УДК 581.1 

СИСТЕМНАЯ ЗАЩИТА РИСА ОТ ПИРИКУЛЯРИОЗА С ПОМОЩЬЮ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ

© 2017 г. А. А. Аверьяновa, 1 , Т. Д. Пасечникa, В. П. Лапиковаa, Т. С. Романоваa, 

К. Дж. Бейкерb

a Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии, Большие Вяземы, Московская обл.

b Лаборатория молекулярной патологии растений, Служба сельскохозяйственных исследований Департамента сельского хозяйства США, Белтсвил, Мериленд, США

Поступила в редакцию 10.06.2016 г.

Системная болезнеустойчивость растений может быть индуцирована экзогенными активными формами кислорода или их источниками. Некоторые вещества (фотосенсибилизаторы) продуцируют АФК за счет энергии света. Из них в данной работе испытаны фотодинамические красители бенгальский розовый и метиленовый синий, образующие синглетный кислород, и меркаптопиридин-N-оксид, образующий гидроксильный радикал. Целью было выяснить, могут ли они системно защищать рис (Oryza sativa L.) от пирикуляриоза, вызванного грибом Magnaporthe oryzae Conouch et Kohn, и участвуют ли АФК в защитных механизмах. Исследуемые соединения наносили на 4-й (верхний) лист. Когда развивался 5-й лист (через 7 дней), его заражали вирулентным штаммом гриба. Мы обнаружили, что почти все химические обработки повреждали 4-й лист, и все они ослабляли симптомы болезни на 5-м листе. Антиоксиданты в комбинации с исследуемыми веществами ослабляли защиту от болезни. Фотосенсибилизаторы, нанесенные на 4-й лист, усиливали продукцию супероксида в капельных диффузатах здорового и, в большей степени, зараженного 5-го листа. В этих диффузатах также усиливалась фунгитоксичность, которая ослаблялась антиоксидантами, добавленными в диффузаты. Кроме того, обработка меркаптопиридин-N-оксидом системно ослабляла эндогенную антиокислительную (H2O2-разрушающую) активность диффузата. Предполагается, что окислительный взрыв в обработанных листьях индуцировал системную болезнеустойчивость, реализация которой могла происходить при участии вторичного окислительного взрыва в системно защищенных листьях, что подавляло развитие патогена. 

_________________

Сокращения: БАМК − -аминомасляная кислота; БР − бенгальский розовый; МС − метиленовый синий; СОД − супероксиддисмутаза; BTH − бензотиадиазол; DABCO − 1,4-диазабициклооктан; INA − изоникотиновая кислота; MPNO − меркаптопиридин-N-оксид; O2. – − супероксидный радикал.

1Адрес для корреспонденции: Аверьянов Андрей Александрович. 143050 Большие Вяземы, Московская обл. Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии. Электронная почта: andrey.a.averyanov@yandex.ru

 

Ключевые слова: Oryza sativa – Magnaporthe oryzae – активные формы кислорода – антиокислительная активность – пирикуляриоз риса – системная болезнеустойчивость – фотосенсибилизаторы

 

ВВЕДЕНИЕ

Многие биологические и абиотические факторы, вызывая локальное повреждение растений, могут также инициировать в отдаленных частях растений системную устойчивость к болезням, которая проявляется при последующем заражении этих частей [1]. Зачастую повреждение, индуцирующее такую устойчивость, связано с окислительным взрывом, а именно, усиленной продукцией АФК. Это происходит, например, при сверхчувствительной гибели растительных клеток, вызванной авирулентными бактериями [2]. Окислительный взрыв в обработанных тканях предшествует системной устойчивости, индуцированной паракватом [3], K2HPO4 [4], бензотиадиазолом (BTH) [5] или β-аминомасляной кислотой (БАМК) [6] и, очевидно, участвует в механизме индукции. 

Среди экзогенных источников и стимуляторов эндогенных источников АФК индукторы устойчивости, возможно, более многочисленны, чем принято думать. В этом отношении важным фактором среды является свет. За счет его энергии некоторые вещества (фотосенсибилизаторы) образуют АФК [7]. Среди них фуранокумарины, полиацетилены и тиофены вносят вклад в природную устойчивость растений к патогенам и вредителям [8]. Экзогенные флавиновые соединения системно защищают растения от грибных паразитов: табак от Alternaria alternata [9] и рис от Magnaporthe oryzae [10]. Фталоцианиновые металлокомплексы также системно защищают рис от пирикуляриоза [11] и картофель от фитофтороза [12]. Фотодинамические красители метиленовый синий (МС) и бенгальский розовый (БР) системно подавляют оливковую пятнистость огурца [13], а БР — мозаику табака [14]. Известно, что такие красители проявляют непосредственную цитотоксичность при освещении [15], но неясен механизм системной защиты ими от болезней.

Независимо от природы индуктора, обработанные им восприимчивые растения реагируют на инфекцию подобно устойчивым. В частности, их системно защищенные части отвечают на заражение вторичным окислительным взрывом [2]. Образованные в нем АФК участвуют в разнообразных противоинфекционных реакциях, включающих прямое подавление патогенных микроорганизмов. Вторичный окислительный взрыв происходит не только внутри, но и снаружи клеток — в апопласте и в инфекционной капле. Так, устойчивость риса к пирикуляриозу, вызванная внесением в почву трициклазола, пробеназола [16] или фенантролинового комплекса кобальта [17], сопровождается интенсивной продукцией супероксида в диффузатах зараженных листьев. Те же обработки придают диффузатам токсичность для спор возбудителя болезни, что ослабляется антиоксидантами и потому зависит от АФК.

В данной работе исследованы фотодинамические красители бенгальский розовый (БР) и метиленовый синий (МС), на свету образующие синглетный кислород [15], и меркаптопиридин-N-оксид (MPNO), образующий гидроксильный радикал [18]. Цитотоксичность MPNO известна [18], но, по-видимому, нет данных о защите им от фитопатогенов. Мы проверили, защищают ли упомянутые фотосенсибилизаторы рис от пирикуляриоза системно, и участвуют ли АФК в механизмах локальной индукции и системной реализации болезнеустойчивости. Было также выяснено, способны ли эти вещества системно изменять антиокислительную активность инфекционной капли. Для сравнения в тех же условиях были испытаны некоторые известные индукторы СПУ.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный и грибной материал. Растения риса (Oryza sativa L.) сорта Sha-tiao-tsao выращивали в почвенной культуре в климатической камере при 28–29/21–23°C (день/ночь) и освещали 150–240 мкмоль/(м2 с) двумя лампами ДРИ-2000 (в диапазоне 350-800 нм) по 12 ч в сутки. Использован вирулентный штамм H5-3 гриба Magnaporthe oryzae Conouch et Kohn. Метод выращивания гриба, гены его вирулентности и гены устойчивости растения указаны в работе [19].

Обработка растений. На верхние поверхности четвертых (верхних) листьев 21-27-дневных интактных проростков наносили дистиллированную воду или испытуемые растворы шестью каплями на лист по 20 мкл каждая [19]. Испытаны БР (“Serva”, Германия), МС (“Sigma”, Германия) и MPNO (“Aldrich”, Германия). В наших опытах растворы или инокулюм помещали на листья в виде крупных неподвижных капель. Чтобы показать применимость такого метода к данной системе, тем же способом вносили известные индукторы болезнеустойчивости K2HPO4, FeCl2, FeCl3 (“Merck”, Германия), изоникотиновую кислоту (INA, “Aldrich”), 1,2,3-бензотиадиазол (BTH, “Aldrich”) или БАМК (“Sigma”). Эффективные концентрации веществ подобраны в предварительных опытах, а концентрации красителей – в работе [13]. Обработанные растения возвращали в климатическую камеру.

Чтобы показать участие АФК в индукции болезнеустойчивости, вызванной MPNO, его капли через день после нанесения заменяли каплями антиоксиданта – восстановленного глютатиона (“Serva”). В сходных опытах с красителями последние смешивали с тушителями синглетного кислорода [20] L-гистидином (“Merck”) или 1,4-диазабициклооктаном (DABCO, “Merck”).

Заражение растений. Когда появлялся 5-й лист (через 8–10 дней после обработки), на него помещали шесть капель (по 20 мкл каждая) воды или суспензии спор (105 спор/мл), смытых с 7–10-дневного мицелия [19]. Растения выдерживали 22–24 ч в темноте при 23°C и возвращали в климатическую камеру.

Оценка визуальных изменений. На каждом четвертом листе, через 18–20 дней после обработки подсчитывали, какая часть (%) из шести нанесенных капель оставляла изменения. Повреждения называли “химическими ожогами”, чтобы отличить их от инфекционных пятен.

На пятых листьях через 10 дней после заражения оценивали симптомы болезни. Для этого подсчитывали процент капель инокулюма, которые оставили пятна совместимого типа (типы 4 или 5, признак восприимчивости), пятна несовместимого типа (типы 1–3, признак устойчивости), или не оставили симптомов (балл 0, признак сильной устойчивости) [21].

Приготовление листовых или споровых диффузатов. Капли споровой суспензии, проинкубированные 1 сутки на 5-м листе (см. выше), собирали и освобождали от спор центрифугированием. Супернатант называли диффузатом зараженного листа. Диффузат здорового листа получали инкубацией на нем капель воды вместо суспензии [22]. Диффузат спор получали из суспензии, проинкубированной порциями по 50 мкл в 96-луночных пластинах Cellstar (“Greiner Bio-One”, Германия) в темноте то же время и при той же температуре, что и зараженные растения.

Продукцию супероксидного радикала в диффузатах анализировали по окислению экзогенного адреналина, чувствительному к супероксиддисмутазе (СОД) [19]. Оптическую плотность окисленного адреналина измеряли при 480 нм на спектрофотометре Benchmarck Plus (“Bio-Rad”, Япония) и нормировали к длине оптического пути 1 см. Чтобы учесть автоокисление адреналина, оптические плотности образцов, содержащих воду вместо диффузата, вычитали из плотностей образцов с диффузатами (отдельно для образцов, содержащих и не содержащих СОД).

Фунгитоксичность диффузатов оценивали по прорастанию спор в них. В лунке 96-луночной пластины, 40 мкл воды или свежесобранного диффузата смешивали с 5 мкл свежевыделенных спор (тест-организм в конечной концентрации 3.5 × 104 спор/мл) и 5 мкл воды. Материал инкубировали 5 ч при 25°C в темноте, фиксировали этанолом и подсчитывали прорастание.

Чтобы выявить участие АФК в токсичности, вместо 5 мкл воды добавляли антиоксиданты [20] в указанных конечных концентрациях: 50 мкг/мл СОД (4470 ед./мг, “Sigma”), 50 мкг/мл каталазу из печени быка (13200 ед./мг, “Sigma”) или, для контроля, 50 мкг/мл БСА (“Sigma”). Также использовали перехватчик супероксидного радикала 1 мМ тайрон (“Serva”) и перехватчики гидроксильного радикала - 10 мМ маннит (“Sigma”) и 1 мМ формиат натрия (“Merck”). Концентрации антиоксидантов подобраны в предварительных опытах.

Сходным образом оценивали непосредственную фунгитоксичность испытуемых веществ, взятых в тех же концентрациях, что и для обработки 4-го листа.

H2O2-разрушающую активность диффузатов определяли путем инкубации экзогенной перекиси в диффузате с последующим анализом ее остаточных количеств с использованием хлорида титана [23]. В лунке 384-луночной пластины (“Greiner Bio-One”) смешивали 40 мкл воды или диффузата с 5 мкл 1 мМ H2O2 (“Merck”) и инкубировали 60 мин при 25°C в темноте. Затем добавляли 5 мкл 10 мМ TiCl4 (в 20% HCl, “Fluka”, Швейцария) и через 5 мин измеряли А410 на спектрофотометре Benchmark Plus. Подсчитывали относительную (%) разность оптических плотностей образцов, содержащих воду и диффузат.

Статистическая обработка. Для оценки визуальных изменений, вызванных обработкой или заражением, подсчитывали, какая доля (%) из нанесенных на один лист шести капель вызывала определенный эффект. Генерацию O2.– и распад H2O2 определяли в 6 аналитических повторностях для каждой обработки. Прорастание подсчитывали в 4 повторностях по 100 спор. Каждый показатель усредняли для всех растений в нескольких независимых опытах, подсчитывали стандартную ошибку (SE) и достоверность различий по t-критерию Стьюдента.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

Визуальные изменения

BTH вызывал точечные химические ожоги на обработанном 4-м листе и, в соответствии с литературными данными для пирикуляриоза риса [24], ослаблял тяжесть болезни на зараженном 5-м листе (табл. 1). Оба эти явления, наблюдающиеся при обработках риса INA [25], вторичным фосфатом калия и солями Fe (II) или Fe (III) [26] отмечены и нами (табл. 1). Следовательно, данная методика подходит для выявления системной защиты риса от пирикуляриоза. Тем же способом была проверена БАМК, хорошо известная как системное средство защиты двудольных от многих болезней [6], но, вероятно, не испытанная против пирикуляриоза риса. Мы обнаружили такую защиту, причем практически без повреждения обработанного листа.

Фотосенсибилизатор MPNO, неизвестный как индуктор болезнеустойчивости, системно проявлял это свойство вслед за повреждением обработанных листьев (рис. 1, 2а, табл. 1, 3). Фотодинамические красители БР и МС вели себя примерно так же (рис. 1, 2а, табл. 2), но оставляли на 4-м листе не точечные, а крупные сливающиеся ожоги, частоту которых было трудно подсчитать. Эффективность защиты красителями не зависела от их концентраций в пределах 0.01 – 0.05 мМ (данные не приводятся). Ни одно из веществ, нанесенных на четвертый лист, не приводило к визуальным изменениям незараженного пятого листа.

Чтобы показать участие АФК в индукции болезнеустойчивости фотосенсибилизаторами, последние комбинировали с антиоксидантами. Тушители синглетного кислорода гистидин или DABCO в отдельности не влияли на болезнь, но, смешанные с МС, уменьшали частоту бессимптомных исходов и повышали частоту симптомов совместимого типа, т.е. уменьшали эффективность защиты красителем (табл. 2). Гистидин или DABCO, смешанные с БР, не влияли на совместимые симптомы, но DABCO достоверно уменьшал частоту бессимптомных исходов, увеличенную внесением БР.

Если капли MPNO на 4-м листе заменяли на следующий день каплями восстановленного глютатиона, то на 5-м листе наблюдалось меньше бессимптомных исходов, чем после замены MPNO на воду (табл. 3). Глютатион в отдельности не влиял на болезнь. Следовательно, данный антиоксидант ослаблял защиту, вызванную MPNO, что, как и влияние тушителей синглетного кислорода, указывает на участие АФК в индукции устойчивости.

Таким образом, по-видимому, впервые установлено, что фотосенсибилизаторы и БАМК могут системно ослаблять пирикуляриоз риса. Это может быть обусловлено системной болезнеустойчивостью, которая реализуется в других частях растения в реакциях, включающих в себя окислительный взрыв. 

 

Образование супероксидного радикала в диффузатах

В обработанном водой контрольном варианте заражение листьев усиливало продукцию супероксидного радикала ими (рис. 2б), как это наблюдалось ранее [10, 16]. Скорость реакции была выше в диффузатах спор, свидетельствуя о вкладе патогена в продукцию АФК в инфекционной капле. В незараженных растениях все испытанные соединения стимулировали реакцию по сравнению с водным контролем. В зараженных растениях BTH и МС не оказывали влияния, но другие вещества (фосфат, БАМК, БР и MPNO) усиливали реакцию. Во всех случаях, за исключением обработанных BTH зараженных растений, СОД тормозила окисление адреналина, подтверждая участие O2.– в окислении.

Следовательно, как некоторые известные, так и впервые испытанные препараты, системно ослабляя болезнь, системно же усиливали продукцию супероксидного радикала в здоровых и, сильнее, в зараженных листьях. Этот окислительный взрыв мог быть одной из реакций, в которых реализовалась устойчивость, индуцированная этими веществами.

 

Фунгитоксичность диффузатов

АФК-зависимые защитные реакции включают в себя подавление развития патогена, что, например, наблюдается в диффузатах листьев риса. Эта способность, как и химически проанализированная генерация АФК, усиливается в листьях, системно защищенных от пирикуляриоза, и ингибируется антиоксидантами, добавленными в диффузаты [10, 16]. Мы определили, как обработки 4-го листа влияют на токсичность диффузата 5-го листа.

Как и в процитированных работах, в необработанном контроле прорастание спор тест-организма было слабо подавлено в диффузате здорового листа (по сравнению с прорастанием в воде), но сильнее – в зараженном варианте (рис. 2в). Диффузат спор, проросших в отдельности, занимал промежуточное положение между диффузатами здоровых и зараженных листьев. Токсичность диффузатов здоровых листьев не изменялась после обработок BTH, БАМК или MPNO и четко возрастала после K2HPO4. В зараженных же листьях любые из этих веществ, включая оба красителя, усиливали данную активность.

Чтобы выяснить возможное участие АФК (O2.–, H2O2 и .OH) в фунгитоксичности, в анализах диффузатов использованы соответствующие антиоксиданты. Последние включали СОД и тайрон (против O2.–), каталазу (против H2O2), маннит и формиат натрия (против .OH), а также БСА как нейтральный белковый контроль на ферменты. Обнаружено, что подавление прорастания спор в диффузате зараженных растений, обработанных водой, и еще более сильное подавление после обработки любым фотосенсибилизатором ослаблялись всеми, либо хотя бы одним антиоксидантом, из которых каталаза была наиболее эффективной (табл. 4). Это свидетельствует об АФК-зависимом механизме токсичности, однако, не единственном, что особенно ясно для других индукторов болезнеустойчивости. Например, фосфат индуцировал наибольшую токсичность, которая, однако, была наименее чувствительна к антиоксидантам, но ослаблялась альбумином.

Наши опыты исключали прямой контакт испытуемых веществ с патогеном, но это возможно при их внесении в поле, где уже присутствует инфекция. Возможно, что некоторые из них не только индуцируют устойчивость, но и подавляют гриб непосредственно. Чтобы это проверить, мы определили их фунгитоксичность в концентрациях, системно защищавших от болезни.

Обнаружено, что BTH, БАМК и оба красителя не влияли на прорастание спор, но оно слабо подавлялось фосфатом и сильно – MPNO (табл. 5). Допустимо, что MPNO служил непосредственной причиной токсичности диффузата, но при условии, что это вещество в достаточном количестве распространялось в верхний лист, который появился после обработки. В остальном такой механизм маловероятен, так как фосфат был менее токсичен, чем диффузат обработанных им растений, а остальные вещества были совсем нетоксичны. Поэтому вызванное ими системное усиление токсичности диффузатов, по-видимому, было опосредовано растением.

 

H2O2-разрушающая активность диффузатов

Повышение уровня АФК в системно-защищенных листьях может быть следствием как стимуляции эндогенных источников АФК, так и ингибирования антиокислительной способности. Для проверки второй возможности, мы проанализировали одну из антиокислительных активностей, а именно, разрушение H2O2 в диффузатах листьев. Ранее эта активность была обнаружена нами в диффузате проросших спор того же штамма гриба [27]. В приведенной работе экзогенную перекись водорода добавляли в диффузат и через 1 ч анализировали ее остаток с хлоридом титана. Обнаруженная H2O2-разрушающая активность подавлялась кипячением, цианидом или азидом, но не была чувствительна к известному ингибитору каталазы [20] аминотриазолу (10 мМ). Поэтому она могла принадлежать какому-либо гемовому ферменту, но не каталазе.

В диффузате здорового 5-го листа контрольных растений H2O2-разрушающая активность была довольно слабой. Если этот лист заражали, активность увеличивалась в несколько раз, примерно, до уровня диффузата спор (рис. 3), которые, вероятно, были главным источником активности в инфекционной капле. Обработки 4-го листа BTH, фосфатом или, более всего, MPNO достоверно ослабляли H2O2-разрушающую активность диффузата зараженного 5-го листа. Обработки БАМК или фотодинамическими красителями не влияли на активность (данные не приводятся).

Таким образом, некоторые известные и впервые выявленные индукторы болезнеустойчивости не только стимулировали окислительный взрыв, но и подавляли противоположную, антиокислительную активность в системно защищенном листе. Оба изменения повышают уровень АФК и, возможно, способствуют реализации системной устойчивости. Не все испытанные индукторы подавляли H2O2-разрушающую активность, но они могли влиять на другие антиокислительные системы.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Свет является фактором среды, который определяет (или влияет на) многие аспекты жизни растений, в том числе их взаимоотношениями с микроорганизмами. Зачастую он способствует устойчивости к инфекциям, например, участвуя в синтезе веществ, необходимых для защитных реакций, или управляя этими реакциями с помощью фоторецепторов [28]. К важным светозависимым процессам относится образование АФК фотосенсибилизаторами [7]. Ввиду участия АФК в фитоиммунитете, фотосенсибилизаторы интересны не только как естественные элементы болезнеустойчивости, но и как искусственные средства ее повышения. Тем не менее, второй подход слабо разработан.

Мы попытались системно защитить рис от пирикуляриоза с помощью экзогенных фотосенсибилизаторов. Получены положительные результаты и свидетельства участия АФК в процессах, протекающих как в обработанных, так и системно защищенных частях растения (табл. 2–4, рис. 2). Использованная экспериментальная модель подтвердила свою пригодность, так как показала системное подавление пирикуляриоза некоторыми известными индукторами устойчивости (табл. 1, рис. 1). Такая защита была обнаружена также после обработок фотодинамическими красителями или MPNO, как и после БАМК (табл. 1, рис. 1, 2a). Насколько известно авторам, это первое сообщение о системной защите от данной болезни с помощью фотосенсибилизаторов или БАМК. Мы полагаем, что в обработанных листьях фотосенсибилизаторы вызывали окислительный взрыв, индуцирующий системную болезнеустойчивость, возможно, являющуюся системной приобретенной. С участием АФК в ее индукции согласуется ослабление устойчивости антиоксидантами (табл. 2, 3). Известно, что другие испытанные вещества, а именно, фосфат [4], соли железа [20], INA [29], BTH [5] и БАМК [6] также проявляют проокислительные свойства, существенные для индукции болезнеустойчивости. Недавно мы сообщали о системной защите от пирикуляриоза с помощью ингибиторов СОД или каталазы, возможно, основанной на сходном механизме [22]. Хотя локальная гибель клеток хозяина во многих случаях ведет к системной болезнеустойчивости, мы не нашли соответствия последней частоте ожогов. Более того, БАМК (табл. 1) или вышеупомянутые ингибиторы [22] практически не вызывали локальной гибели тканей листа, видимой невооруженным глазом. Последняя, следовательно, не была необходима для индукции системной болезнеустойчивости.

Защитные реакции в системно защищенных частях растений разнообразны. Они также могут включать окислительный взрыв, в данном случае вторичный [2, 16, 17]. Он известен меньше, чем первичный и наблюдался в наших опытах. Как известный индуктор системной устойчивости риса (фосфат), так и, по-видимому, впервые выявленный (БАМК), а также фотосенсибилизаторы БР и MPNO, помещенные на 4-й лист, стимулировали образование супероксида 5-м листом. Избыточные АФК могли участвовать в механизме реализации устойчивости.

Известно, что АФК цитотоксичны. Повышение их уровня в диффузатах системно-защищенных листьев (рис. 2б), могло подавлять развития патогена in planta. Антигрибные эффекты не обязательно вызываются самими АФК. Довольно сильная токсичность после обработки фосфатом была лишь слабо чувствительна к антиоксидантам. Она могла быть обусловлена продуктами иными, чем АФК, но образованными при участии АФК, как это было показано на каллусных культурах риса [30]. 

Наряду с системным усилением проокислительной активности, мы обнаружили системное ослабление антиокислительной активности, вызванное тремя веществами (BTH, K2HPO4 или MPNO) в диффузате зараженных листьев. Этот эффект может косвенно повышать уровень АФК в инфекционной капле и быть одной из защитных реакций, вызванных данными индукторами устойчивости.

Испытанные вещества в использованных концентрациях ослабляли болезнь почти одинаково, но на другие свойства влияли по-разному. Например, в зараженных растениях BTH не стимулировал образование супероксида, но повышал токсичность и понижал антиокислительную активность. Причина, возможно, в том, что мы регистрировали изменения только одной АФК, одной из антиокислительных активностей, только внеклеточно и только через один фиксированный срок после обработки и заражения. 

Химические обработки усиливали генерацию O2.– не только в зараженных, но и в здоровых растениях. Фосфат влиял таким же образом и на фунгитоксичность диффузатов листьев. У нас, как и в других случаях системной устойчивости, мало известно о природе подвижных сигналов, запускающих устойчивость, и об их мишенях. В здоровом растении источником сигналов, бесспорно, служит само растение, но в зараженном – возможно участие и хозяина, и паразита. По-видимому, ослабление антиокислительной активности происходит преимущественно за счет паразита как основного ее носителя.

Исследованные нами диффузаты были получены без поранения и, поэтому, имитируют процессы, происходящие в инфекционной капле на интактном растении. По нашему мнению, способность веществ к светозависимой генерации АФК может быть основой для создания новых индукторов болезнеустойчивости.

Работа поддержана Службой сельскохозяйственных исследований Департамента сельского хозяйства США при посредничестве Международного научно-технического центра (грант № 4071р). Авторы признательны Prof. Yigal Cohen (Bar-Ilan University, Israel) за идею защиты риса от пирикуляриоза с помощью БАМК.

 

 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Lucas J.A. Plant immunisation: from myth to SAR // Pestic. Sci. 1999. V. 55. P. 193196.

2. Alvarez E.A., Pennel R.I., Meijer P.-J., Ishikawa A., Dixon R.A., Lamb C. Reactive oxygen intermediates mediate a systemic signal network in the establishment of plant immunity // Cell. 1998. V. 92. P. 773–784.

3. Strobel N.E., Kuć J.A. Chemical and biochemical inducers of systemic resistance to pathogens protect cucumber and tobacco plants from damage caused by paraquat and cupric chloride // Phytopathology. 1995. V. 85. P. 13061310.

4. Orober M., Siegrist J., Buchenauer H. Mechanisms of phosphate-induced disease resistance in cucumber // Eur. J. Plant Pathol. 2002. V. 108. P. 345353.

5. Iriti M., Faoro F. Benzothiadiazole (BTH) induces cell-death independent resistance in Phaseolus vulgaris against Uromyces appendiculatus // J. Phytopathol. 2003. V. 151. P. 171–180. 

6. Cohen Y.R. β-Aminobutyric acid-induced resistance against plant pathogens // Plant Dis. 2002. V. 86. P. 448457. 

7. Foote C.S. Type I and type II mechanisms of photodynamic action // Light-Activated Pesticides / Eds. Heitz J.R., Downum K.R. Washington, DC: Am. Chem. Soc., 1987. P. 2238.

8. Downum K.R., Nemec S. Light-activated antimicrobial chemicals from plants: their potential role in resistance to disease-causing organisms // Light-Activated Pesticides / Eds. Heitz J.R., Downum K.R. Washington, DC: Am. Chem. Soc., 1987. P. 281294.

9. Dong H., Beer S.V. Riboflavin induces disease resistance in plants by activating a novel signal transduction pathway // Phytopathology. 2000. V. 90. P. 801811.

10. Аверьянов А.А., Лапикова В.П., Николаев О.Н., Степанов А.И. Зависящая от активации кислорода защита риса от пирикуляриоза с помощью рибофлавина и розеофлавина // Биохимия. 2000. Т. 65. С. 15301537. 

11. Vol’pin М.Е., Novodarova G.N., Krainova N.Yu., Lapikova V.P., Aver'yanov A.A. Redox and fungicidal properties of phthalocyanine metal complexes as related to active oxygen // J. Inorg. Biochem. 2000. V. 81. P. 285292.

12. Aver'yanov A.A., Lapikova V.P., Pasechnik T.D., Kvasyuk N.Ya., Gabel B.V., Luk'yanets E.A., Kaliya O.L., Vorozhtsov G.N. Phthalocyanine metal сomplexes сan induce resistance of potato to late blight // Modern Fungicides and Antifungal Compounds III /  Eds. Dehne H.-W., Gisi U., Kuck K.H., Russell P.E., Lyr H. Bonn: AgroConcept, 2002, P. 361364.

13. Aver’yanov A.A., Lapikova V.P., Pasechnik T.D., Zakharenkova T.S., Pogosyan S.I., Baker C.J. Suppression of cucurbit scab on cucumber leaves by photodynamic dyes // Crop Prot. 2011. V. 30. P. 925930.

14. Enyedi A.J. Induction of salicylic acid biosynthesis and systemic acquired resistance using the active oxygen species generator rose bengal // J. Plant Physiol. 1999. V. 154. P. 106112.

15. Spikes J.D., Straight R.C. Biochemistry of photodynamic action // Light-Activated Pesticides / Eds. Heitz J.R., Downum K.R. Washington, DC: Am. Chem. Soc., 1987. P. 98108.

16. Nikolaev O.N., Aver’yanov A.A., Lapikova V.P., Djavakhia V.G. Possible involvement of reactive oxygen species in action of some anti-blast fungicides // Pestic. Biochem. Physiol. 1994. V. 50. P. 219228.

17. Николаев О.Н., Новодарова Г.Н., Колосова Е.М., Аверьянов А.А., Джавахия В.Г., Вольпин М.Е. Индукция устойчивости растений риса к пирикуляриозу под действием фенантролинового комплекса кобальта и ее возможный механизм // Докл. АН СССР. 1991. Т. 316. С. 15151517.

18. Viera A.J.S.C., Telo J.P., Dias R.M.B. Generation of hydroxyl radical by photolysis of mercaptopyridine N-oxides: application to redox chemistry of purines // Methods in Enzymology. 1999. V. 300, Acad. Press, P. 194201.

19. Aver'yanov A.A., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Gaivoronskaya L.M., Kuznetsov Vl.V., Baker C.J. Possible contribution of blast spores to the oxidative burst in the infection droplet on rice leaf // Acta Phytopathol. Entomol. Hung. 2007. V. 42. P. 305–319. 

20. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford: Oxford University Press, 2007.

21. Latterell F.M., Marchetti M.A., Grove B.R. Co-ordination of effort to establish an international system for race identification in Piricularia oryzae // The Rice Blast Disease / Ed. Chandler R.F. Baltimore: The Johns Hopkins University Press, 1965. P. 257274.

22. Аверьянов А.А., Пасечник Т.Д., Лапикова В.П., Романова Т.С., Бейкер К.Дж. Системная защита риса от пирикуляриоза ингибиторами антиокислительных ферментов // Физиология растений. 2015. Т. 62. С. 628637.

23. Patterson B.D., MacRae E.A., Ferguson I.B. Estimation of hydrogen peroxide in plant extracts using Titanium (IV) // Anal. Biochem. 1984. V. 139. P. 487492.

24. Shimono M., Sugano S., Nakayama A., Jiang C.-J., Ono K., Toki S., Takatsuji H. Rice WRKY45 plays a crucial role in benzothiadiazole-inducible blast resistance // Plant Cell. 2007. V. 19. P. 2064–2076.

25. Schweizer P., Buchala A.,Métraux J.-P. Gene-expression patterns and levels of jasmonic acid in rice treated with the resistance inducer 2,6-dichloroisonicotinic acid // Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 6170.

26. Manandhar H.K., Lyngs H.J., Mathur S.B., Smedegaard-Petersen V. Resistance to rice blast induced by ferric chloride, di-potassium hydrogen phosphate and salicylic acid // Crop Prot. 1998. V. 17. P. 323329.

27. Aver’yanov A.A., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Abramova O.S., Gaivoronskaya L.M., Kuznetsov Vl.V., Baker C.J. Pre-illumination of rice blast conidia induces tolerance to subsequent oxidative stress // Fungal Biol. 2014. V. 118. P. 743753.

28. Roberts M.R., Paul N.D. Seduced by the dark side: integrating molecular and ecological perspectives on the influence of light on plant defence against pests and pathogens // New Phytol. 2006. V. 170. P. 677699.

29. Conrath U., Chen Z., Ricigliano J.R., Klessig D.F. Two inducers of plant defense responses, 2,6-dichloroisonicotinic acid and salicylic acid, inhibit catalase activity in tobacco // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 71437147.

30. Aver'yanov A.A., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Gaivoronskaya L.M. Fungitoxic responses of rice callus culture as an expression of inheritable resistance to blast. Implication of active oxygen // Plant Physiol. Biochem. 2001. V. 39. P. 415424. 

 Таблица 1. Визуальные изменения обработанного реагентами 4-го листа и зараженного пирикуляриозом 5-го листа риса

Среда, нанесенная

на 4 лист Частота ожогов

на 4 листе, % Частота указанных признаков на 5 листе, %

Отсутствие

симптомов 

(тип 0) Пятна несовместимого

типа (типы 1−3) Пятна совместимого

типа (типы 4 и 5)

Вода 0 23 ± 2 25 ± 2 52 ± 2

10 мМ K2HPO4 46 ± 4** 81 ± 3** 15 ± 3** 3 ± 1**

25 мМ K2HPO4 93 ± 3** 70 ± 7** 24 ± 6 6 ± 3**

50 мМ K2HPO4 68 ± 7** 84 ± 3** 16 ± 3** 2 ± 1**

25 мМ FeCl2 66 ± 6** 81 ± 5** 13 ± 3** 6 ± 3**

25 мМ FeCl3 58 ± 6** 80 ± 4** 10 ± 3** 10 ± 3**

1 мМ INA 62 ± 10** 78 ± 8** 8 ± 2** 14 ± 7**

0.3 мМ BTH 17 ± 4** 77 ± 4** 9 ± 3** 6 ± 2**

10 мМ БАМК 1 ± 1* 69 ± 3** 24 ± 3 7 ± 2**

0.01 мМ MPNO 28 ± 7** 89 ± 5** 9 ± 4** 2 ± 2**

0.1 мМ MPNO 44 ± 5** 81 ± 4** 13 ± 3** 6 ± 2**

1 мМ MPNO 89 ± 5** 81 ± 6** 18 ± 7 1 ± 1**

 

Примечание. На 4 лист риса сорта Sha-tiao-tsao наносили капли испытанных растворов. Когда появлялся 5 лист, на него наносили капли споровой суспензии M. oryzae вирулентного штамма Н5-3. Ожоги от обработки и симптомы болезни оценивали через 7–10 дней после заражения (13–14 дней после обработки). Представлены средние значения ± SE из 3–35 независимых опытов с 6−8 растениями в каждом. В каждой колонке величины, достоверно отличающиеся от обработанного водой контроля при р ≤ 0.05 или р ≤ 0.01 обозначены, соответственно, * или **. 

 Таблица 2. Влияние обработок 4-го листа риса фотодинамическими красителями (в том числе совместно с тушителями синглетного кислорода) на симптомы пирикуляриоза на зараженном 5-м листе

Среда, нанесенная

на 4 лист Частота указанных признаков на 5 листе, %

Отсутствие

симптомов 

(тип 0) Пятна несовместимого

типа (типы 1−3) Пятна совместимого

типа 

(типы 4 и 5)

Вода 13 ± 4a 19 ± 4a 68 ± 5a

0.02 мМ МС + вода 63 ± 7b 31 ± 6b 6 ± 3b

0.02 мМ МС + 0.1 мМ DABCO 45 ± 7b 33 ± 5b 22 ± 5c

0.02 мМ МС + 1 мМ гистидин 31 ± 6c 31 ± 4b 38 ± 6c

0.02 мМ БР + вода 67 ± 11b 27 ± 9b 6 ± 5b

0.02 мМ БР + 0.1 мМ DABCO 37 ± 8c 49 ± 7b 14 ± 7b

0.02 мМ БР + 1 мМ гистидин 46 ± 9b 44 ± 9b 10 ± 3b

Вода + 0.1 мМ DABCO 17 ± 6a 25 ± 9a 58 ± 10a

Вода + 1 мМ гистидин 19 ± 7a 36 ± 7b 45 ± 9a

 

Примечание. На 4 лист риса сорта Sha-tiao-tsao наносили капли испытанных растворов. Указаны конечные концентрации веществ. Пятый лист заражали каплями споровой суспензии M. oryzae вирулентного штамма Н5-3. Симптомы болезни оценивали через 7 дней после заражения (14 дней после обработки). Представлены средние значения ± SE из 2–5 независимых опытов с 6−8 растениями в каждом. В каждой колонке величины, достоверно различающиеся при p < 0.05, обозначены разными буквами.

 Таблица 3. Визуальные изменения обработанного MPNO (в том числе совместно с восстановленным глютатионом) 4-го листа и зараженного пирикуляриозом 5-го листа риса 

Среда, нанесенная

на 4 лист Частота ожогов

на 4 листе, % Частота указанных признаков на 5-м листе, %

Отсутствие

симптомов 

(тип 0) Пятна несовместимого

типа (типы 1−3) Пятна совместимого

типа 

(типы 4 и 5)

Вода затем вода 0 a 11 ± 3a 17 ± 3a 73 ± 5a

0.1 мМ MPNO затем вода 31 ± 5b 51 ± 8b 18 ± 5a 31 ± 8b

0.1 мМ MPNO затем 10 мМ GSH 35 ± 6b 26 ± 7c 30 ± 6b 44 ± 7b

Вода затем 10 мМ GSH 9 ± 2a 9 ± 0a 21 ± 6a 70 ± 8a

 

Примечание. На 4 лист риса сорта Sha-tiao-tsao наносили капли воды или MPNO и заменяли другими каплями через сутки. Пятый лист заражали каплями споровой суспензии M. oryzae вирулентного штамма Н5-3. Ожоги от обработки и симптомы болезни оценивали через 7 дней после заражения (14 дней после обработки). Представлены средние значения ± SE из 3–5 независимых опытов с 6−8 растениями в каждом. В каждой колонке величины, достоверно различающиеся при p < 0.05, обозначены разными буквами.

 Табл. 4. Фунгитоксичность диффузатов здорового или зараженного пирикуляриозом 5-го листа риса или диффузата спор M. oryzae (в том числе после обработок 4-го листа испытанными веществами и добавления антиоксидантов в диффузаты)

Среда, нанесенная

на 4 лист Инокуляция 

5-го листа Прорастание (%) спор тест-объекта в присутствии

Без добавок 50 мкг/мл

СОД 50 мкг/мл

каталаза 50 мкг/мл

БСА 1 мМ

тайрон 1 мМ

формиат 10 мМ

маннит

В воде

84 ± 1 85 ± 1 87 ± 0** 86 ± 1* 85 ± 1 82 ± 1* 86 ± 1

В диффузате 5-го листа

Вода Здоровый 78 ± 1 81 ± 1* 87 ± 1** 84 ± 1** 79 ± 2 83 ± 2*

Зараженный 69 ± 1 82 ± 1** 86 ± 0** 74 ± 2* 82 ± 1** 81 ± 1** 83 ± 1**

0.3 мМ BTH Здоровый 73 ± 2 84 ± 2** 84 ± 2** 88 ± 1** 74 ± 2 84 ± 2**

Зараженный 54 ± 3 73 ± 3** 85 ± 1** 57 ± 1 74 ± 4** 79 ± 2**

10 мМ K2HPO4 Здоровый 45 ± 6 61 ± 3* 58 ± 2 66 ± 1** 58 ± 3 61 ± 2**

Зараженный 27 ± 2 31 ± 3 36 ± 4* 43 ± 1** 55 ± 8** 25 ± 4 34 ± 3**

10 мМ БАМК Здоровый 80 ± 2 82 ± 3 85 ± 2 88 ± 1** 71 ± 3* 81 ± 3

Зараженный 60 ± 2 71 ± 2** 83 ± 1** 60 ± 1 78 ± 3** 67 ± 2** 81 ± 1**

0.02 мМ БР Зараженный 57 ± 2 84 ± 1** 86 ± 1** 83 ± 1** 81 ± 1** 83 ± 1**

0.02 мМ МС Зараженный 50 ± 1 82 ± 2** 85 ± 1** 82 ± 1** 79 ± 3** 85 ± 1**

0.1 мМ MPNO Здоровый 74 ± 3 84 ± 2* 83 ± 1** 80 ± 2 85 ± 2**

Зараженный 41 ± 3 65 ± 3** 82 ± 1** 77 ± 4** 74 ± 2** 71 ± 3**

В диффузате спор

73 ± 1 82 ± 1** 86 ± 0** 79 ± 1** 85 ± 1** 79 ± 2* 83 ± 1**

 

Примечание. Капли воды или испытуемых веществ наносили на 4-й лист риса сорта Sha-tiao-tsao. Капли воды или суспензии спор M. oryzae вирулентного штамма Н5-3 наносили на 5 лист. Через сутки собирали диффузаты. В них (или в воде) проращивали свежеполученные споры того же штамма, в том числе в присутствии указанных антиоксидантов. Диффузат спор, проинкубированных вне листьев, анализировали тем же способом. Представлены средние ± SE, полученные в 3–26 независимых опытах с 4 аналитическими повторностями в каждом; прочерк означает “не измеряли”. В каждой строке достоверные отличия от варианта “без добавок” обозначены * или **, соответственно, для р ≤ 0.05 или р ≤ 0.01.

 

 Таблица 5. Влияние испытанных веществ на прорастание спор M. oryzae в воде

Среда 

инкубации спор Прорастание спор, %

Вода 81 ± 1

0.3 мМ BTH 83 ± 1

10 мМ БАМК 79 ± 1

10 мМ K2HPO4 73 ± 2**

0.02 мМ БР 75 ± 3

0.02 мМ МС 82 ± 1

0.1 мМ MPNO 9 ± 1**

 

Примечание. Прорастание спор подсчитано через 5 ч. Представлены средние ± SE, полученные в 3 независимых опытах с 4 аналитическими повторностями в каждом. 

** ― Достоверные отличия от водного контроля  при р ≤ 0.01.

 ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

 

Рис. 1. Влияние обработок 4-го листа риса 0.3 мМ BTH, 10 мМ K2HPO4, 10 мМ БАМК, 0.02 мМ БР, 0.02 мМ МС или 0.1 мМ MPNO на симптомы пирикуляриоза на 5-м листе, зараженном M. oryzae.

 

Рис. 2. Влияние обработок 4-го листа риса 0.3 мМ BTH, 10 мМ K2HPO4, 10 мМ БАМК, 0.02 мМ БР, 0.02 мМ МС или 0.1 мМ MPNO на (а) частоту симптомов пирикуляриоза на 5 листе, (б) генерацию O2.– и (в) фунгитоксичность в его диффузате или диффузате спор.

Капли воды или испытуемых веществ наносили на 4-й лист риса сорта Sha-tiao-tsao. Когда развивался 5 лист (через 810 суток), на него наносили капли воды или суспензии спор M. oryzae вирулентного штамма Н5-3; часть суспензии инкубировали вне листьев. Через сутки собирали диффузаты 5-го листа или спор, где определяли (а) генерацию радикала O2.– по окислению экзогенного адреналина и (б) фунгитоксичность по подавлению прорастания свежеполученных спор того же штамма. Через 10 суток после заражения оценивали симптомы болезни. Их частота выражена (а), как доля (%) инфекционных капель, оставивших инфекционные пятна совместимого типа (типы 4 и 5) или не оставивших пятен (0). Инфекционным пятнам несовместимого типа (1–3) соответствуют промежутки между столбцами, направленными вверх и вниз. На (а) представлены средние величины ± SE, полученные в 3–4 независимых опытах с 6–8 растениями в каждом; на (б) в 3–4 опытах с 6 аналитическими повторностями в каждом; на (в) в 3–26 опытах с 4 аналитическими повторностями. На (а) средние, достоверно (при р < 0.01) отличающиеся от обработанного водой контроля, обозначены звездочками (**); на (б) и (в) величины, достоверно (при р < 0.05) различающиеся между собой, обозначены разными буквами. На (а): ■ – совместимые симптомы, □ – бессимптомные исходы; на (б): диффузат здорового листа 1 – без СОД, 2 – + СОД, диффузат зараженного листа 3 – без СОД, 4 – + СОД, диффузат спор 5 – без СОД, 6 – + СОД; на (в): 1 – диффузат здорового листа, 2 − диффузат зараженного листа, 3 – вода, 4 – диффузат спор.

 

Рис. 3. H2O2-разрушающая активность диффузатов 5-го листа риса или спор M. oryzae. Влияние обработок 4-го листа 0.3 мМ BTH, 10 мМ K2HPO4, или 0.1 мМ MPNO.

Капли воды или испытуемых веществ наносили на 4-й лист риса сорта Sha-tiao-tsao. Когда развивался 5-й лист (через 810 суток), на него наносили капли воды или суспензии спор M. oryzae вирулентного штамма Н5-3; часть суспензии инкубировали вне листьев. Через сутки собирали диффузаты 5-го листа или спор, куда добавляли H2O2 в конечной концентрации 1 мМ. Через 1 ч ее анализировали с TiCl4. Количество перекиси, разрушенной в диффузатах, выражено, как часть (%) от концентрации в образце, где ее смешивали с водой. Представлены средние величины ± SE, полученные в 3–5 независимых опытах с 6 аналитическими повторностями в каждом. Достоверные (при р < 0.05) различия обозначены разными буквами. 1 – диффузат здорового листа, 2 − диффузат зараженного листа, 3 – диффузат спор.