УДК 581.1
ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ПЛАСТИДНОГО ГЕНОМА И РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ Arabidopsis thaliana С НАРУШЕННЫМ СИНТЕЗОМ БРАССИНОСТЕРОИДОВ
© 2012 г. М. В. Ефимова*, В. В. Кузнецов**, А. К. Кравцов**,
Д. А. Барташевич**, Р. А. Карначук*, И. С. Ковтун*, Вл. В. Кузнецов**
*Томский государственный университет, Биологический институт, Томск
**Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений
им. К.А. Тимирязева РАН, Москва
Поступила в редакцию 23.05.2011 г.
Проведен сравнительный анализ ростовых показателей, содержания ауксинов и цитокининов, а также уровня фотосинтетических пигментов у мутантных растений det2 Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., характеризующихся нарушенным синтезом брассиностероидов и, как результат, их пониженным эндогенным содержанием. У мутантной линии наблюдалось проявление признаков деэтиоляции: формирование крупных семядолей и длинных гипокотилей в темноте, как это было показано ранее. Впервые проанализирована транскрипция 12 хлоропластных генов, кодирующих функционально различные белки и РНК, в розеточных листьях A. thaliana как дикого типа, так и линии det2. В розеточных листьях мутантных растений транскрипционная активность изученных пластидных генов была значительно выше, чем у родительской линии. На этом основании высказано предположение, что пониженный уровень брассиностероидов коррелирует с увеличением интенсивности транскрипции ряда хлоропластных генов и реализацией программы деэтиоляции.

Ключевые слова: Arabidopsis thaliana  брассиностероиды  фотоморфогенез  фитогормоны  фотосинтетические пигменты  run-on транскрипция  транскрипция пластидных генов

---------------------------------
Адрес для корреспонденции: Ефимова Марина Васильевна. 634050 Томск, пр. Ленина, 36. Томский государственный университет, Биологический институт, кафедра физиологии растений и биотехнологии. Факс: 007 (3822) 529-765; электронная почта: stevia555@mail.ru
 ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время не вызывает сомнения, что фитогормоны играют важную роль в реализации регуляторной и фотосинтетической функций света. Известна способность некоторых фитогормонов “имитировать” регуляторную функцию света, сходным образом контролируя скорость и характер протекания морфофизиологических процессов в растениях [1]. Данная функция фитогормонов была продемонстрирована при изучении фенотипических особенностей растений, отличающихся эндогенным уровнем гормонов или чувствительностью к ним [26]. Особое положение среди фитогормонов занимают брассиностероиды, которые, наряду с цитокининами, не только способны вызывать фенотипические изменения, но и инициировать проявление признаков светового развития растений в темноте [79]. Вместе с тем, экспериментальные данные о вкладе брассиностероидов в регуляцию фотоморфогенеза растений весьма противоречивы. Так, некоторые исследователи установили, что брассиностероиды способны в темноте подавлять развитие зародышевых стеблей (гипокотилей) и усиливать рост семядолей [5, 10]. С другой стороны, некоторые мутанты гороха с нарушенным биосинтезом брассиностероидов (lkа, lkb) сохраняли этиолированный фенотип в темноте [11, 12]. Кроме того, получены свидетельства в пользу негативного влияния брассиностероидов на фотоморфогенез растений при использовании в качестве экспериментальной модели мутанты с нарушенным синтезом брассиностероидов или чувствительностью к ним [2, 13].
Для исследования роли брассиностероидов в регуляции фотоморфогенеза большой интерес представляют мутантные растения det2 Arabidopsis thaliana, которые характеризуются нарушенным биосинтезом брассиностероидов и их низким содержанием. В процессе темнового развития этот мутант накапливает мРНК ряда генов ядерной и пластидной локализации, кодирующих белки фотосинтетического аппарата [2, 14]. В данной работе предпринята попытка исследовать возможную роль брассиностероидов в регуляции фотоморфогенеза, основываясь на изучении не только ростовых показателей и гормонального баланса проростков A. thaliana дикого типа и мутантной линии det2, но также и содержания фотосинтетических пигментов и транскрипционной активности ряда пластидных генов. Помимо этого, важно было выяснить, на каком уровне осуществляется регуляция экспрессии этих генов в мутанте det2 с выраженным дефицитом эндогенных брассиностероидов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования выполнены на растениях Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. экотипа Columbia и его мутантной формы det2 с нарушенным синтезом брассиностероидов [2]. Семена обеих линий были получены из Arabidopsis Biological Resource Center, Ohio State University, Columbus (США).
Ростовые показатели оценивали у 7-дневных этиолированных проростков. Семена A. thaliana стерилизовали раствором 3% Н2О2 в 80% этаноле и высевали в чашки Петри на модифицированную жидкую среду (1/2 нормы среды Мурасиге-Скуга). Для стимуляции и синхронизации прорастания семена арабидопсиса выдерживали в течение 3 дней при температуре 46ºС и освещали белым светом в течение 3 ч (люминесцентные лампы ЛД-40, 3700 лк), после чего их проращивали 7 дней в темноте. Размеры гипокотилей и корней проростков определяли с помощью лупы БМ-51-2, площадь семядолей измеряли под микроскопом Micros МС 100 (Австрия) с помощью цифровой камеры Moticam 2000 (Испания) и программы Motic Images Plus 2.0. Для каждого варианта опыта использовали по три биологические повторности, каждая из которых содержала по 30 проростков.
Количественное определение фитогормонов в 7-дневных этиолированных проростках осуществляли классическим твердофазным иммуноферментным методом. Растительный материал (1.01.5 г свежей массы) фиксировали жидким азотом с последующей спиртовой экстракцией, как это было описано ранее [5]. Разделение фитогормонов проводили с помощью ТСХ на пластинках Sorbfil (“Сорбиополимер”, Россия), используя стандартные метчики ИУК (“Serva”, Германия), зеатина и рибозида зеатина (“Sigma”, США). Определение фитогормонов проводили в трех биологических и шести аналитических повторностях.
Интенсивность транскрипции хлоропластных генов и содержание фотосинтетических пигментов изучали на розеточных листьях 3.5-недельных растений A. thaliana, выросших в условиях фитотрона на белом свету (плотность потока падающих квантов составляла 220 мкмоль/(м2 с)) при фотопериоде 16/8 ч (день/ночь) и температуре воздуха 2022°С.
Для оценки уровня фотосинтетических пигментов листья Arabidopsis растирали в 96% этаноле и центрифугировали 15 мин при 14 тыс. об./мин (микроцентрифуга MiniSpin, “Eppendorf”, Германия). Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Genesys 10UV (“Thermo Fisher Scientific”, США). Концентрацию пигментов в спиртовой вытяжке рассчитывали, согласно Lichtenthaler [15].
Выделение пластид и run-on транскрипцию в пластидных лизатах проводили, согласно описанной ранее методике [16]. Хлоропласты из розеточных листьев растений выделяли с помощью ступенчатого градиента перкола (40 и 70%) при 4ºС. Транскрипцию in vitro проводили в течение 15 мин при 25°С в лизате, содержавшем 5  107 хлоропластов в объеме 100 мкл в буфере следующего состава: 50 мМ ТрисHCl, pH 8.0, 10 мМ MgCl2, 0.2 мМ ЦTФ, ГТФ и АТФ, 0.01 мМ УТФ, 50 μСi [α-32P]-УТФ (“Amersham”, Великобритания), 20 е.а. ингибитора РНКаз (“Fermentas”, Литва), 10 мМ β-меркаптоэтанола. Реакция транскрипции была остановлена добавлением равного объема стоп-буфера (50 мМ ТрисHCl, pH 8.0, 25 мМ ЭДТА, 5% саркозил). 32P-меченную РНК, синтезированную в ходе реакции транскрипции, выделяли из реакционной среды и использовали для гибридизации. Была проанализирована транскрипция двенадцати хлоропластных генов ячменя, высоко гомологичных генам Arabidopsis, представляющих функционально различные группы генов пластома. Подробная характеристика ген-специфичных фрагментов, используемых в качестве гибридизационных зондов, приведена в публикациях [1719]. По 2 мкг каждого из фрагментов изучаемых генов наносили в 2-кратной повторности на нейлоновую мембрану Hybond-N+ (“Amersham Pharmacia Biothech”, Англия). После их гибридизации с 32P-меченными РНК, полученными в ходе транскрипции in vitro, радиоактивные сигналы отсканировали и оцифровали, используя Phosphorimager Typhoon Trio (сканер Typhoon TRIO+ Variable Mode Imager с пакетом Typhoon Scaner Control) и ImagerQuant TL Control Centre (“GE Healthcare”, США). Изменение интенсивности транскрипции считалось достоверным, если сигнал отличался от контроля не менее, чем в два раза.
Результаты экспериментов представлены на рисунках как средние арифметические и их стандартные ошибки. Для сравнения независимых выборок, подчиняющихся закону нормального распределения, использовали параметрический критерий Стьюдента. Значения t-критерия находили для 95% уровня значимости (Р < 0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ
Ростовые показатели и содержание фотосинтетических пигментов
у растений A. thaliana
Данные морфометрического исследования 7-дневных этиолированных проростков A. thaliana дикого типа Columbia (Col-0) и его мутантной формы (det2) свидетельствуют о том, что у проростков det2, выращенных в темноте, формировался деэтиолированный фенотип. Признаки деэтиоляции проявлялись в значительном (в 2.2 раза) укорочении осевых органов – гипокотилей и корней  и, напротив, в увеличении в 1.3 раза размеров семядолей (табл. 1). Подавление растяжения клеток, вызванное мутацией в DET2 гене [2], влияло и на формирование настоящих листьев. Так, размеры и форма розеточных листьев у 3.5-недельных растений det2 изменялись за счет недоразвития листового черешка (рис. 1).
У проростков мутанта det2 установлено изменение баланса фотосинтетических пигментов. Анализ пигментного состава розеточных листьев Arabidopsis показал достоверное увеличение уровня хлорофиллов a и b и каротиноидов у мутанта по сравнению с растением дикого типа (рис. 2). При этом соотношение содержания хлорофилла a к хлорофиллу b составляло 2.3 и 2.2 для линии дикого типа и мутанта det2 соответственно.

Содержание фитогормонов в этиолированных проростках Arabidopsis
Мутация в гене DET2 приводила к нарушению первичных этапов синтеза брассиностероидов и к 10-кратному снижению их эндогенного содержания в проростках det2 по сравнению с проростками дикого типа [14]. Можно было ожидать, что подобное изменение баланса стероидных гормонов будет сопровождаться изменением содержания других типов фитогормонов. Анализ содержания ИУК (свободной и связанной форм) и цитокининов (зеатина и рибозида зеатина) показал, что у мутанта det2 по сравнению с диким типом наблюдалось 2-кратное снижение уровня свободной формы ауксина и одновременное увеличение в 1.4 раза его связанной формы; при этом суммарное содержание эндогенных ауксинов оставалось неизменным. Подобно ауксинам содержание зеатина и рибозида зеатина в проростках det2 мутанта по сравнению с родительской формой возрастало в 3.8 и 32 раза соответственно. На этом основании можно высказать предположение, что одной из причин формирования у мутанта более крупных семядолей (табл. 1) является их способность аккумулировать большое количество цитокининов (табл. 2), которые, как известно, стимулируют деление и растяжение клеток [20].

Транскрипция хлоропластных генов
С помощью метода run-on была изучена интенсивность транскрипции некоторых хлоропластных генов в растениях дикого типа A. thaliana и его мутантной формы (det2). Основой транскрипционной системы служили лизированные хлоропласты, которые мы выделяли из розеточных листьев 3.5-недельных растений арабидопсиса, выращенных на белом свету. В ходе реакции транскрипции во вновь синтезированные молекулы РНК включался радиоактивно меченный α32Р-УМФ, что позволило в дальнейшем проанализировать только вновь синтезированные транскрипты. Радиоавтографы типичного опыта, полученные в ходе run-on эксперимента с хлоропластами розеточных листьев арабидопсиса, и интенсивность транскрипции, выраженная в условных единицах, представлены на рис. 3.
Нами был проведен сравнительный анализ интенсивности транскрипции 12 хлоропластных генов, относящихся к функционально различным группам генов пластома (рис. 3). Прежде всего, это гены, продукты которых выполняют первостепенную роль для реализации процесса фотосинтеза: гены ФС I  psaA и psaB, ФС II – psbA, psbD и psbK, ген большой субъединицы РБФК (rbcL), АТФ-синтетазного комплекса  atpB и субъединицы F НАДФ·Н-пластохиноноксидоредуктазы  ndhF. Среди генов “домашнего хозяйства” была изучена транскрипция гена, кодирующего β-субъединицу РНК-полимеразы бактериального типа (rpoB), гены 16S- и 23S-рибосомной РНК (rrn16 и rrn23) и гены тРНК-Глу и тРНК-Тир (trnE-Y).
Полученные результаты показали, что наибольшая интенсивность транскрипции среди изученных пластидных генов в розеточных листьях родительской и мутантной линий была отмечена для генов, кодирующих 16S- и 23S-рРНК (rrn16 и rrn23), некоторые белки ФС I и II (psaA, psbA и psbD), большую субъединицу РБФК и Glu/Tyr-транспортные РНК. Наименьшую же транскрипционную активность у изученных линий проявляли гены psaB, psbK, ndhF и rpoB. Некоторые из проанализированных генов по-разному транскрибировались у двух сравниваемых линий. Так, если гены psaB и atpB проявляли среднюю активность у растений det2, то интенсивность их транскрипции у Col-0 была незначительной. В целом, основываясь на полученных результатах, можно заключить, что интенсивность транскрипции всех исследованных пластидных генов в розеточных листьях det2 была значительно выше, чем их транскрипционная активность у проростков исходной линии.
Достоверными считали 2-кратные (и выше) различия в интенсивности транскрипции генов. Для 9 хлоропластных генов мутантных растений det2 интенсивность транскрипции была в 24 раза выше, чем у родительской линии. Наибольшие различия (812-кратные) были отмечены для слабо транскрибируемых генов – psbK, ndhF и atpB. Таким образом, в мутанте det2 продемонстрирована дифференциальная регуляция интенсивности транскрипции ряда хлоропластных генов.

ОБСУЖДЕНИЕ
Среди многочисленных регуляторных функций брассиностероидов одной из ключевых является стимуляция ими роста растений посредством активации деления и растяжения клеток [21]. Этот гормональный эффект достигается путем регуляции брассиностероидами экспрессии генов, кодирующих белки экспансины и ферменты клеточной стенки (ксилоглюкан эндотрансгликозилазы/гидролазы, пектин-подобной лиазы, глюканазы), активности аквапоринов и вакуолярной Н+-АТФазы. Экспрессия некоторых из перечисленных выше генов зависела, вероятно, только от эндогенного уровня брассиностероидов, поскольку другие фитогормоны, такие как ауксины, этилен и гиббереллины, оказывающие существенное влияние на растяжение клеток, были в данном случае не эффективны [21].
Специфическая регуляция брассиностероидами была показана на примере экспрессии гена Korrigan, кодирующего эндо-β-1,4-глюканазу, необходимую для правильной сборки компонентов клеточной стенки [22]. Весьма вероятно, что именно недостаточный синтез брассиностероидов приводил к формированию карликовых осевых органов (гипокотиля и корня) у проростков Arabidopsis в темноте (табл. 1). Такая тенденция сохранялась и на стадии формирования розеточных листьев у det2 на свету, что проявлялось в укорочении зародышевого стебля (гипокотиля) и черешков розеточных листьев (рис. 1).
Подобные ярко выраженные фенотипические изменения ранее были выявлены у мутантных растений det2 Arabidopsis [2], у которых эндогенный уровень физиологически активных брассиностероидов не превышал 1015% от их уровня в растениях дикого типа, что являлось следствием нарушения функционирования ключевого гена биосинтеза гормона (DET2) [14]. Эта мутация проявлялась органоспецифично: в то время как длина осевых органов уменьшалась, размеры семядолей увеличивались. В основе этого явления могут лежать значительные изменения эндогенного уровня ряда других гормонов. В частности, в этиолированных проростках det2 было отмечено уменьшение содержания свободных ауксинов и значительное увеличение содержания цитокининов (табл. 2). Увеличение уровня эндогенных цитокининов могло стимулировать деление и растяжение клеток, что и являлось одной из вероятных причин увеличения площади семядолей проростков линии det2 в процессе темнового развития (табл. 1). Формирование подобного деэтиолированного фенотипа у проростков в темноте (короткого гипокотиля и крупных семядолей) свидетельствует о проявлении у них признаков “светового” (светорегулируемого) развития.
Регуляция “светового” развития растений фитогормонами происходит не только на уровне морфологических изменений, но и на генном уровне. Проведенные исследования позволили продемонстрировать участие фитогормонов в регуляции экспрессии генов ядерной и хлоропластной локализации, продукты которых существенны для реализации фотосинтетической функции. В связи с этим, некоторые исследователи отмечали важную роль гормонов-антагонистов цитокининов и АБК, которые, наряду со светом, вовлекаются в регуляцию процесса формирования фотосинтетического аппарата у двудольных и однодольных растений [2325]. Возможно, подобное влияние фитогормонов на реализацию фотосинтетической роли света обусловлено тем, что в пластидах растений не только локализованы ферменты биосинтеза некоторых гормонов, но в них же протекают и определенные этапы их биосинтеза [26].
Анализ полученных нами с помощью run-on транскрипции экспериментальных данных свидетельствует о том, что наибольшая интенсивность транскрипции хлоропластных генов, вне зависимости от эндогенного уровня брассиностероидов, отмечена для двух генов, кодирующих белки D1 и D2 ФС II – psbA и psbD. Продукты этих генов образуют реакционный центр, который, являясь ключевым компонентом ФС II, выполняет как функцию первичного разделения зарядов на хлорофилле P680, так и передачи электрона от водорасщепляющего комплекса на пул пластохинонов. Высокая активность транскрипции показана также для гена psaA, кодирующего субъединицу А реакционного центра ФС I.
На свету недостаточный синтез брассиностероидов приводил к формированию у растений det2 сверхдеэтиолированного фенотипа. Данный эффект проявлялся не только на уровне морфологических изменений, но и на уровне содержания хлорофиллов a и b и каротиноидов (рис. 2). Помимо этого имела место активация транскрипции большого спектра функционально различных хлоропластных генов. Так, например, интенсивность транскрипции гена, кодирующего F-субъединицу НАД·Н-пластохиноноксидоредуктазы, участвующей в дыхательном обмене растений, была в 12 раз выше в мутанте det2 по сравнению с растениями дикого типа. Следующими генами, для которых были показаны большие различия (810 раз) в интенсивности транскрипции у двух сравниваемых линий, являлись ген psbK, кодирующий К-субъединицу (3.9 кД) ФС II, и ген β-субъединицы АТФ-синтазы (atpB). Транскрипционная активность остальных девяти генов в розеточных листьях мутантных растений была в среднем в 24 раза выше, чем у родительской линии.
Полученные нами данные позволяют также ответить на вопрос о том, на каком уровне в мутантных растениях det2 осуществляется регуляция экспрессии пластидных генов. Ранее было показано [2], что в проростках det2 в темноте наблюдалось 1030-кратное увеличение уровня мРНК некоторых пластидных генов (psaA, psaB, psbA, rbcL, rrn16) [2]. Однако оставалось не ясным, осуществлялась ли активная конститутивная экспрессия этих генов на уровне транскрипции или на посттранскрипционном уровне. Примененный нами метод run-on транскрипции для оценки экспрессии пластидных генов однозначно показал, что в проростках мутантной линии det2 в условиях освещения по сравнению с растениями дикого типа имела место более интенсивная транскрипция исследованных нами хлоропластных генов (рис. 3). Это означает, что снижение в 10 раз [14] уровня эндогенных брассиностероидов в проростках сопровождалось дерепрессией ряда пластидных генов на транскрипционном уровне. Эти данные, тем не менее, не исключают наличия в мутанте det2 и других уровней регуляции экспрессии указанных генов. Кроме того, они делают весьма вероятным предположение, согласно которому наблюдаемая ранее интенсивная экспрессия пластидных генов в проростках det2 в темноте [2] также осуществляется на транскрипционном уровне, хотя не исключают регуляцию содержания мРНК и на уровне ее стабильности.
Таким образом, сравнительный анализ особенностей экспрессии ряда генов пластидного генома, а также развития растений A. thaliana дикого типа и мутанта det2 с нарушенным синтезом и выраженным дефицитом брассиностероидов показал, что низкий уровень брассиностероидов инициирует проявление признаков “светового” развития растений в темноте, и более интенсивную транскрипцию пластидных генов в условиях освещения.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Федеральной целевой программы “Научные и научно-педагогические кадры инновационной России” на 20092013 гг. (мероприятие 1.3.1., 1.3.2 и 1.4) (Гос. контракты №№ П1369 от 02.09.2009 г., П209 от 23.04.2010 г. и № 14.740.12.0820 от 15.04.2011 г.) и Российского фонда фундаментальных исследований (№№ 11-04-90806-моб_ст и 11-04-90785-моб_ст).
 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Khripach V.A., Zhabinskii V.N., Karnachuk R.A. Science at the Interface of Brassinosteroids: A New Role of Steroids as Bio-Signaling Molecules // Chemical Probes in Biology Science at the Interface of Chemistry, Biology, and Medicine / Ed. Schneider M.P. 2004. V. 129. P. 153-167.
2. Chory J., Nagpal P., Peto C.A. Phenotypic and Genetic Analysis of det2, a New Mutant That Affects Light-Regulated Seedling Development in Arabidopsis // Plant Cell. 1991. V. 3. P. 445-459.
3. Chory J., Reinecke D., Tim S., Wasburn T., Brenner M. A Role for Cytokinins in De-Etiolation in Arabidopsis: det Mutants Have an Altered Response to Cytokinins // Plant Physiol. 1994. V. 104. P. 339-347.
4. Li J., Nagpal P., Vitart V., McNorris Т.О., Chory J. A Role for Brassinosteroids in Light-Dependent Development in Arabidopsis // Science. 1996. V. 272. P. 398-401.
5. Карначук Р.А., Головацкая И.Ф., Ефимова М.В., Хрипач В.А. Действие 24-эпибрассинолида на морфогенез и соотношение гормонов у проростков Arabidopsis на зеленом свету // Физиология растений. 2002. Т. 49. С. 591-595.
6. Ефимова М.В. Физиологическая роль брассиностероидов в развитии проростков Arabidopsis thaliana L. (Heynh) на селективном свету // Вестн. Томского гос. ун-та. Биология. 2010. № 4. С. 106-116.
7. Mandava N.B., Sasse J.M., Yopp J.H. Brassinolide, a Growth-Promoting Steroidal Lactone. II. Activity in Selected Gibberellin and Cytokinin Bioassays // Physiol. Plant. 1981. V. 53. P. 453-461.
8. Yu J.Q., Huang L.F., Hu W.H., Zhou Y.H., Mao W.H., Ye S.F., Nogués S. A Role for Brassinosteroids in the Regulation of Photosynthesis in Cucumis sativus // J. Exp. Bot. 2004. V. 55. P. 1135-1143.
9. Holá D. Brassinosteroids and Photosynthesis // Brassinosteroids: A Class of Plant Hormone / Eds Hayat S., Ahmad A. Springer Science + Business Media B.V. 2011. P. 143-192.
10. Ефимова М.В. Физиологическая роль брассинолида в световом развитии проростков Arabidopsis thaliana // Вестн. Ун-та дружбы народов. 2011. № 2. С. 42-50.
11. Symons G.M., Schultz L., Kerckhoffs L.H.J., Davies N.W., Gregory D., Reid J.B. Uncoupling Brassinosteroid Levels and De-Etiolation in Pea // Physiol. Plant. 2002. V. 115. P. 311-319.
12.  Symons G., Reid J. Hormone Levels and Response during De-Etiolation in Pea // Planta. 2003. V. 216. P. 422-431.
13. Clouse S.D., Langford M., McMorris T.C. A Brassinosteroid-Insensitive Mutant in Arabidopsis thaliana Exhibits Multiple Defects in Growth and Development // Plant Physiol. 1996. V. 111. P. 671-678.
14. Fujioka S., Li J., Choi Y.-H., Seto H., Takatsuto S., Noguchi T., Watanabe T., Kuriyama H., Yokota T. Chory J., Sakurai A. The Arabidopsis Deetiolated2 Mutant Is Blocked Early in Brassinosteroid Biosynthesis // Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1951-1962.
15. Lichtenthaler H.K. Chlorophylls and Carotenoids, the Pigments of Photosynthetic Biomembranes // Methods Enzymol. 1987. V. 148. P. 350-382.
16. Зубо Я.О., Кузнецов В.В. Применение метода run-on транскрипции для изучения регуляции экспрессии пластидного генома // Физиология растений. 2008. Т. 55. С. 114-122.
17. Зубо Я.О., Ямбуренко М.В., Кравцов А.К., Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Отделенные от растений листья ячменя как экспериментальная модель для изучения регуляции цитокинином транскрипции пластидных генов // Физиология растений. 2009. Т. 56. С. 609-618.
18. Zubo Y.O., Yamburenko M.V., Kusnetsov V.V., Börner T. Methyl Jasmonate, Gibberellic Acid, and Auxin Affect Transcription and Transcript Accumulation of Chloroplast Genes in Barley // J. Plant Physiol. 2011. V. 168. P. 1335-1344.
19. Kravtsov A.K., Zubo Y.O., Yamburenko M.V., Kulaeva O.N., Kusnetsov V.V. Cytokinin and Abscisic Acid Control Plastid Gene Transcription during Barley Seedling De-Etiolation // Plant Growth Regul. 2011. V. 64. P. 173-183.
20. Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка. 41-е Тимирязевское чтение. М.: Наука, 1982. 82 с.
21. Pereira-Netto A.B. Genomic and Non-Genomic Events Involved in the Brassinosteroid-Promoted Plant Cell Growth // Brassinosteroids: A Class of Plant Hormone / Eds Hayat S., Ahmad A. Springer Science + Business Media B.V. 2011. P. 243-269.
22. He J.-X., Fujioka S., Li T.-C., Kang S.G., Seto H., Takatsuto S., Yoshida S., Jang J.-C. Sterols Regulate Development and Gene Expression in Arabidopsis // Plant Physiol. 2003. V. 131. P. 1258-1269.
23. Ma L., Li J., Qu L., Hager J., Chen Z., Zhao H., Deng X.W. Light Control of Arabidopsis Development Entails Coordinated Regulation of Genome Expression and Cellular Pathways // Plant Cell. 2001. V. 13. P. 2589-2607.
24. López-Juez E. Plastid Biogenesis, between Light and Shadows // J. Exp. Bot. 2007. V. 58. P. 11-26.
25. Waters M.T., Langdale J.A. The Making of a Chloroplast // EMBO J. 2009. V. 28. P. 2861-2873.
26. Benkova E., Witters E., van Donger W., Kolar J., Motyka V., Brzobohaty B., van Onckelen H.A., Macháčková I. Cytokinins in Tobacco and Wheat Chloroplasts, Occurrence and Changes due to Light/Dark Treatment // Plant Physiol. 1999. V. 121. P. 245-251.
 Таблица 1. Ростовые показатели 7-дневных этиолированных проростков Arabidopsis thaliana


Линия
    Размеры гипокотиля    Площадь семядолей,
тыс. мкм2    Длина корня,
мм
    длина, мм    ширина, мм        
Col-0    14.30 ± 0.22    0.190 ± 0.002    141.9 ± 4.1    3.12 ± 0.10
det2    6.60 ± 0.12    0.200 ± 0.002    189.0 ± 6.5    1.43 ± 0.06

 Таблица 2. Содержание фитогормонов в 7-дневных этиолированных проростках Arabidopsis thaliana


Линия
    Содержание ИУК,
нг/г сырой массы    Содержание цитокининов,
нг/г сырой массы
    свободная    связанная    зеатин    рибозид зеатина
Col-0    98.08 ± 10.10    117.30 ± 21.00    0.86 ± 0.20    1.15 ± 0.10
det2    53.26 ± 6.70    166.50 ± 15.00    3.30 ± 1.00    37.24 ± 5.40

 ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

Рис. 1. 3.5-недельные растения Arabidopsis thaliana, выращенные на свету.
Col-0  растение дикого типа, det2  мутантное растение.

Рис. 2. Содержание хлорофиллов a и b и каротиноидов в розеточных листьях 3.5-недельных растений A. thaliana, выращенных на свету.
1  Col-0, 2  det2.

Рис. 3. Интенсивность транскрипции пластидных генов в розеточных листьях 3.5-недельных растений A. thaliana, выращенных на свету.
а  радиоавтограмма результатов run-on транскрипции с хлоропластами растений Arabidopsis дикого типа Col-0 и мутанта det2; б  результаты сканирования радиоавтограммы: 1  Col-0, 2  det2.