УДК 581.1

Сезонные изменения первичных процессов фотосинтеза при низкотемпературной адаптации ХВОИ Pinus sylvestris В Центральной Якутии

© 2018 г. В. Е. Софронова1, *, Т. К. Антал2, O. В. Дымова3, Т. К. Головко3

1Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологических проблем криолитозоны Сибирского отделения Российской академии наук, Якутск

2Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, Москва

3Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук, Сыктывкар, Россия

Поступила в редакцию 06.06.2017 г.

С помощью методов индукции флуоресценции хлорофилла и ВЭЖХ изучено влияние осеннего снижения температуры на фотохимическую активность и электронный транспорт в фотосистеме II (ФС II), параметры нефотохимического тушения избыточной энергии и пигментный состав в хвое первого года Pinus sуlvestris L., произрастающей в условиях Центральной Якутии. Выявлено, что в период от начала сентября до конца первой декады октября количество хлорофиллов уменьшалось вдвое, а отношение Хл a/Хл b возрастало c 2.9 до 4.3–4.5, что указывает на деградацию периферических антенных комплексов. Снижение среднесуточной температуры до 4.9−6.4°С приводит к транзиторному росту квантового выхода нефотохимического тушения (ΔpH–зависимого параметра ϕNPQ). Наряду с этим медленно возрастала не регулируемая светом фракция зеаксантина. При дальнейшем снижении температуры до околонулевых значений содержание зеаксантина резко возрастало, а рН-зависимое тушение сменялось конститутивным тушением (параметр ϕf,D) обусловленным, по-видимому, структурной реорганизацией ФС II. Эти процессы сопровождались быстрым снижением функциональной активности ФС II, в основном, за счет нарушения фотохимического восстановления пластохинонов. Воздействие отрицательных температур −3.6…−12.1°С приводило к деструкции кислород-выделяющего комплекса в ФС II и полной инактивации реакционных центров ФС II. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что наибольшие изменения в состоянии фотосинтетического аппарата (ФСА) происходят в узком интервале околонулевых температур и продолжаются вплоть до инактивации ФС II под влиянием отрицательных температур.

 

Ключевые слова: Pinus sylvestris – хвоя – флуоресценция хлорофилла – фотосинтетические пигменты – сезонная динамика – низкотемпературная адаптация

 

 

 

________________________

Сокращения: Ант – антераксантин; АФК – активные формы кислорода; Вио – виолаксантин; ВКЦ – виолаксантиновый цикл; Зеа – зеаксантин; Кар – каротиноиды; β-Кар – β-каротин; КВК  кислород выделяющий комплекс; Ксант – ксантофиллы; Лют – лютеин; Нео – неоксантин; ПБК – пигмент-белковые комплексы; ППФ – плотность потока фотонов; ПХ – пластохиноны; PЦ – реакционные центры; 1O2* – синглетный киcлород; ФХ  флуоресценция хлорофилла; ФСА – фотосинтетический аппарат; ФС I – фотосистема I; ФС II – фотосистема II; Хл – хлорофилл; 1Хл* – синглетный хлорофилл; qE  энергизационый компонент нефотохимического тушения ФХ; NPQ  нефотохимическое тушение ФХ; QA  первичный хинонный акцептор электронов в ФС II; QB  вторичный хинонный акцептор электронов.

*Адрес для корреспонденции: Софронова Валентина Егоровна. 677000 Якутск, пр-т Ленина 41. Институт биологических проблем криолитозоны СО РАН. Электронная почта: vse07_53@mail.ru

 

  1. введение
  2. В северных широтах умеренной зоны, деревья воспринимают сокращение фотопериода и снижение температуры как сигнал о наступлении осени, остановке роста и начале холодового закаливания [1]. Снижение фотосинтеза у вечнозеленых хвойных растений в осенний период сопровождается адаптацией первичных процессов фотосинтеза, позволяющей избежать накопления избыточной световой энергии и генерации АФК в хлоропластах. В холодные сезоны года быстрые процессы нефотохимического тушения (qE) теряют эффективность из-за снижения электронного транспорта и низкой энергизации мембран. Поэтому важное значение приобретают независимые от света механизмы конститутивного тушения энергии в антенне [2, 3] и реакционном центре [4]. Механизмы адаптации могут включать инактивацию РЦ ФС II и структурно-функциональную реорганизацию ССК, обеспечивающую трансформацию в состояние с высоким нефотохимическим тушением за счет агрегации белков ССК II, накопления каротиноидов Зеа и Лют, обладающих фотозащитными и антиоксидантными свойствами, повышения экспрессии PsbS и ELIP белков [5–11]. Энергетический баланс между ФС II и ФС I в естественных условиях холодовой адаптации у хвойных контролируется через редокс-состояние пластохинона (ПХ), на которое существенное влияние оказывает усиление циклического транспорта электрона в ФС I и хлоропластного дыхания [2, 12].

    Для Центральной Якутии характерно быстрое по темпам снижение температуры, что приводит к установлению большего градиента между падением температуры и фотопериода по сравнению с регионами при той же широте с более мягким климатом. Также этот регион отличают нигде не повторяющиеся в Северном полушарии крайне низкие температуры зимой (средняя температура от ‒32.5 до ‒42.5°С). Эти особенности определяют специфику холодовой адаптации первичных процессов фотосинтеза вечнозеленых древесных растений.

    Pinus sylvestris (cосна обыкновенная) является исключительно холодоустойчивым видом [13, с. 194]. Сосновые леса занимают 8–9% площади бореальных лесов Якутии. В ходе холодовой адаптации, продолжающейся в Центральной Якутии примерно в течение 6–7 недель с начала сентября до середины октября, сезонное снижение среднесуточной температуры от 10−12°С до −3…−8°С и сокращение фотопериода с 16.5 до 10 ч формируют зимнее состояние ФСА, что позволяет сосне противостоять экстремально низким зимним температурам и, в последующем, успешно возобновлять фотосинтез в начале лета.

    В данной работе впервые проведены комплексные исследования процессов функциональной инактивации ФС II, нефотохимического тушения и пигментного состава у P. sуlvestris при формировании морозоустойчивого состояния в естественных условиях Центральной Якутии.

     

  3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
  4. Объект и условия произрастания растений. Pinus sylvestris L. вечнозеленый лесообразующий древесный вид бореальных лесов Якутии. Исследования проводили в 2014 г. в лесопарковой зоне на территории Ботанического сада Института биологических проблем криолитозоны СО РАН, расположенного на второй надпойменной террасе долины р. Лены (6215′ с.ш., 12937′ в.д.). Сбор полевых материалов осуществляли на постоянной пробной площадке. Возраст деревьев сосны – 15–18 лет, высота около 3–5 м.

    Температуру воздуха на участке регистрировали с помощью термографа DS 1922L iBitton (“Dallas Semiconductor”, США) с интервалом 1 ч. Освещенность регистрировали с помощью сенсора LI-190 (“LI-COR”, США) каждые 30 минут. Поступление солнечной радиации за день определяли как среднее получасовых измерений от восхода до захода солнца и выражали как величину плотности потока фотонов (ППФ) в мкмоль фотонов/(м2 с). Средняя температура воздуха за вегетационный период (май – сентябрь) 2014 г. составляла 13.6С, сумма осадков 145 мм. Погодные условия в период проведения эксперимента были типичными для Центральной Якутии.

    Измерение флуоресценции хлорофилла а (ФХ). Сезонную динамику кинетических кривых световой индукции ФХ (OJIP-кривых) отслеживали с 23 августа по 25 ноября 2014 г. с помощью PAR-FluorPen FP 100-MAX-LM (“Photon Systems Instruments”, Чехия) после темновой адаптации в течение 30 мин в полевых (август – сентябрь) или лабораторных (октябрь – ноябрь) условиях. OJIP-кривые индуцировали синим светом (‪λ = 455 нм) с ППФ 3000 мкмоль фотонов/(м2 с) в течение 3 с. При измерениях в лабораторных условиях побеги срезали за час до восхода солнца и транспортировали в течение 30 мин в лабораторию без доступа света в сумке-термостате при температуре, уравновешенной с естественной температурой воздуха. Далее немедленно проводили процедуру измерения без предварительного выдерживания растительного материала при комнатной температуре. Полученные кривые анализировали с использованием параметров JIP-теста [14]. ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

    Квантовые выходы фотохимического ϕPSII = (Fm' – Fs)/Fm', pH-зависимого нефотохимического тушения ϕNPQ = Fs/Fm' – Fs/Fm, и нерегулируемых потерь (конститутивное тушение) ϕf,D = Fs/Fm в хвое текущего года определяли с помощью флуориметра РАМ-2500 (“Walz”, Германия) [15]. Минимальную флуоресценцию (F0) возбуждали в адаптированных к темноте в течение 30 мин образцах с помощью зондирующих импульсов света (ППФ = 0.1 мкмоль фотонов/(м2 с), λ = 630 нм, длительность импульса 1 мкс, частота модуляции 200 Гц). Максимальный выход флуоресценции (Fm) индуцировали в адаптированных к темноте образцах зондирующими импульсами света, наложенными на мощную насыщающую вспышку света с частотой 100 кГц. Насыщающая вспышка характеризовалась ППФ 8000 мкмоль фотонов/(м2 с) с максимумом эмиссии при 630 нм и длительностью 400 мс. На адаптированных к свету образцах измеряли выход ФХ в стационарном состоянии Fs (технически измерение аналогично F0) и максимальную флуоресценцию Fm' (измерение аналогично Fm). На основании этих базовых параметров определяли характеристики фотохимических и нефотохимических процессов в ФС II.

    Измерения указанных параметров ФХ проводили с июля по сентябрь in situ в первой половине солнечного дня (11:00–13:00 часов). Для этого неотделенную хвою текущего года адаптировали к темноте в течение 30 мин и предварительно определяли Fm и F0. Затем образцы последовательно освещали в течение 10 мин актиничным светом при ППФ 5, 28, 65, 112, 190, 250 и 305, 460, 637 мкмоль фотонов/(м2 с). В конце каждого 10-минутного цикла, достаточного для перехода фотосинтеза в стационарную фазу, измеряли параметры Fs и Fm'. На основании этих параметров рассчитывали ϕPSII, ϕf,D и ϕNPQ.

    Анализ пигментов. Хвою текущего года отбирали со средней хорошо освещаемой части кроны до восхода солнца. Пробы фиксировали жидким азотом сразу же после отбора на месте произрастания растений и транспортировали в сосудах Дьюара в лабораторию. Фотосинтетические пигменты из растительного материала экстрагировали 100% ацетоном при 8−10C на слабом свету. Гомогенат центрифугировали 20 мин при 8000 g при температуре 4C. Содержание Хл и Кар в супернатанте определяли спектрофотометрически с использованием спектрофотометра Agilent 8453E (“Agilent Technologies Deutschland GmbH”, Германия) путем регистрации оптической плотности при длинах волн 662, 644 и 470 нм [16]. Сухую массу растительного материала определяли высушиванием параллельных проб (50 мг, 3‒4 повторности) до постоянного веса в сушильном шкафу при 100°С и основной погрешностью стабилизации температуры ±2°С.

    Для анализа состава каротиноидов фиксированные в жидком азоте пробы хвои высушивали на лиофилизаторе (“VirТis”, США). Лиофилизаты хранили при −80°С и использовали для анализа пигментов методом ВЭЖХ. Разделение индивидуальных Кар проводили с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (“Knauer”, Германия) в соответствии с модифицированным методом [17] после экстрагирования лиофилизатов 100% ацетоном. Для построения градуировочных кривых использовали стандарты чистых веществ (пигментов) (“Sigma” и “Fluka”, США).

    Полученные данные обрабатывали методом дисперсионного анализа (ANOVA) описательной статистики с уровнем значимости 0.05. Статистическую значимость различий между независимыми выборками оценивали с помощью критерия Фишера и теста Дункана. В таблице и на рисунках представлены средние арифметические величины и их стандартные отклонения. Определение биохимических показателей проводили в 3–5 биологических и в двух аналитических повторностях.


  5. Результаты
  6. Эксперименты проводили с начала августа по третью декаду декабря 2014 г. За это время среднесуточная температура воздуха снизилась с 21−22°С до −30…−46°С, а длина светового дня сократилась с 17.4 до 5.1 ч (рис. 1). Средняя ночная температура была на 35°С ниже. Начало слабых заморозков отмечали в середине третьей декады сентября, устойчивый переход ночной температуры через 0С – с 27 сентября. Сумма осадков составила в августе 43 мм, в сентябре и октябре – 25 и 11 мм соответственно. Снежный покров установился с 19 октября. К середине ноября его толщина составила 16 см, в декабре – 24–26 см.

    Проведенные исследования выявили снижение содержания Хл a и b в сформировавшейся однолетней хвое в осенний период (табл.). Основное уменьшение отмечали в течение первой и второй декады сентября. За этот период долгота светового дня сократилась с 16 до 12.7 ч, среднесуточная температура воздуха снизилась от 18.5 ± 6.0 до 6.2 ± 2.3С (рис. 1). Среднесуточные значения ППФ ФАР уменьшились от 540 ± 120 до 380 ± 160 мкмоль фотонов/(м2 с). С 19 по 26 сентября ночные и дневные температуры были равны 1.6 ± 2.4 и 4.0 ± 2.3С соответственно, при средней дневной интенсивности ФАР 305 ± 85 мкмоль фотонов/(м2 с). В дальнейшем, ночные и дневные температуры в течение двух последующих недель плавно снизились до −3.6…−5.6 и −2.3…−4.1С (рис. 1), а интенсивность ФАР – до 280 ± 85 мкмоль фотонов/(м2 с). В этих условиях, соответствующих второй фазе закаливания растений, темпы уменьшения фонда Хл заметно замедлялись. Содержание Хл (a + b) практически не изменялось после установления снежного покрова (19 октября) и низких отрицательных температур (−18…−46°С). Величина соотношения Xл a/Хл b составляла 2.9 в августе и возрастала до 3.9–4.5 в сентябре и первой половине октября вследствие того, что Хл b деградировал сильнее, чем Хл а (табл.).

    Наиболее выраженные изменения в составе каротиноидов наблюдали в сентябре (рис. 2). В августе на долю β-Кар приходилось 36%, а в октябре – около 23% общего фонда Кар. Основное уменьшение содержания β-Кар (до 26.3%) наблюдали до середины третьей декады сентября при постепенном понижении среднесуточной температуры от 16.3°С до околонулевых значений. В последующем, при воздействии слабых отрицательных температур (−3.5…−4.0°С) относительный вклад β-Кар снизился всего на 2.5% в течение десяти дней. Как видно на рис. 2, подобно β-Кар, ранние осенние изменения характерны и для Лют. К окончанию второй декады сентября относительное содержание Лют транзиторно возросло от 44 до 54%, но уже в конце сентября снизилось до 48%, а в начале октября составило около 45%.Тем не менее, зимой антенные ПБК в пересчете на Хл были обогащены Лют в 2.3−2.5 раза больше, чем летом (табл., рис. 2).

    Сумма ксантофиллов ВКЦ (Зеа, Вио, Ант) составила летом 8–10%, зимой − 23–24% от общего фонда каротиноидов. Доля пигментов ВКЦ практически не изменялась по мере снижения среднесуточной температуры до 5−6°С. В то же время доля сохраняющегося в ночное время суток Зеа возросла с 1.7 до 4.2% на фоне снижения относительного содержания Вио от 6.1 до 1.9%. Резкое увеличение содержания Зеа до 15.9 %, что в 9 раз больше по сравнению с августом, отмечали в конце сентября, когда среднесуточная температура воздуха снизилась до 2.2 ± 1.9°С, а средняя ночная температура составила 1.4 ± 0.4°С (рис. 2). В течение следующих 10 дней доля Зеа возросла еще на 6.8 %. В результате к середине октября доля Зеа превысила летние значения в 12.9 раз.

    Для оценки состояния первичных реакций фотосинтеза в хвое P. sylvestris проводили измерения OJIP-кривых (рис. 3). На кривых, измеренных в конце августа – начале сентября (кривые 1 и 2), отчетливо видны три основные фазы роста выхода ФХ, характеризующие последовательное светоиндуцированное восстановление акцепторной стороны ФС II (фаза OJ), пула пластохинонов (JI), и всей фотосинтетической ЭТЦ цепи, включая ФС I (IP) [18]. Из рисунка 3а видно, что начальный выход ФХ (О), соответствующий величине F0, снижался по мере уменьшения температуры. Это согласуется с данными по уменьшению общего содержания Хл в хвое (табл.). Изменения сопровождались снижением амплитуды OP (рис. 3а), соответствующей параметру Fv/Fm, который отражает максимальную фотохимическую активность ФС II.

    Относительная величина амплитуды JP характеризует способность ФС II восстанавливать ПХ пул [14]. Ее снижение свидетельствует о нарушении электронного транспорта на акцепторной или донорной стороне ФС II и о накоплении, так называемых, QВ-невосстанавливающих центров ФС II. Для оценки относительной величины JP, кривые OJIP нормировали на амплитуду OJ (рис. 3б). На рисунке видно, что амплитуда JP была максимальной в период с конца августа до начала сентября, а затем быстро снизилась почти до нуля в конце сентября. Кривые, измеренные в конце октября и ноябре, характеризовались начальным подъемом ФХ до уровня J и последующим снижением ФХ ниже начального уровня О (рис. 3б).

    Рис. 4 характеризует фотохимическую активность ФС II (параметр Fv/Fm) и способность ФС II к восстановлению пула ПХ (параметр (1 − Vj), где 1 − Vj является относительной амплитудой JP фазы) в связи с сезонными изменениями температуры среды. Параметры ФХ были автоматически рассчитаны из кривых на рис. 3. Максимальное снижение обоих параметров наблюдали в период с 19.09 по 6.10, когда температура изменялась незначительно, однако в этот период происходил переход через ноль (рис. 4а). Примечательно, что параметр (1 − Vj) достигал нулевых значений в начале октября, а параметр Fv/Fm – в конце октября, свидетельствуя о том, что сначала ФС II полностью теряла способность восстанавливать ПХ пул, а затем – способность к фотохимическому преобразованию световой энергии, то есть, к первичному разделению зарядов и восстановлению QА.

    Для выявления особенностей развития фотозащитных процессов отслеживали сезонную динамику фотохимической эффективности ФС II (ϕPSII), квантового выхода конститутивных потерь энергии (ϕf,D) и квантового выхода нефотохимического тушения (ϕNPQ) в периоды летней вегетации и осеннего закаливания хвои (рис. 5). На рисунке приведены результаты измерений параметров ФХ в стационарном состоянии фотосинтеза при интенсивности актиничного света 250 мкмоль фотонов/(м2 с), что примерно соответствует среднедневной освещенности во второй половине сентября, которая варьировала от 150 до 460 мкмоль фотонов/(м2 с) в зависимости от облачности. Необходимо отметить, что использование более высокой или низкой интенсивности актиничного света в пределах данного диапазона не оказывало существенного влияния на характер и закономерности сезонных изменений параметров ФХ.

    Сокращение фотопериода и осеннее похолодание индуцировало постепенное падение параметра ϕPSII с 0.7 летом до 0.4 в сентябре и более быстрое снижение до 0.2 при достижении околонулевых значений температуры. Величина параметра ϕNPQ составила 0.09 в начале августа, затем возросла в третьей декаде до 0.18…0.20. Максимальные значения ϕNPQ, 0.32…0.34, наблюдали во второй половине сентября при значениях среднесуточной температуры 1−6°С. При последующем понижении среднесуточных температур до 1…−3°С величина ϕNPQ резко снизилась (рис. 5). Значения параметра ϕf,D, характеризующего конститутивные нефотохимические потери энергии, выросли с 0.23−0.25 в середине сентября до 0.68 в конце сентября, когда среднесуточная температура опустилась с 4−6°С до 0…−3°С (рис. 5), и этот процесс сопровождался накоплением нерегулируемой фракции Зеа, сохраняющейся в ночное время (рис. 2).

     

  7. ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что низкие температуры снижают активность фотосинтеза, в первую очередь, реакций цикла Кальвина, индуцируя накопление неиспользованного восстановителя в строме хлоропласта и восстановление переносчиков фотосинтетической ЭТЦ, включая пул ПХ [2, 19]. Дополнительное накопление восстановленных форм НАД(Ф) и ПХ может происходить также в результате расщепления крахмала в хлоропластах мезофилла хвои в осенний период [13, с. 142]. Возникающий дисбаланс между световыми реакциями и фотосинтетическим метаболизмом углерода стимулирует генерацию АФК: синглетного кислорода в ФС II и супероксид-анион радикала в ФС I. Окислительный стресс вызывает деструкцию ФСА, тилакоидных мембран и других клеточных компонентов [2, 19]. В этих условиях возникает необходимость в структурно-функциональной реорганизации световых реакций фотосинтеза, в первую очередь комплекса ФС II, и в активации ряда фотозащитных и регуляторных механизмов, направленных на поддержание редокс гомеостаза и фотостаза в хлоропласте и подавление реакций окислительной деструкции. К основным фотозащитным механизмам можно отнести уменьшение активности и поперечного сечения поглощения ФС II, и рост диссипативных процессов в ССК и центрах ФС II [2, 4–9, 11].

В настоящей работе исследовали развитие фотозащитных процессов в хвое P. sylvestris в связи с сезонными изменениями окружающей температуры и фотопериода. Для этого измеряли пигментный состав и параметры ФХ в течение осенней холодовой адаптации. Согласно теории закаливания древесных растений [20, с. 160], эксперименты охватывали необходимые этапы формирования морозоустойчивого состояния растений – переход в состояние покоя, затем первую (днем около 5–12°С, ночью около 2–6°С) и вторую (от 0 до –10°С) фазы закаливания, а также зимний покой.

В течение осенней холодовой адаптации содержание Хл (a + b) в хвое уменьшалось в 1.8 раза (табл.). В отличие от других регионов с более мягким климатом [5–9], основное снижение Хл происходило быстрыми темпами в первой половине сентября в ответ на понижение среднесуточной температуры до 5–6°С, когда длина светового дня составляла 12.7…14.2 ч. Уменьшение концентрации Хл в хвое может отражать снижение содержания антенных хлорофилл-связывающих белков Lhcb (ФС II) и Lhca (ФС I) в ответ на понижение температуры [5, 8, 9]. По данным литературы [5], осенне-зимнее падение содержания Lhcb белков внешней антенны на 40–45% с сентября по декабрь в хвое P. sylvestris, произрастающей в северной Скандинавии (63°50' с.ш., 20°20' в.д.), сопровождалось снижением Хл в 1.7 раза. В основе этого явления лежит понижающая регуляция транскрипции и трансляции ядерных генов белков семейства Lhcb, обусловленная увеличением восстановленности пула ПХ в результате ингибирования реакций цикла Кальвина [2, 21].

Кроме общего снижения хлорофилла, нами выявлено преимущественное снижение Хл b по отношению к Хл а (табл.). Величина соотношения Xл a/Хл b в августе была равна 2.9, а к началу октября увеличивалась более чем в 1.5 раза. Для сравнения отметим, что в северной Скандинавии повышение величины Xл а/Хл b у P. sylvestris происходило постепенно и продолжалось с сентября по декабрь [5]. Хл b является необходимым и незаменимым компонентом периферической антенны ССК II [22]. Снижение содержания Хл b отражает уменьшение размера периферической антенны ФС II и, соответственно, потока энергии в реакционный центр, что способствует восстановлению баланса между поглощением и утилизацией энергии в фотосинтезе.

Исследование активности ФС II выявило ее максимальное падение в период с 19 сентября по 6 октября, когда среднесуточная температура постепенно снижалась с 3 до −3°С (рис. 4). Этот период соответствует завершению первой и началу второй фазы закаливания, когда происходил отток не связанной воды из клеток в межклетники [13, с. 195]. Действительно, в условиях Центральной Якутии к концу сентября в хвое у P. sylvestris резко возрастает содержание дегидрина 15 кД, ассоциированное с существенным уменьшением содержания воды в хвое [23]. По наблюдениям ряда авторов, обезвоживание тканей хвои сопровождается падением значений Fv/Fm [9]. К началу октября параметр Fv/Fm снизился до 0.25, что отражает резкое сокращение комплексов ФС II, способных осуществлять первичное разделение зарядов и восстановление QA. Снижение фотохимически активных центров ФС II связано, в первую очередь, с ускоренными темпами окислительной деструкции ФС II и нарушением ресинтеза D1 белка при околонулевых температурах [5, 8, 9].

При переходе через 0°С ФС II полностью теряла способность восстанавливать пул ПХ, о чем свидетельствуют нулевые значения параметра (1 − Vj) (рис. 4, кривая 2). Установлено, что у P. sylvestris при переходе через 0°C имеет место подавление подвижности ПХ в липидном бислое тилакоидных мембран [24], и это приводит к ингибированию электронного транспорта с ФС II в ПХ пул. Более того, реокисление акцепторной стороны ФС II блокировано в результате восстановленного состояния ПХ пула. Ингибирование реокисления ФС II может приводить к двухэлектронному восстановлению и протонированию QA, и его диссоциации от D2 белка РЦ [25]. Этот процесс инициирует фотоингибирование по акцепторному механизму в результате повышения вероятности рекомбинации P680+Pheo и последующей генерации триплетной формы P680 и 1O2*. Сохранению определенной доли активности комплексов ФС II при полном блокировании электронного транспорта в ПХ пул при отрицательных температурах (рис. 4, кривая 1) могут способствовать механизмы тушения энергии в антенне и РЦ [2, 4, 11].

По окончании второй фазы закаливания в конце второй декады октября при −8…−10°С завершается выход почти всей не связанной воды в межклетники с образованием внеклеточного льда [20, с. 202]. К этому времени оставшиеся комплексы ФС II полностью теряли остаточную фотохимическую активность (рис. 4) в результате разрушения КВК (рис. 3б). Форма индукционной кривой ФХ в этих условиях характеризовалась быстрым подъемом до максимума и последующим снижением ФХ (рис. 3б). Как известно, такие изменения отражают избирательное ингибирование КВК в ФС II [26]. Наши результаты находятся в соответствии с результатами работы [6], в которой обнаружено, что снижение среднесуточных температур до −10°С в зимние месяцы у вечнозеленых хвойных Abies lasiocarpa и Pinus contorta (40°02′ с.ш., 105°32′ з.д.) приводит к частичной деградации КВК ФС II.

В ответ на постоянные изменения освещенности, температуры и влажности в течение светового дня в антенне ФС II активируются процессы нефотохимического тушения (регулируемый qE компонент), вызванные светоиндуцированной энергизацией мембран в результате понижения pH люмена тилакоидов. Характеристические времена генерации и релаксации qE компонента составляют секунды и минуты. qE тушение включает несколько ключевых элементов: рост транстилакоидного ΔpH, изменение свойств антенных ПБК и аккумуляцию/активацию тушителей (PsbS белок, Зеа, Лют) [3], которые обеспечивают возможность функционирования этого механизма в достаточно широком диапазоне температурно-световых условий.

Согласно полученным нами результатам, сезонная динамика изменения квантового выхода NPQ (ϕNPQ ≈ ϕqE) показала наличие трех последовательных фаз (рис. 5): 1) постепенное повышение до максимальных значений с середины августа до середины сентября; 2) сохранение стабильно высоких значений 0.32–0.34 в сентябре при понижении среднесуточной температуры от 6.4 до 1°С; 3) быстрое падение в конце сентября, когда среднесуточные температуры понижались до 0…−3°С. Увеличение ϕNPQ во второй половине августа обусловленo сменой фаз годичного ростового цикла P. sylvestris при сокращении фотопериода. С вхождением в состояние органического покоя апикальной меристемы побегов хвои прекращаются ростовые процессы [13, с. 194], заметно снижается интенсивность фотосинтеза [27]. Среднесуточные и ночные температуры в начале второй половины сентября составляли 6.2 ± 2.3 и 4.5 ± 1.7°С соответственно (рис. 1). Примерно в этом диапазоне температур F. Busch с соавт. [7] наблюдали агрегацию тримеров ССК II в хвое Pinus banksiana. Это дает основания предположить, что адаптивные изменения в макроструктурной организации антенных ПБК ФС II, циклический электронный транспорт вокруг ФС I позволяют поддерживать высокие значения ϕNPQ осенью при низких положительных температурах (1–10°С).

При переходе через 0°С в ФС II резко ослабевали процессы нефотохимического тушения (ϕNPQ) (рис. 5). К этому времени ФС II полностью теряла способность восстанавливать пул ПХ (рис. 4, кривая 2) и, следовательно, генерировать транстилакоидный pH градиент. При околонулевых температурах резко возрастала величина конститутивного (рН-независимого) тушения ϕf,D (рис. 5). Максимальные значения ϕf,D наблюдались одновременно с достижением максимума содержания нерегулируемой фракции Зеа (рис. 2 и 5). Эти изменения свидетельствуют о комплексной низкотемпературной реорганизации ФС II, включающей конститутивное накопление Зеа, агрегацию тримеров ССК II и блокирование электронного транспорта в ПХ пул (рис. 4).

И так, полученные нами данные и имеющиеся в литературе сведения позволяют сконструировать целостное представление о сезонных изменениях первичных процессов фотосинтеза адаптации хвои P. sylvestris к чрезвычайно низким зимним температурам в Центральной Якутии. Выявленное нами раннее и быстрое по темпам сезонное снижение Хл и повышение величины соотношения Хл a/Хл b в течение первой фазы закаливания является следствием деградации внешней антенны ССК II и, соответственно, снижения поперечного сечения поглощения ФС II. Это предотвращает избыточное поглощение световой энергии и способствует поддержанию баланса между первичными реакциями фотосинтеза и углеродным метаболизмом. Адаптации подвергается также важнейший из механизмов кратковременных реакций ФСА – qE тушение в антенном комплексе. Оно возрастает одновременно с Зеа при снижении среднесуточной температуры до 4–6°C. В конце первой и начале второй фазы закаливания при 3…−3°С выявлена быстрая функциональная инактивация комплексов ФС II, механизмы которой включают подавление ресинтеза D1 белка и нарушение электронного транспорта в ПХ пул. Одновременно резко возрастает содержание Зеа, а регулируемое qE тушение быстро сменяется конститутивными формами с участием Зеа и Лют. При воздействии более низких температур −3.6…−12.1°С в течение второй фазы закаливания происходит полная инактивация ФС II в результате дезинтеграции КВК. Полученные в работе результаты позволяют сделать вывод о том, что наибольшие изменения ФСА происходят в узком интервале околонулевых температур, свидетельствуя о важной роли редокс-состояния и мобильности ПХ в регуляции адаптационных процессов и формировании морозоустойчивости хвои.

Финансовое обеспечение исследований осуществлялось из средств федерального бюджета на выполнение государственных заданий ИБПК СО РАН (регистрационный номер АААА-А17-117020110054-6) и ИБ Коми НЦ УрO РАН (регистрационный номер АААА-А17-117033010038-7). Т. К. Антал благодарит Российский научный фонд (проект № 14-50-00029) за поддержку в обработке и обсуждении JIP-тестов, участии в написании статьи.

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Chang Chr.Y., Fréchette E., Unda F., Mansfield Sh.D., Ensminger I. Elevated Temperature and CO2 stimulate late-season photosynthesis but impair cold hardening in pine // Plant Physiol. 2016. V. 172. P. 802–818.
  2. Ensminger I., Busch F., Huner N.P.A. Photostasis and cold acclimation: sensing low temperature through photosynthesis // Physiol. Plant. 2006. V. 126. P. 28–44.
  3. Ruban A.V., Johnson M.P., Duffy C.D.P. The photoprotective molecular switch in the photosystem 2 antenna // Biochim. Biophys. Acta. 2012. V. 1817. P. 167–181.
  4. Ivanov A.G., Sane P.V., Zeinalov Y., Simidjiev I., Huner N.P.A., Oquist G. Seasonal responses of photosynthetic electron transport in Scots pine (Pinus sylvestris L.) studies by thermoluminescence // Planta. 2002. V. 215. P. 457–465.
  5. Ottander C, Campbell D, Oquist G. Seasonal-changes in photosystem II organization and pigment composition in Pinus sylvestris // Planta. 1995. V. 197. P. 176–183.
  6. Zarter C.R., Adams W.W, Ebbert V., Cuthbertson D.J., Adamska I., Demmig-Adams B. Winter down-regulation of intrinsic photosynthetic capacity coupled with up-regulation of Elip-like proteins and persistent energy dissipation in a subalpine forest // New Phytol. 2006. V. 172. P. 272–282.
  7. Busch F., Huner N.P.A., Ensminger I. Increased air temperature during simulated autumn conditions does not increase photosynthetic carbon gain but affects the dissipation of excess energy in seedlings of the evergreen conifer Jack pine // Plant Physiol. 2007. V. 143. P. 1242–1251.
  8. Verhoeven A., Osmolak A., Morales P., Crow J. Seasonal changes in abundance and phosphorylation status of photosynthetic proteins in eastern white pine and balsam fir // Tree Physiol. 2009. V. 29. P. 361–374.
  9. Verhoeven A. Sustained energy dissipation in winter evergreens // New Phytologist. 2014. V. 201. P. 57–65.
  10. Софронова В.Е., Чепалов В.А., Дымова O.В., Головко Т.К. Pоль пигментной системы вечнозеленого кустарничка Ephedra monosperma в адаптации к климату Центральной Якутии // Физиология растений. 2014. Т. 61. C. 266–274.
  11. Софронова В.Е., Дымова О.В., Головко Т.К., Чепалов В.А., Петров К.А. Адаптивные изменения пигментного комплекса хвои Pinus sylvestris при закаливании к низкой температуре // Физиология растений. 2016. Т. 63. С. 461−471.
  12. Savitch L.V., Ivanov A.G., Krol M., Sprott D.P., Oquist G., Huner N.P.A. Regulation of energy partitioning and alternative electron transport pathways during cold acclimation of Lodgepole pine is oxygen dependent // Plant Cell Physiol. 2010. V. 51. P. 1555–1570.
  13. Судачкова Н.Е., Гирс Г.И., Прокушкин С.Г., Антонова Г.Ф., Вараксина Т.Н., Каверзина Л.Н., Кожевникова Н.Н., Козлова Л.Н., Коловский Р.А., Кудашова Ф.Н., Меняйло Л.Н., Милютина И.Л., Осипов В.И., Романова Л.И., Семенова Г.П, Стасова В.В., Шеин И.В., Александрова Л.П. Физиология сосны обыкновенной. Новосибирск: Наука, Сибирское отделение, 1990. 248 с.
  14. Strasser R.J., Tsimilli-Michael M., Srivastava A. Analysis of chlorophyll a fluorescence transient // Chlorophyll fluorescence: a signature of photosynthesis / Eds. Papageorgiou G. Govindjee C. Dordrecht/Boston/ London: Kluwer Academic Publishers, 2005. P. 321–362.
  15. Klughammer С., Schreiber U. Complementary PS II quantum yields calculated from simple fluorescence parameters measured by PAM fluorometry and the Saturation Pulse method // PAM Application Notes. 2008. V. 1. P. 27–35.
  16. Lichtenthaler H.K. Chlorophylls and carotenoids pigments of photosynthetic biomembranes // Methods in Enzymology. V. 148 / Eds. Colowick S.P., Kaplan N.O. San Diego: Academic, 1987. P. 350–382.
  17. Gilmore A.M., Yamamoto H.Y. Resolution of lutein and zeaxanthin using a non-endcapped, lightly carbon loaded C18 high performance liquid chromatographic column // J. Chromatogr. 1991. V. 35. P. 67–78.
  18. Antal T., Rubin A. In vivo analysis of chlorophyll a fluorescence induction // Photosynth Res. 2008. V. 96. P. 217–226.
  19. Климов С.В. Адаптация растений к стрессам через изменение донорно-акцепторных отношений на разных уровнях структурной организации // Успехи современной биологии. 2008. Т. 128. С. 282−300.
  20. Туманов И.И. Физиология закаливания и морозостойкости растений. М.: Наука, 1979. 350 с.
  21. Oquist G., Huner N.P.A. Photosynthesis of overwintering evergreen plants // Annu. Rev. Plant Biol. 2003. V. 54. P. 329–355.
  22. Sato R., Ito H., Tanaka A. Chlorophyll b degradation by chlorophyll b reductase under high-light conditions // Photosynth. Res. 2015. V. 126. P. 249–259.
  23. Татаринова Т.Д., Перк А.А., Бубякина В.В., Васильева И.В., Пономарев А.Г., Максимов Т.Х. Стрессовые белки-дегидрины в хвое Pinus sylvestris L. в условиях экстремального климата Якутии // Доклады Академии Наук. 2017. Т. 473. С. 233–236.
  24. Oquist G. Seasonally induced changes in acyl lipids and fatty acids of chloroplast thylakoids of Pinus sylvestris // Plant Physiol. 1982. V. 69. P. 869–875.
  25. Richter M., Rhule W., Wild A. Studies on the mechanism of photosystem II photoinhibition: II. The Involvement of toxic oxygen species // Photosynth. Res. 1990. V. 24. P. 237–243.
  26. Strasser B. Donor side capacity of Photosystem II probed by chlorophyll a fluorescence transients // Photosynth. Res. 1997. V. 52. P. 147–155.
  27. Vogg G., Heim R., Hansen J., Schafer C., Beck E. Frost hardening and photosynthetic performance of Scots pine (Pinus sylvestris L.). I. Seasonal changes in the photosynthetic apparatus and its function // Planta. 1998. V. 204. P. 193–200.


ПОДПИСИ К РИСУНКАМ
Рис. 1. Сезонное снижение среднесуточной температуры (1) и фотопериода (2) в период проведения исследований. Якутск (62°15' с.ш. и 129°37' в.д.), 2014 г. Представлены усредненные данные за сутки и световой день, соответственно. Интервал между измерениями температуры на опытном участке на высоте 2 м от грунта составлял 1 ч.
Рис. 2. Влияние снижения фотопериода (1) и ночных температур (2) (а) на содержание индивидуальных каротиноидов (% от суммы каротиноидов) в хвое текущего года Pinus sylvestris (б), где 1 – β-каротин, 2 – зеаксантин, 3 – лютеин, 4 – антераксантин, 5 – виолаксантин, 6 ‒ неоксантин. 2014 г.
Рис. 3. Индукционные кривые флуоресценции хлорофилла (OJIP), измеренные на хвое текущего года Pinus sylvestris с помощью прибора PEA (Hansatech, GB):
а – оригинальные кривые, б – кривые, нормированные на амплитуду фазы OJ (3 мс). Кривые 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 соответствуют измерениям, проведенным 23.08, 9.09, 19.09, 24.09, 6.10, 24.10 и 25.11. 2014 г., соответственно. Интенсивность возбуждающего света составляла 3000 мкмоль фотонов / (м2 с). Измерения проводили при температуре окружающей среды после 30 мин темновой адаптации. Каждая кривая получена путем усреднения как минимум 5 измерений.
Рис. 4. Изменения среднесуточной температуры (а) и параметров флуоресценции хлорофилла (б) при сезонной адаптации Pinus sylvestris. Параметры Fv/Fm и (1 − Vj) рассчитаны из кривых на рис. 3. 1 – Fv/Fm, 2 – 1 − Vj.
Рис. 5. Сезонные изменения среднесуточной температуры (а) и параметров фотохимического и нефотохимического тушения (б) в хвое первого года Pinus sylvestris. Индукцию ϕPSII (1), ϕNPQ (2) и ϕf,D (3) запускали актиничным светом интенсивностью 250 мкмоль фотонов/(м2 с). Измерения флуоресценции проводили на неотделенной хвое в полевых условиях. Все приведенные данные представляют среднее ± стандартное отклонение (n = 3–5).