УДК 581.1

ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРОВ ДВУХ ПУТЕЙ БИОСИНТЕЗА ИЗОПРЕНОИДОВ НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК Dioscorea deltoidea Wall.

© 2016 г. М. В. Титова a, b,*, М. Т. Ханды b, c, С. В. Константинова a, b, И. Е. Куличенко a, Е. С. Суханова a, b, Д. В. Кочкин a, b, А. М. Носов a, b

a Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева Российской академии наук, Москва

b Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова, Москва

c  Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Амосова, Якутск

Поступила в редакцию 18.05.2016 г.

Исследовали влияние ингибиторов двух путей биосинтеза изопреноидов: фосмидомицина (MEP-пути) и мевинолина (MVA-пути) на ростовые (накопление биомассы, индекс роста, удельная скорость роста), физиологические (интенсивность и соотношение цитохромного и цианидрезистентного дыхания) и биосинтетические (образование стероидных гликозидов) характеристики суспензионной культуры клеток диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoidea Wall). 

Установлено, что оба ингибитора снижали индекс роста культуры на 20–25%, при этом их влияние на динамику роста клеток было различным. Воздействие мевинолином снижало максимальное накопление биомассы на 20%, по сравнению с контролем, однако не изменяло характер ростовой кривой. Обработка фосмидомицином приводила к значительной задержке роста (лаг-фаза длилась около 6 суток) с последующим коротким периодом активного роста (µ = 0.29 сут -1). 

Воздействие ингибиторами не оказывало существенного влияния на общую скорость поглощения кислорода клетками, которая на разных этапах роста составляла в среднем 100 – 200 мг О2/г сухой массы клеток в час, однако кардинально изменяло характеристики дыхательного метаболизма. Ингибиторы увеличивали активность цианидрезистеного и снижали интенсивность цитохромного путей дыхания клеток, причем специфично для каждого из них. В варианте с мевинолином максимальный уровень цианидрезистентного дыхания (70% от общей интенсивности дыхания) наблюдали на начальных этапах роста, в процессе выращивания культуры эта доля постепенно снижалась до 6–8%. Фосмидомицин вызывал обратную динамику процесса: на начальных этапах роста вклад цианидрезистентного дыхания составлял 30%, а к фазе стационара и деградации его доля увеличивалась до 50–60%.

Обработка клеток фосмидомицином привела к существенному (в 2 раза) повышению содержания фуростаноловых гликозидов в клетках в стационарной фазе роста, тогда как на средах с мевинолином наблюдали снижение содержания этих соединений, по сравнению с контролем. Ингибиторы также оказывали влияние на соотношение индивидуальных гликозидов (протодосцина, дельтозида и их 26-S-изомеров).

Полученные результаты подтверждают гипотезу о возможности обмена интермедиатами между пластидным (МЕР) и цитозольным (MVA) путями образования изопреноидов, причем преимущественно в направлении от пластид к цитозолю. 

 

Ключевые слова: Dioscorea deltoidea Wall – cуспензионная культура растительных клеток – фуростаноловые гликозиды – фосмидомицин – мевинолин – протодиосцин – дельтозид 

 

Сокращения: MEP – 2-С-метил-D-эритритол-4-фосфат (МЕР-путь – биосинтез изопреноидов через МЕР); MVA – мевалоновая кислота (MVA-путь – биосинтез изопреноидов через MVA).

 

*Адрес для корреспонденции: Титова Мария Владимировна. 127276, Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН. Электронная почта: titomirez@mail.ru

 

ВВЕДЕНИЕ

Изопреноиды представляют собой одну из наиболее обширных групп природных соединений – более 40 000 индивидуальных веществ [1]. В различных организмах образование стартовой молекулы синтеза изопреноидов – изопентенил дифосфата (IPDP) - происходит по одному из двух вариантов: через мевалонат (мевалонатный или MVA-путь) либо через 2-C-метил-D-эритритол-4-фосфат (альтернативный, или МЕР-путь) [2]. Высшие растения вследствие симбиогенного происхождения пластид являются уникальной группой организмов, у которых в клетке одновременно функционируют оба пути синтеза IPDP, при этом MVA-путь происходит в цитозоле, а МЕР-путь – в пластидах. Разные пути синтеза используются клеткой для образования различных классов изопреноидов. Считается, что сескви- и тритерпеноиды (включая стероиды) образуются по MVA пути, тогда как моно-, ди- и тетраизопреноиды (включая фитол и каротиноиды) – по МЕР-пути. Для образования некоторых соединений используются оба пути синтеза [3]. 

Одной из наиболее важных проблем физиологии и биохимии вторичного метаболизма растений является вопрос взаимодействия двух путей образования изопреноидов. В ряде работ показано, что в клетке может происходить обмен интермедиатами (прежде всего IPDP) между MVA и MEP путями их образования, однако направленность этого обмена, его интенсивность и значение для функционирования клетки однозначно не установлены. Для решения этих вопросов обычно используют ингибиторы путей биосинтеза изопреноидов [4, 6]. Антибиотик фосмидомицин, ингибирующий N-ацетил-D-глюкозамино-3-О-энолпирувил-трансферазу, выключает MEP путь образования изопреноидов, тогда как выделенный из грибов мевинолин (ловастатин), подавляющий активность фермента 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-редуктазы, является ингибитором MVA-пути. Для проведения исследований по выяснению влияния различных факторов на клеточные процессы наиболее удобным объектом традиционно считаются культуры клеток [7].

В ряде работ было проведено изучение действия фосмидомицина и мевинолина на образование изопреноидов в системах in vitro. В работе J. Palazon с соавторами [5] в качестве объекта использовали культуру клеток тиса ягодного (Taxus baccata), синтезирующую противоопухолевые дитерпеноиды (таксоиды) паклитаксел и баккатин III. Было установлено, что как фосмидомицин, так и мевинолин снижали уровень образования таксоидов, однако влияние фосмидомицина было существенно сильнее, что позволило авторам сделать вывод об образовании таксоидов по MEP-пути. Аналогичный результат – ослабление биосинтеза – был получен при выяснении влияния этих ингибиторов на образование тритерпеновых гликозидов (гинзенозидов) в трансформированных корнях женьшеня, при этом авторы сделали вывод, что в образовании гинзенозидов участвуют оба пути образования IPDP [6].

В настоящей работе впервые изучено влияние фосмидомицина и мевинолина на рост и образование стероидных гликозидов в суспензионной культуре клеток диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoidea Wall). Для оценки влияния ингибиторов на физиологическое состояние клеток использовали характеристики окислительного метаболизма клеток (общая интенсивность дыхания, соотношение его цитохромного и цианидрезистентного вариантов).

 

методЫ исследования

В качестве объекта исследования использовали суспензионную культуру клеток Dioscorea deltoidea Wall – штамм-сверхпродуцент фуростаноловых гликозидов ИФР ДМ-0.5 (депонирован в ВККК ВР ИФР РАН, коллекционный № 6). 

Культуру выращивали на модифицированной питательной среде с минеральной основой по Мурасиге-Скуга [8] с добавлением 30 г/л сахарозы, витаминов по Стаба [9] и регуляторов роста (1.0 мг/л 2,4-Д и 0.1 мг/л кинетина). Для выращивания культуры использовали колбы объемом 1.0 л, в 100 мл свежей питательной среды вносили 20 мл инокулюма 14-дневной культуры (конец экспоненциальной фазы роста). Культивирование проводили в темноте при температуре в камере 26 ± 0.5ºС и влажности 60–70%. Скорость вращения качалки составляла 95 ± 3 об/ мин, эксцентриситет – 18 ± 2 мм. 

Для характеристики роста и физиологического состояния культур использовали сухую и сырую массы, а также жизнеспособность и концентрацию клеток.

Для определения сырой и сухой массы клеток суспензию фильтровали с помощью воронки Бюхнера под вакуумом, клетки промывали на фильтре дистиллированной водой и высушивали до постоянного веса при температуре 55–60ºС. 

Индекс роста рассчитывали по формуле: 

I = (Xmax-X0)/X0,

где Xmax и X0 – максимальное и начальное значение содержания сухой биомассы в литре питательной среды. 

Удельную скорость роста µ рассчитывали по формуле: 

µ = (lnX2-lnX1)/(t2-t1),

где X2 и X1 – значения содержания сухой биомассы в литре питательной среды в момент времени t2 и t1, соответственно [10].

Жизнеспособность определяли под микроскопом как процент не окрашиваемых 0.025%-ной синькой Эванса клеточных агрегатов. Просчитывали не менее 250 агрегатов в трех повторностях. 

Для подсчета числа клеток 0.5 мл суспензии инкубировали с 2.0–2.5 мл 20% раствора хромовой кислоты при 60ºС в течение 15–20 минут, в зависимости от возраста и типа суспензии. Число клеток просчитывали в камере Фукса-Розенталя [10].

 

Полярографический метод определения вкладов различных путей дыхания в общее поглощение кислорода

Определение вкладов различных путей дыхания в общее поглощение кислорода производили при помощи полярографической установки с непроточной ячейкой и электродом Кларка при 27ºС. Для измерений использовали суспензию клеток (из расчета 10 и 40 граммов сырой биомассы клеток в литре питательной среды). Для определения вклада различных путей дыхания использовали ингибиторы: азид натрия (NaN3, 5mМ), подавляющий цитохромоксидазный комплекс, и салицилгидроксамовую кислоту (SHAM, 10 mМ), блокирующую альтернативное дыхание [11, 12].

Для исследования путей синтеза стероидных гликозидов культуру клеток Dioscorea deltoidea выращивали с добавлением в питательную среду антибиотика фосмидомицина (ингибитор МЕР пути синтеза изопреноидов) или мевинолина (ингибитор MVA-пути). Растворы ингибиторов стерилизовали с помощью фильтра с размером пор 0.22 мкм и добавляли в питательную среду при пересадке культуры. Концентрации ингибиторов подбирали в соответствии с данными литературы [4–6]. Водный раствор фосмидомицина (Invitrogen, США) добавляли в среду культивирования до конечной концентрации 200 мкМ [4]. Для мевинолина (Sigma, Япония) готовили маточный раствор натриевой соли ингибитора, последовательно растворяя 90 мг мевинолина в теплом этаноле (95% EtOH, 55°C, 1.8 мл), щелочи (NaOH, 0.6 N, 0.9 мл) и дистиллированной воде (18 мл) с последующей инкубацией в течение 30 минут при комнатной температуре. Уровень рН полученного раствора доводили 1N HCl до значения 8.0, и увеличивали общий объем раствора до 22.5 мл. Конечная концентрация мевинолина в среде составляла 1 мкМ.

 

Определение количественного содержания фуростаноловых гликозидов (олигофуростанозидов) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. 

Качественное и количественное содержание фуростаноловых гликозидов в сухой биомассе определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для приготовления проб брали по 10–20 мг измельченной воздушно-сухой биомассы культур клеток, трижды экстрагировали водой в течение 30 мин под действием ультразвука при комнатной температуре. Соотношение биомасса/экстрагент 1:50 (масса/объем). Полученный экстракт центрифугировали в течении 5 минут при 130 об/мин. Супернатант пропускали через экстракционную трубку Supelclean™ ENVI™-18 SPE (Supelco, USA) и фильтровали через нейлоновой фильтр Acrodisc с порами 0.2 мкм (Pall Corporation, UK). Полученную пробу использовали для ВЭЖХ анализа. Объем вводимой пробы составлял 20 мкл.

ВЭЖХ проводили на приборе Agilent 1200 Series (Agilent technologies, USA). Раствор экстракта в смеси ацетонитрил : вода (24 : 76 по объему) наносили на колонку Pecosphere 3CR C18 (83×4,6 мм, 3 мкм). (Perkin Elmer, USA)  В качестве компонентов подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и воды. Элюирование осуществляли в изократическом режиме при соотношении ацетонитрил : вода (24:76 по объему). Условия хроматографирования: первую минуту анализа скорость подвижной фазы составляла 0.6 мл/мин., со 2 по 25 минуту – 0.4 мл/мин. Детекция по поглощению осуществлялась при длине волны 203 нм. Количественное содержание дельтозида и протодиосцина и их 26-S-изомеров определяли по стандарту R-протодиосцина чистотой 98%. Типичная хроматограмма представлена на рис. 1. 

 

Статистическая обработка результатов.

Статистическую обработку результатов проводили по стандартным методикам. На графиках и в таблицах представлены средние арифметические значения и стандартные отклонения из 3 биологических повторностей (по 3 колбы или по 3 фиксированных объема клеточной суспензии (при отборе проб из биореакторов) на точку) для каждого срока, пассажа и варианта культивирования. Стандартные отклонения менее 10% от величин средних значений на графиках не отображали. 

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В целях изучения функционирования двух путей синтеза тритерпеноидов (мевалонатного и альтернативного) был применен метод выращивания культуры клеток на питательных средах с добавлением специфичных ингибиторов фосмидомицина (ингибитора пластидного МЕР пути синтеза) и мевинолина (ингибитора цитозольного MVA-пути). 

На основе анализа данных литературы были выбраны следующие концентрации ингибиторов в культуральных средах: 200 мкМ фосмидомицина и 1.0 мкМ мевинолина [4–6]. Ингибиторы добавляли в питательную среду в начале цикла выращивания (“нулевые” сутки). Полученные кривые роста и ростовые характеристики суспензионных культур клеток Dioscorea deltoidea представлены на рис. 2 и в табл. 1, 2.

Из полученных результатов следует, что обработка ингибиторами приводила к снижению индекса роста культуры на 20–25%, однако в целом их влияние на интегральные ростовые характеристики культуры были незначительны (табл. 1). В то же время характер ростовой кривой при действии фосмидомицина и мевинолина существенно различался (табл.2, рис. 2). Обработка фосмидомицином приводила к значительной задержке роста культуры (лаг-фаза составляла 6 суток) с последующим коротким периодом активного роста (экспоненциальная фаза длительностью около 4 суток с удельной скоростью µ = 0.29 сут -1, что почти в полтора раза превышало контроль) затем следовала выраженная фаза замедления роста (с 11 по 14 сутки) и длительная фаза стационара (более 7 суток). При добавлении мевинолина наблюдали обратную картину – лаг фаза, аналогично контрольному варианту, практически отсутствовала (не более 2 суток), а фаза экспоненциального роста оказалась достаточно протяженной (около 10 суток, что также мало отличалось от контроля) затем следовала относительно кроткая (3–4 суток) стационарная фаза роста. 

Таким образом, оба ингибитора ухудшали рост культуры, но специфика их действия существенно отличалась. Действие мевинолина не изменяло характер роста культуры, что свидетельствует о его постоянном угнетающем влиянии на клетки. Фосмидомицин гораздо сильнее ингибировал рост культуры на начальных этапах, но затем наблюдалась резкая интенсификация ростовых процессов. Такое поведение характерно для относительно мощных, но быстро инактивирующихся ингибиторов. 

Для оценки возможного влияния ингибиторов на физиологическое состояние клеток определяли общую скорость поглощения кислорода и вклад в этот процесс цианидрезистентного (альтернативного) и цитохромного путей дыхания, результаты представлены на рис. 3 и 4.

Из полученных результатов следует, что наибольшая интенсивность дыхания для культуры клеток Dioscorea deltoidea приходилась на 10 сутки, что для всех вариантов соответствовало экспоненциальной фазе роста (рис. 3). При этом ингибиторы незначительно повлияли на общую интенсивность дыхания клеток in vitro: за исключением заключительных фаз роста культуры, различия в общей интенсивности дыхания не превышали 20–25%. В фазах стационара и деградации (19–21 сутки выращивания) в вариантах с ингибиторами не наблюдали снижения интенсивности дыхания, характерного для контроля.

В то же время анализ специфики дыхательного метаболизма клеток in vitro позволил установить, что добавление ингибиторов привело к существенному увеличению доли цианидрезистентного дыхания, что может быть связано с реакцией клеток на стресс (рис. 4). Максимальный вклад альтернативного дыхания в контрольной культуре, как правило, не превышал 35% (максимум 45% в фазе деградации), тогда как при использовании ингибиторов он мог достигать 60–70%. Важно отметить, что доля альтернативного дыхания и ее изменение в цикле выращивания при применении разных ингибиторов различна. При добавлении мевинолина степень альтернативного дыхания была максимальной в начальные фазы роста, и составляла до 70% от общей дыхательной активности. В процессе цикла выращивания эта доля постепенно снижалась вплоть до 4–7% при относительно постоянной интенсивности общего дыхания. При использовании фосмидомицина вклад альтернативного дыхания также мог превышать 50% от общего дыхания, но степень его изменения в цикле выращивания не столь значительна и противоположна по направлению (с 35% в начале цикла до 63% в стационарной фазе роста). 

Таким образом, ингибиторы MVA- и MEP-путей синтеза изопреноидов вызывали состояние стресса в клетках Dioscorea deltoidea в условиях in vitro, о чем можно судить по существенному увеличению доли цианидрезистентного дыхания. Однако специфика их влияния на физиологическое состояние клеток различна, о чем свидетельствует разная динамика соотношения вариантов дыхательного метаболизма в цикле выращивания клеток. 

Анализ содержания фуростаноловых гликозидов проводили на 7, 14 и 21 сутки культивирования, что соответствовало фазе ускорения роста, концу экспоненциальной и стационарной фаз соответственно (рис. 5). Было показано, что добавление фосмидомицина приводило к изменению динамики и уровня накопления индивидуальных соединений – протодиосцина, дельтозида и их 26-S-изомеров. При выращивании кульутры клеток Dioscorea deltiodea на контрольной среде максимальное содержание этих веществ наблюдали в начале экспоненциальной фазы роста и в конце стадии стационара перед началом деградации (до 56.4 мг/г сухой массы клеток протодиосцина, 7.6 мг/г его 25-S-изомера, 17.3 мг/г дельтозида и 3.1 мг/г 25-S-изомера дельтозида). При выращивании клеток на среде с фосмидомицином происходило постепенное увеличение содержания каждого из гликозидов в течение цикла выращивания, однако в значительно большей степени для 25-R-изомеров. Мексимальное значение зафиксировано на 21 сутки культивирования (109.0, 8.9, 45.4 и 4.2 мг/г сухой массы протодиосцина, 25-S-изомера протодиосцина, дельтозида, 25-S-изомера дельтозида соответственно). Также для варианта с этим ингибитором отмечен более высокий уровень общего накопления фуростаноловых гликозидов – максимальное содержание протодиосцина и дельтозида было почти в 2 раза выше, чем   в контрольной культуре клеток. В противоположность фосмидомицину, обработка мевинолином приводила к снижению содержания стероидных гликозидов в 1.4–1.6 раза.

Таким образом, ингибиторы MEP- и MVA-путей синтеза изопреноидов по разному влияют на образование стероидных гликозидов в культуре клеток Dioscorea deltoidea – если фосмидомицин увеличивает их общее содержание, то мевинолин – снижает. Можно также отметить, что образование изомеров дельтозида и протодиосцина в культуре клеток достаточно лабильно и зависит от интенсивности роста клеток in vitro. При продолжительной стационарной фазе наблюдается значительное увеличение накопления R-форм гликозидов, что, возможно, является ответной реакцией клеток на стресс, вызванный фосмидомицином.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты подтверждают гипотезу о возможности обмена интермедиатами между пластидным (МЕР) и цитозольным (MVA) путями образования изопреноидов. Отсутствие значительного влияния мевинолина на рост культуры клеток свидетельствует о высокой вероятности выхода изопентенилдифосфата из пластид в цитозоль, поскольку для процессов деления и роста клеток необходимы фитостерины, которые являются первичными метаболитами (компонентами мембран) и в норме образуются по мевалонатному пути. Значительное ингибирование ростовых процессов фосмидомицином в начальные фазы роста культуры позволяет сделать вывод об отсутствии или ограничении обратного потока интермедиатов образования изопреноидов из цитозоля в пластиды, а также о важной роли образования изопреноидов по МЕР-пути в гетеротрофных клетках, несмотря на отсутствие основных первичных метаболитов, образующихся в пластидах этим способом. 

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (№ 16-14-00126).