Великобритании и в 1876–1889 гг. в Германии, Дании и Швеции, и из изолятов US-8, US-22, US-23 и 13_A2, ответственных за недавние пандемии фитофтороза в Северной Америке и Европе, показало, что в строении генома P. infestans произошли заметные изменения; в частности, современные формы патогена обогатились новыми Avr генами [1, 2831].

Чрезвычайно интересные сведения о коэволюции патогена и его хозяина дает анализ геномов современных форм P. infestans. По всей видимости, разнообразие рас P. infestans возникло на плоскогорьях Центральной Мексики, в частности в высокогорной долине Толука [1, 7, 28]. Важным фактором генетического разнообразия и эволюции P. infestans в мексиканском центре происхождения стало необходимое для полового размножения патогена одновременное присутствие форм с двумя типами спаривания, A1 and A2 [28, 32]. Центр в Андах имеет вторичное происхождение, разнообразие форм P. infestans там меньше, и они по большей части представлены клонами. 

Специфичные наборы Avr генов у различных генотипов P. infestans сложились в процессе коэволюции с растениями Solanum. В связи с этим возникает вопрос о географии R генов устойчивости среди клубненосных сородичей картофеля. Мексиканский центр происхождения P. infestans  это ареал разнообразных дикорастущих сородичей картофеля, несущих R гены устойчивости к фитофторозу; в Южной Америке таких видов Solanum значительно меньше или они слабее исследованы [7, 9, 33]. Микросателлитный анализ изолятов Phytophthora, собранных на высокогорных плато Эквадора, обнаружил характерную связь между распределением форм патогена и растения-хозяина, по крайней мере, на уровне видов и секций; эта связь указывает на процесс коэволюции [34]. Новый свет на происхождение патогена и его коэволюцию с растениями Solanum сможет, вероятно, пролить сравнительное изучение профилей Avr генов P. infestans и R генов Solanum в их исходных ареалах, где в результате балансирующего отбора достигнуто “временное перемирие”, и в посадках культурного картофеля, где сорта-клоны являются средой для быстрого отбора эффективных рас, так что в итоге формируется большой генофонд популяции возбудителя. В какой степени отбор на устойчивых сортах приводит к локальной адаптации систем растениепатоген? Во Франции генотипы картофеля определяли структуру популяций P. infestans [35]. В Северной Ирландии заметная конкуренция между генотипами патогена отмечена в полевых опытах с сортами картофеля, различавшимися по восприимчивости; отбор генотипов P. infestans шел сильнее на более устойчивых сортах картофеля [36].

В последние три десятилетия появление форм с типом спаривания A2 в Европе и США привело к возникновению новых генотипов P. infestans [4, 29, 37]. Самым ярким примером современной эволюции патогена стало быстрое распространение в Западной Европе, а также в Индии и Китае чрезвычайно агрессивного клона 13_A2, доля которого достигает 75% популяции P. infestans в некоторых странах Европы и 100% в Южной Индии [3, 4, 38]. Любопытно, что в Европе клон 13_A2 приобрел высокую агрессивность уже после того, как он вытеснил доминировавшие до того времени A1 генотипы [39]. Такое же вытеснение, но в разной степени и на различных генотипах картофеля, происходит и по мере развития болезни в течение одного сезона вегетации [3].

К сожалению, мы не всегда знаем, какие изменения в спектрах Avr генов и AVR эффекторов, экспрессируемых этими генами, сопровождают резкие изменения в структуре популяций P. infestans и делают агрессивными отдельные клоны этого патогена. Популяции P. infestans чрезвычайно полиморфны, и в патогенезе участвуют наборы RxLR эффекторов, которые различаются по динамике экспрессии в процессе заражения и по вкладу в агрессивность и вирулентность популяции в целом [8]. Важным фактором изменения вирулентности популяций P. infestans является также спектр R генов в посадках картофеля: показано, что экспрессия специфичных RxLR эффекторов коррелирует с вирулентностью изолятов на различных генотипах картофеля. Как и следует из динамической модели Pritchard и Birch [19], ситуация еще более усложняется, когда мы рассматриваем динамику заражения разнообразных генотипов картофеля сразу несколькими патотипами P. infestans [3, 7, 3941].

 

ПАРТНЕРЫ ПО КОЭВОЛЮЦИИ: ГЕНЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ P. infestans

 

Род Phytophthora относится к оомицетам; систематически эти эукариоты далеки от настоящих грибов и ближе всего к бурым и диатомовым водорослям. В жизненном цикле гемибиотрофа P. infestans выделяют две фазы развития: биотрофную, когда патоген взаимодействует с растением-хозяином, и некротрофную, когда ткани растения деградируют, мицелий оомицета быстро распространяется в мертвой ткани и симптомы поражения проявляются в полной мере [42].

На биотрофной стадии размножение патогена подвижными зооспорами приводит к быстрому распространению инфекции. Вслед за прорастанием зооспор на поверхности растения, разветвленные гифы оомицета распространяются по межклетникам, проникают в апопласт клеток и секретируют в это пространство апопластические эффекторы, которые взаимодействуют с внеклеточными мишенями и поверхностными рецепторами растения, подавляя первичный иммунный ответ PTI, характерный для расонеспецифической устойчивости. О высокой биохимической специфичности такого взаимодействия свидетельствует, к примеру, анализ характерных аминокислотных последовательностей протеазы растения, секретируемой в ответ на заражение, и эффектора P. infestans, который ингибирует эту протеазу [43].

Специализированные инвагинирующие структуры гифов оомицета  гаустории  соприкасаются с плазменной мембраной клетки растения, и в клетку проникают цитоплазматические AVR эффекторы [1, 4447]. Все или почти все охарактеризованные к настоящему времени AVR эффекторы P. infestans, которые участвуют в поражении картофеля, относятся к суперсемейству RxLR эффекторов; многие из них найдены только у P. infestans и не имеют ортологов у других видов Phytophthora.

Своими размерами геном P. infestans (240 млн. п. н.) на порядок величины превышает геномы других видов Phytophthora. Определение нуклеотидной последовательности генома и исследования транскрибируемых последовательностей генов P. infestans обнаружили 563 гена, кодирующих RxLR эффекторы; из них лишь четверть экспрессируется и только 79 резко усиливают экспрессию в первые дни после заражения. Большинство генов RxLR эффекторов сосредоточены в периферических участках генома P. infestans, бедных “генами домашнего хозяйства”, но чрезвычайно богатых повторяющимися последовательностями, прежде всего транспозонами [5, 42]. Дупликация генома P. infestans с избирательным сохранением (retention) копий генов, участвующих в патогенезе [48], и амплификация Avr генов с образованием кластеров, по соседству с которыми расположены участки генома с высокой рекомбинационной активностью [5],  вот что в первую очередь определяет поразительное разнообразие наборов Avr генов, ответственных за патогенность и специфичность того или иного штамма P. infestans по отношению к растению-хозяину. Разнообразие активных Avr генов увеличивается благодаря эпигенетической регуляции (silencing) транспозонов и самих Avr генов с помощью малых РНК [49]. Увеличение размеров генома дает патогену существенные преимущества: в результате эволюционной пластичности генома в популяции P. infestans быстро и эффективно отбираются вирулентные генотипы, несущие новые формы RxLR эффекторов, которые не распознаются рецепторными киназами  продуктами R генов устойчивости растения [7, 42, 50, 51]. 

RxLR эффекторы  это модульные белки, которые содержат на N-конце сигнальный пептид и RxLR-мотив, обеспечивающий перенос эффектора в клетку растения-хозяина. RxLR мотив не нужен для секреции AVR эффекторов из гаусториев P. infestans, но когда эффектор секретирован, его дальнейший перенос в инфицированную клетку растения требует участия RxLR мотива и не зависит от транспортной системы самого патогена. Для эффектора AVR3a показано, что аминокислотные остатки RxLR домена важны для гомодимеризации этого белка [52, 53].

C-концевой домен определяет биохимическую активность эффектора, в том числе специфичное распознавание своей мишени в цитоплазме растительной клетки, т.е. функцию вирулентности, или узнавание эффектора рецепторной киназой. C-домен наиболее полиморфен, поэтому именно этот участок белка служит местом приложения отбора при коэволюции патогена и растения-хозяина. Этим функции C-концевой части эффектора не ограничиваются: так, в случае AVR3a эта часть эффектора стабилизирует E3 убиквитин-лигазу CMPG1, задерживая смерть растительных клеток, индуцированную элиситином P. infestans INF1; тем самым оомицет регулирует продолжительность биотрофной фазы своего развития. Половина RxLR эффекторов содержит на полиморфном C-конце молекулы спирализованный WY домен, отвечающий за присоединение фосфатидилинозитол-3-фосфата мембраны растительной клетки в процессе эндоцитоза. Показано, что этот домен критичен для проявления вирулентности эффекторов AVR3a, AVR4, IPI-O1 и IPI-O4 (IPI от in-planta induced). Когда эффектор содержит раздельные характерные последовательности (signatures) для взаимодействия с рецепторной киназой и для функции вирулентности, Avr ген может избежать узнавания вследствие изменения строения соответствующей последовательности, но при этом сохранить вирулентность. Такие Avr гены являются предпочтительными мишенями диверсифицирующей селекции, определяющей быстрые изменения вирулентности патогена [7, 42, 45, 5052, 5456]. 

Определяющим фактором эволюции Avr генов P. infestans является механизм, позволяющий патогену преодолеть ETI защитную систему растения. Когда патоген теряет авирулентные эффекторы или приобретает новые вирулентные эффекторы, он избегает распознавания растением-хозяином и вызывает поражение хозяина. Механизм специфичного распознавания RxLR эффекторов CC-NB-LRR рецепторными киназами, которое определяет ген-специфичную устойчивость растений, исследован совершенно недостаточно и только для нескольких пар Avr ген P. infestansR ген Solanum. 

Остановимся подробнее на этих эффекторах. Эффекторы семейства IPI-O вызывают реакцию сверхчувствительности у тех гаплотипов S. bulbocastanum и S. stoloniferum, которые несут функциональный ген RB/Rpi-blb1. Сравнение популяций P. infestans свидетельствует о том, что семейство генов Avr-blb1/ipiO обнаруживает наибольший полиморфизм. Выделяют три класса этих генов (I, II и III); среди них наиболее полиморфен класс I, который включает хорошо охарактеризованные гены ipiO1 и ipiO2. Растения с геном RB/Rpi-blb1 поражаются только в отсутствие генов ipiO. Тот факт, что почти все изоляты P. infestans содержат хотя бы один аллель ipiO, объясняет широкий спектр расоспецифичной устойчивости S. bulbocastanum, обусловленной геном Rpi-blb1 [7, 5557]. Для того чтобы объяснить, как расы P. infestans, экспрессирующие эффектор IPI-O4, преодолевают устойчивость растений, несущих ген RB/Rpi-blb1, была предложена модель [57], в которой оба эффектора, авирулентный IPI-O1 и вирулентный IPI-O4, взаимодействуют с CC-доменом RB киназы. Эффектор IPI-O1 обеспечивает димеризацию молекул киназы, необходимую для ее активации, а IPI-O4 блокирует такую димеризацию и тем самым препятствует узнаванию патогена.

Гомологичные гены семейства Avr2 по-разному узнают ген R2, и эти различия также связаны со строением характерной последовательности С-участка эффектора. Растения с геном R2 взаимодействует с эффектором PiAVR2 при посредстве фосфатазы растения BSU-LIKE PROTEIN1 (BSL1), это взаимодействие приводит к распознаванию эффектора. Гомолог AVR2-like также взаимодействует с BSL1, однако ассоциация комплекса AVR2-likeBSL1 с R2 киназой не происходит, и растения поражаются [40]. Среди многочисленных аллелей гена Avr4 найдены псевдогены, продукты которых не распознаются соответствующей киназой растения; такая форма избегает узнавания геном R4, но остается вирулентной [52]. 

Наиболее подробно исследован полиморфизм эффектора AVR3a. Для реакции сверхчувствительности критичны аминокислотные остатки 73147; удаление последних 16 остатков из молекулы этого белка делает невозможным узнавание R3a киназы; N-концевой мотив не участвует в этом узнавании. Два аллеля гена, Avr3aKI и Avr3aEM, кодируют эффекторы AVR3aKI и AVR3aEM, которые различаются двумя аминокислотными остатками в мотиве W в положениях 80 и 103. Эти два аллеля гена Avr3a существенно различаются уровнем экспрессии, а третий ген из того же семейства не экспрессируется вовсе [9, 51, 53, 54]. Мутационный анализ киназы R3a обнаружил восемь аминокислотных остатков, критических для узнавания различных изоформ AVR3a [58].

 

ПАРТНЕРЫ ПО КОЭВОЛЮЦИИ: ГЕНЫ УСТОЙЧИВОСТИ Solanum К P. infestans

 

Начиная с 2002 г., когда был клонирован ген R1 S. demissum, быстро увеличивается число R генов устойчивости, клонированных из дикорастущих сородичей картофеля. К настоящему времени клонированы более 20 таких генов, однако многие R гены, перечисленные в таблице, еще полностью не охарактеризованы по строению и функции [7, 9, 11, 59].

Основными инструментами для поиска и выделения новых R генов являются генетическое и физическое картирование протяженных участков генома с использованием маркеров ДНК, фланкирующих количественные локусы устойчивости, и маркеров, основанных на последовательности уже известных генов-прототипов, так называемый “метод генов-кандидатов” [12, 5962]. Надежным доказательством функциональной активности изолированных R генов служит устойчивость растений картофеля, трансформированных этими генами, однако получение такого доказательства требует много труда и времени. Поэтому сегодня преобладающим методом функционального анализа становится совместная транзиторная экспрессия изолированных R генов и Avr генов после их агроинфильтрации в листья Nicotiana benthamiana. Этот метод, который получил название “эффекторомики”, позволяет точнее охарактеризовать уже изолированные R гены, различая их функциональные аллели, а также быстро и специфично обнаруживать R гены, включая их ранее неизвестные формы, у перспективных видов Solanum и в селекционных источниках и донорах [7, 10, 51].

По характеру эволюции NB-LRR гены устойчивости разделяют на два типа. Для быстро эволюционирующих генов типа I характерна высокая частота реорганизация первичной структуры (sequence shuffling); напротив, медленно эволюционирующие гены типа II консервативны [63]. На долю семейства NB-LRR генов, к которым относятся R гены устойчивости Solanum, приходится более 1% всех генов растения. Все R гены расоспецифичной устойчивости растений к P. infestans, охарактеризованные к настоящему времени у картофеля и его дикорастущих сородичей, кодируют внутриклеточные CC-NB-LRR рецепторные киназы. Общее число таких генов превышает 100, однако следует учитывать, что часть этих последовательностей принадлежит неактивным гомологам. В результате многочисленных событий тандемной, эктопической и сегментной дупликации и рекомбинации возникают кластеры генов. Тот факт, что бóльшая часть этих кластеров образована гомологичными генами, свидетельствует об их недавнем происхождении от общего предшественника в результате локальной тандемной дупликации [11, 21]. Как и в случае Avr генов P. infestans, дупликация и кластерная организация R генов в растениях во многом определяют полиморфизм генов устойчивости. Параллельный филогенетический анализ геномов Solanum и самих R генов устойчивости позволяет предполагать, что дивергенция R генов предшествовала разделению видов Solanum, однако в сравнительно недалеком прошлом в ответ на изменения в популяционном составе патогена в резервуаре дуплицированных R генов произошла вторичная специализация (неофункционализация) этих генов. Поэтому значительное сходство в строении последовательностей R генов или соответствующих киназ не обязательно свидетельствует о таксономической близости соответствующих видов Solanum [9]. Примечательное исключение из этого правила  ортологи Rpi-blb1 и Rpi-sto1: их сходство объясняется тем, что S. bulbocastanum послужил источником генома B в составе тетраплоидного S. stoloniferum [60].

Рассмотрим подробнее наиболее хорошо изученные R гены устойчивости к фитофторозу (таблица). Самый большой кластер этих генов на хромосоме 4 представлен преимущественно гомологичными последовательностями, включая гены R2 из S. demissum, Rpi-blb3 из S. bulbocastanum и их ортологи из североамериканских видов S. demissum, S. bulbocastanum, S. hjertingii, S. edinense и S. schenckii. В этом же кластере расположен ген Rpi-mcd1 из S. microdontum, отличающийся по строению от ортологов R2, потому что он не распознается эффектором Avr2 [7, 21]. Уникальный по строению ген R1 расположен на хромосоме 5 в сложном кластере паралогичных генов типа I; из трех гаплотипов аллогексаплоидного S. demissum только один содержит функциональную форму R1 [64]. Кластер RB генов на хромосоме 8 образован тандемной дупликацией генов типа II; два активных паралога, Rpi-blb1 и Rpi-bt1, найдены у S. bulbocastanum. Rpi-blb1 присутствует только в геноме B Solanum [7]; интригующее исключение составляет его ортолог RBver, найденный в геноме A S. verrucosum [65]; этот ген не был картирован.

Среди нескольких кластеров R генов на длинном плече хромосомы 9 наибольший интерес представляют расположенные по соседству гены R8, R9a и R9b из S. demissum и семейство генов Rpi-vnt1 из южноамериканского вида S. venturii; гомологи R9a и Rpi-vnt1-1 сходны на 78% [7, 9, 66]. Ген R8, по-видимому, соответствует недавно описанному локусу Rpi-Smira2 из сорта Sarpo Mira, на сегодня наиболее устойчивого к фитофторозу [66, 67]. Наиболее гетерогенным является кластер генов R3 на хромосоме 11 S. demissum: он представлен блоками гомологичных последовательностей двух генов  R3a и R3b; часть этих гомологов у S. demissum пока охарактеризована только методами генетического картирования и эффекторомики; кроме того, гомолог R3a Rpi-sto2 найден у S. stoloniferum [7, 9, 59]. Новым геном в кластере R3 является Rpi-Smira1  еще один локус, найденный у сорта Sarpo Mira [67, 68].

Заметный аллельный полиморфизм некоторых R генов устойчивости растений предполагает, что появление новых вариантов рецепторных киназ путем неофункционализации дуплицированных генов обеспечивает растению определенные селективные преимущества в условиях быстрой эволюции патогена. Такая диверсифицирующая селекция говорит в пользу прямого взаимодействия CC-NB-LRR рецепторных киназ со специфичными по отношению к ним AVR белками, однако доказательства такого взаимодействия пока малочисленны: достаточно подробно исследовано поведение только четырех эффекторов: AVR2, AVR3A, AVR-BLB1 and AVR-BLB2 [9].

Экспрессия R генов устойчивости также изучена недостаточно. Эти гены конститутивно экспрессируются на низком уровне, и исследователи расходятся в оценке экспрессии, индуцированной заражением. Для гена Rpi-blb1 показана зависимость устойчивость растений к фитофторозу от количества молекул соответствующей рецепторной киназы, которое определялось дозой и экспрессией R гена или стабильностью соответствующей киназы в клетке [9, 69].

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ: НА ПУТИ К ДОЛГОВРЕМЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ КАРТОФЕЛЯ 

К ФИТОФТОРОЗУ

 

Вследствие быстрой эволюции P. infestans и появления Avr генов, “новых” для R генов, присутствующих в посадках картофеля, патоген поражает ранее устойчивые сорта картофеля. Культивирование сортов картофеля с новыми R генами быстро приводит к изменению популяции патогена, и новые патотипы “преодолевают” устойчивость этих сортов [1]. Такое преодоление R генов резко ускорилось в последние три десятилетия, когда из Мексики в области интенсивного возделывания картофеля попали новые патотипы P. infestans с A1 и A2 типами спаривания [1, 3, 4, 44, 70]. Наиболее заметно снизилась устойчивость сортов, несущих по одному R гену из S. demissum; тем не менее, “преодоленные” R гены сохраняют свое действие: их присутствие отчетливо коррелирует с устойчивостью сортов картофеля [65].

Селекция на долговременную и высокую устойчивость предполагает несколько подходов. Один из них направлен на замедление эволюции P. infestans и увеличение “срока службы” индивидуальных R генов или их ансамблей в сортах картофеля. Этот срок зависит от величины резервуара Avr генов в популяции P. infestans и скорости эволюции патогена, который определяется размерами эффективной популяции P. infestans и наличием в посадках картофеля генов устойчивости, в том числе распределением сортов с генами устойчивости по годам выращивания. На практике для этого выбирают и соответствующим образом размещают в поле сорта картофеля, которые благодаря расонеспецифичной устойчивости задерживают размножение патогена и таким образом уменьшают эффективные размеры популяции [44, 72, 73].

Основной массив экспериментальных данных о коэволюции P. infestans и растения-хозяина составляют сведения о снижении (или даже полной потере) устойчивости сортов картофеля к фитофторозу на фоне изменений в популяциях патогена. Гораздо слабее исследованы быстрые процессы смены популяций P. infestans в пределах одного генотипа Solanum в связи с профилем Avr и R генов. На этом фоне особого внимания заслуживает недавнее исследование эволюции R гена в искусственно созданных условиях, когда вновь созданная форма гена R3a приобретала высокую способность противостоять наиболее вирулентному гену Avr3aEM [74].

Другой подход основан на представлении о том, что ансамбль R генов с широким спектром специфичности по отношению к Avr генам патогена обеспечит более высокую и долговечную устойчивость к фитофторозу. Чтобы расширить спектр специфичности R генов у картофеля, необходимо вовлекать в селекцию новые R гены, по преимуществу из тех видов Solanum, которые ранее не использовали в селекционном процессе. Другой подход  по возможности расширить набор R генов у индивидуальных растений. Хотя быстро эволюционирующие Avr гены P. infestans преодолевают большинство R генов, интрогрессированных в культурный картофель, не исследованными остаются еще десятки дикорастущих видов картофеля. Чтобы как можно больше расширить набор R генов в индивидуальном растении, селекционеры стремятся ввести в геном картофеля сразу несколько R генов, различающихся по специфичности и поэтому способных распознавать широкий круг Avr генов и, соответственно, патотипов P. infestans [72, 73].

С тех пор, когда селекционеры интрогрессировали в картофель устойчивость к фитофторозу из S. demissum [75], постепенно расширяется круг дикорастущих клубненосных видов Solanum секции Petota, перспективных для селекции на устойчивость к фитофторозу. Половая гибридизация систематически удаленных видов Solanum представляет значительные трудности, тем не менее, вслед за S. demissum и S. stoloniferum в селекцию удалось ввести немало южноамериканских и североамериканских видов картофеля. Интрогрессия генетического материала S. bulbocastanum в картофель была осуществлена путем слияния протопластов [7, 9, 11, 28, 33, 59, 61].

Новые возможности для переноса R генов в культурный картофель из любых видов Solanum открывают методы генетической инженерии [66, 72, 76, 77]. Важнейшими достижениями в этом направлении является трансформация картофеля такими R генами с широкой специфичностью по отношению к P. infestans, как Rpi-blb1, Rpi-blb2 и Rpi-mcd1. Еще более эффективным приемом является перенос в одно растение картофеля сразу нескольких R генов устойчивости, которые различаются по специфичности; такой перенос называют пирамидированием, или stacking. Методами генной инженерии созданы сорта картофеля, несущие по три R гена устойчивости [66, 72, 73, 76, 77].

Наиболее успешными примерами пирамидирования R генов устойчивости традиционными методами селекции служат сорт-дифференциатор Мастенброка MaR9 и сорт Sarpo Mira: в их геномах методами эффекторомики найдены, соответственно, семь и пять R генов устойчивости, перенесенных из различных дикорастущих видов Solanum [51, 6668, 78, 79]. Традиционные методы селекции позволяют совместить в одном растении новые R гены с уже присутствующей полигенной устойчивостью к фитофторозу и другими хозяйственно ценными генами [73].

C усилиями генетиков и селекционеров, направленными на создание долговременной устойчивости к фитофторозу, тесно связан мониторинг патогена современными молекулярно-генетическими методами [3]. Если дополнить такой мониторинг сопряженным анализом спектров Avr генов и их аллелей, специфично взаимодействующих с R генами (Avr profiling), и самих R генов у возделываемых сортов картофеля, то, возможно, удастся прогнозировать развитие эпидемии и оценить в первом приближении возможные потери урожая [3, 7, 8].

Автор благодарит Н.Л. Клячко и Е.В. Рогозину за конструктивные замечания. 

Лекция подготовлена в рамках проекта Российского фонда фундаментальных исследований № 13-04-00163. 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Fry W. Phytophthora infestans: the plant (and R gene) destroyer // Mol. Plant Pathol. 2008. V. 9. P. 385402.

2.Haverkort A.J., Boonekamp P.M., Hutten R.C.B., Jacobsen E., Lotz L.A.P., Kessel G.J.T., Visser R.G.F., van der Vossen E.A.G. Societal costs of late blight in potato and prospects of durable resistance through cisgenic modification // Potato Res. 2008. V. 51. P. 4757.

3.Cooke D.E.L., Cano L.M., Raffaele S., Bain R.A., Cooke L.R., Etherington G.J., Deahl K.L., Farrer R.A., Gilroy E.M., Goss E.M., Grünwald N.J., Hein I., MacLean D., McNicol J.W., Randall E., Oliva R.F., Pel M.A., Shaw D.S., Squires J.N., Taylor M.C., Vleeshouwers V.G., Birch P.R., Lees A.K., Kamoun S. Genome analyses of an aggressive and invasive lineage of the Irish Potato Famine pathogen // PLoS Pathol. 2012. V. 8: e1002940.

4.Lees A.K., Stewart J.A., Lynott J.S., Carnegie S.F., Campbell H., Roberts A.M.I. The effect of a dominant Phytophthora infestans genotype (13_A2) in Great Britain on host resistance to foliar late blight in commercial potato cultivars // Potato Res. 2012. V. 55. P. 125134.

5.Haas B.J., Kamoun S., Zody M.C., Jiang R.H.Y, Handsaker R.E., Cano L.M., Grabherr M., Kodira C.D., Raffaele S., Torto-Alalibo T., Bozkurt T.O., Ah-Fong A.M., Alvarado L., Anderson V.L., Armstrong M.R., Avrova A., Baxter L., Beynon J., Boevink P.C., Bollmann S.R., Bos J.I., Bulone V., Cai G., Cakir C., Carrington J.C., Chawner M., Conti L., Costanzo S., Ewan R., Fahlgren N., Fischbach M.A., Fugelstad J., Gilroy E.M., Gnerre S., Green P.J., Grenville-Briggs L.J., Griffith J., Grünwald N.J., Horn K., Horner N.R., Hu C.H., Huitema E., Jeong D.H., Jones A.M., Jones J.D., Jones R.W., Karlsson E.K., Kunjeti S.G., Lamour K., Liu Z., Ma L., Maclean D., Chibucos M.C., McDonald H., McWalters J., Meijer H.J., Morgan W., Morris P.F., Munro C.A., O'Neill K., Ospina-Giraldo M., Pinzón A., Pritchard L., Ramsahoye B., Ren Q., Restrepo S., Roy S., Sadanandom A., Savidor A., Schornack S., Schwartz D.C., Schumann U.D., Schwessinger B., Seyer L., Sharpe T., Silvar C., Song J., Studholme D.J., Sykes S., Thines M., van de Vondervoort P.J., Phuntumart V., Wawra S., Weide R., Win J., Young C., Zhou S., Fry W., Meyers B.C., van West P. Genome sequence and analysis of the Irish Potato Famine pathogen Phytophthora infestans // Nature. 2009. V. 461. P. 393398.

6.Potato Genome Sequencing Consortium. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato // Nature. 2011. V. 475. P. 189–195.

7.Vleeshouwers V.G.A.A., Raffaele S., Vossen J., Champouret N., Oliva R., Segretin M.E., Rietman H., Cano L.M., Lokossou A., Kessel G., Pel M.A., Kamoun S. Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors // Annu. Rev. Phytopathol. 2011. V. 49. P. 507531.

8.Pais M., Win J., Yoshida K., Etherington G.J., Cano L.M., Raffaele S., Banfield M.J., Jones A., Kamoun S., Saunders D.G. From pathogen genomes to host plant processes: the power of plant parasitic oomycetes // Genome Biol. 2013. V. 14: 211. http://genomebiology.com/2013/14/6/211

9.Rodewald J., Trognitz B. Solanum resistance genes against Phytophthora infestans and their corresponding avirulence genes // Mol. Plant Pathol. 2013. V. 14. P. 740757.

10.Vleeshouwers V.G.A.A., Oliver R.P. Effectors as tools in disease resistance breeding against biotrophic, hemibiotrophic, and necrotrophic plant pathogens // Mol. PlantMicrobe Interact. 2014. V. 27. P. 196206.

11.Simko I., Jansky S.H., Stephenson S., Spooner D.M. Genetics of resistance to pests and disease // Potato Biology and Biotechnology: Advances and Perspectives / Eds. Vreugdenhil D., Bradshaw J., Gebhardt C., Govers F., Mackerron D.K.L., Taylor M.A., Ross H.A. Amsterdam: Elsevier, 2007. P. 117155.

12.Poland J.A., Balint-Kurti P.J., Wisser R.J., Pratt R.C., Nelson R.J. Shades of gray: the world of quantitative disease resistance // Trends Plant Sci. 2009. V. 14. P. 2129.

13.Flor H.H. Current status of the gene-for-gene concept // Annu. Rev. Phytopathol. 1971. V. 9. P. 275296.

14.Du J. Elicitin-triggered apoplastic immunity against late blight in potato: PhD thesis. Wageningen, The Netherlands: Wageningen University, 2014. 140 p. 

15.Jones J.D., Dangl J.L. The plant immune system // Nature. 2006. V. 444. P. 323–329.

16.Hein I., Gilroy E.M., Armstrong M.R., Birch P.R. The zig-zag-zig in oomyceteplant interactions // Mol. Plant Pathol. 2009. V. 10. P. 547562.

17.Dodds P.N., Rathjen J.P. Plant immunity: towards an integrated view of plantpathogen interactions // Nat. Rev. Genet. 2010. V. 11. P. 539–548.

18.Pritchard L., Birch P.R.J. The zigzag model of plant–microbe interactions: is it time to move on? // Mol. Plant Pathol. 2014. V. 15. P. 865–870.

19.Thomma B.P.H.J., Nürnberger T., Joosten M.H.A.J. Of PAMPs and effectors: the blurred PTI-ETI dichotomy // Plant Cell. 2011. V. 23. P. 415.

20.Danan S., Veyrieras J.-B., Lefebvre V. Construction of a potato consensus map and QTL meta-analysis offer new insights into the genetic architecture of late blight resistance and plant maturity traits // BMC Plant Biol. 2011. V. 11: 16. http://www.biomedcentral.com/1471-2229/11/16

21.Jupe F., Pritchard L., Etherignton G.J., Mackenzie K., Cock P.J., Wright F., Sharma S.K., Bolser D., Bryan G.J., Jones J.D., Hein I. Identification and localisation of the NB-LRR gene family within the potato genome // BMC Genomics. 2012. V. 13: 75. http://www.biomedcentral.com/1471-2164/13/75

22.Draffehn A.M., Li L., Krezdorn N., Ding J., Lübeck J., Strahwald J., Muktar M.S., Walkemeier B., Rotter B., Gebhardt C. Comparative transcript profiling by SuperSAGE identifies novel candidate genes for controlling potato quantitative resistance to late blight not compromised by late maturity // Front. Plant Sci. 2013. V. 4: 423. doi 10.3389/fpls.2013.00423

23.Ali A., Sandin M., Resjö S., Lenman M., Hedley P., Levander F., Andreasson E. Quantitative proteomics and transcriptomics of potato in response to Phytophthora infestans in compatible and incompatible interactions // BMC Genomics. 2014. V. 15: 497. http://www.biomedcentral.com/1471-2164/15/497

24.Pajerowska-Mukhtar K., Stich B., Achenbach U., Ballvora A., Lübeck J., Strahwald J., Tacke E., Hofferbert H.R., Ilarionova E., Bellin D., Walkemeier B., Basekow R., Kersten B., Gebhardt C. Single nucleotide polymorphisms in the allene oxide synthase 2 gene are associated with field resistance to late blight in populations of tetraploid potato cultivars // Genetics. 2009. V. 181. P. 11151127.

25.Du J., Tian Z., Liu J., Vleeshouwers V.G., Shi X., Xie C. Functional analysis of potato genes involved in quantitative resistance to Phytophthora infestans // Mol. Biol. Rep. 2013. V. 40. P. 957967.

26.Bengtsson T., Weighill D., Proux-Wéra E., Levander F., Resjö S., Burra D.D., Moushib L.I., Hedley P.E., Liljeroth E., Jacobson D., Alexandersson E., Andreasson E. Proteomics and transcriptomics of the BABA-induced resistance response in potato using a novel functional annotation approach // BMC Genomics. 2014. V. 15: 315. http://www.biomedcentral.com/1471-2164/15/315

27.Ovchinnikova A., Krylova E., Gavrilenko T., Smekalova T., Zhuk M., Knapp S., Spooner D.M. Taxonomy of cultivated potatoes (Solanum section Petota: Solanaceae) // Bot. J. Linn. Soc. 2011. V. 165. P. 107–155.

28.Grünwald N.J., Flier W.G. The biology of Phytophthora infestans at its center of origin // Annu. Rev. Phytopathol. 2005. V. 43. P. 171190.

29.Fry W.E., Grünwald N.J., Cooke D.E.L., McLeod A., Forbes G.A., Cao K. Population genetics and population diversity of Phytophthora infestans // Oomycete Genetics and Genomics: Diversity, Interactions, and Research Tools / Eds. Lamour K., Kamoun S. Oxford, UK: Wiley-Blackwell, 2009. P. 139164.

30.Martin M.D., Cappellini E., Samaniego J.A., Zepeda M.L., Campos P.F., Seguin-Orlando A., Ho S.Y.W., Dietrich F.S., Mieczkowski P.A., Heitman J., Willerslev E., Krogh A., Ristaino J.B., Gilbert M.T.P. Reconstructing genome evolution in historic samples of the Irish Potato Famine pathogen // Nat. Commun. 2013. V. 4: 2172. doi 10.1038/ncomms3172

31.Yoshida K., Burbano H.A., Krause J., Thines M., Weigel D., Kamoun S. Mining herbaria for plant pathogen genomes: back to the future // PLoS Pathog. 2014. V. 10: e1004028.

32.Goss E.M., Tabima J.F., Cooke D.E.L., Restrepo S., Fry W.E., Forbes G.A., Fieland V.J., Cardenas M., Grünwald N.J. The Irish Potato Famine pathogen Phytophthora infestans originated in central Mexico rather than the Andes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014. V. 111. P. 87918796.

33.Рогозина Е.В. Молекулярно-генетические взаимодействия в системе “патоген-хозяин” при фитофторозе картофеля и современные стратегии селекции // С.-х. биология. 2011. Т. 5. С. 1730.

34.Oliva R.F., Chacon M.G., Cooke D.E.L., Lees A.K., Forbes G.A. Is Phytophthora infestans a good taxonomist? Host recognition and co-evolution in the Phytophthora/Solanum interaction // Acta Hort. 2007. V. 745. P. 465470.

35.Montarry J., Andrivon D., Glais I., Corbiere R., Mialdea G., Delmotte F. Microsatellite markers reveal two admixed genetic groups and an ongoing displacement within the French population of the invasive plant pathogen Phytophthora infestans // Mol. Ecol. 2010. V. 19. P. 19651977.

36.Young G.K., Cooke L.R., Kirk W.W., Tumbalam P., Perez F.M., Deahl K.L. Influence of competition and host plant resistance on selection in Phytophthora infestans populations in Michigan, USA and in Northern Ireland // Plant Pathol. 2009. V. 58. P. 703714.

37.Montarry J., Corbiere R., Lesueur S., Glais I., Andrivon D. Does selection by resistant hosts trigger local adaptation in plant–pathogen systems? // J. Evol. Biol. 2006. V. 19. P. 522531.

38.Chowdappa P., Nirmal Kumar B.J., Madhura S., Mohan Kumar S.P., Myers K.L., Fry W.E., Cooke D.E.L. Severe outbreaks of late blight on potato and tomato in South India caused by recent changes in the Phytophthora infestans population // Plant Pathol. 2014. doi 10.1111/ppa.12228

39.Mariette N., Montarry J., Boulard F., Mabon R., Corbière R., Andrivon D. Aggressiveness and genetic structure of French populations of Phytophthora infestans from 2001 to 2008 // Proc. 19th Triennual Conference EAPR2014 (611 July, 2014, Brussels). http://www.eapr.net/eapr-19th-triennial-conference-brussels-belgium-july-2014

40.Saunders D.G.O., Breen S., Win J., Schornack S., Hein I., Bozkurt T.O., Champouret N., Vleeshouwers V.G.A.A., Birch P.R.J., Gilroy E.M., Kamoun S. Host protein BSL1 associates with Phytophthora infestans RXLR effector AVR2 and the Solanum demissum immune receptor R2 to mediate disease resistance // Plant Cell. 2012. V. 24. P. 34203434.

41.Clement J.A.J., Magalon H., Glais I., Jacquot E., Andrivon D. To be or not to be solitary: Phytophthora infestans’ dilemma for optimizing its reproductive fitness in multiple infections // PLoS ONE. 2012. V. 7: e37838.

42.Raffaele S., Kamoun S. Genome evolution in filamentous plant pathogens: why bigger can be better // Nat. Rev. Microbiol. 2012. V. 10. P. 417430.

43.Dong S., Stam R., Cano L.M., Song J., Sklenar J., Yoshida K., Bozkurt T.O., Oliva R., Liu Z., Tian M., Win J., Banfield M.J., Jones A.M.E., van der Hoorn R.A.L., Kamoun S. Effector specialization in a lineage of the Irish Potato Famine pathogen // Science. 2014. V. 343. P. 552555.

44.Дьяков Ю.Т., Еланский С.Н. Популяционная генетика Phytophthora infestans // Микология сегодня / Под ред. Дьякова Ю.Т., Сергеева Ю.В. Москва: Национальная академия микологии, 2007. Т. 1. С. 107139.

45.Birch P.R., Boevink P.C., Gilroy E.M., Hein I., Pritchard L., Whisson S.C. Oomycete RXLR effectors: delivery, functional redundancy and durable disease resistance // Curr. Opin. Plant Biol. 2008. V. 11. P. 373379.

46.Bouwmeester K., Meijer H.J.G., Govers F. At the frontier: RXLR effectors crossing the Phytophthora–host interface // Front. Plant Sci. 2011. V. 2: 75. doi 10.3389/fpls.2011.00075

47.Kale S.D. Oomycete and fungal effector entry, a microbial Trojan horse // New Phytol. 2012. V. 193. P. 874881.

48.Martens C., van de Peer Y. The hidden duplication past of the plant pathogen Phytophthora and its consequences for infection // BMC Genomics. 2010. V. 11: 353. http://www.biomedcentral.com/1471-2164/11/353

49.Vetukuri R.R., Åsman A.K., Jahan S.N., Avrova A.O., Whisson S.C., Dixelius C. Phenotypic diversification by gene silencing in Phytophthora plant pathogens // Commun. Integr. Biol. 2013. V. 6: e25890.

50.Birch P.R., Armstrong M., Bos J., Boevink P., Gilroy E.M., Taylor R.M., Wawra S., Pritchard L., Conti L., Ewan R., Whisson S.C., van West P., Sadanandom A., Kamoun S. Towards understanding the virulence functions of RXLR effectors of the oomycete plant pathogen Phytophthora infestans // J. Exp. Bot. 2009. V. 60. P. 11331140.

51.Rietman H. Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; identification of many new R and Avr genes in Solanum: PhD thesis. Wageningen, The Netherlands: Wageningen University, 2011. 169 p.

52.Bouwmeester K., van Poppel P.M.J.A., Govers F. Genome biology cracks enigmas of oomycete plant pathogens // Molecular Aspects of Plant Disease Resistance / Ed. Parker J.E. Oxford, UK: Wiley-Blackwell, 2009. P. 102134.

53.Wawra S., Agacan M., Boddey J.A., Davidson I., Gachon C.M., Zanda M., Grouffaud S., Whisson S.C., Birch P.R., Porter A.J., van West P. Avirulence protein 3a (AVR3a) from the potato pathogen Phytophthora infestans forms homodimers through its predicted translocation region and does not specifically bind phospholipids // J. Biol. Chem. 2012. V. 287. P. 38 10138 109.

54.Bos J.I.B., Armstrong M.R., Gilroy E.M., Boevink P.C., Hein I., Taylor R.M., Zhendong T., Engelhardt S., Vetukuri R.R., Harrower B., Dixelius C., Bryan G., Sadanandom A., Whisson S.C., Kamoun S., Birch P.R.J. Phytophthora infestans effector AVR3a is essential for virulence and manipulates plant immunity by stabilizing host E3 ligase CMPG1 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. V. 107. P. 99099914.

55.Halterman D.A., Chen Y., Sopee J., Berduo-Sandoval J., Sánchez-Pérez A. Competition between Phytophthora infestans effectors leads to increased aggressiveness on plants containing broad-spectrum late blight resistance // PLoS ONE. 2010. V. 5: e10536.

56.Whisson S.C., Avrova A.O., Boevink P.C., Armstrong M.R., Seman Z.A., Hein I., Birch P.R.J. Exploiting knowledge of pathogen effectors to enhance late blight resistance in potato // Potato Res. 2011. V. 54. P. 325340.

57.Chen Y., Liu Z., Halterman D.A. Molecular determinants of resistance activation and suppression by Phytophthora infestans effector IPI-O // PLoS Pathol. 2012. V. 8: e1002595.

58.Segretin M.E., Pais M., Franceschetti M., Chaparro-Garcia A., Bos J.I., Banfield M.J., Kamoun S. Single amino acid mutations in the potato immune receptor R3a expand response to Phytophthora effectors // Mol. PlantMicrobe Interact. 2014. V. 27. P. 624637.

59.Hein I., Birch P.R.J., Danan S., Lefebvre V., Odeny D.A., Gebhardt C., Trognitz F., Bryan G.J. Progress in mapping and cloning qualitative and quantitative resistance against Phytophthora infestans in potato and its wild relatives // Potato Res. 2009. V. 52. P. 215227.

60.Wang M., Allefs S., van den Berg R.G., Vleeshouwers V.G.A.A., van der Vossen E.A., Vosman B. Allele Mining in Solanum: conserved homologues of Rpi-blb1 are identified in Solanum stoloniferum // Theor. Appl. Genet. 2008. V. 116. P. 933943.

61.Park T.H., Vleeshouwers V.G.A.A., Jacobsen E., Visser R.G.F., van der Vossen E.A.G. Molecular breeding for resistance to Phytophthora infestans in potato // Plant Breed. 2009. V. 128. P. 109117.

62.Tiwari J.K., Siddappa S., Singh B.P., Kaushik S.K., Chakrabarti S.K., Bhardwaj V., Chandel P. Molecular markers for late blight resistance breeding of potato: an update // Plant Breed. 2013. V. 132. P. 237245.

63.Kuang H., Woo S.-S., Meyers B.C., Nevo E., Michelmore R.W. Multiple genetic processes result in heterogeneous rates of evolution within the major cluster disease resistance genes in lettuce // Plant Cell. 2004. V. 16. P. 2870–2894.

64.Kuang H., Wei F., Marano M.R., Wirtz U., Wang X., Liu J., Shum W.P., Zaborsky J., Tallon L.J., Rensink W., Lobst S., Zhang P., Tornqvist C.E., Tek A., Bamberg J., Helgeson J., Fry W., You F., Luo M.C., Jiang J., Buell C.R., Baker B. The R1 resistance gene cluster contains three groups of independently evolving, type I R1 homologues and shows substantial structural variation among haplotypes of Solanum demissum // Plant J. 2005. V. 44. P. 3751.

65.Liu Z., Halterman D. Identification and characterization of RB-orthologous genes from the late blight resistant wild potato species Solanum verrucosum // Physiol. Mol. Plant Pathol. 2006. V. 69. P. 230–239.

66.Jo K.R. Unveiling and deploying durability of late blight resistance in potato: from natural stacking to cisgenic stacking: PhD thesis. Wageningen, The Netherlands: Wageningen University, 2013. 168 p.

67.Rietman H., Bijsterbosch G., Cano L.M., Lee H.R., Vossen J.H., Jacobsen E., Visser R.G., Kamoun S., Vleeshouwers V.G. Qualitative and quantitative late blight resistance in the potato cultivar Sarpo Mira is determined by the perception of five distinct RXLR effectors // Mol. PlantMicrobe Interact. 2012. V. 25. P. 910–919.

68.Tomczynska I., Stefanczyk E., Chmielarz M., Karasiewicz B., Kaminski P., Jones J.D.G., Lees A.K., Sliwka J. A locus conferring effective late blight resistance in potato cultivar Sárpo Mira maps to chromosome XI // Theor. Appl. Genet. 2014. V. 127. P. 647–657.

69.Bradeen J.M., Iorizzo M., Mollov D.S., Raasch J., Kramer L.C., Millett B.P., Austin-Phillips S., Jiang J., Carputo D. Higher copy numbers of the potato RB transgene correspond to enhanced transcript and late blight resistance levels // Mol. PlantMicrobe Interact. 2009. V. 22. P. 437–446.

70.Li Y., van der Lee T.A, Evenhuis A., van den Bosch G.B., van Bekkum P.J., Förch M.G., van Gent-Pelzer M.P., van Raaij H.M., Jacobsen E., Huang S.W., Govers F., Vleeshouwers V.G., Kessel G.J. Population dynamics of Phytophthora infestans in the Netherlands reveals expansion and spread of dominant clonal lineages and virulence in sexual offspring // G3 (Bethesda). 2012. V. 2. P. 1529–1540.

71.Gebhardt C. Bridging the gap between genome analysis and precision breeding in potato // Trends Genet. 2013. V. 29. P. 248256.

72.Haverkort A.J., Struik P.C., Visser R.G.F., Jacobsen E. Applied biotechnology to combat late blight in potato caused by Phytophthora infestans // Potato Res. 2009. V. 52. P. 249–264.

73.Michelmore R.W., Christopoulou M., Caldwell K.S. Impacts of resistance gene genetics, function, and evolution on a durable future // Annu. Rev. Phytopathol. 2013. V. 51. P. 291319.

74.Chapman S., Stevens L.J., Boevink P.C., Engelhardt S., Alexander C.J., Harrower B., Champouret N., McGeachy K., van Weymers P.S.M., Chen X., Birch P.R.J., Hein I. Detection of the virulent form of AVR3a from Phytophthora infestans following artificial evolution of potato resistance gene R3a // PLoS ONE. 2014. V. 9: e110158.

75.Bradshaw J.E. Potato breeding at the Scottish Plant Breeding Station and the Scottish Crop Research Institute: 1920–2008 // Potato Res. 2009. V. 52. P. 141–172.

76.Jo K.R., Kim C.J., Kim S.J., Kim T.Y., Bergervoet M., Jongsma M.A., Visser R.G., Jacobsen E., Vossen J.H. Development of late blight resistant potatoes by cisgene stacking // BMC Biotechnol. 2014. V. 14: 50. http://www.biomedcentral.com/1472-6750/14/50

77.Jones J.D.G., Witek K., Verweij W., Jupe F., Cooke D., Dorling S., Tomlinson L., Smoker M., Perkins S., Foster S. Elevating crop disease resistance with cloned genes // Phil. Trans. R. Soc. B. 2014. V. 369. № 1639. doi 10.1098/rstb.2013.0087

78.Kim H.J., Lee H.R., Jo K.R., Mortazavian S.M., Huigen D.J., Evenhuis B., Kessel G., Visser R.G., Jacobsen E., Vossen J.H. Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes // Theor. Appl. Genet. 2012. V. 124. P. 923–935.

79.Zhu S., Vossen J.H., Bergervoet M., Nijenhuis M., Kodde L., Kessel G.J.T., Vleeshouwers V., Visser R.G.F., Jacobsen E. An updated conventional- and a novel GM potato late blight R gene differential set for virulence monitoring of Phytophthora infestans // Euphytica. 2014. doi 10.1007/s10681-014-1276-0