КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 581.1
ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ ПРИ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ
АДАПТАЦИИ ЛИСТЬЕВ И КОРНЕЙ ТЕПЛОЛЮБИВЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА
© 2010 г. В. Н. Попов, О. В. Антипина, Т. И. Трунова
Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А.
Тимирязева РАН, Москва
Поступила в редакцию 11.03.2009 г.Исследовали особенности низкотемпературной адаптации теплолюбивых растений табака на
уровне листьев и корней в связи с процессами ПОЛ. Объектом исследования служили
растения табака (Nicotiana tabacum L.) сорта Самсун. Проведенные исследования показали,
что холодовое закаливание (6 суток при температуре 8оС) оказывало принципиально
различное воздействие на листья и корни растений табака. В листьях происходило снижение
содержания диеновых конъюгатов и МДА, что сопровождалось повышением
холодостойкости листовой ткани вплоть до устойчивости к отрицательным температурам. В
то же время, в корнях наблюдалось увеличение интенсивности процессов ПОЛ и снижение
холодостойкости этого органа. Высказано предположение, что неспособность корневой
системы табака к низкотемпературной адаптации является лимитирующим фактором,
определяющим в целом низкий потенциал устойчивости теплолюбивых растений к
гипотермии.

Ключевые слова: Nicotiana tabacum – листья и корни – гипотермия – низкотемпературная
адаптация – перекисное окисление липидов

--------------------------------
Сокращение: ДК – диеновые конъюгаты.
Адрес для корреспонденции: Попов Валерий Николаевич. 127276 Москва, Ботаническая ул.,
35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18, электронная почта:
trunova@ippras.ru

ВВЕДЕНИЕ

Температура является одним из наиболее значимых лимитирующих факторов среды,
определяющих географическое распространение и продуктивность растений. Поскольку у
растений отсутствуют механизмы тепловой регуляции, они вынуждены постоянно
адаптироваться к колебаниям температуры среды обитания [1]. Проблема устойчивости к
холоду особенно актуальна для теплолюбивых растений тропического и субтропического
происхождения, которые особенно чувствительны к низким температурам [2].
Устойчивость растений к низкой температуре – это многокомпонентное свойство,
развивающееся в результате низкотемпературной адаптации, под которой понимается
процесс формирования свойств холодо- или морозостойкости растений [3, 4]. Наиболее
полно изучены процессы низкотемпературной адаптации морозостойких растений,
некоторые из которых после лабораторного закаливания способны выносить любые низкие
температуры, вплоть до температуры жидкого гелия (–273оС). В отличие от морозостойких,
теплолюбивые растения могут повреждаться низкими положительными температурами и
имеют механизм адаптации к ограниченному диапазону действия пониженных температур
[4].
Известно, что при охлаждении теплолюбивых растений в их клетках инициируются
процессы образования АФК, возникающих в результате нарушений в работе электронно-
транспортных цепей [5, 6]. Образующиеся во время холодового стресса АФК активизируют
процессы ПОЛ. При этом сначала образуются первичные молекулярные продукты ПОЛ, к
которым относятся диеновые конъюгаты и гидропероксиды липидов. Первичные продукты
претерпевают дальнейшие превращения, в результате чего образуются вторичные продукты
ПОЛ, к числу которых относится МДА [7, 8]. При этом в мембранных липидах уменьшается
количество ненасыщенных ЖК, что сопровождается снижением текучести и повышением
проницаемости клеточных мембран [9]. Следствием таких процессов может быть нарушение
метаболизма и даже гибель растений [10]. В связи с этим, исследование закономерностей
накопления продуктов ПОЛ в период адаптации к низким температурам имеет существенное
значение для выяснения механизмов устойчивости теплолюбивых растений к гипотермии.
Следует отметить, что до сих пор большинство исследователей основное внимание
уделяли изучению окислительного стресса, развивающегося в листьях. Тем не менее,
известно, что устойчивость растений к низким температурам во многом определяется
высокой чувствительностью к действию низких температур корневой системы, причины
которой недостаточно изучены [11, 12].
В связи с этим, цель данной работы заключалась в исследовании низкотемпературной
адаптации теплолюбивых растений табака на уровне листьев и корней в связи с процессами
перекисного окисления липидов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили теплолюбивые растения табака (Nicotiana tabacum
L.) сорта Самсун. Растения размножали черенкованием и культивировали на минеральном
субстрате при 22оС, 16-часовом фотопериоде и освещенности 5 клк в камере фитотрона ИФР
РАН. Для опытов использовали растения в возрасте 6 нед. Растения имели 6–7 листьев
массой в среднем 3 г, при высоте стебля в 6–8 см. Масса корневой системы составляла 1.25–
1.5 г.
Закаливание растений проводили в течение 6 суток при температуре 8оС в
климатической камере Binder KBW-240 (Германия). Данная температура является нижней
границей диапазона температур холодового закаливания для теплолюбивых растений табака,
она была подобрана в ходе предварительных опытов [13]. После процедуры
низкотемпературного закаливания растения видимых повреждений не имели и сохраняли
способность к дальнейшему росту.
Содержание первичных продуктов ПОЛ – диеновых конъюгатов (ДК) – определяли
путем измерения оптической плотности липидных экстрактов в смеси метанол : гексан (5 : 1)
на спектрофотометре GENESYS 10UV (США) при длине волны 232 нм (максимум
поглощения ДК) [14].
Содержание МДА определяли по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой с
последующим измерением оптической плотности окрашенного раствора на
спектрофотометре GENESYS 10UV при длине волны 532 нм [15].
Холодостойкость листьев и корней растений табака оценивали по выходу
электролитов из поврежденной холодом ткани в водную фазу [16], а также по выживаемости
растений после их промораживания при температуре –3оС в течение суток.
Во всех экспериментах биологическая повторность измерений была шестикратной,
аналитическая – трехкратной. Результаты экспериментов обработаны статистически. На
рисунках представлены средние значения и их доверительные интервалы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Важным фактором успешного закаливания растений к гипотермии является
сохранение функциональной активности клеточных мембран в условиях действия
пониженных температур [17, 18]. Поскольку ПОЛ, индуцированное гипотермией, приводит к
разрушению полиненасыщенных ЖК и вызывает изменение физико-химических свойств
мембран, то детальное изучение процессов ПОЛ на органном уровне (у листьев и корней)
представляется важным для оценки способности теплолюбивых растений табака к
низкотемпературной адаптации.
Представленные на рис. 1 данные свидетельствуют о том, что в листьях незакаленных
растений уровень содержания ДК составлял 2.16 ммоль/г сырой массы, что значительно
превышало их содержание в корнях – 0.66 ммоль/г сырой массы. В процессе
низкотемпературного закаливания концентрация ДК в листьях растений табака снижалась на
15% и составляла уже 1.84 ммоль/г сырой массы, а в корнях, наоборот, возрастала почти в 2
раза по сравнению с незакаленными растениями и равнялась 1.25 ммоль/г сырой массы.
Полученные данные свидетельствуют о принципиальном различии в изменении содержания
первичных продуктов ПОЛ в листьях и корнях в процессе длительной низкотемпературной
адаптации.
Так как диены – это первичные продукты, образующиеся при окислении мембранных
липидов, то следующим этапом было определение содержания МДА, являющегося одним из
конечных продуктов процесса ПОЛ. Из данных, представленных на рис. 2, следует, что в
процессе закаливания содержание МДА в листьях снижалось с 3.62 до 2.88 мкмоль/г сырой
массы, что, по-видимому, свидетельствует о снижении интенсивности окисления в
мембранных липидах листьев табака. За этот же период времени количество МДА в корнях
возрастало с 2.63 до 5.16 мкмоль/г сырой массы, что является признаком существенной
интенсификации процессов ПОЛ под воздействием низких положительных температур.
Учитывая, что показатели интенсивности ПОЛ отражают начальные этапы
повреждения клеточных мембран, в дальнейшем, для определения эффективности
низкотемпературной адаптации растений табака, было необходимо оценить в целом
функциональное состояние мембран клеток листьев и корней до и после закаливания. Для
этого был использован метод определения степени проницаемости клеточных мембран по
электропроводности водных экстрактов, полученных из тканей растений. Данный метод
позволяет выявить нарушение структуры клеточных мембран при охлаждении, следствием
чего является повышение их проницаемости, которое легко регистрируется в виде резкого
увеличения скорости утечки растворенных веществ из тканей растений [19]. Увеличение
выхода электролитов может происходить за счет повышения пассивной проницаемости
мембран в результате возникновения пор или разрывов мембран, либо вследствие
модификации мембранных каналов изменяющимся липидным микроокружением, а также за
счет нарушения активного транспорта ионов с одновременным усилением их выхода из
клетки через ионные каналы [20].
Наши исследования показали, что у незакаленных растений выход электролитов из
клеток корней составлял 29% от максимально возможного выхода из убитой кипячением
ткани, что в два раза превышало их выход из листьев (рис. 3). После 6-дневного закаливания
растений выход электролитов из клеток корней значительно увеличивался и составлял уже
54%, в то время как в листьях этот показатель практически не изменялся. Эти результаты
свидетельствуют о различном влиянии низкотемпературной экспозиции на холодостойкость
листьев и корней табака. Если в листьях за время опыта наблюдалось сохранение барьерных
свойств клеточных мембран, то в корнях в это же время происходило резкое возрастание
проницаемости плазмалеммы для ионов, свидетельствующее о серьезных повреждениях
мембранной системы клеток.
Для более эффективной оценки эффективности закаливания в дальнейшем был
использован метод прямого промораживания растений табака при температуре –3оС в
течение суток. По истечении данной холодовой экспозиции все незакаленные растения
погибали. Напротив, закаленные растения табака после оттаивания сохраняли тургор, и
видимых повреждений надземной части не имели. Тем не менее, эти закаленные растения
засыхали через 3 суток после промораживания при их выращивании в оптимальных
температурных условиях (22оС), что может свидетельствовать о гибели корневой системы.
Для проверки этой гипотезы у части закаленных растений после промораживания при –3оС
были срезаны побеги и помещены в резервуары с водой. Спустя 3 суток эти побеги не только
не засыхали, но и демонстрировали возобновление ростовых процессов и формирование
придаточных корней. Полученные данные свидетельствуют о достаточно высокой
эффективности закаливания листьев теплолюбивых растений табака, способных развивать
устойчивость к отрицательным температурам, что ранее считалось исключительно
свойством морозостойких растений [4].
Проведенные нами эксперименты показали, что использованная в работе холодовая
экспозиция оказывала различное воздействие на надземную и подземную части растений
табака. В листьях происходило снижение содержания ДК и МДА, что сопровождалось
повышением холодостойкости листовой ткани. В то же время, в корнях наблюдалось
увеличение интенсивности процессов ПОЛ и снижение холодостойкости этого органа.
Поскольку накопление первичных и вторичных продуктов ПОЛ происходит за счет
активации свободнорадикальных реакций с участием АФК, приводящих к окислению
прежде всего ненасыщенных ЖК липидов, то в корнях растений табака в результате
уменьшения доли ненасыщенных ЖК, возможно, происходит снижение текучести клеточных
мембран, что и приводит к уменьшению холодостойкости данного органа [21].
Так как свободнорадикальные реакции в растении находятся под контролем
многокомпонентной антиоксидантной системы, буферная емкость которой достаточно
велика [22, 23], то полученные нами данные свидетельствуют о том, что листья табака в
отличие от корней, были способны поддерживать активность антиоксидантной системы в
течение всей холодовой экспозиции, что позволяло им эффективнее противостоять
накоплению АФК. Это, в свою очередь, приводило к снижению интенсивности процессов
ПОЛ и, тем самым, к повышению холодостойкости листьев, демонстрируя их способность к
низкотемпературной адаптации.
Таким образом, можно констатировать, что холодостойкость теплолюбивых растений
табака определяется способностью к низкотемпературной адаптации их органов. Мы
показали возможность значительного повышения устойчивости листьев растений табака,
вплоть до устойчивости к отрицательным температурам. В то же время, установлена
неспособность корневой системы табака к низкотемпературной адаптации, что, по-
видимому, является лимитирующим фактором, определяющим в целом низкий потенциал
устойчивости теплолюбивых растений к гипотермии.
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 09-
04-00355).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Margesin R., Neuner G., Storey K.B. Cold-Loving Microbes, Plants, and Animals –
Fundamental and Applied Aspects // Naturwissenschaften. 2007. V. 94. P. 77-99.
2. Лукаткин А.С. Холодовое повреждение теплолюбивых растений и окислительный
стресс. Саранск: изд-во Мордовск. ун-та, 2002. 208 с.
3. Xin Z., Browse J. Cold Comfort Farm: The Acclimation of Plants to Freezing Temperatures //
Plant Cell Environ. 2000. V. 23. P. 893-902.
4. Трунова Т.И. Растение и низкотемпературный стресс // 64-е Тимирязевское чтение. М.:
Наука, 2007. 54 с.
5. Hariadi P., Parkin K.L. Chilling Induced Oxidative Stress in Cucumber Seedling // J.Plant
Physiol. 1993. V. 141. № 6. P. 733-738.
6. Prasad T.K., Anderson M.D., Martin B.A., Stewart C.R. Evidence for Chilling-Induced
Oxidative Stress in Maize Seedlings and a Regulatory Role for Hydrogen Peroxide // Plant
Cell. 1994. V. 6. P. 65-74.
7. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов биологических
мембран. М.: Наука, 1972. 252 с.
8. Барабой В.А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов // Успехи соврем.
биол. 1991. Т. 111. С. 923-931.
9. Alonso A., Queiroz C.S., Magalhaes A.C. Chilling Stress Leads to Increased Cell-Membrane
Rigidity in Roots of Coffee (Coffea arabica L.) Seedlings // Biochim. Biophys. Acta. 1997.
V. 1323. P. 75-84.
10. Мерзляк М.Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах
растительной клетки // Итоги науки и техники. Сер. Физиология растений. 1989. Т. 6.
167 с.
11. Балагурова Н.И., Акимова Т.В., Титов А.Ф. Влияние локального охлаждения
проростков огурца и пшеницы на различные виды устойчивости листа и корня //
Физиология растений. 2001. Т. 48. С. 113-118.
12. Климов С.В., Попов В.Н., Дубинина И.М., Бураханова Е.А., Трунова Т.И. Пониженная
холодостойкость теплолюбивых растений связана с ингибированием ассимиляции СО2
в листьях и накопления сахаров в корнях // Физиология растений. 2002. Т. 49. С. 871-
877.
13. Попов В.Н., Кипайкина Н.В., Астахова Н.В., Трунова Т.И. Ультраструктурная
организация хлоропластов листьев растений табака, трансформированных геном 9-
ацил-липидной десатуразы из Synechococcus vulcanus, в норме и при гипотермии //
Физиология растений. 2007. Т. 54. С. 312-315.
14. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир, 1975. 324 с.
15. Лукаткин А.С., Голованова В.С. Интенсивность перекисного окисления липидов в
охлажденных листьях теплолюбивых растений // Физиология растений. 1988. Т. 35. С.
773-780.
16. Orlova I.V., Serebriiskaya T.S., Popov V.N., Merkulova N.V., Nosov A.M., Trunova T.I.,
Tsydendambaev V.D., Los D.A. Transformation of Tobacco with a Gene for the Thermophilic
Acyl-Lipid Desaturase Enhances the Chilling Tolerance of Plants // Plant Cell Physiol. 2003.
V. 44. P. 447-450.
17. Sung D., Kaplan F., Lee K., Guy C.L. Acquired Tolerance to Temperature Extremes // Trends
Plant Sci. 2003. V. 8. P. 179-187.
18. Uemura M., Tominaga Y., Nakagawara C., Shigematsu S., Minami A., Kawamura Y.
Responses of the Plasma Membrane to Low Temperatures // Physiol. Plant. 2006. V. 126. P.
81-89.
19. Hepburn H.A., Naylor F.L., Strokes D.I. Electrolyte Leakage from Winter Barley Tissue as
Indicator of Winterhardiness // Ann. Appl. Biol. 1986. V. 108. P. 164-165.
20. Simon E.W. Phospholipids and Plant Membrane Permeability // New Phytol. 1974. V. 73. P.
377-420.
21. Лось Д.А. Молекулярные механизмы холодоустойчивости растений // Вестн. РАН.
2005. Т. 75. С. 338-345.
22. Apel K., Hirt H. Reactive Oxygen Species: Metabolism, Oxidative Stress, and Signal
Transduction // Annu. Rev. Plant Biol. 2004. V. 55. P. 373-399.
23. Suzuki N., Mittler R. Reactive Oxygen Species and Temperature Stresses: A Delicate Balance
between Signaling and Destruction // Physiol. Plant. 2006. V. 126. P. 45-51.

Подписи к рисункам

Рис. 1 Содержание диеновых конъюгатов в листьях и корнях при низкотемпературном
закаливании растений табака.
1 – лист; 2 – корень.

Рис. 2. Интенсивность ПОЛ в листьях и корнях при низкотемпературном закаливании
растений табака.
1 – лист; 2 – корень.

Рис. 3. Выход электролитов из листьев и корней при низкотемпературном закаливании
растений табака.
1 – лист; 2 – корень.