УДК 581.1

ОСОБЕННОСТИ ВОДНОГО РЕЖИМА ПРИ ПРОРАСТАНИИ СЕМЯН

© 2017 г. Н. В. Обручева1, И. А. Синькевич, С. В. Литягина, Г. В. Новикова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва

Поступила в редакцию 29.07.2016 г.

Жизненная стратегия растений зависит от успешного прорастания семян в заданных внешних условиях, важнейшим из которых является наличие в почве достаточного количества влаги. Рассмотрен вопрос о том, как осуществляются первые этапы прорастания у семян, кардинально отличающихся по своему водному статусу. В качестве основных показателей изучены влажность осевых органов зародыша, пути биогенеза вакуолей в них и участие аквапоринов в транспорте воды. Проведено сравнение двух типов семян: ортодоксальных, которые после созревания высыхают и сохраняют низкую влажность, и рекальцитрантных, которые созревают и опадают, имея высокую влажность, но гибнут при высыхании. У ортодоксальных воздушно-сухих семян кормовых бобов (Vicia faba minor), поддерживающих жизнеспособность при 810% влажности, вакуоли сохранены в виде белок-запасающих вакуолей; при набухании семян происходит мобилизация запасного белка и вакуоли реставрируются. Однако в меристематических, вновь образовавшихся клетках корня, вакуоли возникают из провакуолей. У рекальцитрантных семян конского каштана (Aesculus hippocastanum), имеющих влажность осевых органов 6364%, нет белок-запасающих вакуолей, а сохраняются вакуоли, образованные при созревании. Независимо от типа биогенеза вакуолей, их дальнейшая судьба одинакова: они увеличиваются в объеме и сливаются, формируя осмотический компартмент, что предшествует и обязательно для начала растяжения клеток. До инициации роста вода поступает и передвигается путем диффузии, несмотря на наличие аквапоринов, образующих водные каналы в мембранах. У обоих типов семян водные каналы открываются и интенсивно функционируют после инициации растяжения клеток. Экспрессия генов и состав аквапоринов у кормовых бобов меняются в растягивающихся клетках. Тем самым достигается интенсивное поступление воды в растущие клетки проростка, независимо от различий в уровнях оводненности семян и типах биогенеза вакуолей.

Ключевые слова: Aesculus hippocastanumVicia faba minor – семена – прорастание – биогенез вакуолей – водные каналы – тонопластные аквапорины – водный режим

 

1Адрес для корреспонденции: Обручева Наталья Владимировна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: obroucheva@ippras.ru 

 

Основополагающая роль воды в жизни растений хорошо известна. Вода представляет собой внутреннюю среду для протекания всех метаболических процессов. Она является универсальным растворителем газов (кислорода, углекислоты, этилена) и других метаболитов, а также средой для их передвижения. Водная среда связывает все внутриклеточные компартменты, представляя собой тем самым коммуникационную среду. Оводненность тканей обеспечивает их тургесцентность и осмотичность. От уровня гидратации зависит не только доставка растворенных субстратов к молекулам ферментов, но и активная конфигурация самих ферментов и других белков. Не менее важна достаточная оводненность для более сложных конформационных изменений белков в субклеточных структурах во время их биогенеза.

Приведенные закономерности особенно важны при прорастании семян, поскольку вода является не только обязательным условием, но и триггером прорастания [1]. Во время набухания семян при повышении оводненности последовательно до пороговых для каждого процесса уровней начинают функционировать основные процессы метаболизма [2]. Так, первичная активация дыхания за счет гликолиза и цикла Кребса, а также аминокислотный метаболизм начинаются, главным образом, при достижении 18–20% влажности, что достигается приобретением активной конформации соответствующими ферментами при наличии субстратов и их успешной доставке. Дальнейшее повышение оводненности до 45% приводит к завершению митохондриогенеза и, следовательно, к повышению интенсивности дыхания до максимальной. В интервале влажности 45–55% начинается транскрипция, а такие сложные органеллы как рибосомы приобретают активную конфигурацию и начинают функционировать. В белковых телах и амилопластах становится возможным гидролиз запасных соединений. Таким образом, к тому времени, когда влажность достигнет 60%, в семенах уже активирован и функционирует основной метаболизм. 

Следует отметить три физиологические особенности 60%-ного уровня оводненности. Во-первых, такая влажность достигается при наличии воды автоматически, то есть набухание семени, как и любого капиллярно-пористого тела, в котором много гидрофильных соединений, происходит за счет матричных сил. До такого же уровня набухают и "мертвые" семена. Следовательно, основной метаболизм в семенах начнется обязательно, если вода доступна. Во-вторых, такая влажность поддерживается в семядолях, что обычно определяет общую влажность семени, но ее недостаточно для начала роста в осевых органах зародыша. В-третьих, 60% оводненность характерна для меристематических клеток, а более высокая влажность указывает на присутствие вакуолей.

Для инициации растяжения клеток при прорастании необходимо поступление дополнительных количеств воды благодаря накоплению в осевых органах эндогенных осмотиков на фоне активированного основного метаболизма. В свою очередь, поступление воды сопровождается формированием вакуолей как осмотического компартмента, и приводит к повышению тургорного давления на клеточные стенки, имеющие разрыхленную структуру [1, 2]. Так начинается растяжение клеток в осевых органах, проявляющееся в проклевывании корешка через семенную кожуру и обеспечивающее начало прорастания.

Такой ход запуска процессов при подготовке прорастания типичен для обычных (ортодоксальных) семян, которые в зрелом состоянии теряют воду, хранятся в воздушно-сухом состоянии и набухают от влажности 8–10% до влажности, при которой начнется прорастание. Другая категория семян, так называемые рекальцитрантные (“непослушные”) семена, в зрелом состоянии поддерживают высокую оводненность (влажность семян 40–50%, влажность осевых органов 55–65%); при высыхании они погибают. Зрелые семена быстро набухают до уровня, необходимого для прорастания. Таким образом, у рекальцитрантных семян осевые органы сохраняют состояние метаболической готовности, позволяющей быстро начаться прорастанию при наличии доступной воды [3]. 

При сравнении кардинально отличающихся по водному статусу ортодоксальных и рекальцитрантных семян можно проследить его особенности при подготовке и инициации растяжения клеток в прорастающих семенах. Примерами таких двух типов семян являются кормовые бобы (Vicia faba minor L.) и конский каштан (Aesculus hippocastanum L.). Оба вида семян отличаются тем, что прорастание в них происходит только путем растяжения клеток, тогда как деления в осевых органах начинаются гораздо позже. Тем самым они представляют собой удобную модель для изучения начала прорастания [1, 3]. Различия в их водном статусе в зрелом состоянии заключаются не только в разных уровнях оводненности, но и в распределении воды внутри клеток, проявляющемся в различной вакуолизации. Изучение биогенеза вакуолей важно, так как они выполняют роль резервуара воды в клетке и ее осмотического компартмента, и тем самым необходимы для начала растяжения клеток. Понятно, что наличие и увеличение объема вакуоли предшествует инициации растяжения клеток. К концу растяжения центральная вакуоль занимает бóльшую часть объема клетки, оттеснив цитоплазму к периферии.

Для характеристики водного режима при прорастании семян следует рассмотреть также вопрос о способах транспорта воды в клетках осевых органов. Поступление воды в цитоплазму и вакуоль может происходить в результате диффузии молекул и в результате их прохождения по мембранным водным каналам, образованным белками аквапоринами. Этот способ обеспечивает в десятки раз более быстрое продвижение молекул воды через мембраны, а именно через плазмалемму и тонопласт. Интенсивное поступление воды по водным каналам присуще растягивающимся клеткам различных органов [4].

Ниже сравнивая прорастание семян с различным водным статусом, рассмотрим такие компоненты водного режима семян, как влажность осевых органов, биогенез вакуолей в них, а также механизм транспорта воды в связи с инициацией растяжения клеток.

 

Оводненность и инициация роста в осевых органах ортодоксальных и рекальцитрантных семян

Различия в водном статусе ортодоксальных семян кормовых бобов и рекальцитрантных семян конского каштана наглядно видны при сравнении кривых влажности набухающих непокоящихся семян (рис. 1). У семян бобов повышение влажности осевых органов при набухании до начала прорастания происходит в результате медленного поступления воды в семя как в воздушно-сухое капиллярно-пористое тело, содержащее гидрофильные компоненты (белки, полимеры клеточных стенок), до влажности примерно 60%; дальнейшее поглощение воды происходит в результате накопления эндогенных осмотиков [1, 5]. Эти семена прорастают при влажности в осевых органах 72–73%.

Осевые органы семян каштана при опадении имеют высокую влажность (64–65%). Диапазон повышения влажности у них гораздо меньше, чем у ортодоксальных семян. При набухании до проклевывания (74%) вода также поглощается за счет разницы в осмотическом давлении, а основным осмотиком является сахароза, доминирующая как запасное вещество [3, 6]. Общее свойство этих семян – ускоренное поглощение воды после начала роста, когда происходит интенсивное растяжение клеток в осевых органах.

Прорастание семян происходит в результате растяжения клеток осевых органов. У семян кормовых бобов и каштана тип прорастания гипогеальный (подземный), то есть семядоли не выносятся наверх, а остаются вместе с гипокотилем под землей. Гипокотиль играет роль не только подземного запасающего органа, но и органа, в котором начинается прорастание. Растяжение клеток начинается в верхних клетках гипокотиля и распространяется постепенно вниз на корешок [7]. Увеличения длины клеток в верхней части гипокотиля достаточно для проталкивания не растущего кончика корня через семенные покровы. Так происходит инициация роста в осевых органах, регистрируемая обычно как наклевывание семени (проклевывание корешка). Постепенно к растяжению переходят нижележащие клетки гипокотиля, а затем, уже после начала прорастания, начинается растяжение базальных клеток корня. Понятно, что вакуолизация клеток, предшествующая началу растяжения, происходит сначала в гипокотиле, а потом в корешке.

 

Биогенез вакуолей в осевых органах семян при прорастании

Проблеме биогенеза вакуолей в растительных клетках сейчас уделяется много внимания, в частности, такой модели как образование вакуолей в осевых органах зародыша при прорастании семян. Достаточно долго существовало представление о том, что в одной клетке существуют одновременно два типа вакуолей: белок-запасающие вакуоли (protein-storage vacuoles), которые раньше называли “белковыми телами”, и литические вакуоли, содержащие кислые гидролазы. Предполагалось, что сливаясь между собой, они дают начало центральной вакуоли. Однако в последние годы установлено, что в зародыше прорастающего семени исходно имеется только один тип – белок-запасающие вакуоли [8–10]. Они обнаружены во время эмбриогенеза к концу стадии торпедо [8], тогда как литических вакуолей не наблюдалось [11]. Белок-запасающие вакуоли интенсивно образуются из вакуолей в период созревания семян вследствие отложения в них запасных белков и вытеснения воды, и сохраняются в сухих семенах ортодоксального типа. При набухании и прорастании семян в них происходит гидролиз запасных белков, затем такие вакуоли сливаются и дают начало центральной вакуоли, имеющей кислый рН, характерный для литических вакуолей.

Один из способов изучения биогенеза вакуолей в прорастающих семенах – использование белка-маркера аквапорина TIP3 (ранее α-TIP), характерного для тонопластов белок-запасающих вакуолей (14, 15), и маркера литических вакуолей – тонопластного аквапорина TIP1;1 (ранее γ-TIP) [12]. На корнях прорастающих семян арабидопсиса [8], табака [10], ячменя и гороха [9] показано, что α-ТIP/TIP3 присутствует в белок-запасающих вакуолях зрелых сухих семян, в начале прорастания α-ТIP/TIP3 исчезает и заменяется в них же на γ-TIP/TIP1;1, считающийся маркером литических вакуолей и характерным для вакуолизированных клеток [13, 14]. Тем самым был подтвержден путь превращения белок-запасающих вакуолей в вакуоли растущих клеток при прорастании ортодоксальных семян. Этот путь, по-видимому, не является видоспецифичным, поскольку одинаков в белок-запасающих вакуолях гороха и ячменя [9]. Следует отметить возможность тканевой специфичности, связанной с наличием или отсутствием глобоидов внутри белок-запасающей вакуоли и с различиями в участии тонопласта в слиянии и захвате участков цитоплазмы [10].

Представляло интерес сравнить биогенез вакуолей в прорастающих ортодоксальных и рекальцитрантных семенах, а именно: в кормовых бобах [15] и конском каштане [7]. Их прорастание осуществляется по гипогеальному типу, при котором в зародышевой оси первыми начинают растягиваться клетки гипокотиля (см. выше). В обоих случаях прорастание начинается путем растяжения клеток, чему предшествует их вакуолизация. Однако сам биогенез вакуолей в них отличается кардинально.

У гипокотилей набухающих кормовых бобов гомогенный электронно-плотный матрикс в белок-запасающих вакуолях, приобретает сначала хлопьевидную структуру, указывающую на распад белков, а затем становится электронно-прозрачным при полной деградации белков, что характерно для вакуолей (рис. 2а, 2б). У кормовых бобов в белок-запасающих вакуолях нет глобоидов [16], а их запасные белки представлены преимущественно глобулинами, точнее, легумином. Протеолиз запасных белков начинается при достижении зародышевыми осями влажности 45–55% [1] и осуществляется имеющимися в белок-запасающих вакуолях протеиназами [17]. В интервале влажности 55–65% происходит протеолиз легумина [18], в котором принимают участие эндопептидазы, доставляемые из цитоплазмы [17]. Когда влажность приближается к 68% видны уже вакуоли, и при дальнейшем подъеме влажности происходит их увеличение и слияние (рис. 2в, 2г). Вакуолизация начинается в верхних клетках гипокотиля и постепенно распространяется по нему в направлении корня.

В корешках зародышей кормовых бобов такие белок-запасающие вакуоли имеются в базальных, примыкающих к гипокотилю клетках, и вакуолизация начинается с них. Однако в ниже расположенных клетках меристемы, когда они начинают делиться, то есть во вновь образованных клетках корня, белок-запасающих вакуолей нет, и наблюдается иной путь образования вакуолей, а именно появление множественных мелких провакуолей (рис. 2д). В дальнейшем, они увеличиваются в размерах и сливаются (рис. 2е, 2ж). Можно заключить, что в пролиферирующих меристематических клетках корня формирование вакуолей начинается с образования провакуолей, а далее их биогенез идет обычным путем.

Таким образом, в зародыше кормовых бобов образование вакуолей происходит двумя способами: в гипокотиле – из белок-запасающих вакуолей, а в меристеме корня – из провакуолей. И в корнях, и в гипокотилях кормовых бобов образовавшиеся вакуоли затем увеличиваются в объеме, сливаются и дают начало центральной вакуоли.

Следует отметить, что и при эпигеальном прорастании семян, при котором первым начинает расти корешок, многочисленные белок-запасающие вакуоли в клетках корня превращаются в вакуоли так же, как это происходит в гипокотиле при гипогеальном прорастании [8–10]. При эпигеальном прорастании в кончике корня овса также наблюдалось образование провакуолей, в котором участвовали везикулы аппарата Гольджи и эндоплазматического ретикулума, причем в последних отмечалось даже присутствие субъединиц вакуолярной АТФазы [19].

Возможность и пути de novo образования провакуолей были рассмотрены ранее [20]. Высказано предположение, что провакуоли могут возникнуть из лагун эндоплазматического ретикулума и/или везикул аппарата Гольджи. В настоящее время более принята гипотеза об образовании провакуолей в субдоменах эндоплазматического ретикулума [21]. Реалистичность такого пути биогенеза вакуолей из провакуолей в меристематических клетках корня, подтверждается тем, что в растущих корнях клетки меристемы не содержат белок-запасающих вакуолей, а для них типично наличие мелких вакуолей, совокупность которых цитологи называют вакуом. На других семенах, например, в прорастающих семенах арабидопсиса были обнаружены, но не идентифицированы точечные ярко флуоресцирующие структуры в цитоплазме кончика корня, содержащие либо TIP1;1/γ-ТIP [22], либо такие аквапорины тонопласта, как α-ТIP, γ-ТIP и δ-ТIP [8].

Что касается рекальцитрантных семян, судьба вакуолей, образовавшихся в зародышевой оси, резко отличается от ортодоксальных семян [3]. В гипокотилях и корешках зародышей каштана нет белок-запасающих вакуолей, а сохраняются вакуоли, возникшие при созревании (рис. 3). Очевидно, это связано с тем, что основным запасным веществом у рекальцитрантных семян является сахароза [3]. О сохранности вакуолей свидетельствует их окрашиваемость красителем нейтральным красным и данные электронной микроскопии [7]. Их тонопласт содержит аквапорины TIP3 и TIP1 и ε-субъединицу вакуолярной АТФазы. Вакуоли сохраняются как в гипокотиле, так и в корешке даже во время покоя семян и выхода из покоя. При прорастании такие вакуоли увеличиваются в размерах, сливаются и формируют в растущих клетках центральную вакуоль.

Таким образом, в осевых органах прорастающих семян вакуоли могут образовываться из белок-запасающих вакуолей, из провакуолей (оба – у ортодоксальных семян), тогда как у рекальцитрантных семян вакуоли сохраняются без изменений. Следовательно, способ биогенеза вакуолей определяется, скорее, высокой оводненностью после опадения рекальцитрантных семян или сохранением вакуоли в виде белок-запасающей вакуоли при высыхании ортодоксальных семян, у которых de novo образование вакуолей в меристематических клетках растущих корней происходит из провакуолей.

 

Транспорт воды в прорастающих семенах

Благодаря открытию водных каналов, формируемых белками аквапоринами, встал вопрос о механизмах транспорта воды в зародыше семени. Ранее предполагалось, что вода поступает и передвигается внутри семян путем диффузии, тогда как, благодаря водным каналам, в 1020 раз увеличивается гидравлическая проводимость мембран и их осмотическая проницаемость для воды [23]. Если водные каналы открыты, то облегчен внутри- и трансклеточный транспорт воды. Он происходит пассивно по градиенту осмотического потенциала, без затраты энергии, и может осуществляться в прямом и обратном направлении.

Само вхождение воды в клетку осуществляется через водные каналы, образованные аквапоринами плазмалеммы (PIP), тогда как поступление избытка воды в вакуоль, осмотическая проницаемость которой гораздо выше, происходит через каналы, состоящие из тонопластных аквапоринов (TIP) [24, 25]. Таким образом, в организации водного транспорта важна функциональная активность аквапоринов, а не только их присутствие как маркеров того или иного состояния вакуолей.

Экспрессия генов аквапоринов, а также изменения содержания кодируемых ими белков отмечены в формирующихся семенах и активно происходят при созревании семян, вследствие чего ортодоксальные воздушно-сухие семена содержат заметные количества аквапоринов [4, 26, 27], в первую очередь, белка TIP3/α- TIP в тонопласте белок-запасающих вакуолей.

В сухих семенах арабидопсиса показана лишь крайне слабая экспрессия PIP1;2. Напротив, гены TIP3 и TIP5 транскрибируются очень активно. Через два дня после проклевывания картина меняется: транскрипция нескольких изоформ PIP1 и PIP2, а также TIP1;1, TIP1;2 и TIP2;1 существенно возрастает, тогда как экспрессия TIP3 и TIP5 падает практически до нуля [28]. В отличие от TIP3 белки PIP1, PIP2 и TIP1 обнаруживаются только через сутки после проклевывания. То есть, у арабидопсиса только белок TIP3 имеется с начала набухания и исчезает после 60 ч, когда семена прорастают. Белки PIP1, PIP2 и TIP1 выявляются, начиная с 60 ч вплоть до 84 ч. Стоит отметить, что даже после такого детального исследования осталось не вполне понятным, как обнаруженное крайне низкое содержание изоформ аквапоринов семейства PIP обеспечивает активное поступление воды на ранних стадиях прорастания семян арабидопсиса.

Изменение состава транскриптов PIP наблюдалось и в семенах риса Oryza sativa [29]. Анализ изменения экспрессии всех 11 генов OsPIP показал, что в отличие от большинства генов OsPIP, транскрипция которых наиболее высока при наклевывании семян, но снижается сразу после проклевывания, экспрессия OsPIP2;2 и OsPIP2;6 увеличивается по мере прорастания семени и поддерживается на высоком уровне и после прорастания [29]. Такой характер экспрессии генов OsPIP позволяет заключить, что специфические изоформы PIP могут играть собственную роль в ходе прорастания семян. 

Динамика транскрипции генов аквапоринов детально изучена и для других ортодоксальных семян – кормовых бобов, у которых проанализированы изменения в составе транскриптов именно в осевых органах зародыша [15]. На рис. 4 показана динамика экспрессии генов PIP и TIP при набухании и прорастании семян кормовых бобов, у которых экспрессия VfPIP2;1 практически не изменялась. Обращает на себя внимание многократное снижение и даже прекращение транскрипции генов VfTIP3;1 и VfTIP3;2, связанное с описанным выше превращением белок-запасающих вакуолей в обычную вакуоль. Постепенно усиливается транскрипция гена VfTIP1;1, но особенно сильно после начала роста возрастает транскрипция генов VfTIP2;1 и VfTIP2;2. Эти данные находятся в соответствии с иммунохимической идентификацией белков аквапоринов в набухающих и прорастающих семенах кормовых бобов (рис. 5). При сохранении белка PIP1, наблюдается сначала присутствие в набухающих семенах белка TIP3, который затем, вероятно, деградирует при проклевывании (инициации роста). Обратная картина имеет место для белка TIP1, который выявляется при проклевывании и далее накапливается.

В осевых органах рекальцитрантных семян конского каштана [7] установлено присутствие двух белков аквапоринов плазмалеммы (PIP1 и PIP2) и двух аквапоринов тонопласта (TIP 3;1 и TIP2) не только при опадении семян, но и в набухающих, начинающих рост (при проклевывании) и растущих осевых органах (рис. 6). Таким образом, при прорастании не наблюдается смены состава аквапоринов. Выше уже было отмечено, что в осевых органах конского каштана нет белок-запасающих вакуолей, а вакуоли, образовавшиеся при созревании семян, сохраняются при прорастании. Этим объясняется тот факт, что аквапорин TIP3/α-TIP не деградирует при прорастании. Более того, в осевых органах каштана постоянно присутствует аквапорин TIP2/γ-TIP, характерный для вакуолей растянувшихся клеток [14]. Сохранность аквапорина TIP3 указывает на то, что его правильнее считать маркером тонопласта вакуолей созревающих семян, чем маркером тонопласта белок-запасающих вакуолей.

Таким образом, в осевых органах и ортодоксальных, и рекальцитрантных семян до прорастания присутствуют аквапорины как плазмалеммы, так и тонопласта. Однако этот факт еще не указывает на функционирование водных каналов, поскольку они могут находиться в закрытом состоянии и не участвовать в транспорте воды.

Способность водных каналов быстро пропускать воду была оценена при помощи широко используемого теста на подавление поглощения воды осевыми органами при действии ионов ртути (HgCl2), которое может быть “снято” посредством восстановления дитиотреитолом (ДТТ) [25, 30, 31]. На рис. 7а и 7б приведены результаты такого теста для осевых органов кормовых бобов при проклевывании и при росте соответственно [15], а на рис. 7в и 7г – аналогичные данные для конского каштана [7]. У обоих типов семян поглощение воды интенсивно растущими осевыми органами ингибируется ионами ртути, и этот эффект снимается ДТТ. Это указывает на то, что водные каналы открыты и участвуют в передвижении воды. Реакция осевых органов в момент проклевывания иная: у кормовых бобов нет достоверного ингибирования ионами ртути поглощения воды (рис. 7а), а у каштана (рис. 7в) нет восстановления ДТТ поступления воды. Следовательно, водные каналы функционируют только после проклевывания, то есть тогда, когда клетки осевых органов начинают и продолжают растягиваться. Хотя предложено несколько механизмов, влияющих на открывание и закрывание водных каналов [31], основным механизмом открывания считается фосфорилирование Са2+-зависимыми протеинкиназами, а закрывания  дефосфорилирование при помощи протеинфосфатаз [32].

Поступление воды в осевые органы семян до проклевывания происходит без участия водных каналов, как следует из приведенных данных для обоих типов семян. В опытах с инкубацией целых семян арабидопсиса показано, что ингибирование поглощения воды в растворе HgCl2 начинается с момента проклевывания семян, что также позволяет предположить, что аквапорины не участвуют в поглощении воды в период, предшествующий началу роста осевых органов [28]. У целых семян гороха, имеющих высокую всхожесть, набухание до 20 ч, по-видимому, также происходило без участия аквапоринов, так как ртуть-содержащий препарат не влияет на динамику поступления воды. Предполагается, что закрывание каналов происходит в самом начале набухания и каналы можно открыть под действием ингибитора фосфатаз NaF [33, 34].

Следовательно, на основании анализа прорастания не только целых семян, но и осевых органов зародыша было показано, что до инициации роста вода проникает через мембраны путем диффузии, несмотря на наличие в семенах аквапоринов. Только после начала прорастания водные каналы открываются и могут начинать функционировать. 

Водный статус, прорастание и рост осевых органов растяжением

Суммируя приведенные данные, можно заключить, что при прорастании водный статус ортодоксальных и рекальцитрантных семян складывается по-разному, но нацелен на общую задачу – обеспечить интенсивное поступление воды в растущие клетки проростка. Осевым органам ортодоксальных семян, которые сохраняют жизнеспособность в воздушно-сухом состоянии при низкой влажности, нужно поглотить воду, чтобы достичь оводненности около 60%, при которой активируется метаболизм и может начаться подготовка к прорастанию, тогда как семена конского каштана сохраняют такую влажность осевых органов после опадения, что обеспечивает возможность их быстрого прорастания. У ортодоксальных семян сохранение жизнеспособности в состоянии низкой оводненности предусматривает использование вакуолей в качестве хранилища запасного белка. При набухании необходима реставрация вакуолей, что обеспечивает в самом гипокотиле (при гипогеальном прорастании) или в зародышевом корне (при эпигеальном прорастании) мобилизацию запасного белка и возобновление функционирующих вакуолей как осмотического компартмента. В корне во вновь образованных клетках меристемы, ввиду отсутствия белковых тел, вакуоли формируются de novo из провакуолей, образовавшихся из лагун эндоплазматического ретикулума, возможно с участием везикул аппарата Гольджи. У рекальцитрантных семян вакуоли сохранены и как структуры, и как готовые функционировать органеллы. 

Таким образом, независимо от способа биогенеза, вакуоли участвуют в подготовке начала растяжения клеток, то есть в инициации прорастания. Роль вакуолей в осевых органах зародыша заключается, с одной стороны, в создании и поддержании осмотического компартмента, от которого зависит дальнейшее поступление воды в клетку, а с другой стороны, в обеспечении тургорного давления, оказываемого через цитоплазму на клеточные стенки, подвергшиеся структурной модификации, и приводящего к разрыхлению полимеров и увеличению объема клетки.

Общее свойство водного статуса ортодоксальных и рекальцитрантных семян заключается в том, что поступление воды во время набухания происходит путем диффузии через мембраны, а имеющиеся водные каналы остаются закрытыми. В растущие осевые органы вода поступает гораздо быстрее, чем при проклевывании (3.5 и 0.5 мг/ч, соответственно, у кормовых бобов, и 25 и 6 мг/ч у более массивных осевых органов каштана) (рис. 7). Интенсивное растяжение клеток напрямую зависит от быстрого поступления воды в растущие клетки, что обеспечивается работой открытых водных каналов. 

Экспрессия генов вакуолярных аквапоринов крайне существенно возрастает после инициации растяжения клеток в осевых органах (рис. 4). Это можно еще раз продемонстрировать на примере зоны растяжения в корне кукурузы (Zea mays L.) [35]. При переходе клеток к растяжению ZmTIP1;1 экспрессировался в несколько раз эффективнее, по сравнению с генами ZmPIP1;2 и ZmPIP2;4. Затем в самой зоне растяжения во много раз усиливалась экспрессия обоих генов PIP, на фоне высокого уровня экспрессии ZmTIP1;1.

Вслед за началом бурного образования мРНК аквапоринов может происходить активный синтез белков аквапоринов и образование новых водных каналов в растягивающихся клетках. В начавших расти клетках меняется состав аквапоринов и преимущественно накапливаются аквапорины, характерные для вакуолизированных и зрелых клеток. Тем самым будет обеспечено интенсивное поступление воды в растянувшиеся и зрелые клетки.

 Такая стимуляция растяжения клеток гарантирует контакт растущего корня с фронтом почвенной влаги и возможность не терять контакта с ним при весенней засухе. Вместе с тем обеспечивается передвижение воды в надземные органы, рост которых начинается после начала роста подземных органов, что в свою очередь, определит успешный рост проростка.

Работа выполнена при частичной поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, грант № 14-04-31609 (Синькевич И.А., Литягина С.В.) и Российского научного фонда, грант № 14-24-00020 (Г.В. Новикова).

 

 

 

 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Obroucheva N.V. Seed germination: a guide to the early stages. Backhuys Publishers: Leiden, 1999.

2. Обручева Н.В. Переход от гормональной к негормональной регуляции на примере выхода семян из покоя и запуска прорастания // Физиология растений. 2012. Т. 59. С. 591–600.

3. Obroucheva N., Sinkevich I., Lityagina S. Physiological aspects of seed recalcitrance: a case study on the tree Aesculis hippocastanum. // Tree Physiology. 2016. 

4. Обручева Н.В., Синькевич И.А. Аквапорины и рост // Физиология растений. 2010. Т. 57. С. 163–176.

5. Обручева Н.В., Антипова О.В. Физиология инициации прорастания семян // Физиология растений. 1997. Т. 44. С. 287–302.

6. О6ручева Н.B., Литягина C.B., Рихтер А. Динамика углеводов в осевых органах семян конского каштана при переходе от покоя к прорастанию // Физиология растений. 2006. Т. 53. С. 869–879.

7. Obroucheva N.V., Lityagina S.V., Novikova G.V., Sinkevich I.A. Vacuolar status and water relations in embryonic axes of recalcitrant Aesculus hippocastanum seeds during stratification and early germination // AoB Plants. 2012. pls008; doi 0.1093/aobpla/pls008. P. 1–14.

8. Hunter P.R., Craddock C.P., Benedetto S.D., Roberts L.M., Frigerio L. Fluorescent reporter proteins for the tonoplast and the vacuolar lumen identify a single vacuolar compartment in Arabidopsis cells // Plant Physiol. 2007. V. 145. P. 1371–1382.

9. Olbrich A., Hillmer S., Hinz G., Oliviusson P., Robinson D.G. Newly formed vacuoles in root meristems of barley and pea seedlings have characteristics of both protein storage and lytic vacuoles // Plant Physiol. 2007. V. 145. P. 1383–1394.

10. Zheng H., Staehelin L.A. Protein storage vacuoles are transformed into lytic vacuoles in root meristematic cells of germinated seedlings by multiple, cell– type specific mechanisms // Plant Physiol. 2011. V. 155. P. 2023–2035.

11. Otegui M.S., Herder R., Schulze J., Jung R., Staehelin L.A. The proteolytic processing of seed storage proteins in Arabidopsis embryo cells starts in the multivesicular bodies // Plant Cell. 2006 V. 18. P. 2567–2581.

12. Jauh G.Y., Phillips T.E., Rogers J.C. Tonoplast intrinsic protein isoforms as markers for vacuolar functions // Plant Cell. 1999. V. 11. P. 1867–1882.

13. Ludevid D., Höfte H., Himelblau E., Chrispeels M.J. The expression pattern of tonoplast intrinsic protein γ–TIP in Arabidopsis thaliana is correlated with cell enlargement // Plant Physiol. 1992. V. 100. P. 1633–1639.

14. Karlsson M., Johansson I., Bush M., McCann M., Maurel C., Larsson C., Kjellbom P. An abundant TIP expressed in mature highly vacuolated cells // Plant J. 2000. V. 21. P. 83–90.

15. Novikova G., Tournaire-Roux C., Sinkevich I., Lityagina S., Maurel C., Obroucheva N. Vacuolar biogenesis and aquaporin expression at early germination of broad bean seeds // Plant Physiol. Biochem. 2014. V. 82. P. 123–132.

16. Weber E., Neumann D. Protein bodies, storage organelles in plant seeds // Biochemie und Physiologie der Pflanzen. 1980. V. 175. P. 279–306.

17. Muntz K., Belozersky M.A., Dunaevsky Y.E., Schlereth A., Tiedermann J. Stored proteinases and the initiation of storage protein mobilization in seeds during germination and seedling growth // J. Exp. Bot. 2001. V. 52. P. 1741–1752.

18. Lichtenfeld C., Manteuffel R., Muntz K., Neumann D., Scholz C., Weber E. Protein degradation and proteolytic activities in germinating field beans (Vicia faba L., var. minor) // Biochemie und Physiologie der Pflanzen. 1979. V. 174. P. 255–274.

19. Herman E.M., Li X., Su R.T., Larsen P., Hsu Ht., Sze H. Vacuolar–type H+–ATPases are associated with the endoplasmic reticulum and provacuoles of root tip cells // Plant Physiol. 1994. V. 106. P. 1313–1324.

20. Marty F. Plant vacuoles // Plant Cell. 1999. V. 11. P. 587–600.

21. Viotti C. ER and vacuoles: never been closer // Frontiers in Plant Sci. 2014 V. 5. P. 1–7.

22. Bolte S., Lanquar V., Soler M.-N., Beebo A., Satiat–Jeunemaitre B., Bouhidel K., Thomine S. Distinct lytic vacuolar compartments are imbedded inside the protein storage vacuole of dry and germinating Arabidopsis thaliana seeds // Plant Cell Physiol. 2011. V. 52. P. 1142–1152.

23. Maurel C., Javot H., Lauvergeat V., Gerbeau P., Tournaire C., Santoni V., Heyes J. Molecular physiology of aquaporins in plants // Int. Rev. Cytol. 2002. V. 215. P. 105–148.

24. Трофимова М.С., Жесткова И.М., Андреев И.М., Свинов М.М., Бобылев Ю.С., Сорокин Е.М. Осмотическая водная проницаемость вакуолярных и плазматических мембран, изолированных из корней кукурузы // Физиология растений. 2001. Т. 48. С. 341–348.

25. Javot H., Maurel C. The role of aquaporins in root water uptake // Ann. Bot. 2002. V. 90. P. 301–313.

26. Maurel C., Chrispeels M.J., Lurin C., Tacnet F., Geelen D., Ripoche P., Guern J. Function and regulation of seed aquaporins // J. Exper. Bot. 1997. V. 48. P. 421– 430.

27. Obroucheva N.V. Aquaporins in seeds // Seed Science Research. 2013. V. 23. P. 213–216.

28. Vander Willigen V.C., Postaire O., Tournaire–Roux C., Boursiac Y., Maurel C. Expression and inhibition of aquaporins in germinating Arabidopsis seeds // Plant Cell Physiol. 2006. V. 47. P. 1241–1250.

29. Liu H.Y., Yu X., Cui D.Y., Sun M.H., Sun W.N., Tang Z.C., Su W.A. The role of water channel proteins and nitric oxide signaling in rice seed germination // Cell Research. 2007. V. 17. P. 638–649.

30. Maurel C., Verdoucq L., Luu D.T., Santoni V.P. Plant aquaporins. Membrane channels with multiple integrated functions. Ann. Rev. Plant Biol. 2008. V. 59. P. 595–624.

31. Barrouclough D., Peterson C., Steudle E. Radial hydraulic conductivity along developing onion roots // J. Exp. Bot. 2000. V. 51. P. 547–557.

32. Chaumont F., Moshelion M., Daniels M.J. Regulation of plant aquaporin activity // Biol. Cell. 2005. V. 97. P. 749–764.

33. Bеселова Т.В., Веселовский В.А. Возможность участия аквапоринов в поглощении воды семенами гороха разного качества // Физиология растений. 2006. Т. 53. С. 106–112.

34. Веселовский В.А., Веселова Т.В. Нарушение функции аквапоринов клеточных мембран как причина изменения всхожести семян гороха при действии γ–излучения в малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология. 2007. Т. 47. С. 28–33. 

35. Hukin D., Doering Saad C., Thomas C.R., Pritchard J. Sensitivity of cell hydraulic conductivity to mercury is coincident with symplasmic isolation and expression of plasmalemma aquaporin genes in growing maize roots // Planta. 2002. V. 215. P. 1047–1056.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

 

Рис. 1. Влажность осевых органов при набухании. 1 – кормовых бобов, 2 – конского каштана. Стрелка обозначает проклевывание (инициацию роста).

Рис. 2. Вакуолизация клеток осевых органов кормовых бобов при прорастании. (а) – (г) гипокотиль; (д) – (ж) проклюнувшийся корешок. (а) – белок-запасающие вакуоли в начале набухания; (б) – реставрация вакуоли из белок-запасающей вакуоли; (в) – образовавшиеся вакуоли; (г) – слияние вакуолей; (д) – новообразование вакуолей в меристематических клетках; (е) – провакуоли и вакуоли; (ж) – слияние вакуолей. Стрелки показывают мелкие провакуоли. в – вакуоль, бзв – белок-запасающая вакуоль, пв – провакуоль. 

Рис. 3. Вакуоли в клетках осевых органов конского каштана при прорастании. (а) – гипокотиль в набухающем семени; (б) – гипокотиль при проклевывании; (в) – корешок при проклевывании; (г) – корешок, растущий после проклевывания. в – вакуоль, кс – клеточная стенка, я – ядро, м – митохондрия. 

Рис. 4. Экспрессия генов тонопластных аквапоринов в осевых органах прорастающих семян кормовых бобов.

 Проклевывание семян – в 24 ч, сроки 39 ч и 54 ч относятся к растущим осевым органам длиной 1 и 2 см. 

Рис. 5. Идентификация (вестерн-блоттинг) плазмалеммных (PIP) и тонопластных (TIP) аквапоринов в осевых органах прорастающих семян кормовых бобов. Цифры над блотами означают: 1 – 12 ч набухания; 2 – 16 ч набухания; 3 – наклевывание; 4 – растущие осевые органы длиной 1 см. 

Рис. 6. Идентификация (вестерн-блоттинг) плазмалеммных (PIP) и тонопластных (TIP) аквапоринов в осевых органах прорастающих семян конского каштана. Цифры над блотами означают: 1 – опавшие семена; 2 – семена перед наклевыванием; 3 – наклевывание семян.

Рис. 7. Тест с применением ионов ртути на участие водных каналов в поглощении воды осевыми органами прорастающих семян. (а) и (б) – кормовые бобы, (в) и (г) – конский каштан. (а) и (в) – поглощение воды при наклевывании; (б) и (г) – поглощение воды растущими осевыми органами ((б) – длиной 1 см, (г) – длиной 3 см). Стрелка показывает перенос осевых органов из раствора сулемы в раствор восстановителя дитиотреитола. По оси ординат – поглощение воды в мг на осевые органы одного семени.