УДК 581.1
КИСЛОТНОСТЬ ПОЧВЫ ПОВЫШАЕТ СОДЕРЖАНИЕ ФИТОГОРМОНОВ И β-ЭУДЕСМОЛА В КОРНЯХ Atractylodes lancea
© 2009 г. Ю. Юйань*, Ю. Дж. Лиу**, Л. Ц. Хуан*, Г. Х. Куи*, Г. Ф. Фу*
* Институт изучения лекарственных препаратов Китая, Китайская академия медицинских наук, Пекин, Китай
** Институт зерновых культур, Китайская академия сельскохозяйственных наук, Пекин, Китай
Поступила в редакцию 12.12.2007 г.

Исследовали влияние низкого рН на рост корней традиционного для Китая лекарственного растения Atractylodes lancea и накопление в них основного активного соединения  -эудесмола. Наши результаты показали, что при низком рН увеличивалась густота корневых волосков и сухой вес корней, но главный корень был короче. Сильное закисление среды стимулировало синтез -эудесмола в корнях A. lancea.

Ключевые слова: Atractylodes lancea  -эудесмол  кислая среда  корни.

------------------
Сокращение: ЗР  рибозид зеатина.
Адрес для корреспонденции: L.Q. Huang. Institute of Chinese Materia Medica, Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China. Fax: + 86-10-84044340; e-mail: huangluqi@263.net
 ВВЕДЕНИЕ

Atractylodes lancea является традиционным лекарственным растением Китая [1], чьи природные ресурсы снижаются из-за слишком интенсивного сбора растений . Клинические исследования на протяжении нескольких тысячелетий показали, что качественно лучшие растения произрастают в области Маошэнь (провинция Цзянсу, Китай). На сегодня запасы диких растений Маошэня существенно истощены. Но хотя дикие растения были найдены также в области Сишэнь, по качеству они оказались хуже. Следует отметить, что почвы в области Маошэнь более кислые (рН 5.3), чем в области Сишэнь (рН 6.9) [2].
Низкий рН почвы может повлиять на рост растений не прямо, а посредством повышения растворимости алюминия и марганца и снижения доступности молибдена, фосфора, кальция или магния. С другой стороны, низкий рН может подавлять рост и напрямую. Обработка экзогенной АБК помогает преодолеть негативное воздействие низкого рН на рост корней [3, 4]. В то же время, как сообщали Konno с соавт. [5], низкий рН индуцировал образование корневых волосков у проростков латука при наличии в среде минералов. Takahashi с соавт. [6] предположили, что и ауксин, и этилен вовлечены в инициацию корневых волосков, индуцированную низким рН. Обнаружено, что у Arabidopsis и жасмонаты способны стимулировать образование корневых волосков, возможно, при взаимодействии с этиленом [7, 8].
Растения A. lancea богаты некоторыми незаменимыми маслами, составляющими до 7% от сухого веса корней. Основными активными соединениями являются сесквитерпены. В эту группы входят -эудесмол, атрактилон, элемол, атрактиленолид и хинезол. Наиболее важным активным соединением у этих растений является -эудесмол. Факторы среды могут оказывать сильное влияние на выделение летучих веществ, их количество и состав незаменимых масел [9, 10].
Для того, чтобы понять, как низкий рН действует на рост растений A. lancea и накопление в них активных соединений, мы изучили ростовую активность корней и содержание -эудесмола в корнях проростков, растущих на МС-среде при рН 5.3 в варианте с воздействием низкого рН и при рН 6.0 в контроле.

МЕТОДИКА

Растительный материал и условия выращивания. Семена A. lancea, собранные в провинции Хубэй, Китай, замачивали в деионизованной воде в течение 3 дней для индукции прорастания. Проростки стерилизовали 1% HgCl2, после чего переносили в колбы на основную МС-среду, содержавшую 30 г/л сахарозы и 8 г/л агара, и выращивали в течение 30 и 60 дней при 16-часовом фотопериоде и 25С. МС-среду в опытном варианте доводили до рН 5.3 с помощью HCl, в контрольном  до рН 6.0 с помощью NaOH.
Измерение числа корневых волосков, длины корней и их сухого веса. Брали по 10 проростков для каждого определения, подсчитывали количество корневых волосков в апикальных сегментах длиной 23 мм, для чего использовали стереомикроскоп ("Nikon", Япония) [11]. У 30- и 60-дневных проростков (по 10 штук на вариант) измеряли длину главного корня с помощью нониусного кронциркуля ("Mitutoyo", Япония). Затем корни сушили при комнатной температуре в течение 3 дней и взвешивали.
ELISA-тест для определения фитогормонов. Брали корни 30- или 60-дневных проростков, после чего проводили экстракцию, очистку и определение ИУК, ГК, АБК и рибозида зеатина (ЗР) с помощью непрямого ELISA-теста в соответствии с методиками [1214]. Образцы гомогенизировали в жидком азоте и проводили экстракцию в течение ночи при 4С в охлажденном 80% метаноле с добавлением 1 мМ бутилированного гидрокситолуола. Экстракты собирали после центрифугирования при 10 000 g при 4С в течение 20 мин, затем пропускали через С18 Sep-Pak колонку ("Waters", США) и высушивали в токе N2. Образцы растворяли в PBS-буфере (0.01 М, рН 7.4) и определяли содержание ИУК, ГК, АБК и ЗР. На планшеты для микротитрования наносили конъюгаты ИУК, ГК, ЗР или АБК с БСА в NaHCO3-буфере (50 мМ, рН 9.6) и выдерживали в течение ночи при 37С. БСА (10 мг/мл) добавляли в каждую лунку, чтобы предотвратить неспецифическое связывание. После 30-минутной инкубации при 37С добавляли образцы стандартов ИУК, ГК, АБК и ЗР и антитела (предоставленные докт. Baomin Wang, Китайский сельскохозяйственный университет) и проводили инкубацию при 37С в течение 45 мин. Затем в каждую лунку вносили антикроличий иммуноглобулин, конъюгированный с пероксидазой хрена, и инкубировали при 37С в течение 1 ч. Наконец, добавляли забуференный субстрат (о-фенилендиамин) для ферментативной реакции, которую проводили в темноте при 37С в течение 15 мин и останавливали 3 М H2SO4. Поглощение регистрировали при 490 нм. Расчет данных иммуноферментного анализа проводили, как описано Weiler с соавт. [15].
Процентный выход каждого гормона рассчитывали после добавления известных количеств их стандартов к экстрактам. Выход всех гормонов превышал 90%, и кривые разбавления для всех экстрактов шли параллельно кривым, полученным для стандартов, что свидетельствовало об отсутствии неспецифических ингибиторов в экстрактах.
ГХМС-анализ сесквитерпенов. Пробы воздушно-сухих корней (примерно 0.5 г) измельчали и подвергали гидродистилляции в течение 1.5 ч в аппарате типа Clevenger ("Lanhong", Китай). Полученные масла высушивали над безводным сульфатом натрия и растворяли в 20 мкл этилацетата. В качестве внутреннего стандарта добавляли 6 мкл раствора цетанола (1 мг/мл). ГХМС-анализ проводили на Trace GC/MC ("Finnigan", США) при следующих условиях: импульс электронов  70 эВ, температура  200С, сила тока  150 мкА. Спектры сканировали со скоростью 0.4 с в диапазоне масс 35455 Д. Была использована бесполюсная колонка DB-5 (30 м  0.32 мм, толщина поверхностного слоя 0.25 мкм).
Раствор незаменимых масел вводили в ГХМС-анализатор, и колонку выдерживали при 120С в течение 1 мин. Температуру постепенно увеличивали: до 167С со скоростью 20С/мин, от 167 до 173С со скоростью 0.3С/мин, от 173 до 220С со скоростью 30С/мин. При 220С колонку выдерживали в течение 2 мин. Давление на входе равнялось 150 КПа. Температура инжектора  240С, объем пробы  1 мкл, расщепление  1/20. Соединения идентифицировали, сравнивая их времена удерживания и масс-спектры с таковыми стандартов, используя библиотеку JL-USE (созданную проф. L. Ji, Китайская академия медицинских наук) и NIST (Национальный институт стандартов и технологий), версия 1.7 поисковой библиотеки. Стандарт -эудесмола был получен от докт. M.H. Fu (Китайская академия медицинских наук), стандарт цетанола был приобретен у фирмы "Fluka" (Швейцария). ГХМС-анализы повторяли не менее 6 раз [16].
Статистическая обработка данных. Разброс данных оценивали по стандартной ошибке (SE). Значимые различия между вариантами рассчитывали с использованием t-теста. Корреляционный анализ проводили в Excel 2003 (Microsoft)в программе CORREL.

РЕЗУЛЬТАТЫ
Низкий рН влияет на рост корней
Динамика образования корневых волосков у проростков A. lancea показана на рис. 1. Густота корневых волосков при рН 5.3 в 1.7 раз превышала таковую в контроле (рН 6.0) на 30-й день и в 3.4 раза, на 60-й день (рис. 1а). Увеличенное количество волосков при низком рН совпало с результатами, представленными Konno с соавт. [5]. Длина главного корня при рН 5.3 составляла 81% от длины корня при рН 6.0 через 30 дней, и через 60 дней корень был все еще короче (рис. 1б). Сухой вес корней возрастал при рН 5.3 по сравнению с таковым при 6.0 (рис. 1в). Эти результаты показали, что низкий рН (рН 5.3) оказывал негативный эффект на рост главного корня, но стимулирующий  на образование корневых волосков по сравнению с контрольными растениями (рН 6.0).

Низкий рН влияет на некоторые фитогормоны
Наши результаты показали, что при рН 5.3 в корнях проростков повышалось содержание ИУК, АБК и ЗР по сравнению с контролем (рН 6.0) (рис. 2). При этом при рН 5.3 содержание АБК и ИУК было, соответственно, в 1.4 и 2.8 раз выше через 30 дней, а через 60 дней содержание АБК, ИУК и ЗР было выше, соответственно, в 1.7, 1.3 и 2.0 раза. В то же время, уровень ГК при рН 5.3 и рН 6.0 был одинаковым. Соотношения ИУК/АБК, ИУК/ЗР и ИУК/ГК при рН 5.3 превышали эти соотношения в контроле, возможно, из-за того, что при низком рН ИУК играет главную роль.

Низкий рН стимулирует образование активных соединений
Для обнаружения активных соединений в корнях A. lancea из них выделяли незаменимые масла и анализировали их методом ГХМС. У растений, выращенных при низком рН, в незаменимых маслах оказалось больше активных соединений, чем у растений контрольного варианта (рис. 3а и 3б). Пики 1 на рис. 3а и 3в соответствуют -эудесмолу, которого при низком рН было значительно больше (в контроле его количество не определялось, рис. 3б). Через 30 дней средний уровень -эудесмола соответствовал 11.3 мкг/г сухого веса, а через 60 дней  278 мкг/г сухого веса (рис. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ

Растения A. lancea, произрастающие в области Маошэнь, содержали гораздо больше активных соединений, чем растения из других областей, но этот феномен до конца не изучен. Guo с соавт. [2] предположили, что причиной высокого содержания активных соединений является закисление почвы (рН 5.3) в области Маошэнь. Некоторые "кислые" факторы могут действовать на рост корней, влияя прямо на ростовой процесс или косвенно через ухудшение питания растений [17]. Guo с соавт. [2] показали, что, с точки зрения экологии, закисление почвы вносит вклад в определение качества этих растений. Наши результаты подтвердили это на биохимическом уровне.
Мы показали увеличение плотности корневых волосков и сухого веса корней при рН 5.3 (рис. 1). Inoue с соавт. [18] обнаружили, что низкий рН усиливает образование корневых волосков у проростков латука; количество корневых волосков при рН 4.04.5 было почти в 7 раз больше, чем при рН 5.5. Мы установили, что при низком рН значительно возрастало количество корневых волосков на 23-миллиметровых апикальных отрезках корней (рис. 1а). На отрезках выше 3 мм также обнаружили большое количество волосков, тогда как на аналогичных отрезках в контроле их практически не было (данные не приведены). Итак, продукция активных соединений может быть связана с корневыми волосками, возможно, посредством увеличения способности растений поглощать элементы питания из почвы. При низком рН также увеличивался сухой вес корней (рис. 1в) и содержание -эудесмола (рис. 4), т.е., как нам кажется, усиливалось образование активных соединений.
Согласно классической теории кислого роста, ИУК подкисляет апопласт путем стимуляции активного выделения Н+, участвуя, таким образом, в разрыхлении клеточных стенок при растяжении клеток [19]. Подкисление является предпосылкой роста растяжением, и ИУК играет доминирующую роль в условиях низкого рН. При изучении мутантов Arabidopsis обнаружили, что ауксин и этилен инициировали рост корневых волосков [20, 21]. Было показано, что ИУК способствует образованию боковых корней и подавляет удлинение корня [22]. Согласно нашим результатам, при низком рН увеличивалось содержание ИУК, АБК и ЗР (рис. 2) и замедлялся рост в длину главного корня (рис. 1). Следовательно, возросший уровень ИУК в корнях, росших при низком рН, мог быть причиной подавления роста главного корня.
АБК как гормон, относящийся к С15 сесквитерпенам [23], обнаруживает схожесть по химической структуре и биосинтезу с -эудесмолом, и поэтому АБК могла конкурировать с -эудесмолом в некоторых биосинтетических реакциях. С другой стороны, предшественником биосинтеза АБК, ГА и ЗР является изопентенил-пирофосфат [24], он же  предшественник синтеза -эудесмола. Таким образом, три фитогормона могли быть тесно связаны с -эудесмолом. Факторы окружающей среды, такие как свет, температура и влажность, могут влиять на образование незаменимых масел [9, 10]. Итак, мы показали, что кислотность почвы также является фактором, стимулирующим накопление незаменимых масел, особенно -эудесмола, влияя на рост корня и уровень фитогормонов.
Авторы благодарны г-же Li Ji из Китайской академии медицинских наук за помощь при работе методом ГХМС и докт. Baomin Wang из Китайского сельскохозяйственного университета за помощь при проведении ELISA.
Работа была поддержана Министерством науки и технологий Китая, программа "R&D Infrastructure and Facility Development" (грант № 2003DIB3J110).
 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Gainesville F.L. Powerful and Unusual Herbs from the Amazon and China. Florida: World Preserv. Soc., 1995.
2. Guo L.P., Huang L.Q., Shao A.J. The Status and Changes of Soil Nutrients in Rhizosphere of Cultivated Atractylodes lancea // China J. Chinese Materia Medica. 2005. V. 30. P. 1504–1507.
3. Yan F., Schubert S., Mengel K. Effect of Low Root Medium pH on Net Proton Release, Root Respiration, and Root Growth of Corn (Zea mays L.) and Broad Bean (Vicia faba L.) // Plant Physiol. 1992. V. 99. P. 415–421.
4. Yan F., Feuerle R., Schaffer S., Fortmeier H., Schubert S. Adaptation of Active Proton Pumping and Plasmalemma ATPase Activity of Corn Roots to Low Root Medium pH // Plant Physiol. 1998. V. 117. P. 311–319.
5. Konno M., Ooishi M., Inoue Y. Role of Manganese in Low-pH-Induced Root Hair Formation in Lactuca sativa, cv. Grand Rapids Seedlings // J. Plant Res. 2003. V. 116. P. 301–307.
6. Takahashi H., Kawahara A., Inoue Y. Ethylene Promotes the Induction by Auxin of the Cortical Microtubule Randomization Required for Low-pH-Induced Root Hair Initiation in Lettuce (Lactuca sativa L.) Seedlings // Plant Cell Physiol. 2003. V. 44. P. 932–940.
7. Zhu J.K. Salt and Drought Stress Signal Transduction in Plants // Annu. Rev. Plant Biol. 2002. V. 53. P. 247–273.
8. Zhu C., Gan L., Shen Z., Xia K. Interactions between Jasmonates and Ethylene in the Regulation of Root Hair Development in Arabidopsis // J. Exp. Bot. 2006. V. 57. P. 1299–1308.
9. Staudt M., Bertin N. Light and Temperature Dependence of the Emission of Cyclic and Acyclic Monoterpenes from Holm Oak (Quercus ilex L.) Leaves // Plant Cell Environ. 1998. V. 21. P. 385–395.
10. Gershenzon J., McConkey M.E., Croteau R.B. Regulation of Monoterpene Accumulation in Leaves of Peppermint // Plant Physiol. 2000. V. 122. P. 205–214.
11. Muller M., Schmidt W. Environmentally Induced Plasticity of Root Hair Development in Arabidopsis // Plant Physiol. 2004. V. 134. P. 409–419.
12. He Z.P. A laboratory Guide to Chemical Control Technology on Field Crop. Beijing: Beijing Agricultural University Press, 1993. P. 60–68.
13. Yang Y.M., Xu C.N., Wang B.M., Jia J.Z. Effects of Plant Growth Regulators on Secondary Wall Thickening of Cotton Fibres // Plant Growth Regul. 2001. V. 35. P. 233–237.
14. Teng N.J., Wang J., Chen T., Wu X.Q., Wang Y.H., Lin J.X. Elevated CO2 Induces Physiological, Biochemical and Structural Changes in Leaves of Arabidopsis thaliana // New Phytol. 2006. V. 172. P. 92–103.
15. Weiler E.W., Jourdan P.S., Conrad W. Levels of Indole-3-Acetic Acid in Intact and Decapitated Coleoptiles as Determined by a Specific and Highly Sensitive Solid-Phase Enzyme Immunoassay // Planta. 1981. V. 153. P. 561–571.
16. Yuan Y., Huang L.Q., Yang B. The Content of β-eudesmol in Atractylodes lancea by GC // Chinese J. Exp. Trad. Medical Formulae. 2006. V. 10. P. 23–24.
17. Marschner H. Mineral Nutrition of Higher plants. London: Academic, 1995.
18. Inoue Y., Yamaoka K., Kimura K., Sawai K., Arai T. Effects of Low pH on the Induction of Root Hair Formation in Young Lettuce (Lactuca sativa L. cv. grand rapids) Seedling // J. Plant Res. 2000. V. 113. P. 39–44.
19. Felle H.H. pH: Signal and Messenger in Plant Cells // Plant Bio. 2001. V. 3. P. 577–591.
20. Leyser H.M., Pickett F.B., Dharmasiri S., Estelle M. Mutations in the AXR3 Gene of Arabidopsis Result in Altered Auxin Response Including Ectopic Expression from the SAUR-AC1 Promoter // Plant J. 1996. V. 10. P. 403–413.
21. Pitts R.J., Cernac A., Estelle M. Auxin and Ethylene Promote Root Hair Elongation in Arabidopsis // Plant J. 1998. V. 16. P. 553–560.
22. Woodward A.W., Bartel B. Auxin: Regulation, Action, and Interaction // Ann. Bot. 2005. V. 95. P. 707–735.
23. Chappell J. The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism // Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 1–6.
24. Eckardt N.A. Abscisic Acid Biosynthesis Gene Underscores the Complexity of Sugar, Stress, and Hormone Interactions // Plant Cell. 2002. V. 14. P. 2645–2649.
 ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

Рис. 1. Временнáя кривая развития корня A. lancea.
а  плотность корневых волосков на 23-миллиметровом апикальном отрезке корня; б  длина главного корня; в  сухой вес корней. 1  рН 5.3, 2  рН 6.0. Представлены средние значения для 10 проростков и их стандартные ошибки. Звездочками обозначены достоверно различающиеся данные для рН 5.3 и 6.0 (P  0.05, t-тест).

Рис. 2. Эндогенный уровень АБК, ГК, ИУК и ЗР в корнях A. lancea, растущих в среде с различным рН, через 30 дней (а) и 60 дней (б).
1  рН 5.3, 2  рН 6.0. Представлены средние значения из 3 экспериментов и их стандартные ошибки. Звездочками обозначены достоверно различающиеся данные (P  0.05, t-тест).

Рис. 3. Сесквитерпены в 30-дневных корнях A. lancea, растущих при разных рН.
а  рН 5.3; б  рН 6.0; в  ГХ-спектры стандартных соединений: 1  -эудесмол, 2  цетанол, 3  внутренний стандарт; г  структура и спектр -эудесмола (JL-USE библиотека).

Рис. 4. Уровень -эудесмола в корнях A. lancea, растущих при разных рН, через 30 дней (а) и 60 дней (б).
Представлены средние значения из 6 независимых экспериментов и их стандартные ошибки.