УДК 581.1

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЕРЕМЕННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛОРОФИЛЛА ДЛЯ ОЦЕНКИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА РАСТЕНИЙ

 2016 г. В.Н. Гольцев*, Х.М. Каладжи**, М. Паунов*, В. Баба***, Т. Хорачек****,

Я. Мойски****, Х. Коцел****, С.И. Аллахвердиев*****,******,*******

*Кафедра биофизики и радиобиологии Биологического факультета Софийского университета им. Св. Климента Охридского, София, Болгария

** Кафедра физиологии растений, Варшавский университет естественных наук, Варшава, Польша

***Кафедра экологии растений, Институт Ботаники, Ягелонский Университет, Краков, Польша

****Институт технологий и естественных наук, Рашин, Польша

***** Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва

******Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино Московской обл.

*******Кафедра физиологии растений, биологический факультет, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,  Москва

Поступила в редакцию 24.02.2016 г.

Изучение поведения растений в разнообразных условиях окружающей среды требует наличия адекватных методов оценки протекаемых в растении процессов. Надежным источником информации о состоянии растения является фотосинтетический аппарат и его реакция на стрессовое воздействие. Одним из наиболее информативных методов мониторинга, основанных на измерении биофизических характеристик растений, является измерение и анализ излучаемого растением света флуоресценции хлорофилла а. Флуоресценция испускается в основном молекулами хлорофилла а антенных комплексов фотосистемы 2 (ФС II), но она связана не только с процессами в пигментной  матрице или реакционном центре ФС II, но также с окислительно-восстановительными реакциями на донорной и акцепторной сторонах, и даже во всей цепи переноса электронов. В настоящее время производится множество флуориметров, использование которых не требует специализированной подготовки, но для правильной интерпретации результатов необходимо иметь определенные знания для преобразования измеряемых прибором величин в необходимую информацию о состоянии исследуемого растения. Предлагаемый обзор предназначен для широкого круга специалистов, использующих флуоресцентные методы для мониторинга состояния растений. В ней в доступной форме даны теоретические основы излучения света молекулами хлорофилла, описаны механизмы формирования квантов переменной флуоресценции, показана связь отдельных характеристик свечения с окислительно-восстановительным состоянием переносчиков электронов и с реакциями световой фазы фотосинтеза. Подробно описаны подходы к обработке и анализу данных и извлечения информации из индукционных кривых переменной флуоресценции, основанные в разработанной профессором Рето Й. Страссером теории потоков энергии в фотосинтетическом аппарате, оформленной в виде „JIP-теста“. Для каждого вычисляемого параметра подробно описан физический смысл и его связь с определенными фотосинтетическими характеристиками, а также даны примеры использования параметров для оценки физиологического состояния растений. 

----------------------------------

Сокращения: РЦ – реакционный центр; ССК – светособирающей комплекс; Фл – флуоресценция; ФС I – фотосистема I; ФС II – фотосистема II; CS – Cross Section, возбуждаемая единичная площадь поверхности фотосинтезирующих объектов; ETR – Electron Transport Rate, скорость электронного транспорта; P680 – реакционный центр ФС II; PPFD – Photosynthetic Photon Flux Density, плотность потока фотосинтетически активных фотонов.

 

Адрес для корреспонденции: Гольцев В.Н. Болгария, 1164 София, бул. Драгана Цанкова, 8, Кафедра Биофизики и Радиобиологии Биологического факультета Софийского университета им. Св. Климента Охридского, Электронная почта: goltsev@biofac.uni-sofia.bg; Аллахвердиев Сулейман Ифхан оглы. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: suleyman.allakhverdiev@gmail.com

 

Ключевые слова: растения – флуоресценция хлорофилла а – JIP-тест – фотосистема II – стресс

ВВЕДЕНИЕ

Растительные организмы существуют в постоянном взаимодействии с окружающей средой. Условия среды обитания часто неблагоприятны для жизнедеятельности растения. Продуктивность реальных посевов или выживание растительных видов в природных условиях сильно зависят от факторов среды обитания. При культивировании растительных культур в оптимальных условиях продуктивность определяется эффективностью фотосинтетического аппарата.

В природных условиях жизненность каждого организма в экосистеме зависит от его способности адаптироваться к условиям среды обитания. Для эффективного управления сельскохозяйственных культур, садов, лесов, природных территорий необходимы различные способы оценки физиологического состояния растений, их жизненности, а также наличия и уровня стресса. В процессе создания растений с высокой устойчивостью к стрессовым факторам окружающей среды важным аспектом являются экспериментальные подходы, способные обеспечить возможность наблюдать в условиях in vivo физиологическое состояние растений, их реакцию на приложение стрессового воздействия, а также давать оценку потенциальных возможностей растения выжить в неблагоприятных условиях среды.  

Для реализации таких целей необходимо использовать экспериментальный метод, который с одной стороны недеструктивен и позволяет проведение исследований в естественных (нативных) для растения условиях, а с другой – максимально информативен, что позволит делать мультипараметрическую оценку стрессовой реакции, учитывая широкий спектр процессов, протекающих в растительной клетке [1]. Для возможности рутинного использования подобного теста необходимо, чтобы он удовлетворял дополнительным важным характеристикам: легкость использования, короткое время измерения, легкость и однозначность интерпретации данных, возможность автоматизации измерений, автономность аппаратуры (для проведения полевых измерений) и желательно, чтобы для получения информационного сигнала от исследуемого объекта не требовалось дорогостоящих расходных материалов. 

Очень чувствительным методом, который позволяет оценить изменения общего биоэнергетического статуса растения является метод флуоресценции хлорофилла [2, 3]. Изменения излучения флуоресценции прямо или косвенно относятся ко всем этапам световой фазы процесса фотосинтеза: фотолизу воды, переносу электронов, генерации градиента рН на мембранах тилакоидов и синтезу АТФ.

Измерения флуоресценции хлорофилла применялись в сельскохозяйственной практике [4, 5], садоводстве [6], лесном хозяйстве [7], для оценки качества семян [8], исследования окружающей среды [9], в растениеводстве, при хранении пищевых продуктов и переработки овощей и фруктов [10].

Флуоресценция хлорофилла была также использована для прогнозирования урожайности в различных экологических условиях [4]. В последние годы параметры флуоресценции хлорофилла используются в качестве критериев для селекции растений в селекционных программах [11]. В настоящем обзоре мы рассмотрим экспериментальный подход, который базируется на измерении в условиях in vivo и анализе переменной флуоресценции хлорофилла а. В начале будет дан анализ современных представлений о механизмах излучения флуоресценции хлорофилла растениями и связи кинетических характеристик излучения с реакциями и процессами в фотосинтетическом аппарате растительной клетки на мембранном и молекулярном уровне. Будут рассмотрены основные экспериментальные методы и аппаратура для регистрации данного излучения, а также подходы для анализа сигнала флуоресценции, вычисления определенных параметров и для общей оценки физиологического состояния растений. 

ПЕРЕМЕННАЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ ХЛОРОФИЛЛА А – ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ ИНДИКАТОР ПЕРВИЧНЫХ ПРОЦЕССОВ ФОТОСИНТЕЗА

Механизмы излучения флуоресценции молекулами хлорофилла

Вещества могут излучать свет в оптической спектральной области при нагревании [12] или в результате люминесценции. По определению Словаря терминов IUPAC [13] люминесценция – это спонтанное излучение радиации электронно- или вибрационно- возбужденными молекулярными частицами или вибрационно-возбужденными, но не находящимися в тепловом равновесии с окружающей средой молекулярными частицами. По определению С.И. Вавилова люминесценцией тела в данной спектральной области называется избыток излучения над температурным при условии, что это избыточное излучение обладает конечной длительностью, превышающей период световых колебаний. 

В первой части данной формулировки Вавилов отделяет люминесценцию от теплового излучения, а во второй – от рассеянного телами света. Люминесценция излучается возбужденными молекулами, причем источник энергии возбуждения может быть различным. В зависимости от вида энергии используемой для возбуждения – могут существовать различные виды люминесценции. Возбуждение молекул при протекании некоторых химических реакций может приводить к хемилюминесценции. В частности, если такие реакции протекают с участием ферментативных систем в клетках некоторых организмов, говорят о биолюминесценции. При протекании электрического тока в газо-разрядных трубках возникает свечение, называемое электролюминесценцией.  Если источником энергии для возбуждения молекул является ионизирующая радиация – говорим о радиолюминесценции, звуковые волны (ультразвук) – сонолюминесценция, при механическом воздействии на твердые тела (например, трение поверхностей) – может возникать триболюминесценция. При нагревании физических или биологических систем, которые содержат долгоживущие метастабильные состояния, может испускаться свечение, называемое термолюминесценцией [14]. Наиболее распространенным видом люминесценции является фотолюминесценция. В этом случае источником энергии возбуждения молекул является поглощенная энергия инфракрасного, видимого или ультрафиолетового света [13]. 

При поглощении фотона молекула оказывается в возбужденном состоянии (рис.  1). В зависимости от количества поглощенной энергии молекула попадает на один из энергетических уровней. За время порядка пикосекунды часть энергии возбужденной молекулы расходуется на колебательные движения ядер и поступательное движение молекул растворителя, т.е. рассеивается в тепло и молекула релаксирует до самого низкоэнергетического вибрационного уровня электронно-возбужденного состояния. Как правило, это первое синглетно-возбужденное состояние молекулы.  

Обратный переход молекулы из синглетно-возбужденного (S1) в основное (S0) состояние сопровождается либо рассеиванием энергии возбуждения, которая растрачивается на колебательные движения ядер и поступательное движение молекул растворителя, т.е. превращается в тепловую энергию (константа скорости процесса – kd), либо излучением кванта света, называемого флуоресценцией (kf). Излучательный переход может наблюдаться и в триплетно-возбужденных молекулах. В этом случае наблюдается второй вид фотолюминесценции, называемый фосфоресценцией [15]. При достаточно высоких температурах (~ 20°C) триплетно-возбужденные молекулы могут осуществлять обратный переход на уровень S1 с последующим излучением света замедленной флуоресценции [16]. Для обратного перехода молекула нуждается в поглощении дополнительной энергии, источником которой может быть тепловая энергия окружающих молекул растворителя (замедленная флуоресценция Е-типа). Вторично возбужденные синглетные молекулы могут образоваться при рекомбинации двух триплетов (замедленная флуоресценция Р-типа). 

Основным пигментом в практически всех оксигенных фотосинтезирующих организмах является молекула хлорофилла а [17]. Молекулы хлорофилла а, ассоциированные с антенными комплексами выполняют в основном светособирающую функцию. При наличии в микроокружении возбужденной молекулы подходящих молекул, способных взаимодействовать с ее электронной оболочкой, возбуждение с высокой скоростью мигрирует по соседним молекулам пигментов. Несмотря на случайный характер единичного акта переноса, миграция в целом направлена от периферических молекул к фотохимически активной молекуле реакционного центра.   

Возбужденная молекула пигмента в антенных комплексах может участвовать в нескольких процессах, приводящих к дезактивации возбуждения, которые конкурируют с излучательным переходом. Квантовый выход флуоресценции, φf, зависит от соотношения констант скоростей излучательного и всех безызлучательных процессов дезактивации (ур. 1):

 

,

(1)

 

где буквами kf, kd, kp, kt, kic, kq представлены константы скоростей флуоресценции, внутренней конверсии, фотохимической реакции, миграции возбуждения на соседние молекулы, интеркомбинационнной конверсии и тушения возбуждения молекулами тушителей. Время жизни возбужденного состояния молекулы, которое будет равно и экспериментально определяемой скорости затухания флуоресценции (τ), определяется суммарной скоростью процессов дезактивации энергии возбуждения молекулы:

 



(2)

Интенсивность излучения флуоресценции пропорциональна скорости поглощения света молекулами пигмента (Ia) и квантовому выходу флуоресценции (φf): 

 

F = Ia.φf 

(3)

В растворе хлорофилл а флуоресцирует с квантовым выходом 20-35% и затухает со временем жизни 6-20 нс, в то время как у молекул хлорофилла а, ассоциированных с белковыми молекулами хлорофиллы антенных комплексов тилакоидных мембран, φf ≈ 2-10% [18], а времена затухания – порядка 1-2 нс [19]. При комнатной температуре флуоресценция в основном испускается антенными комплексами Фотосистемы II (ФС II), а вклад Фотосистемы I (ФСI) составляет 5-30% у С3 растений [18], но может значительно увеличиться при низких температурах, или при регистрации испускания длинноволнового света. Большинство квантов флуоресценции излучается антенной комплекса – белками CP43 и CP47 [20].

При постоянной скорости поглощения интенсивность излучаемой фотосинтезирующим объектом флуоресценции определяется скоростью конкурирующих с флуоресценцией процессов – рассеивания энергии возбуждения в тепло (все не связанные с фотохимической реакцией процессы объединены под общим названием «нефотохимическое рассеивание» или «нефотохимическое тушение» с константой скорости kN), и (фотохимическая реакция в реакционном центре ФС II с константой скорости kP):

 



(4)

Константа нефотохимического рассеивания энергии возбуждения представляет собой суперпозицию констант скоростей флуоресценции, внутренней конверсии, дисипации возбуждения молекулами тушителей или миграции энергии возбуждения к ФСI (kT): 

 



(5)

Несмотря на то, что флуоресценция излучается в основном молекулами антенного хлорофилла а в ФС II, исходя из уравнений (4 и 5) интенсивность свечения связана с соотношением скоростей утилизации энергии возбуждения в каждой молекуле, в антенном комплексе, ее перераспределения между фотосистемами, а также скорости фотохимических процессов. Кроме того, в последние несколько десятилетий разработан экспериментальный подход, позволяющий связать интенсивность флуоресценции с реакциями переноса электронов между двумя фотосистемами [1, 21-23]. В следующей главе рассмотрим этот подход, связанный с анализом фотоиндуцированных изменений флуоресценции в адаптированных к темноте фотосинтезирующих образцах. 

Динамика переменной флуоресценции – индукционные кривые

Флуоресценция хлорофилла а представляет собой вторичное излучение световой энергии, поглощенной молекулой хлорофилла. Часть поглощенной энергии, которая теряется для процесса фотосинтеза в виде флуоресценции, мала и, хотя составляет по величине только от 3 до 5%, является для нас источником важной информации. Флуоресценция хлорофилла а (Фл) во время фотосинтеза является мерой энергии поглощаемых квантов света, которые не были использованы в процессе фотосинтеза. При нормальной и эффективной работе фотосинтетических реакций интенсивность Фл хлорофилла а остается низкой, а любое нарушение процесса фотосинтеза понижает его эффективность, что приводит к значительному увеличению Фл [24].

При освещении фотосинтезирующих объектов, предварительно адаптированных к темноте, интенсивность флуоресценции меняется во времени, претерпевая характерную динамику, называемую индукцией переменной флуоресценции [25] или кривыми Каутского [26]. История изучения флуоресценции и индукционных кривых (ИК) подробно рассмотрена в [20, 27] или на сайте www.fluoromatics.com/kautsky_effect.php.

Индукционную кривую можно разделить на две фазы – быструю фазу нарастания флуоресценции, начинающуюся в момент включения освещения (уровень “О“) и заканчивающуюся за время меньшее 1 с (“Р“), и медленную фазу преимущественного затухания свечения от максимума до стационарного светового уровня (уровень “Т″, рис. 2б). Как нарастание к максимуму, так и последующий спад к стационару, как правило, многофазны [20, 22, 23, 28-30], т.е. представляют несколько фаз подъема и спуска с различными характеристическими временами. Форма фотоиндуцированных переходов индукционной кривой флуоресценции отражает кинетику процессов в фотосинтетическом аппарате, влияющих на квантовый выход флуоресценции. Поэтому наиболее информативные точки на кривой получили собственные имена, последовательно обозначенные как “O″, “J″, “I″, “P″, “M″, “S″ и “T″, согласно современной номенклатуре Strasser и Govindjee [31, 32] для быстрой фазы и Papageorgiou и Govindjee [33, 34] для медленной фазы переходов.  

Начало интерпретации кинетики переменной части флуоресценции положено Duysens и Sweers [35]. Согласно их гипотезе, поддержанной позже Butler [36], реакционные центры ФС II могут находиться в двух альтернативных состояниях, различающихся по квантовому выходу флуоресценции – „открытом″ и „закрытом″ Состояние реакционного центра считают открытым, если возбуждение реакционного центра может привести к фотохимической реакции. В этом случае поглощенная энергия кванта света используется для фотосинтеза и квантовый выход флуоресценции низкий. Причиной “закрывания″ реакционного центра является восстановление хинонового акцептора электронов в ФС II, QA. 

Согласно теории обратимой радикальной пары Шатса (reversible radical pair, RRP) [18, 37, 38] первичная фотохимическая реакция в реакционном центре ФС II обратима (схема 1):  



Схема 1. Схема процессов в ФС II и реакционном центре (РЦ), приводящих к излучению переменной флуоресценции. 

С другой стороны, и процесс переноса энергии возбуждения от антенны на хлорофилл РЦ протекает в равновесии с обратным процессом, т.е. Согласно гипотезе, первоначально предложеной Duysens и Sweers [35] и впоследствии разработанной Butler [39], флуоресценция имеет минимальные значения, когда первичный хиноновый акцептор QA окислен. При этом реакционные центры ФС II с окисленным хиноновым акцептором называются “открытыми″, а с восстановленным – „закрытыми″. Эффективность испускания флуоресценции “закрытыми” РЦ приблизительно в 5 раз превышает квантовый выход “открытых″ центров [30]. Дополнительная флуоресценция, излучаемая фотосинтезирующими объектами и превышающая уровень минимальной флуоресценции называется переменной флуоресценцией. Флуоресценция ФС I не зависит от окислительно-восстановительного состояния РЦ или электронных акцепторов и не участвует в переменной флуоресценции, однако вносит некоторый вклад в постоянную флуоресценцию (F0) и макс. кв. выход флуоресценции Fv/F0. 

Это связанно с относительной стабильностью P700+, в то время, как P680+ быстро получает электрон от YZ. В "закрытых” РЦ ФС I стабильный P700+ улавливает энергию возбуждения хлорофиллов антенных комплексов и превращает ее в тепло, поэтому флуоресценция остается низкой [40]. Franck и соавт. [41] оценивают вклад флуоресценции ФС I, сравнивая спектры излучения флуоресценции открытых и закрытых РЦ; их данные показывают, что вклад ФС I в общее излучение открытых РЦ составляет 40%.  

Переменная флуоресценция описывается в рамках вышеупомянутой модели обратимой радикальной пары [37, 42], согласно которой возбужденные состояния антенных хлорофиллов и P680 находятся в равновесии, а с другой стороны существует частичное равновесие между P680*I и P680+I–. Более ранняя гипотеза, предложенная, Климовым и Аллахвердиевым [43, 44], предполагает, что переменная флуоресценция является результатом излучательной рекомбинации пары P680+I– в закрытых РЦ. Согласно Schatz и соавт. [37], что подтверждено и другими авторами [45], в реакционных центрах с восстановленным хиноновым акцептором (QA–) разделение заряда сильно ограничено наличием сильного электростатического отталкивания. В таком случае участие рекомбинации в переменной флуоресценции будет незначительно.

Изменения интенсивности флуоресценции связанно с процессами в и около реакционного центра ФС II, приводящими к изменению окислительно-восстановительного состояния акцепторов и квантового выхода свечения (рис. 3). В темноте все фотосинтетические реакционные центры "открыты" и могут быть возбуждены, так как все электронные переносчики ФС II находятся в окисленном состоянии. На момент включения фотохимически активного освещения (AL, от англ. actinic light – дозa светa, которая вызывает фотохимические изменения) начинается быстрая фаза индукции флуоресценции. Интенсивность AL, как правило, определяется на уровне от 200 до 500 мкмоль/м2 с. Измерения значения Фл хлорофилла в первой точке индукции должны быть завершены не более чем за 40 мкс (на индукционной кривой – точка O). Эта величина называется начальной флуоресценцией (F0 или FО), которая в основном связана с потерями энергии в ФС II антенны пигмента [30]. Увеличение выхода Фл хлорофилла от FО до FP проходит в несколько этапов и зависит от правильного функционирования акцепторов и доноров электронного транспорта в ФС II и эффективности взаимодействия между фотосинтетическими единицами, что определяет возможность переноса энергии возбуждения между соседними реакционными центрами. 

В результате разделения зарядов в возбужденном реакционном центре ФС II электроны P680  восстанавливают феофитин (Фео),  первичный акцептор фотосистемы II. От Фео– электрон переносится к QA (пластохинону, связанному с D2 белком на участке QA) – первичному стабильному акцептору ФС II. С восстановлением первичного хинона реакционные центры переходят в „закрытое“ состояние и интенсивность флуоресценции увеличивается. Одновременно с этим процессом в „закрытых“ центрах происходит ре-окисление QA– окисленными молекулами вторичного хинона (QB) и далее – остальной частью электрон-транспортной цепи, что приводит к замедлению нарастания флуоресценции. После 2-5 мс освещения исследуемого объекта восстановление акцептора заканчивается, так как скорости восстановления и ре-окисления хинона QA выравниваются и флуоресценция доходит до уровня в точке J. Во время постепенного восстановления следующих акцепторов в электрон-транспортной цепи (подвижный пластохинон (ПХ), цитохромный b6f комплекс и акцепторы ФС I) интенсивность Фл хлорофилла увеличивается от точки J до точки I, этот процесс длится от 3-5 до 30 мс. Восстановление пула пластохинонов сопровождается одновременным его окислением за счет работы ФС I. На уровне I наступает равновесие между скоростями переноса электронов к ПХ-пулу и от него через ФС I – к ее акцепторам (НАДФ+ и др.). После окончательного восстановления наличных акцепторов ФС I флуоресценция достигает своего максимума (FP) в точке P, что соответствует (при данной интенсивности действующего света, AL) достижению максимальной восстановленности акцепторов ФС II и самому низкому выходу фотохимических реакций (рис. 3). Площадь над кривой быстрой фазы индукции Фл хлорофилла (закрашенная серым площадь на рис. 3, AM) свидетельствует о количестве имеющихся акцепторов электрона в ФС II [30]. В фазе между точками P и S наблюдается некоторый спад флуоресценции, который связывают с окислением пула акцепторов ФС I, с ускоренной передачей энергии возбуждения от ФС II к ФС I и увеличением концентрации протонов во внутреннем пространстве тилакоидов (люмене) и формированием протонного градиента (ΔpH) между люменом и стромой хлоропластов. Это способствует интенсификации процессов фотофосфорилирования и начала темновой фазы фотосинтеза. Через несколько секунд после начала освещения (от 5 до 9 с) интенсивность флуоресценции вновь возрастает (между точкой S и точкой М) в связи с замедлением линейного потока электронов между фотосистемами протонным градиентом по механизму отрицательной обратной связи (down-regulation). Через несколько секунд (3-5 с) увеличение продукции АТФ и активация флавин-НАДФ-оксидоредуктазы (ФНР) и связанное с ними производство восстановленного  НАДФ-Н снова приводит к активации цикла Кальвина-Бенсона, усилению линейного потока электронов и снижению Фл хлорофилла, которое продолжается несколько минут, пока не достигнет своего стационарного выхода – точки T (на англ. terminal fluorescence level). Снижение флуоресценции в этот период связанно с фотохимическим и нефотохимическим тушением возбуждения молекул хлорофилла а в антенных комплексах ФС II.  Время, необходимое для достижения этого уровня, сильно зависит от физиологического состояния растений и стадии их развития [5]. Достижение стационарного уровня излучения Фл хлорофилла указывает на то, что достигнуто равновесие между производством соединений, обладающих высокой свободной энергией (НАДФ-Н и АТФ) в фотохимических реакциях световой фазы, и использованием этих продуктов в биохимических реакциях темновой фазы (рис. 3). 

Методы измерения флуоресценции хлорофилла

Измерение Фл хлорофилла требует разделения измеряемого сигнала от возбуждающего света, который вызывает фотохимические реакции фотосинтеза и возбуждает сопровождающую их флуоресценцию хлорофилла в фотосинтетическом аппарате, при этом часть непоглощенного света отражается от поверхности листа или рассеивается внутренними структурами. Для измерения флуоресценции хлорофилла используют спектрофлуориметры, у которых принцип измерения основан на эмиссионной спектроскопии. До настоящего времени разработан ряд методов измерения Фл, и широкий спектр флуориметров. Наиболее практичными и часто используемыми методами измерения являются прямая регистрация Фл и модулированная флуоресценция. 

Прямая регистрация флуоресценции хлорофилла

Измерение производится после адаптации фотосинтезирующего объекта к темноте (около 20-30 мин). Образец освещается непрерывным светом длиной волны короче 670 нм (что достигается с помощью оптических фильтров или специальных диодов или диодных лазеров). С включением возбуждающего света фотоприемник регистрирует свет флуоресценции хлорофилла в диапазоне длин волн примерно от 680 нм до 760 нм. По характеру кривой индукции флуоресценции можно судить о некоторых характеристиках фотосинтетического аппарата образца и динамике протекания реакций фотосинтеза [5]. В конце фазы индукции Фл хлорофилла (достижения постоянного уровня FT) при непрерывном освещении образца флуориметр измеряет стационарную интенсивность флуоресценции хлорофилла (рис. 3).

Описанная выше типичная система измерения Фл хлорофилла называется системой с постоянным возбуждением (от англ. continuous-excitation type chlorophyll fluorescence system). Она состоит из источника возбуждающего света около 3500 мкмоль/м2 с с длиной волны около 625 нм и детектора с фильтром, пропускающим только излучение с λ > 700 нм (рис. 4). Детектор, регистрирующий Фл хлорофилла, передает сигнал на усилитель, а затем сигнал преобразуется в цифровой вид и загружается в микропроцессор для расчета требуемых параметров флуоресценции.

При использовании этой методики определяются следующие параметры (подробнее они описаны в следующей главе): 

FO начальная (нулевая) флуоресценция; 

FM максимальная флуоресценция; 

FV = FM-F0 переменная флуоресценция; 

FV / FM максимальная квантовая эффективность ФС II; 

tFM время для достижения FM; 

PI индекс производительности ФС аппарата;

AM площадь поверхности над индукционной кривой

  флуоресценции хлорофилла.

 

Благодаря быстрому развитию технологий современные флуориметры могут регистрировать основные параметры Фл, определяемые по форме начальной фазы кривой Каутского. Аппараты оснащены источником света высокой интенсивности (выше 2500 мкмоль квантов/м2 с) и фотоприемником с микропроцессором, которые обеспечивают быстрое и точное проведение измерений (разрешение по времени – 10 мкс), что позволяет мерить интенсивность флуоресценции на коротких временах, в том числе на начальных фазах индукции (рис. 5). Таким образом, по флуоресценции можно наблюдать ход первичных реакций фотосинтеза. При детальном анализе измеряемых сигналов (JIP-тест) можно оценить воздействие целого ряда стрессовых факторов на растения [3, 29, 46]. 

Модулированная флуоресценция хлорофилла а

При измерении модулированной флуоресценции хлорофилла – на базе системы PAM (от англ. Pulsе Amplitude Modulation) [47], для возбуждения Фл хлорофилла используется источник, излучающий модулированный свет, который включается и выключается через определенные промежутки времени, и детектор, регистрирующий только переменную составляющую индуцированной в образце флуоресценции (рис. 6). Таким образом, Фл хлорофилла может быть измерена в присутствии дополнительного источника действующего света с любым спектральным составом, а также солнечного света.

При этой системе измерения свет включается на короткое время (1-3 мкс), этот интервал времени достаточен для определения импульса Фл хлорофилла. На детектор этого аппарата попадают три вида световых сигналов (рис. 6): 

Рассеянный от поверхности объекта действующий свет (непрерывное освещение); 

Сигнал флуоресценции объекта, индуцированной действующим светом (непрерывный сигнал), 

Импульсно-индуцированный сигнал флуоресценции, возбуждаемой модулированный светом. Именно этот сигнал флуоресценции усиливается в электронном виде, а другие, не импульсные сигналы, игнорируются.

Измерения могут проводиться на целых листьях или их частях, а также на суспензиях хлоропластов или клеток водорослей, адаптированных к темноте или на свету.

Техника с использованием PAM-технологии позволяет надежное измерение уровня начальной флуоресценции, F0, так как измерительный луч света имеет такую нискую интенсивность, что не инициирует фотохимические реакции. При использовании системы PAM измерение начинается включением очень слабого импульсного луча модулированного излучения, ML (от англ. Modulated Light), который вызывает флуоресценцию хлорофилла (рис. 6а). Источником ML являются светоизлучающие диоды (LED), которые испускают излучение в красной области спектра (как правило, λmax = 650 нм). Это излучение очень слабое и не вызывает индукционные процессы в листьях, а возбуждение Фл хлорофилла происходит в основном путем потерь энергии при ее миграции по антенне и, следовательно, его значение можно принять за F0 (рис. 7). Затем включается насыщающий импульс, SP (англ. Saturating Pulse). Это короткий (например, 0.8 с) и очень мощный импульс света, интенсивность которого может доходить до 20 000 мкмоль/м2 с (источником может быть галогеновая лампа). Под влиянием восстановления всех акцепторов в ФС II, временно блокируются фотохимические реакции, в результате чего резко повышается выход Фл. Интенсивность флуоресценции в предварительно адаптированном к темноте объекте достигает максимального значения (FM). После снижения уровня Фл до исходного темнового значения F0 включается непрерывный действующий свет, AL (так называемый Actinic Light) с заданной плотностью потока фотосинтетически активных фотонов, PPFD (от англ. Photosynthetic Photon Flux Density), как правило – от 200 до 3000 мкмоль/м2 с, (галогеновая лампа). При этом наблюдается увеличение выхода Фл, которая достигает максимального значения FP, характерного для данной интенсивности AL. В течение следующих нескольких минут эффективность Фл уменьшается, достигая стационарного уровня FT, что означает уравновешивание всех реакций на различных этапах фотосинтеза [5].

После 240 секунд с момента включения освещения AL, включается второй импульс, SP, который восстанавливает акцепторы электронов ФС II и временно блокирует фотохимические реакции. Под влиянием этого импульса наблюдается повышение уровня Фл до F’M, который ниже, чем FM. Разница между FM и F’M связана с нефотохимическим тушением флуоресценции 48. Измерения Фл хлорофилла а с использованием PAM флуориметров позволяют проводить быструю оценку эффективности преобразования энергии фотонов ФАР в химическую энергию в процессе фотосинтеза исследуемых объектов и определение ряда важных параметров:

F’0 начальная (нулевая) флуоресценция, измеренная в адаптированном к свету объекте;

F’M максимальная флуоресценция; 

F’V/F’M = (F’М – F’0) /F’M максимальная квантовая эффективность первичной фотохимической реакции в адаптированном к свету объекте; 

ФФС II = (F’M - F’T) / F’M действительный квантовый выход фотохимических реакций в ФС II на свету; 

qP = (F’M - F’T) / (F’M - F’0) фотохимическоe тушение; 

qN = (FM - F’M) / (FM - Fo) нефотохимическоe тушение; 

ETR = ФФС II × 0,50 × PPFDа = 0,84 × 0,50 × PPFDа – скорость линейного переноса электронов (здесь PPFDа означает скорость поглощения света образцом выраженная в мкмоль/м2 с).

 

Параметры флуоресценции хлорофилла а, их величины и физиологическое значение

При анализе флуоресценции хлорофилла а используется ряд различных характеристик. Несмотря на многократные усилия по систематизации терминологии, один и тот же параметр часто представляется по-разному [49].

F0 – начальная флуоресценция объектов, адаптированных к темноте

Параметр F0 (начальная, нулевая по времени флуоресценция) является индикатором энергетических потерь при передаче энергии возбуждения в антенне и от антенны к реакционному центру ФС II [5, 50]. Нулевая флуоресценция здорового листа (Fopen, Fzero или Fground) является первой точкой на кривой индукции Фл хлорофилла а. Она характеризует излучение флуоресценции возбужденных молекул хлорофилла а в антенне ФС II, когда акцепторы QA (молекулы пластохинона) полностью окислены, все реакционные центры ФС II полностью открыты (способны принять энергию возбуждения и необратимо осуществить первичную фотохимическую реакцию), а также не происходит нефотохимического тушения (qN). Выполнение этих условий требует предварительной адаптации фотосинтезирующих объектов к темноте [51]. Потери энергии в антенне в виде излучения зависят не только от интенсивности возбуждающего света в области ФАР, но и от эффективности передачи энергии возбуждения от ССК II к реакционному центру ФС II. Нулевая флуоресценция измеряется при низких интенсивностях ФАР, например, 0.01 мкмоль/м2 с [52].

Высокие значения F0 указывают на менее эффективную передачу энергии возбуждения между пигментными молекулами в светособирающей антенне ФС II, например, при тепловом стрессе, когда наблюдается повреждение тилакоидов и инактивация ФС II [5]. Увеличение F0 может быть также связано с понижением эффективности переноса энергии к реакционному центру ФС II, вызванной диссоциацией ССК II от ядра ФС II [53]. Аналогичную ситуацию можно наблюдать в случае солевого стресса [54].

 

FM – максимальная флуоресценция 

Определяется после темновой адаптации с помощью насыщающего импульса света (который может насытить фотохимические реакции в реакционном центре ФС II) продолжительностью от 0.8 до 2 с. Максимальную интенсивность флуоресценции (FМ) можно получить, если настроить мощность в насыщающем импульсе так, чтобы значение PPFD было в диапазоне от 3500 до 10 000 мкмоль/м2 с. В этих условиях все молекулы пластохинона в ФС II восстановлены, все реакционные центры фотосистемы II временно закрыты и не могут принимать дополнительные электроны. Кроме того, для правильного определения параметра должно выполняться условие отсутствия нефотохимического тушения (qN). Даже при насыщающем импульсе FM зависит, в том числе, и от содержания хлорофилла в исследуемых тканях. Уменьшение FM указывает на то, что исследуемый фотосинтезирующий объект находится в состоянии стресса, а это означает, что не все акцепторы электронов ФС II могут быть полностью восстановлены. После достижения максимальной интенсивности флуоресценции FM, эффективность флуоресценции хлорофилла а быстро снижается до уровня FT, близкого к значению F0.

Иногда в качестве исследуемого параметра используется соотношение FM /F0 – отношение максимального уровня Фл (FM) к нулевому (F0). В здоровых листьях, соотношение составляет примерно 4-6, и его величина зависит от воздействия определенных стрессовых факторов на растение, например, во время засухи отношение может быть уменьшено до 1 [55], что свидетельствует о разрушении ФС II.

tFM – время достижения максимального уровня флуоресценции хлорофилла FM. 

Параметр tFM определяет время от начала измерения, за которое Фл  хлорофилла достигает максимального уровня (FM), чаще всего оно составляет 500 – 800 мс [52]. Измерение tFM является альтернативным способом определения размера пула окисленных пластохинонов. Под влиянием стрессовых факторов, которые замедляют транспорт высокоэнергетических электронов от реакционного центра к пластохинонам, этот параметр значительно увеличивается [56].

FV = FM – F0 – переменная  флуоресценция

Параметр FV (или Fvariable) представляет собой разницу между величинами Фл хлорофилла FM и F0 (измеренными после темновой адаптации). FV зависит от максимального квантового выхода ФС II. Низкое значение этого показателя указывает на понижение ФС активности и рассеивание энергии возбуждения в виде тепла. Значение FV уменьшается под воздействием стресовых факторов окружающей среды (низкие или высокие температуры, замораживание и т.д.), которые вызывают повреждение тилакоидов [56].

 

FV/F0 = kp/kn – соотношение констант скоростей реакции фотохимической и нефотохимической дезактивации возбуждения в ФС II

Этот параметр также определяется после темновой адаптации. Он отражает эффективность использования энергии возбуждения в ФС II и равен соотношению констант скоростей первичной фотохимической реакции (kp) и общей скорости нефотохимических потерь (kn) 46. При действии стресса, модифицирующего комплекс выделения кислорода, нарастание нефотохимических потерь, как правило, связано с формированием гасящих флуоресценцию состояний пигмента РЦ, P680+. В этом случае параметр характеризует изменения в эффективности расщепления воды (выделения кислорода) в ФС II. Этот комплекс считается очень чувствительной частью фотосинтетической электрон-транспортной цепи 57.

FV/FM – максимальная фотохимическая эффективность ФС II 

Многочисленные исследования подтверждают, что параметр FV/FM, который представляет собой отношение (FM–F0) / FM, измеренное в адаптированных к темноте растениях, отражает потенциальную квантовую эффективность ФС II и может быть использован в качестве надежного индикатора фотохимической активности фотосинтетического аппарата. Для большинства растений при полном развитии в нестрессовых условиях, максимальное значение этого параметра равно 0.83 [58]. Его понижение означает, что перед измерением растение было подвержено влиянию стресса, который повредил ФС функции, что привело к снижению эффективности переноса электронов. Это часто наблюдается в растениях, которые подвергаются воздействию различных стрессовых факторов и, в частности, – воздействию яркого света. Примером могут служить растения картофеля, которые при выращивании в условиях умеренной суши и при высокой интенсивности света проявляют заметное снижение этого параметра. После увлажнения растений наблюдалось постепенное увеличение величины параметра FV/FM до значения, характерного для контрольных растений [59]. Изменение значения параметра FV/FM считается наиболее чувствительным индикатором характеризующим влияние фотоингибирования (явление подавления фотосинтеза и повреждение фотосинтетического аппарата при высокой интенсивности света) [60].

Соотношение FV/FM не пропорционально интенсивности фотосинтеза, измеренного по выделению O2 или ассимиляции CO2, и оно не всегда коррелирует с содержанием хлорофилла в листьях и плодах [61]. Изменения величины FV/FM также могут быть вызваны и нефотохимическим тушением возбужденного состояния молекул хлорофилла [48]. Исследования показали, что в присутствии неорганических анионов, таких как Cl–, SO42– и PO43–, отношение  FV/FM, измеренное в тилакоидных мембранах, понижается, что может быть связано с увеличенной текучестью (пониженной вязкостью) тилакоидных мембран. Присутствие органических анионов, таких как ацетат, янтарная кислота и цитрат не вызывает никаких изменений в скорости электронного транспорта и значения FV/FM [62]. Параметр  FV/FM также может быть использован как индикатор деградации D1-белка (важного элемента ФС II) поврежденного во время стресса, например при световом стрессе или модифицированного по другим причинам, что приводит к инактивации фотосинтетических реакционных центров [63]. 

Иногда при водном стрессе, как например, у субтропического растения вигна (Vigna unguiculata), существенных изменений значения Фл хлорофилла а  не обнаруживается [64], что свидетельствует о сохранении фотохимической активности ФС II. При более продолжительном стрессе регистрированное понижение параметра связывали с индуцированной стрессом безызлучательной диссипации энергии возбуждения в результате увеличения нефотохимического тушения, как и со снижением эффективности захвата энергии возбуждения открытыми центрами. Во время длительного стресса, однако, наблюдалось значительное снижение FV/FM, сопровождаемое также снижением интенсивности фотосинтеза. Через три дня после повторного полива регистрировали возврат к начальной скорости фотосинтеза, а параметры Фл были сходными с записанными до приложения стресса [64].

Когда растения картофеля были подвержены совместному влиянию отрицательных температур (-3°C) и высокой интенсивности света, это приводило к значительному снижению величины FV/FM во всех испытанных генотипах. В этом случае это можно объяснить блокированием ферментативных реакций фотосинтеза в темновой фазе, при сохранении относительно эффективного переноса электронов в световой фазе. При этом высокоэнергетические электроны поступают от ФС I на кислород, что приводит к образованию активных (реактивных) форм кислорода  [65].

AM – площадь над кривой индукции флуоресценции хлорофилла

Значение параметра AM (SM или площадь над индукционной кривой Фл) пропорционально размеру пула акцепторов электронов в ФС II. Измерение АM имеет большое значение для прикладных исследований, таких как анализ действия гербицидов – ингибиторов фотосинтеза, например диурона (DCMU), и динамики их транспорта в листья. За единицу AM можно принять условную единицу бмс (битомиллисекунду), т.е. произведение флуоресцентного сигнала, измеренного в битах, на отрезок времени, в течение которого проведилось измерение (от F0 до FM), представленного в мс. Чем быстрее рост Фл FM (быстрее восстанавливается пул акцепторов электронов ФС II), тем меньше площадь над индукционной кривой Фл хлорофилла. В случае блокирования переноса электронов от реакционных центров к пулу пластохинонов (при стрессе) значение AM снижается [51]. Параметром, подобным АМ, является его нормированная версия SM (SM = AM / FM). Этот параметр также определяет количество невосстановленных акцепторов электронов ФС II, но связан с общим содержанием активного хлорофилла а в исследуемом объекте [66].

FT – стационарная флуоресценция

Параметр FT (иногда обозначается как FS) представляет интенсивность флуоресценции хлорофилла, которая излучается фотосинтезирующими объектами в условиях стационарного освещения. После темновой адаптации достижение стационарного состояния на индукционной кривой Фл хлорофилла (уровень FT) занимает около 3-5 мин. При этом наступает равновесие между производством ассимиляционной силы в фотохимических реакциях (молекулы АТФ и НАДФ·Н) и ферментативными реакциями, использующими эти молекулы в темновой фазе. Любое нарушение фотосинтетических реакций (например, под влиянием стрессовых факторов) задерживает достижение стационарного состояния (FT).

Значение FT зависит от эффективности процесса фотосинтеза и от физиологического состояния изучаемых фотосинтезирующих объектов, которые в свою очередь определяются внешними факторами среды, такими как интенсивность действующего света. После обработки листьев паракватом (гербицидом, который может захватывать электроны от восстановленных ФС I и образовывать перекись водорода в зеленых тканях листьев) уровень FT достигается немедленно [67].

FT/F0 – соотношение стационарной и нулевой флуоресценции

Этот параметр отрицательно коррелирует с нефотохимическим тушением, а при высокой интенсивности света  проявляет отрицательную корреляцию со скоростью переноса электронов, с ассимиляцией двуокиси углерода, а также с устьичной проводимостью. Параметр FT/F0 является хорошим показателем водного статуса растения [6].

FM' – максимальная флуоресценция хлорофилла а в листьях, адаптированных к свету

Этот параметр определяется с помощью насыщающих вспышек на фоне освещения фотосинтетически активным светом. FM' ниже максимальной Фл хлорофилла а, регистрированной после темновой адаптации (FM), поскольку в этом случае акцепторы ФС II частично редуцированны. 

Разница: FM' - FT = ΔF является частью Фл хлорофилла, тушение которой происходит в результате фотохимических реакций;

Разница: FM – FМ' = ΔЕ – тушение Фл хлорофилла а, обусловленное ​​процессами нефотохимической природы [48].

F0' нулевая флуоресценции на фоне освещения

Это параметр обычно измеряется после дополнительного освещения импульсом дальнего красного света с λ ≈ 735 нм (одновременно с действующим светом фотосинтетически активной радиации), что вызывает окисление акцепторов электронов ФС II. В этих условиях возбуждается преимущественно ФС I, что дает возможность вывести электроны из ФС II и перевести большинство реакционных центров в открытое состояние. Наблюдаемая при этом флуоресценция будет соответствовать минимальной (нулевой) флуоресценции, измеренной на свету (F0'). Она является мерой флуоресценции при полном окислении акцептора QA, при наличии нефотохимического тушения.

FV = FM' - F0' – переменная флуоресценция в адаптированных на свету листьях 

Параметр FV' пропорционален фактическому квантовому выходу ФС II на свету (на фоне освещения действующим светом). На величину FV' также влияет и нефотохимическое тушение (qN).

Rfd = (FM - FT) / FT – коэффициент жизненности ФС II (витальности) 

Параметр Rfd (так называемый коэффициент относительного уменьшения флуоресценции, от анг. Relative fluorescence decrease) свидетельствует о взаимодействии свето-зависимых реакций, использующих ФАР, с реакциями темновой фазы. Значение этого параметра уменьшается при нарушении баланса между фотохимическими реакциями в тилакоидах и скоростью ферментативных реакций, протекающих в хлоропластах стромы [68]. При изменении ФАР уровень коэффициента жизненности можно рассматривать как меру потенциальной активности фотосинтеза. Lichtenthaler и соавт. [52] путем измерения листьев деревьев на полном свету получили значения выше 2.7, а на листьях, находящихся в тени – от 1 до 2.7. Обнаружена положительная линейная корреляция между значениями Rfd и интенсивностью фотосинтетической ассимиляции СО2, но только тогда, когда устьица остаются открытыми. 

Величины Rfd около 2.5 или выше указывают на высокую активность фотосинтеза, в то время как значения ниже 1.0 позволяют предположить, что процесс ассимиляции СО2 сильно подавлен [69]. В результате воздействия различных стрессов, как правило, наблюдается рост FT, при относительно постоянной величине FM, тем самым уменьшается разница FM – FT, и, следовательно – понижается величина Rfd [52].

Ap = 1 - (1 + Rfd730) / (1 + Rfd690) – коэффициент адаптации к стрессу 

Параметр Ар может быть определен путем измерения параметра Rfd одновременно на двух длинах волн, например на 690 и 730 нм. Этот показатель высок в молодых здоровых листьях, которые имеют высокую фотосинтетическую активность, а значения Ар от 0.1 до 0.2 означают, что растения находятся под воздействием влияния стресса [24, 70].

 

Параметры фотохимического тушения флуоресценции

Уменьшение сигнала флуоресценции хлорофилла а называется тушением. Резкое понижение интенсивности Фл хлорофилла а, связанное с увеличением использования энергии возбуждения в фотосинтетических реакциях, называется фотохимическим тушением. Если наблюдается снижение сигнала флуоресценции в результате диссипации энергии возбуждения в виде тепла, то такое тушение называется нефотохимическим. Параметры фотохимического тушения свидетельствуют о той части поглощенной растениями энергии света, которая может быть использована в фотохимических реакций фотосинтеза [48].

Квантовый Выход = (FM'-FT) / FM'= ∆F / FM' 

Параметр Квантовый Выход (параметр Genty (Жантѝ), ΦPSII или выход) позволяет оценить квантовый выход фотохимической реакции в ФС II. Это наиболее популярный и важный параметр, который представляет собой соотношение числа квантов, используемых в фотохимических превращениях к общему числу поглощенных квантов ФАР [71]. В лабораторных условиях обнаружена линейная зависимость между значениями параметра Жанти и скоростью фиксации двуокиси углерода в процессе фотосинтеза. Расхождения между этими параметрами может произойти в условиях стресса в связи с изменениями эффективности карбоксилирования при активировании фотодыхании или появлении псевдоциклического переноса электрона [72]. Как правило, при засухе происходит закрывание устьиц и снижение эффективности реакции ассимиляции CO2 и как следствие – сокращение потребления АТФ и НАДФ·Н. Это оказывает влияние на замедление переноса электронов в обеих фотосистемах и должно привести к снижению величины параметра Жанти. 

Активация процесса фотодыхания и ускорение реакции Мелера может привести, однако, и к нормализации электронного транспорта, функционирующего в растениях, выращенных в бесстрессовых условиях, например, Flexase и соавт. [73] обнаружили, что в листьях винограда закрывание устьиц на 75% снизило интенсивность фотосинтеза на 54%, а квантовый выход – только на 19%.

Во время стресса, вызванного низкой температурой происходило снижение параметра выхода, потому что при низких температурах понижается активность реакций цикла Кальвина-Бенсона, для осуществления которых требуются АТФ и НАДФ·Н, и, следовательно, это замедляет перенос электронов в световой фазе фотосинтеза [74]. Прерывание периода охлаждения и повышение температуры привело к незначительному снижению фотохимической эффективности ФС II в листьях кукурузы, что может свидетельствовать о том, что другие факторы, помимо фотохимической эффективности ФС II, ответственны за общее снижение интенсивности фотосинтеза при охлаждении [75]. По Fracheboud [67], снижение выхода может также быть вызвано снижением текучести мембран тилакоидов.

Фотохимическая эффективность (выход, ΦPSII) и фотохимическое тушение (qP) могут не проявлять положительной корреляции с количеством ассимилированного углекислого газа, СО2. Шиндлер и Лихтенталер [76] наблюдали снижение величин этих параметров практически до нуля при 30% ингибировании фотосинтеза листьев клена под прямыми солнечными лучами. Авторы объясняют это тем, что измерение флуоресценции ограничено только хлоропластами на верхней стороне листа.

Еще одна сложность в том, что скорость фотосинтеза при низкой интенсивности света мала, а эффективность преобразования энергии света в химическую энергию связей продуктов фотосинтеза – высока, и наоборот.

В некоторых исследованиях [77], однако, обнаружили тесную положительную корреляцию между фотохимической эффективностью ФС II (выходом) с выходом фиксации CO2 (ΦCO2).

ETR = Yield · 0.84 · 0.50 · PPFD – поток электронов через фотосистемы 

Параметр ETR является произведением квантового выхода (ΦPSII) и плотности потока освещения (PPFD), измеряемого в мкмоль (фотонов ФАР)/м2 с, умноженных на коэффициент 0.50. 

Таким образом, можно подсчитать, что поток электронов, переносимых через фотосистемы, составляет половину потока захватываемых реакционными центрами квантов возбуждения (при условии, что 84% квантов поглощаемого стандартным листом света доходят до реакционных центров, коэффициент 0.84). Учитывается, что для переноса одного электрона через всю цепь электронного транспорта используется энергия двух поглощенных квантов ФАР (один ФС II, а второй – ФС I, коэффициент 0.50).

Стрессовые факторы снижают значение этого параметра, например, скорость электронного транспорта в картофеле в условиях засухи была значительно ниже, чем в контрольной группе [59]. Параметр ETR уменьшался в растениях ячменя в условиях азотного дефицита [78] и в растениях ячменя при засолении [54].

qP = (FM'-FT ') / (FM'-F0) – фотохимическое тушение

Параметр qP представляет долю световой энергии, потребляемой открытыми центрами в реакциях фотосинтеза, в общем количестве поглощаемой ФС II энергии (Таблица). Изменения в qP вызваны закрытием реакционных центров за счет насыщения фотосинтеза действующим светом. Параметр qP указывает долю открытых, а выражение 1-qP – закрытых реакционных центров ФС II [48].

FV'/FM' = (FM'-F0) / FM' – эффективность открытых реакционных центров ФС II на свету

Уменьшение величины отношения FV'/FM' может быть вызвано де-эпоксидированием ксантофилловых пигментов в результате функционирования ксантофилового цикла, который изменяет соотношение пигментов (A+Z)/(V+A+Z), что свидетельствует о роли этого цикла в регуляции активности ФС II в природе. На ярком свету (например, в полдень) в большем количестве представлены пигменты зеаксантин (Z) и антероксантин (А), а в темное время суток доминирует виолоксантин (V) [67].

Параметры нефотохимического тушения флуоресценции

Нефотохимическое тушение (qN, NPQ), свяывают с процессами, ответственными за преобразование в тепло части энергии, поглощенной в световой фазе фотосинтеза 48. Такие процессы активизируются, когда листья слишком интенсивно поглощают свет (при этом возникает фотоингибирование) или в растениях, поврежденных в результате действия других стрессовых факторов. В этих случаях скорость повреждения ФС II превышает скорость ее репарации. 

qN=(FM-FM’)/(FM-F0)=(FM-FM’)/FV – нефотохимическое тушение

Значения qN могут быть в диапазоне от 0 до 1 77. Hartel и соавт. [79] считают, что структурные изменения, вызванные наличием ксантофиллового цикла, являются основной причиной нефотохимического тушения. Величина отношения регулируется небольшими изменениями рН с обеих сторон тилакоидной мембраны [67].

При освещении насыщенным светом объектов, предварительно обработанных нигерицином (нигерицин является протонофором, он снимает градиент протонов через тилакоидные мембраны), наблюдается ослабление нефотохимического тушения флуоресценции хлорофилла а. В необработанных нигерицином объектах большая часть флуоресценции тушилось из-за рассеивания энергии возбуждения в тепло, о чем свидетельствует большое различие между FМ и FМ' и, таким образом, увеличение qN [67]. Rosenqvist и Kooten [80] обнаружили, что размер измеренных параметров флуоресценции хлорофилла, фотохимического (qP) и нефотохимического (qN) тушения, зависит от состояния ФС II и разницы концентраций протонов по обе стороны тилакоидной мембраны (Таблица).

При интенсивном освещении увеличивается содержание зеаксантина (Z) и антероксантина (А) в результате деепоксидации виолаксантина (V) до А и Z в ксантофиловом цикле. Это приводит к повышенной диссипации поглощенной энергии в виде тепла, и, следовательно, уменьшает часть энергии возбуждения, которая передается к реакционных центрам в ФС II, и таким образом защищает растения от фотоингибирования 81. И наоборот, в условиях низкой освещенности Z и А эпоксидируются с образованием V, что уменьшает потери энергии в виде тепла и увеличивает эффективность использования ФАР [82]. 

NPQ = (FM - FM') / FM' – нефотохимическое тушение 

NPQ (SVN – Штерн-Фольмеровское тушение) является альтернативой параметра qN и определяет нефотохимическое тушение [83]. Этот параметр связан с тепловыми потерями, он может принимать значения от 0 до бесконечности. Для большинства здоровых растений значения NPQ находятся в пределах 0.5-3.5, хотя могут наблюдаться значительные различия в растениях, принадлежащих к различным видам или вследствие влияния условий роста [48, 52].

Растения, растущие при высоких интенсивностях света могут терять по 50-70% поглощенной энергии фотонов через выделение тепла, с использованием ксантофиллового цикла [84]. Niyogi и соавт. [85] обнаружили, что в Arabidopsis thaliana ксантофилловый цикл отвечает за 80% от NPQ. Kovar и соавт. [86] показали, что с увеличением ФАР, доступной для растений ячменя, адаптированных к высокой (1500 мкмоль фотонов/м2 с) и низкой (0.25 от предыдущей интенсивности) плотности светового потока, наблюдается увеличение NPQ (выше для растений, адаптированных к низким, и ниже для растений, приспособленных к высокой интенсивности света). Одновременно происходит уменьшение qP (в большей степени у объектов, выросших на сильном, а в меньшей степени – на слабом свету).

JIP (OJIP) Тест

Общее представление о тесте

В этой главе описывается взаимосвязь между фотосинтетическими реакциями и параметрами JIP-теста – количественными характеристиками, полученными на основе сигнала флуоресценции хлорофилла а, а также возможности использования этих параметров в практике. Они основаны на теории потоков энергии в мембранах тилакоидов [87, 88]. Эта теория позволяет создавать простые алгебраические уравнения, выражающие баланс между притоком и оттоком энергии для любой анализируемой системы фотосинтетических пигментов и дает информацию о вероятной судьбе поглощенной энергии. Эти уравнения позволяют характеризовать энергетическое взаимодействие между отдельными компонентами фотосистемы II при различных способах (моделях) организации фотосистем, известных также как "группирование" (от англ. grupping) или "объединение" (от англ. connectivity) и "общая вероятность группирования" (от англ. overall grouping probability), и описывают все способы этой связи [11].

JIP-тест основан на измерении Фл хлорофилла а и анализе сигналов, которые используются для получения подробной информации о структуре и функции фотосинтетического аппарата (в основном ФС II). Использованы модели, описывающие первичные фотосинтетические реакции и учитывающие структуру фотосинтетического аппарата, которые согласуются с теорией потоков энергии в тилакоидной мембране между комплексами фотосинтетических пигментов в ФС II. В последние годы определение параметров JIP-теста все чаще используется в различных областях растительной биологии для оценки физиологического состояния ФС II [46, 89].

Оценка физиологического состояния фотосинтетического аппарата осуществляется с помощью анализа нескольких групп биофизических параметров, измеренных и вычисленных различным образом [22, 90]:

феноменологические потоки энергии, рассчитанные на единицу площади фотосинтезирующего объекта (например, на площадь освещаемой поверхности листа);

специфические потоки энергии, которые рассчитаны на один работающий реакционный центр ФС II;

квантовые выходы, отражающие отношение количества электронов, перенесенных на определенном этапе световой фазы фотосинтеза, к числу поглощенных ФС II квантов света;

эффективности, отражающие вероятности переноса электронов через данной участок цепи электронного транспорта;

продуктивности работы фотосинтетического аппарата, представляющие собой произведения частных потенциалов на последовательных этапах преобразования энергии;

доля реакционных центров, которая позволяет оценку в общем пуле хлорофилла относительных долей тех реакционных центров, которые могут и которые не могут восстанавливать первичный акцептор ФС II (QA). Последние называются тепловыми поглотителями или "спящими центрами". "Спящие реакционные центры" (от англ. silent reaction center – RCsi), реакционные центры, которые не редуцируют QA, но и не возвращают энергию возбуждения назад к светособирающей антенне. Соответствующие структуры ФС II не способствуют формированию переменной флуоресценции, а имеют очень низкий выход Фл, такой же, как и в открытых реакционных центрах ФС II. Эти центры могут активироваться после выхода растения из стресса, который вызвал их инактивацию. С помощью этого теста можно анализировать функцию той части реакционных центров (вторично открытых), которые не могут редуцировать вторичный пластохиноновый акцептор QB (так называемые slow re-opening RCs) и оценивает вероятность потока энергии между различными компонентами ФС II.

Название OJIP происходит от принятого наименования отдельных точек на кривой индукции, отражающей изменение сигнала флуоресценции во время освещения фотосинтезирующего объекта (рис. 8, 9). Во время фазы O-J постепенно редуцируется QA, первичный акцептор электронов в ФС II, и в точке J наступает динамическое равновесие (квази-стационарное состояние) между процессами восстановления и окисления QA. Фаза J-I отражает нарастание Фл хлорофилла а, которое связано со смещением квазистационарного состояния первичного хинона в сторону восстановленности в результате светоиндуцированного восстановления пула пластохинонов. Дальнейшее повышение квантового выхода Фл хлорофилла а в фазе IP отражает постепенное восстановление акцепторов ФС I и полное восстановление PQ-пула.

Анализ OJIP позволяет лучше понять взаимосвязь между структурой и функцией фотосинтетического аппарата и быстро оценить жизнеспособность растений [22, 29, 46].

Для проведения теста необходимо измерить сигнал флуоресценции хлорофилла а через короткие интервалы времени, начиная с 40-50 мкс и заканчивая 1 с. Во время регистрации наиболее важные значения Фл записываются в определенные моменты: 50 мкс, 100 мкс, 300 мкс, 2 мс, 30 мс, 1 с, и по этим значениям можно рассчитать ряд показателей JIP-теста, такие как ABS / CS, TR / CS, ET / CS, RC / CS и DI / CS, которые используются для оценки функции фотосистемы II. Скорость переноса электрона в ФС II зависит активности потребления НАДФ·Н в реакциях темновой фазы фотосинтеза, а также и от скорости расходования продуктов фотосинтеза растением. Это, в свою очередь, зависит от состояния растения и от влияния различных внешних факторов, в частности, стрессовых факторов. 

JIP-тест расширяет возможности флуоресцентных исследований и позволяет за относительно короткий период времени оценивать влияние различных факторов стресса на процесс фотосинтеза [2, 29, 46, 91].

При определенных стрессовых условиях (высокая температура, высокая интенсивность облучения или слишком высокий дефицит азота) ингибируется процесс расщепления воды и блокируется перенос электрона между активным центром КВК и тирозином [92, 93]. В этом случае на индукционной кривой Фл хлорофилла а в области 200-300 мкс появляется специфическая фаза, локальный максимум, называемая К-пиком (точка К) (рис. 9), нарастание относительной величины флуоресценции в этой точке указывает на нарушения окислительно-восстановительных реакций в процессе разложения воды.

Параметры, используемые в JIP (OJIP) тесте

Параметры, характеризующие поглощение энергии ФАР и перенос электронов называются специфическими, когда они представлены в расчёте на один реакционный центр (RC), или феноменологическими, если они рассчитываются на единицу площади возбуждаемой поверхности (CS, от англ. Cross Section) фотосинтетического объекта. Чтобы понять ключевые отношения, используемые в тесте, необходимо знать следующие сокращения:

RC – фотохимически активный реакционный центр ФС II, который может редуцировать QA;

CS – возбуждаемая единичная площадь поверхности (CS) фотосинтезирующих объектов;

О и М (или Р) – индексы, указывающие крайние значения Фл хлорофилла а (F0 и FM, соответственно);

ABS – поток фотонов, поглощаемых молекулами пигмента в антенне.

 

Данные, полученные непосредственно из измерения флуоресценции 29

Ft – флуоресценция, излучаемая в момент времени t, с момента включения действующего света (AL);

F50μs или F20μs – минимальный сигнал флуоресценции (соответствующий значению F0), зарегистрированной на 50 мкс или 20 мкс;

F100μs – флуоресценция через 100 мкс;

F300μs – флуоресценция через 300 мкс;

FJ ≡ F2ms – флуоресценция через 2 мс во время фазы J;

FI ≡ F30ms – флуоресценция, измеренная через 30 мс после начала освещения – во время фазы I;

FP = (FP  FM) – максимальная флуоресценция во время фазы P;

TFM – время (в миллисекундах), необходимое для достижения максимальной флуоресценции – FM;

AM – площадь над индукционной кривой флуоресценции.

 

Флуоресцентные параметры, вычисленные из измеряемых данных

F0 – минимальная флуоресценция, зарегистрированная, когда все реакционные центры ФС II открыты;

FM (FP) – максимальная флуоресценция, излучаемая объектом, в котором все реакционные центры ФС II закрыты;

Fυ = Ft – F0 – переменная флуоресценция в момент времени t;

FV/F0 – отражает соотношение между константами скоростей реакций фотохимического и нефотохимического использования энергии возбуждения реакционного центра; 

Vt = (Ft – F0) / (FM – F0) – относительная величина переменной флуоресценции в момент времени t;

VJ = (FJ – F0) / (FM – F0) – относительная величина переменной флуоресценции в фазе J (после 2 мс освещения), отражает количество закрытых RC по отношению к общему числу RC, которые могут быть закрыты;

VI = (FI – F0) / (FM – F0) – относительная величина переменной флуоресценции во время фазы I (30 мс), связанная с промежуточным стационарным уровнем восстановления пула пластохинонов. Отражает способность ФС I и ее акцепторов окислять восстановленный пластохинон;

WOJ = (Ft – F0) / (FJ – F0) – относительная переменная флуоресценция, нормированная к амплитуде фазы J (FJ – F0);

WOK = (Ft – F0) / (FK – F0) – относительная переменная флуоресценция, нормированная к амплитуде фазы K (FK – F0);

WE,100 мкс = 1 – (1 – W300μs)×1/5 – значение на W в момент 100 мкс, которое моделирует экспоненциальное нарастание флуоресценции в образце при отсутствии связи между отдельными фотосинтетическими единицами ФС II;

М0 = (ΔV / Δt) = 4 (F300µs – F50µs) / (FM – F0) = TRo/RC-ETo/RC – усредненная величина начального наклона (в мс-1), относительной переменной флуоресценции хлорофилла а, V = f(t). Этот параметр отражает скорость закрывания реакционных центров ФС II. Параметр представляет максимальную скорость восстановления QA, т.к. впоследствии восстановленные молекулы переносчика могут повторно окисляться следующим участком цепи электронного транспорта после QA.

SM = (AM) / (FM – F0) – нормированная общая площадь над кривой OJIP, (отражающих емкость пула электронных акцепторов до полного восстановления QA);

SS = VJ / M0 – нормированная общая площадь над кривой OJ (отражающая единичный акт восстановления QA), а минимальная SS наблюдается когда каждый QA редуцируется только одним электроном (например, в присутствии DCMU);

N = (SM / SS) = SMM0 (1/VJ) – число оборотов, т.е. сколько актов восстановления QA происходят за время индукции от 0 до tFM, N – количество электронов, необходимых для полного восстановления всех акцепторов после QA;

Vav = 1 – (SM/tFM) – средняя переменная флуоресценция за время 0 до tFM;

SM / tFM – мера средней энергии возбуждения открытых реакционных центров в течение периода от 0 до tFM, т.е. времени, необходимого для их полного закрывания [29].

 

Специфические потоки энергии через QA-редуцирующий реакционный центр ФС II

(англ. Specific energy fluxes per QA - reducing PSII reaction center - RC)

ABS / RC = М0 (1/VJ) (1/φPo) – поток энергии, поглощаемой одним активным реакционным центром (RC), отражает соотношение между количеством молекул хлорофилла а в антенных комплексах, излучающих флуоресценцию и в активных реакционных центрах [22, 29];

RC / ABS = ChlRC / (1 – ChlRC) – показатель эффективности, выражаемый как концентрация реакционных центров (RC) в общем пуле хлорофиллов (Chl).

TR0 / RC = M0 (1/VJ) – поток энергии возбуждения, улавливаемой одним активным реакционным центром (РЦ) в начальный момент освещения адаптированного к темноте обекта, т.е. при t = 0;

ET0 / RC = M0 (1/VJ) ψ0 – поток электронов, переносимых через один активный реакционный центр (RC), при t = 0;

RE0 / RC = M0 (1/VJ)(1 – VI) – поток электронов, переносимых через один активный реакционный центр (RC) и редуцирующих крайние акцепторы на акцепторной стороне ФС I, при t = 0;

DI0 / RC = (ABS / RC) – (TR0 / RC) – общее количество энергии, рассеиваемой одним реакционным центром (RC) в виде тепла, флуоресценции или переноса к другой фотосистеме, при t = 0.

Квантовые выходы или соотношения потоков

(англ. Yields or flux ratios)

φPo ≡ TR0 / ABS = [1 – (F0 / FM)] = FV / FM – максимальный квантовый выход первичной фотохимической реакций (при t = 0), который указывает на вероятность захвата энергии поглощенных фотонов (или экситонов мигрирующих по антенне) реакционными центрами ФС II. В случае стрессового состояния, вызванного сильным светом или нагреванием объекта, φPo как правило, ниже.

φPo / (1 – φPo) = FV / F0 – показатель эффективности первичной фотохимической реакции (переносa электронов до QA–);

φEo = ET0 / ABS = [1 – (F0 / FM)] ψ0 = φPo ψ0 – квантовая эффективность переноса электронов от QA– далее в цепь транспорта электронов (при t = 0);

ψ0 ≡ ET0 / TR0 = (1 – VJ) – вероятность  транспорта электронов за пределы QA– (при t = 0), т.е. эффективность, с которой экситон, захваченный РЦ, движет электрон по цепочке после QA;

ψ0 / (1 – ψ0) = ET0 / (TR0 – ET0) – ψ по определению выражается как ET / TR и, следовательно, ψ0 / (1 – ψ0) = ET / (TR – ET), а (TR – ET) – число электронов, поступающих и накапливаемых в QA–, т.е. выражение ψ0 / (1-ψ0) представляет собой отношение электронов, выводимых из системы к электронам, накапливаемым в системе. Именно это накопление (скорость dQA–/dt или чистое накопление QA–) отвечает за увеличение сигнала флуоресценции. Этот параметр описывает возможность транспорта электронов далее QA–.

δRo = RE0 / ET0 – (1-VI)/(1-VJ) – вероятность, с которой электрон от переносчиков между двумя фотосистемами восстанавливает конечные акцепторы электрона на акцепторной стороне ФС I (RE); 

φRo = φPo φEo δRo = RE0 / ABS =  φPo (1-VI) – квантовый выход восстановления конечных акцепторов электрона на акцепторной стороне ФС I (RE);

γRC = ChlRC / Chltotal = RC / (ABS + RC) – вероятность того, что данная молекула хлорофилла функционирует как РЦ ФС II; 

φDo ≡ 1 - φPo = (F0 / FM) – квантовая эффективность рассеивания энергии (при t = 0);

φPav = φPo = (1-Vav) = φPo (Sm / tFM) – средний квантовый выход первичных фотохимических реакций (время от 0 до tFM);

 

Феноменологические потоки энергии, отнесенные к единице поверхности фотосинтезирующего объекта

(англ. Phenomenological energy fluxes per excited cross section - CS)

ABS/CSx – поглощенная энергия на единицу площади поверхности фотосинтезирующего объекта (CS) и хлорофилла (CHL), в нулевой момент времени (t = 0) или в момент достижения максимальной флуоресценции FM (M) – это количество энергии фотонов, поглощаемых антенной, принадлежащей активным и неактивным реакционным центрам ФС II. Это количество зависит от концентрации хлорофилла в тестируемом образце потому, что при равновесии скорость поглощения энергии (ABS) антенными молекулами становится равной сумме констант скоростей использования энергии возбуждения по всем возможным путям тушения, умноженной на концентрацию хлорофилла, т. е.:

ABS = (kn + kp) • (CHL), (6)

где kp – константа скорости фотохимических реакций;

kn – константа скорости реакций нефотохимического использования энергии возбуждения [29, 94]. 

ABS/CSChl – поглощеная энергия возбуждения, отнесенная к единице поверхности фотосинтезирующего объекта (CS) и к количеству хлорофилла а, определенные путем измерения отражения (параметр Chl / CS);

ABS/CS0 ≈ F0 – энергия, поглощаемая единицей поверхности фотосинтезирующего объекта (CS) в начальный момент измерения (t = 0), примерно равная F0;

ABS/CSM ≈ FM  – энергия, поглощаемая единицей поверхности фотосинтезирующего объекта (CS) в момент достижения максимума флуоресценции (t = tFm), примерно равная FM;

TR0/CSx = φPo·(ABS/CSx) – поток  энергии возбуждения, улавливаемой реакционными центрами ФС II, на единицу поверхности фотосинтезирующего объекта (CS) при t = 0;

ET0/CSx = φЕo·(ABS/CSx) – поток электронов через ФС II фотосинтезирующего объекта (CS) при t = 0;

DI0/CSx = (ABS/CSx) – (TR0/CSx) – тепловая диссипация энергии в ФС II фотосинтезирующего объекта (CS) при t = 0. 

 

Индекс производительности при t = 0 и плотность активных реакционных центров ФС II

(англ. Performance Indexes at t=0 and Density of reaction centers)

 – индекс  производительности – показатель функциональной активности ФС II, отнесенный к поглощаемой энергии; 

 – индекс  производительности – показатель функциональной активности ФС II, отнесенный к единице площади освещаемой поверхности; 

 – тотальнный индекс  производительности – показатель функциональной активности ФС II, ФС I и цепи переноса электронов между ними. Все параметры, из которых рассчитываются все три показателя были описаны ранее.

RC/CSx = φPo (VJ/M0)(ABS/CSx) – плотность реакционных центров, способных восстанавливать QA.

 

Движущие силы (логарифмы индексов производительности PI при t=0)

(англ. Driving forces – logarithms of performance indexes at t = 0)

 – показатель, характеризующий движущие силы в ФС II по отношению к поглощению. Его можно использовать, чтобы оценить значение суммы отдельных компонентов (показателей), участвующих в осуществлении процессов в ФС II. Включенные в уравнение слагаемые отражают вклады движущих сил (DF), связанных с концентрацией активных реакционных центров ФС II, первичной фотохимической реакцией и реакцией вторичного окисления восстановленного хинона QA–, соответственно: 

DFABS = DFRC + DFсветовых реакций + DFтемновых реакций (7),

где: DFRC = log(RC/ABS),

DFсветовых реакций = log(φP0)/(1 – φP0)) = log Fv/Fo,

DFтемновых реакций = log(ψ0/(1 – ψ0))=log((1-Vj)/Vj).

 – показатель, характеризующий движущие силы в ФС II, отнесенный к измеряемой площади фотосинтезирующего объекта (CS).

 

Обобщенная вероятность группирования реакционных центров

(англ. Overall grouping probability)

Как мы упоминали ранее, энергия квантов света, поглощенная молекулами хлорофилла антенных комплексов ФС II, с большой вероятностью переносится к реакционным центрам. Захваченная открытыми РЦ энергия используется для фотохимических реакций, а закрытые РЦ излучают ее в виде тепла или флуоресценции. Когда исследуемый объект представляет собой смесь открытых и закрытых РЦ, то эффективность фотосинтетических реакций (и связанная с ними интенсивность переменной флуоресценции) будут зависеть от возможности переноса энергии возбуждения от антенных комплексов закрытых РЦ – к открытым центрам. Взаимодействие между фотосинтетическими единицами отражается на форме индукционной кривой Фл. Числено взаимодействие центров ФС II на уровне антенных комплексов можно выразить с помощью коэффициента p2G, называемого вероятность группирования. Его значение можно рассчитать из параметров кривой Фл в начальной фазе индукции:

, (8)

где:

Обобщенная вероятность группирования учитывает все возможные способы переноса энергии между соседними антенными комплексами ФС II и указывает на вероятность использования поглощенной энергии в фотохимических реакциях.

Показатели структуры и функции

(англ. structure-function indexes)

Индекс дает структурную и функциональную информацию о силе влияния внутренних факторов, которые способствуют осуществлению реакций в ФС II.

Обратный параметр, SFINo(ABS), отражает процессы, связанные с ингибированием реакций в ФС II:

(9),

 где Chltot – общее содержание хлорофилла а, Chltot = Chlантенна + ChlRC.

Рассматриваемые параметры JIP-теста можно разделить на две группы. Такие параметры как F0/FM, V100μs, M0 и VJ дают информацию об единичном акте восстановления QA, в то время как параметры VI, Sm и TFM отражают процессы, включающие множественные акты восстановления. 

Основные параметры флуоресценции хлорофилла (параметры JIP теста), измеренной на флуориметре фирмы Hansatech Instruments Ltd. могут быть рассчитаны и представлены в графическом виде с использованием программного обеспечения BIOLYZER (авторские права принадлежат лаборатории Биоэнергетики, Женевского университета, Швейцария). Примерами графического представления могут быть модели потоков энергии в единичном РЦ ФС II (мембранная модель), или представленные в рассчете на единицу поверхности исследуемого объекта – модель листа (рис. 10). Другие способы представления, дающие возможность одновременной визуализации множества важных параметров – паутинная диаграмма (spider plot, рис. 11) (см. также [1]), или ковровая диаграма (carpet plot), см. например [95, 1].

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Стрессовая реакция растения всегда сопровождается изменением различных структурных и функциональных характеристик фотосинтетического аппарата. Измерение и анализ излучаемой молекулами антенного хлорофилла а флуоресценции превращается в мощный источник информации о моментном физиологическом состоянии растений [96]. С одной стороны, изучая параметры JIP-теста можно проследить конкретные изменения в различных участках фотосинтетического аппарата и выяснить механизм действия данного стресса на исследуемый объект [46, 97, 98]. В настоящий момент существует большое разнообразие видов флуоресцентной аппаратуры от различных производителей – от высокочувствительных аналитических систем, комбинирующих сигналы флуоресценции с другими важными характеристиками фотосинтетического аппарата, до портативных, способных проводить автоматизированный скрининг объектов в полевых условиях [98]. С другой стороны, в последнее время разрабатываются подходы для вторичной обработки результатов флуоресцентного исследования с привлечением методов искусственного интелекта [99], позволяющие получать более обобщенную информацию об изучаемых объектах, на первый взгляд не связанную напрямую с флуоресценцией, такую как содержание воды в ткани растений [97], наличие дефицита определенного минерала в питательной среде [100]. 

Данный обзор обобщает информацию о современном биофизическом методе изучения физиологии растения в состоянии in vivo, основанном на измерении и анализе флуоресценции хлорофилла. Авторы надеются, что он поможет заинтересованным читателям превратить его для себя в простой, рутинный, ежедневно используемый монитор для постоянного контроля состояния изучаемых ими растений.  

Василий Гольцев и Момчил Паунов благодарят Болгарский Фонд Научных Исследований (грант № DFNI B02/8) за финансовую поддержку и фирму Astea Solution за материальную помощь. Эта работа также поддержана грантом РФФИ и МКБ РАН.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

 

1.Tsimilli-Michael M., Strasser R.J. In vivo assessment of stress impact on plants' vitality: applications in detecting and evaluating the beneficial role of Mycorrhization on host plants // Mycorrhiza: State of the art, genetics and molecular biology, eco-function, biotechnology, eco-physiology, structure and systematics, vol. 3 / Ed. Varma A. Heidelberg, Berlin: Springer-Verlag, 2008. P. 679-703.

2.Kalaji H.M., Jajoo A., Oukarroum A., Brestic M., Zivcak M., Samborska I., Cetner M.D., Goltsev V., Ladle R.J., Dąbrowski P., Ahmad P. The Use of Chlorophyll Fluorescence Kinetics Analysis to Study the Performance of Photosynthetic Machinery in Plants // Emerging Technologies and Management of Crop Stress Tolerance : V. 2 - A sustainable approach / Eds. Ahmad P., Rasool S. Elsevier, Academic Press, 2014. P. 347-385.

3.Kalaji H.M., Schansker G., Ladle R.J., Goltsev V., Bosa K., Allakhverdiev S.I., Brestic M., Bussotti F., Calatayud A., Dąbrowski P., Elsheery N.I., Ferroni L., Guidi L., Hogewoning S.W., Jajoo A., Misra A.N., Nebauer S.G., Pancaldi S., Penella C., DorothyBelle P., Pollastrini M., Romanowska-Duda Z.B., Rutkowska B., Serodio J., Suresh K., Szulc W., Tambussi E., Yanniccari M., Zivcak M.  Frequently asked questions about in vivo chlorophyll fluorescence: practical issues // Photosynth Res. 2014. V. 122. P. 121-158.

4.Kalaji M.H., Pietkiewicz S.  Some physiological indices to be exploited as a crucial tool in plant breeding // Plant Breed Seeds Sci. 2004. V. 49. P. 19-39.

5.Murkowski A. Oddziaływanie czynników stresowych na luminescencję chlorofilu w aparacie fotosyntetycznym roślin uprawnych. Monografia 61. Lublin, Instytut Agrofizyki im. Bohdana Dobrzańskiego PAN. 2002.

6.Flexas J., Escalona J.M., Evain S., Gulías J., Moya I., Osmond C.B., Medrano H.  Steady-state chlorophyll fluorescence (Fs) measurements as a tool to follow variations of net CO2 assimilation and stomatal conductance during water-stress in C3 plants // Physiol. Plantarum. 2002. V. 114. P. 231-240.

7.Mohammed G.H., Binder W.D., Gillies S.L.  Chlorophyll fluorescence: A review of its practical forestry applications and instrumentation // Scand. J. Forest Res. 1995. V. 10. P. 383-410.

8.Jalink H., Van der Schoor R., Frandas A., Van Pijlen J.G., Bino R.J.  Chlorophyll fluorescence of Brassica oleracea seeds as a non-destructive marker for seed maturity and seed performance // Seed Sci. Res. 1998. V. 8. P. 437-443.

9.Skórska E. Reakcja wybranych roślin uprawnych na promieniowanie UV-B // Rozprawy nr, vol 192.  Szczecinie, Akademia Rolnicza 2000.  

10.Kuckenberg J., Tartachnyk I., Noga G. Evaluation of fluorescence and remission techniques for monitoring changes in peel chlorophyll and internal fruit characteristics in sunlit and shaded sides of apple fruit during shelf-life // Postharvest Biol. Tec. 2008. V. 48. P. 231-241.

11.Kalaji M.H., Guo P. Chlorophyll Fluorescence: A useful tool in barley plant breeding programs // Photochemistry research progress / Eds. Sanchez A., Gutierrez S.J. (eds). New York, USA: Nova Science Publishers Inc., 2008. P. 439-463.

12.Terazima M., Hirota N., Braslavsky S.E., Mandelis A., Bialkowski S.E., Diebold G.J., Miller R.J.D., Fournier D., Palmer R.A., Tam A. Quantities, terminology, and symbols in photothermal and related spectroscopies // Pure Appl. Chem. 2004. V. 76. P. 1083-1118.

13.Braslavsky S.E.  Glossary of terms used in photochemistry 3rd edition // Pure Appl. Chem. 2007. V. 79. P. 293-465.

14.Tyystjarvi E., Vass I. Light emission as a probe of charge separation and recombination in the photosynthetic apparatus: relation of prompt fluorescence to delayed light emission and thermoluminescence // Chlorophyll a  fluorescence: a signature of photosynthesis. Advances in Photosynthesis and Respiration, vol. 19 / Eds. Papageorgiou G.C., Govindjee. Dordrecht, The Netherlands: Springer, 2004. P. 363-388.

15.Neverov K.V., Santabarbara S., Krasnovsky A.A.  Phosphorescence study of chlorophyll d photophysics. Determination of the energy and lifetime of the photo-excited triplet state. Evidence of singlet oxygen photosensitization // Photosynth. Res. 2011. V. 108. P. 101-106.

16.Parker S. Photoluminescence of solutions [in Russian]. Moscow, Izdatelstvo "Mir". 1972.

17.Björn L.O., Papageorgiou G.C., Blankenship R.E., Govindjee  A viewpoint: Why chlorophyll a? // Photosynth. Res. 2009. V. 99. P. 85-98.

18.Trissl H.W., Gao Y., Wulf K. Theoretical fluorescence induction curves derived from coupled differential equations describing the primary photochemistry of photosystem II by an exciton/radical pair equilibrium // Biophys. J. 1993. V. 64. P. 984-998.

19.Lazar D. Chlorophyll a fluorescence induction // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1412. P. 1-28.

20.Govindjee. Sixty-three years since Kautsky: chlorophyll a fluorescence // Aust. J. Plant Physiol. 1995. V. 22. P. 131-160.

21.Strasser B.J., Strasser R.J. Measuring fast fluorescence transients to address environmental questions: The JIP test // Photosynthesis: from Light to Biosphere, vol 5 / Ed. Mathis P. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1995. P. 977-980.

22.Strasser R.J., Tsimilli-Michael M., Srivastava A. Analysis of the chlorophyll a fluorescence transient // Chlorophyll a fluorescence: a signature of photosynthesis. Advances in Photosynthesis and Respiration, vol. 19 / Eds. Papageorgiou G.C., Govindjee. Dordrecht, The Netherlands: Springer, 2004. P. 321-362.

23.Stirbet A., Govindjee Chlorophyll a fluorescence induction: a personal perspective of the thermal phase, the J-I-P rise // Photosynth. Res. 2012. V. 113. P. 15-61.

24.Lichtenthaler H.K., Rinderle U. The role of chlorophyll fluorescence in the detection of stress conditions in plants // Crit. Rev. Anal. Chem. 1988. V. 19. P. 29-85.

25.Kautsky H., Hirsch A.  Neue Versuche zur Kohlensaureassimilation // Naturwissenschaften. 1931. V. 19. P. 964.

26.Papageorgiou G. Chlorophyll fluorescence: an intrinsic probe of photosynthesis // Bioenergetics of Photosynthesis / Ed. Govindjee. New York: Academy Press, 1975. P. 319-371.

27.Kalaji H., Govindjee, Goltsev V., Bosa K., Allakhverdiev S.I., Strasser R. Experimental in vivo measurements of light emission in plants: A perspective dedicated to David Walker // Photosynth Res. 2012. V. 114. P. 69-96.

28.Schreiber U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) fluorometry and saturation pulse method: an overview // Chlorophyll a  fluorescence: a signature of photosynthesis. Advances in Photosynthesis and Respiration, vol. 19 / Eds. Papageorgiou G.C., Govindjee. Dordrecht, The Netherlands: Springer, 2004. P. 279-319.

29.Strasser R.J., Srivastava A., Tsimilli-Michael M. The fluorescence transient as a tool to characterize and screen photosynthetic samples // Probing photosynthesis: mechanism, regulation & adaptation / Eds. Mohanty P., Pathre U., Mohanty P. London: Taylor & Francis, 2000. P. 443-480.

30.Krause G.H., Weis E. Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: The basics // Annu Rev. Plant Physiol. 1991. V. 42. P. 313-349.

31.Strasser R., Govindjee The F0 and the O-J-I-P fluorescence rise in higher plants and algae // Regulation of chloroplast biogenesis / Ed. Argyroudi-Akoyunoglou J.H. New York: Plenum Press, 1991. P. 423-426.

32.Strasser R., Govindjee On the O-J-I-P fluorescence transients in leaves and D1 mutants of Chlamydomonas reinhardtii // Research in photosynthesis, vol II / Ed. Murata N. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1992. P. 29-32.

33.Papageorgiou G., Govindjee  Light-induced changes in the fluorescence yield of chlorophyll a in vivo. I. Anacystis nidulans // Biophys. J. 1968. V. 1968/11/01. P. 1299-1315.

34.Papageorgiou G., Govindjee. Light-induced changes in the fluorescence yield of chlorophyll a in vivo. II. Chlorella pyrenoidosa // Biophys J. 1968. V. 8. P. 1316-1328.

35.Duysens L.N.M., Sweers H.E. Mechanism of two photochemical reaction in algae as studied by means of fluorescence // Studies on Microalgae and Photosynthetic Bacteria / Ed. Ashida J. Tokyo: Tokyo University Press, 1963. P. 353-372.

36.Butler W.L. Fluorescence yield in photosynthetic systems and its relation to electron transport // Current topics in bioenergetics / Ed. Sanadi D.R. New York: Academic Press, 1966. P. 49-73.

37.Schatz G.H., Brock H., Holzwarth A.R. A kinetic and energetic model for the primary processes in photosystem II // Biophys J. 1988. V. 54. P. 397-405.

38.Dau H.  Molecular mechanisms and quantitative models of variable PS II fluorescence // Photochem. Photobiol. 1994. V. 60. P. 1-23.

39.Butler W.L. Energy distribution in the photochemical apparatus of photosynthesis // Annu. Rev. Plant. Physiol. 1978. V. 29. P. 345-378.

40.Nuijs A.M., Shuvalov V.A., van Gorkom H.J., Duysens L.N.M. Picosecond absorbance-difference spectroscopy on the primary reactions and the antenna-excited states in photosystem I particles // Biophys. Biochim. Acta. 1986. V. 850. P. 310-318.

41.Franck F., Juneau P., Popovic R.  Resolution of the photosystem I and photosystem II contributions to chlorophyll fluorescence of intact leaves at room temperature // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1556. P. 239-246.

42.van Grondelle R., Dekker J., Gillbro T., Sundstrom V. Energy transfer and trapping in photosynthesis // Biochemistry-US. 1994. V. 1187. P. 1-65.

43.Климов В.В., Аллахвердиев С.И., Пащенко В.З. Измерение энергии активации и времени жизни флуоресценции хлорофилла фотосистеме 2 // Докл. АН СССР. 1978. Т. 242. С. 1204-1205.

44.Allakhverdiev S.I., Klimov V.V., Carpentier R. Variable thermal emission and chlorophyll fluorescence in photosystem II particles // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 281-285.

45.Gibasiewicz K., Dobek A., Breton J., Leibl W.  Modulation of primary radical pair kinetics and energetics in photosystem II by the redox state of the quinone electron acceptor Q(A) // Biophys. J. 2001. V. 80. P. 1617-1630.

46.Strasser R.J., Tsimilli-Michael M., Qiang S., Goltsev V. Simultaneous in vivo recording of prompt and delayed fluorescence and 820-nm reflection changes during drying and after rehydration of the resurrection plant Haberlea rhodopensis // Biochim. Biophys. Acta. 2010. V. 1797. P. 1313-1326.

47.Schreiber U. Detection of rapid induction kinetics with a new type of high-frequency modulated chlorophyll fluorometer // Photosynth. Res. 1986. V. 9. P. 261-272.

48.Maxwell K., Johnson G.N.  Chlorophyll fluorescence - a practical guide // J. Exp. Bot. 2000. V. 51. P. 659-668.

49.van Kooten O., Snel J.H.  The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology // Photosynth. Res. 1990. V. 25. P. 147-150.

50.Baker N.R., Rosenquist E.  Applications of chlorophyll fluorescence can improve crop production strategies: an examination of future possibilities // J. Exp. Bot. 2004. V. 55. P. 1607-1621.

51.Hansatech (2008) Chlorophyll Fluorescence. Hansatech Instruments Ltd. http://www.hansatech-instruments.co.uk. 

52.Lichtenthaler H., Buschmann C., Knapp M. Measurement of chlorophyll fluorescence kinetics (Kautsky effect) and the chlorophyll fluorescence decrease ratio (RFd-values) with the PAM-fluorometer // Analytical methods in plant stress biology / Eds. Filek M., Biesaga-Kocielniak J., Marciska I. Krakow, Poland: The Franciszek Gorski Inst. Plant Physiol., Polish Academy of Sciences, 2004. P. 93-111.

53.Havaux M.  Rapid photosynthetic adaptation to heat stress triggered in potato leaves by moderately elevated temperatures // Plant Cell Environ. 1993. V. 16. P. 461-467.

54.Kalaji M., Rutkowska A. Reakcje aparatu fotosyntetycznego siewek kukurydzy na stres solny // Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 2004. V. 496. P. 545-558.

55.Hansatech (1996) An introduction to fluorescence measurements with the plant efficiency analyser (PEA). Hansatech Instruments Ltd. http://www.hansatech-instruments.co.uk. 

56.Reigosa R.M.J., Weiss O. Fluorescence techniques // Handbook of plant ecophysiology techniques / Ed.  Reigosa R.M. Dordrecht, the Netherlands: Acad. Publ., 2001. P. 155-171.

57.Pereira W.E., de Siqueira D.L., Martínez C.A., Puiatti M. Gas exchange and chlorophyll fluorescence in four citrus rootstocks under aluminium stress // J. Plant Physiol. 2000. V. 157. P. 513-520.

58.Björkman O., Demmig B. Photon yield of O2 evolution and chlorophyll fluorescence characteristics at 77 K among vascular plants of diverse origins // Planta. 1987. V. 170. P. 489-504.

59.Basu P.S., Sharma A., Sukumaran N.P. Changes in net photosynthetic rate and chlorophyll fluorescence in potato leaves induced by water stress // Photosynthetica. 1998. V. 35. P. 13-19.

60.He J., Chee C.W., Goh C.J.  'Photoinhibition' of Heliconia under natural tropical conditions: the importance of leaf orientation for light interception and leaf temperature // Plant Cell Environ. 1996. V. 19. P. 1238-1248.

61.Mir N.A., Perez R., Beaudry R., M. Chlorophyll fluorescence and whole fruit senescence in Golden Delicious apple // In: Bieleski R, Laing W, Clark C (eds) International Postharvest Science Conference Postharvest 96.  New Zealand Taupo. 1996.  

62.Jajoo A., Bharti S., Govindjee. Inorganic anions induce state changes in spinach thylakoid membranes // FEBS Lett. 1998. V. 434. P. 193-196.

63.Pokorska B., Romanowska E.  Photoinhibition and D1 protein degradation in mesophyll and agranal bundle sheath thylakoids of maize // Funct. Plant Biol. 2007. V. 34. P. 844-852.

64.Souza R.P., Machado E.C., Silva J.A.B., Lagôa A.M.M.A., Silveira J.A.G.  Photosynthetic gas exchange, chlorophyll fluorescence and some associated metabolic changes in cowpea (Vigna unguiculata) during water stress and recovery // Environ. Exp. Bot. 2004. V. 51. P. 45-56.

65.Seppanen M.M. Characterization of freezing tolerance in Solanum commersonii (dun.) with special reference to the relationship between freezing and oxidative stress. Univ. of Helsinki. 2000. Publ. no 56.

66.Schreiber U., Bilger W., Neubauer C. Chlorophyll Fluorescence as a Nonintrusive Indicator for Rapid Assessment of In Vivo Photosynthesis // Ecophysiology of Photosynthesis. V. 100 / Eds. Schulze E.D., Caldwell M. Berlin Heidelberg, Springer: Springer Study Edition edn., 1995. P. 49-70.

67.Fracheboud Y. (2000) Using chlorophyll fluorescence to study photosynthesis. http://jaguar.fcav.unesp.br/download/deptos/biologia/durvalina/TEXTO-71.pdf. 

68.Croxdale J.G., Omasa K.  Patterns of chlorophyll fluorescence kinetics in relation to growth and expansion in cucumber leaves // Plant Physiol. 1990. V. 93. P. 1083-1088.

69.Rinderle U., Lichtenthaler H.K. The chlorophyll fluorescence ratio F690/F735 as a possible stress indicator // Applications of Chlorophyll Fluorescence / Ed. Lichtenthaler H.K. Dordrecht, the Netherlands: Kluwer Acad. Publ., 1988. P. 189-196.

70.Strasser R.J. A concept for stress and its application in remote sensing // Applicationf of chlorophyll fluorescence / Ed. Lichtenthaler H.K.. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1988. P. 333-337.

71.Genty B., Briantais J.-M., Baker N.R. The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence // Biochim. Biophys. Acta. 1989. V. 990. P. 87-92.

72.Fryer M.J., Andrews J.R., Oxborough K., Blowers D.A., Baker N.R.  Relationship between CO2 assimilation, photosynthetic electron transport, and active O2 metabolism in leaves of maize in the field during periods of low temperature // Plant Physiol. 1998. V. 116. P. 571-580 

73.Flexas J., Bota J., Escalona J. M, Sampol B., Medrano H. Effects of drought on photosynthesis in grapevines under field conditions: an evaluation of stomatal and mesophyll limitations // Funct. Plant Biol. 2002. V. 29. P. 461-471.

74.Andrews J.R., Fryer M.J., Baker N.R.  Characterization of chilling effects on photosynthetic performance of maize crops during early season growth using chlorophyll fluorescence // J Exp. Bot. 1995. V. 46 P. 1195-1203 

75.Koscielniak J., Biesaga-Koscielniak J. Effects of exposure to short periods of suboptimal temperature during chili (5 degrees C) on gas exchange and chlorophyll fluorescence in maize seedlings (Zea mays L.) // J. Agron. Crop Sci. 1999. V. 183. P. 231-241.

76.Schindler C., Lichtenthaler H.K. Photosynthetic CO2-assimilation, chlorophyll fluorescence and zeaxanthin accumulation in field grown maple trees in the course of a sunny and a cloudy day // J. Plant Physiol. 1996. V. 148. P. 399-412.

77.Fracheboud Y., Leipner J. The application of chlorophyll fluorescence to study light, temperature, and drought stress // Practical applications of chlorophyll fluorescence in plant biology / Eds. DeEll J., Toivonen P.A.. United States: Springer, 2003. P. 125-150.

78.Kalaji M.H., Woejko E., Loboda T., Pietkiewicz S., Wyszyski Z.  Fluorescencja chlorofilu - nowe narzedzie do oceny fotosyntezy roslin J. czmienia, rosnacych przy rożnych dawkach azotu // Zesz. Probl. Post. Nauk Roln. 2004. V. 496. P. 375-383.

79.Hartel H., Lokstein H., Grimm B., Rank B. Kinetic studies on the xanthophyll cycle in barley leaves // Plant Physiol. 1996. V. 110. P. 471-482.

80.Rosenqvist E., van Kooten O. Chlorophyll Fluorescence: a general description and nomenclature // Practical applications of chlorophyll fluorescence in plant biology / Eds. Dell J.R., Toivonen P.M.A. Dordrecht, the Netherlands: Kluwer Acad. Publ., 2003. P. 31-77.

81.Kramer D.M., Cruz J.A., Kanazawa A. Balancing the central roles of the thylakoid proton gradient // Trends Plant Sci. 2003. V. 8. P. 27-32.

82.Demmig-Adams B., Adams III W.W., Barker D.H., Logan B.A., Bowling D.R., Verhoeven A.S. Using chlorophyll fluorescence to assess the fraction of absorbed light allocated to thermal dissipation of excess excitation // Physiol. Plantarum. 1996. V. 98. P. 253-264.

83.Bilger W., Björkman O.  Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis // Photosynth. Res. 1990. V. 25. P. 173-185.

84.Maxwell K., Bjorkman O., Leegood R. Too many photons: photorespiration, photoinhibition and photooxidation // Trends Plant Sci. 1997. V. 2. P. 119-121.

85.Niyogi K.K., Grossman A.R., Björkman O. Arabidopsis mutants define a central role for the xanthophyll cycle in the regulation of photosynthetic energy conversion // The Plant Cell Online. 1998. V. 10. P. 1121-1134.

86.Kovar M., Brestic M., Olsovska K.  Chlorophyll a fluorescence as a bioindicator of the plant environmental stress // Acta Fytotechn. Zootechn. 2001. V. 4 (Special number). P. 126-127.

87.Strasser R.J. The grouping model of plant photosynthesis // Chloroplast development / Eds. Akoyunoglou G. North Holland: Elsevier, 1978. P. 513-524.

88.Strasser R.J. The grouping model of plant photosynthesis: heterogeneity of photosynthetic units in thylakoidsPhotosynthesis III // Structure and molecular organisation of the photosynthetic apparatus / Eds. Akoyunoglou G. Philadelphia: Balaban International Science Services, 1981. P. 727-737.

89.Antal T., Rubin A. In vivo analysis of chlorophyll a fluorescence induction // Photosynth. Res. 2008. V. 96. P. 217 - 226.

90.Tsimilli-Michael M., Strasser R. The energy flux theory 35 years later: formulations and applications // Photosynth. Res. 2013. V. 117. P. 289-320.

91.Srivastava A., Strasser R.J., Govindjee. Greening of peas: parallel measurements of 77 K emission spectra, OJIP chlorophyll a fluorescence transient, period four oscillation of the initial fluorescence level, delayed light emission, and P700 // Photosynthetica. 1999. V. 37. P. 365-392.

92.Strasser R.J., Tsimilli-Michael M., Srivastava A. Analysis of the chlorophyll a fluorescence transient // Advances in photosynthesis and respiration. chlorophyll a fluorescence: a signature of photosynthesis / Eds. Papageorgiou G.C., Govindjee.  Dordrecht, the Netherlands: Kluwer Acad. Publ., 2005. P. 321-362.

93.Oukarroum A., Goltsev V., Strasser R.J. Temperature effects on pea plants probed by simultaneous measurements of the kinetics of prompt fluorescence, delayed fluorescence and modulated 820 nm reflection // PloS one. 2013. V. 8. P. e59433.

94.Krüger G.H.J., Tsimilli-Michael M., Strasser R.J. Light stress provokes plastic and elastic modifications in structure and function of photosystem II in camellia leaves // Physiol. Plantarum. 1997. V. 101. P. 265-277.

95.Tsimilli-Michael M., Eggenberg P., Biro B., Köves-Pechy K., Vörös I., Strasser R.  Synergistic and antagonistic effects of arbuscular mycorrhizal fungi and Azospirillum and Rhizobium nitrogen-fixers on the photosynthetic activity of alfalfa, probed by the polyphasic chlorophyll a fluorescence transient OJIP // Applied Soil Ecology. 2000. V. 15. P. 169-182.

96. Kalaji H., Goltsev V., Brestic M., Bosa K., Allakhverdiev S.I., Strasser R.J., Govindjee.  In vivo measurements of light emission in plants // Photosynthesis: open questions and what we know today / Eds. Allakhverdiev S, Rubin A, Shuvalov V., Izhevsk-Moscow, Institute of Computer Science, 2014. P. 1-40.

97.Goltsev V., Zaharieva I., Chernev P., Kouzmanova M., Kalaji H.M., Yordanov I., Krasteva V., Alexandrov V., Stefanov D., Allakhverdiev S.I., Strasser R.J. Drought-induced modifications of photosynthetic electron transport in intact leaves: Analysis and use of neural networks as a tool for a rapid non-invasive estimation // Biochim. Biophys. Acta. 2012. V. 1817. P. 1490-1498.

98. Гольцев В.Н., Каладжи М.Х., Кузманова М.А., Аллахвердиев С.И. Переменная и замедленная флуоресценция хлорофилла a - теоретические основы и практическое приложение в исследовании растений. М.-Ижевск, Институт компьютерных исследований, 2014. 220 с.

99.Samborska I.A., Alexandrov V., Sieczko L., Kornatowska B., Goltsev V., Cetner M.D., Kalaji H.M.  Artificial neural networks and their application in biological and agricultural research // J. NanoPhotoBioSciences. 2014. V. 2. P. 14-30.

100.Kalaji H.M., Oukarroum A., Alexandrov V., Kouzmanova M., Brestic M., Zivcak M., Samborska I.A., Cetner M.D., Allakhverdiev S.I., Goltsev V. Identification of nutrient deficiency in maize and tomato plants by in vivo chlorophyll a fluorescence measurements // Plant Physiol. Bioch. 2014. V. 81. P. 16-25.

 

ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

Рис. 1.Диаграмма Яблонского, представляющая схематично электронные и вибрационные энергетические уровни молекул и переходы между ними.

Жирные горизонтальные линии представляют Уровни энергии основного (индекс 0) или возбужденного (индекс 1) состояний молекулы. Буквами S и T обозначены синглетный и триплетный уровни, а стрелками в сдвоенных квадратах показаны ориентации спинового момента электрона на основной и возбужденной орбитали. Буквами kA, kd, kf, kph, kisc и kicc обозначены константы скоростей фотофизических процессов поглощения света, внутренней конверсии энергии возбуждения в теплоту, флуоресценции, фосфоресценции, внутрисистемной конверсии и интеркомбинационной конверсии, сопровождающейся обращением спинового момента возбужденного электрона, соответственно.  

Рис. 2.Индукционные кривые переменной флуоресценции в адаптированных к темноте (30 мин) листьях фасоли, представленные в различных шкалах времени. 

Основная фигура представляет индукционную кривую в полулогарифмическом масштабе. На вставках индукционные кривые представлены в линейном масштабе времени: a - изменения флуоресценции в первые 40 мс измерения; б - ход переменной флуоресценции в течение 10 мин. Флуоресценцию измеряли с помощью флуориметра M-PEA ("Hansatech Instruments Ltd.", Великобритания) при интенсивности освещения 4000 μmol hν/m2 s. 

Рис. 3.Типичный вид индукционной кривой флуоресценции хлорофилла и объяснение процессов определяющих изменение интенсивности флуоресценции. 

Последовательные фазы индукции флуоресценции хлорофилла обозначены буквами около кривой O, J, I, P, S, M и T. Закрашенная серым цветом площадь над частью индукционного перехода между фазами „O" и „P" (АМ) отражает емкость цепи переноса электронов. 

Рис. 4.Схема измеряющей головки флуориметров, осуществляющих прямые измерения флуоресценции хлорофилла а, например PEA, Handy PEA или M-PEA (Hansatech Instruments Ltd.).

Рис. 5.Типичные индукционные кривые переменной флуоресценции, записанные флуориметром Handy PEA при различных интенсивностях возбуждающего света.

Рис. 6.Схема, представляющая регистрированные световые сигналы на детекторе при различных режимах работы.

а - флуоресцентный сигнал, записанный с использованием только модулированного света. б - во время совместного освещения действующим и модулированным светом. в - после фильтрации постоянного компонента действующего света - только флуоресценция, сопровождающая фотохимические реакции хлорофилла (Hansatech Instruments Ltd.

Рис. 7.Схематическое представление типичного эксперимента по определению фотосинтетической эффективности при измерении модулированной флуоресценции. 

Подробное описание можно найти в тексте.

ML - модулированный измеряющий свет

SP - насыщающий импульс 

AL - действующий свет

FR - ближний  инфракрасный свет (дальний красный)

FP - максимальная флуоресценция хлорофилла а при возбуждении действующим светом

F0 - минимальная флуоресценция хлорофилла а в адаптированных к темноте объектах

F'0 - минимальная флуоресценция хлорофилла а в адаптированных к свету объектах

FМ - максимальная флуоресценция хлорофилла а в адаптированных к темноте объектах

F'М - максимальная флуоресценция хлорофилла а в адаптированных к свету объектах

FТ - стационарный уровень флуоресценции хлорофилла а в адаптированных к свету объектах

ΔЕ = FМ - F'М

ΔF = F'М - FТ

 

Рис. 8.Окислительно-восстановительное состояние переносчиков феофитина (Pheo) и хинонов (QA и QB) на акцепторной стороне ФС II в различные моменты индукции (OJIP) [с модификациями по 91]. 

Рис. 9.Индукционная кривая переменной флуоресценции хлорофилла а, измеренной при освещении красным светом интенсивностью 4000 мкмоль фотонов/м2 с в течении 1 с [с модификациями по 91, 2]. 

Стрелками отмечены моменты и время достижения характеристических точек OJIP перехода в индукционное время. На левой шкале представлены измеренные величины флуоресценции, на правой - значения относительной переменной флуоресценции. 

Рис. 10.Модели энергетических потоков в образце, который находится в хорошем (контроль) (а) или в худшем физиологическом состоянии (при стрессовом воздействии) (б). 

Относительная величина каждого параметра пропорциональна ширине соответствующих стрелок. Мембранная модель (левая сторона) представляет собой специфическую активность, отнесенную к единичному реакционному центру (RC). Средний размер антенны представлен параметром ABS/RC. Потоки поглощенной и уловленной невосстанавливающими центрами ФС II энергии показаны как диагонально заштрихованные стрелки ABS/RC и TR/RC. Модель листа (справа) представляет феноменологические значения параметров, отнесенные к единице возбуждаемой поверхности фотосинтезирующего объекта (CS). QA - невосстанавливающие реакционные центры, показаны в виде черных, а активные (восстанавливающие QA) в виде белых кружков. Интенсивность зеленого цвета в окраске листьев в модели листа показывает концентрацию хлорофилла на единицу освещаемой поверхности фотосинтезирующих объектов. Все эти значения могут быть установлены на минимальном (индекс "0") или максимальном ("m") уровне флуоресценции хлорофилла, например ET0 или ЕТm. Представленные на схеме величины потоков нормированы к уровню максимальной флуоресценции (m).

Рис. 11.Паутинная диаграмма показывает относительное отклонение JIP параметров исследуемого объекта, который находится в состоянии стресса (листья саженцев платана Platanus orientalis двух экотипов - болгарского (БГ) и итальянского (ИТ), подверженных 12 дневному ограничению полива), от контрольных величин (контроль - черный круг). 

Величины всех параметров нормированы к контролю, причем для каждого экотипа в качестве контроля использованы величины параметров, измеренных в контрольных растениях соответствующего экотипа. Параметры собраны в следующие группы: скорости потоков энергии, квантовые выходы и эффективности, специфические потоки энергии (рассчитанные на единичный реакционный центр) и феноменологические относительные потоки (рассчитанные на единицу возбуждаемой поверхности фотосинтезирующего объекта), параметры группирования, а также обобщенные функциональные показатели ФС II (индексы производительности). 

Неопубликованные данные авторов.