УДК 581.1

ИЗМЕНЕНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛОРОПЛАСТОВ В КЛЕТКАХ Chara corallina, СВЯЗАННЫЕ С ПЕРЕДАЧЕЙ ФОТОИНДУЦИРОВАННОГО СИГНАЛА С ПОТОКОМ ЦИТОПЛАЗМЫ

© 2012 г. А. А. Булычёв, А. В. Алова, А. Б. Рубин

Кафедра биофизики, биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва

Поступила в редакцию 09.02.2012 г.

 

Внутриклеточный транспорт в зеленых харовых водорослях, опосредованный круговым движением цитоплазмы, оказывает регуляторное влияние на ионные каналы плазмалеммы и фотосинтетическую активность хлоропластов. В опытах с интернодальными клетками Chara corallina Klein ex Willd. показано, что передача фотоиндуцированного сигнала с потоком подвижной цитоплазмы на расстояние 1–3 мм от места его образования вызывает ослабление или усиление нефотохимического тушения флуоресценции в зависимости от интенсивности фонового освещения в анализируемой области. При слабом фоновом освещении (10–30 мкмоль квантов/(м2 с)) поступление дистанционного сигнала из ярко освещенной зоны диаметром 400 мкм вызывало волну возрастания максимальной и фактической флуоресценции (параметры Fm' и F), а при более интенсивном фоновом освещении – приводило к сильному тушению Fm' и переходным изменениям F. Наличие порога для переключения ответной реакции “слабого света” к изменениям Fm' противоположного знака говорит о том, что даже небольшие различия в освещенности слоя хлоропластов, обусловленные строением междоузлий, могут оказаться достаточными для формирования неоднородного профиля фотосинтетической активности под влиянием сигнала, передаваемого вдоль клетки с потоком цитоплазмы. Измерения флуоресценции хлоропластов in situ в условиях внутриклеточной перфузии междоузлий растворами с различными значениями рН позволяют предполагать, что начальная стадия ответной реакции на дистанционный фотостимул связана с кратковременным повышением рН цитоплазмы в области измерения флуоресценции.

 

---------------------------------------

Сокращения: F - фактическая интенсивность флуоресценции; Fm' - максимальная интенсивность флуоресценции; NPQ – нефотохимическое тушение флуоресценции; pHцит – pH цитоплазмы.

Адрес для корреспонденции: Булычёв Александр Александрович. 119991 Москва, Воробьевы горы. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра биофизики. Электронная почта: bulychev@biophys.msu.ru

Ключевые слова: Chara corallina - движение цитоплазмы - фотосинтез - неравномерное освещение - хлоропласты - флуоресценция хлорофилла - нефотохимическое тушение - pH цитоплазмы

 

ВВЕДЕНИЕ

Круговое движение цитоплазмы играет важную роль в жизнедеятельности растительной клетки. Оно ускоряет обмен метаболитов между цитоплазмой и органеллами, координирует метаболические процессы в участках клетки, разделенных расстояниями, на которых диффузия малоэффективна. Эта функция особенно важна для крупных клеток, таких как междоузлия харовых водорослей [1, 2]. Принято считать, что поток цитоплазмы обеспечивает латеральный транспорт ионов и метаболитов, выполняющих роль субстратов и мессенджеров [3, 4]. Однако сведения о регуляторном влиянии потока цитоплазмы на фотосинтетический метаболизм и мембранные процессы немногочисленны. Недавно было показано, что освещение участка интернодальной клетки Chara corallina узким лучом света вызывает локальное возрастание pH на поверхности клетки с амплитудой около 2 ед. на удалении 1–3 мм от зоны освещения в направлении течения цитоплазмы, но не оказывает такого действия в участках, расположенных вверх по течению цитоплазмы [5, 6]. Асимметрия образования щелочных областей на поверхности клетки по разные стороны от освещенной зоны свидетельствует об участии потока цитоплазмы в формировании биологической полярности, стабилизируемой за счет неоднородного распределения проводящих каналов плазмалеммы [6]. Эти результаты говорят также о том, что состав цитоплазмы в зоне освещения изменяется при обмене ионов и метаболитов между хлоропластами и подвижной эндоплазмой, а последующий приток модифицированной цитоплазмы в затененные части клетки повышает проницаемость плазматической мембраны для H+ или OH–. 

Наряду с дальними взаимодействиями между хлоропластами и плазмалеммой, выявлены также дистанционные взаимодействия фотосинтезирующих пластид [7]. Установлено, что перенос модифицированной цитоплазмы из зоны интенсивного освещения в зону затенения вызывает тушение максимальной флуоресценции хлорофилла (Fm') в участках клетки, расположенных ниже по течению цитоплазмы, но не оказывает влияния на Fm' в участках, расположенных вверх по течению от места действия светового луча [8]. Снижение Fm', отражающее нефотохимическое тушение флуоресценции (NPQ), служит регуляторной защитной реакцией, направленной на отведение избытка поглощаемой световой энергии в тепло. Такое тушение понижает квантовый выход переноса электронов по фотосинтетической цепи и препятствует избыточному накоплению восстановленных переносчиков электронов. По-видимому, поток цитоплазмы способен переносить медиатор, регулирующий активность фотосинтеза. Вследствие этого сравнительно короткие импульсы яркого света, имитирующие попадание на клетку солнечных бликов, способны изменять фотосинтетическую активность хлоропластов в стороне от зоны интенсивного освещения с длительной (до 100 с) задержкой после завершения светового импульса [7].

Природа интермедиата, участвующего в дистанционных взаимодействиях хлоропластов, в настоящее время не ясна. В роли интермедиатов могут, в частности, выступать ионы H+ и Ca2+. Фотоиндуцированный обмен этих ионов между цитоплазмой и стромой хлоропластов неоднократно обсуждался в литературе [9–11]. При освещении одиночных интактных хлоропластов Peperomia metallica pH у поверхности пластид быстро возрастал на 0.15–0.60 ед. в зависимости от буферной емкости среды, а затем снижался ниже исходного уровня [9]. Аналогичные двухфазные сдвиги pH цитоплазмы (pHцит) с амплитудой ~0.3 ед. выявлены на клетках Riccia fluitans [12]: под действием света наблюдали сначала возрастание pHцит, а затем его снижение ниже исходного уровня. Данные о фотоиндуцированных изменениях концентрации Ca2+ неоднозначны. Основная точка зрения состоит в том, что интактные хлоропласты поглощают Ca2+ из цитоплазмы при освещении [11]. Вместе с тем, имеются сообщения, что начальная ответная реакция на свет состоит в повышении уровня Ca2+ в цитоплазме за время ~20 с от начала освещения [13]. Наличие в дистанционных взаимодействиях одного или нескольких интермедиатов, уровень которых в цитоплазме претерпевает двухфазные изменения, указывает на возможность того, что выявляемые по изменениям флуоресценции ответные реакции хлоропластов немонотонны и могут включать несколько кинетических компонент. Учитывая тесную связь нефотохимического тушения флуоресценции с трансмембранными потоками H+ и формированием градиента протонов на тилакоидной мембране [14], а также вероятный обмен протонов между стромой и цитоплазмой [10], представляется вероятным, что изменения pH в окружении хлоропластов могут оказывать существенное влияние на уровень флуоресценции и активность фотосинтеза.

Для выявления возможного участия изменений pH цитоплазмы в регуляции фотосинтеза можно использовать метод внутриклеточной перфузии [15] и исследовать зависимость флуоресценции хлоропластов от pHцит в открытой клетке в условиях разрушения тонопласта. В перфузируемой клетке, лишенной тонопласта, хлоропласты остаются закрепленными в кортикальном слое цитоплазмы. Вместе с тем, удаление тонопласта обеспечивает свободное проникновение низкомолекулярных компонентов среды к хлоропластам. 

В связи с этим, в данной работе ставили цель показать, что направленный поток цитоплазмы из области интенсивного освещения в соседние участки клетки харовой водоросли вызывает немонотонные изменения флуоресценции хлорофилла, которые отражают сложную динамику изменения одного эффектора, либо существование нескольких различных эффекторов (медиаторов). Для проверки предположения о том, что эти изменения могут частично определяться потоками H+ через мембраны оболочки хлоропласта, были исследованы зависимости флуоресценции хлорофилла (параметры Fm', F, NPQ) от pH среды, омывающей интактные хлоропласты in situ.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили клетки междоузлий водоросли Chara corallina Klein ex Willd., росшие в аквариуме при комнатной температуре и рассеянном дневном освещении. Изолированные интернодальные клетки длиной 6–8 см и диаметром около 0.9 мм выдерживали не менее суток в искусственной прудовой воде, содержавшей 0.1 мМ KCl, 1.0 мМ NaCl и 0.1 мМ CaCl2. В среду вносили около 0.2 мМ NaHCO3 для доведения pH до 7.0. Для опытов отбирали лишенные кальциевых отложений клетки, которые размещали в прозрачной камере из оргстекла на столике инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 25-CFL (“Zeiss”, Германия). 

Методика измерения флуоресценции хлоропластов на микроучастке диаметром ~100 мкм была описана ранее [16]. Данные представлены в виде непосредственно измеряемых значений максимальной флуоресценции Fm', индуцируемой насыщающими вспышками, и фактического уровня флуоресценции F на действующем свету. Минимальные значения флуоресценции F0 отражают уровень свечения неосвещенной клетки в условиях, когда реакционные центры ФС II полностью открыты. Нефотохимическое тушение (NPQ) рассчитывали по формуле: NPQ = (Fm - Fm’)/Fm’, где Fm и Fm’ – максимальный выход флуоресценции, вызываемый насыщающим световым импульсом после темновой адаптации и на действующем свету, соответственно. 

Действующее фоновое освещение всей клетки создавали с помощью верхнего осветителя микроскопа и светофильтра СЗС-22 (λ < 580 нм, максимальная плотность потока квантов 100 мкмоль/(м2 с)). Интенсивность фонового освещения ослабляли с помощью стеклянных нейтральных светофильтров. Для локальной фотостимуляции участка клетки на удалении 1-3 мм от места измерения использовали тонкий кварцевый световод (диаметр оптоволокна 400 мкм), соединенный со светодиодным источником белого света (светодиод Luxeon LXK2-PWN2-S00, “Lumileds”, США). Согласно оценкам, плотность потока квантов на выходе световода составляла 500 мкмоль/(м2 с) [7]. Чтобы сократить число интермедиатов, участвующих в обмене между хлоропластами и цитоплазмой на интенсивном свету, для локального освещения использовали сравнительно короткие световые импульсы (30 с). В этом случае состав цитоплазмы модифицируется только за счет быстро обмениваемых компонентов. Свободный конец световода закрепляли в держателе микроинструмента и подводили к клетке с помощью микроманипулятора из комплекта КМ-1 под углом 30-45є к горизонтальной плоскости. После юстировки положения световода в поле зрения, световод смещали микрометрическим винтом манипулятора на расстояние 1-3 мм вверх по течению цитоплазмы от анализируемого участка. 

Для внутриклеточных измерений pH использовали сурьмяные микроэлектроды с диаметром кончика около 15 мкм. Микроэлектрод вводили в вакуоль клетки, помещенной в камеру с несколькими отсеками. После введения электрода и продвижения его к дальней (от места прокола) стороне клетки заменяли среду в среднем отсеке на раствор аналогичного состава с добавлением 180 мМ сахарозы, а боковые отсеки заполняли перфузионным буферным раствором, содержащим 20 мМ Hepes-KOH (pH 7.0-7.2), 280 мМ сахарозу, 50 мМ KCl и 3 мМ ЭГТА. Затем отрезали торцы клетки и промывали вакуолярный объем в течение 10-15 мин перфузионным раствором для разрушения тонопласта. После замещения буферного раствора аналогичной средой без буфера регистрировали изменения pH в открытой клетке вблизи хлоропластов при действии света. Электродом сравнения служил Ag/AgCl-полуэлемент, контактирующий с датчиком pH через обрезанный торец клетки.

Для изучения зависимости параметров флуоресценции хлорофилла от pH среды, окружающей хлоропласты, использовали перфузионные растворы с различными pH, которые были приготовлены на основе буферов Mes, Hepes и Tris в концентрации 20 мМ. Перфузионные растворы включали компоненты, перечисленные выше, и отличались лишь присутствием буферных систем с разными значениями pH. Измерения флуоресценции на перфузируемых клетках начинали через 10-15 мин после отрезания ее торцов и замещения вакуолярного сока на буферный раствор. Смену растворов с заданными pH осуществляли в темновых условиях, дожидаясь установления стационарных значений флуоресценции; затем освещали клетку в течение 1 мин и отмечали стационарные значения F и Fm'. Продолжительность отдельного опыта составляла 1-2 ч. Порядок смены растворов варьировали, используя переходы от высокого к низким значениям pH, обратную последовательность смены растворов, а также случайный порядок чередования растворов с разными значениями pH.

На рисунках представлены результаты типичных опытов, выполненных в 3-5-кратном воспроизведении на разных междоузлиях, а также усредненные записи 4-6 измерений с соответствующими стандартными ошибками. 

 

Результаты

Изменения флуоресценции хлорофилла, опосредованные потоком цитоплазмы, включают кинетические компоненты разного знака

 

На рис. 1а представлены изменения максимальной флуоресценции Fm', вызываемые 30-секундным освещением участка, расположенного в стороне (выше по течению цитоплазмы) от области измерения, при разных интенсивностях общего фонового освещения интернодальной клетки. Из рисунка видно, что при плотностях потока квантов 40 и 70 мкмоль/(м2 с) стационарные значения Fm' были примерно одинаковы, однако ответные реакции Fm' на приложение одного и того же светового стимула (500 мкмоль/(м2 с), длительность импульса 30 с) на расстоянии 1 мм от места измерения существенно различались. При пониженной интенсивности общего освещения ответная реакция на локальное воздействие светового луча диаметром 400 мкм состояла в повышении Fm', а при более высокой – в значительном снижении Fm'. Изменения обоих направлений аппроксимировали гауссовыми кривыми. Эти кривые (1 и 2) проявляли сходство с хроматографическими пиками, поскольку компоненты, выделяемые хлоропластами в зоне интенсивного локального освещения, перемещаются с потоком цитоплазмы, проходя через зону измерения. Из рисунка видно также, что максимум и минимум аппроксимирующих гауссовых кривых не совпадали: пик возрастания Fm' достигался раньше, чем положение минимума на кривой тушения Fm' (tmax < tmin). Изменения в сторону возрастания и снижения флуоресценции были полностью обратимыми. При промежуточных интенсивностях общего освещения в ответной реакции Fm' на локальное освещение прослеживалась небольшая стадия нарастания, сменяемая более сильным тушением.

На рис. 1б представлены изменения Fm' и фактической флуоресценции F, вызываемые локальным освещением участка в стороне (выше по течению цитоплазмы) от области измерения флуоресценции. Экспериментальные кривые были нормированы к максимальной амплитуде изменений, что облегчало усреднение и сравнение динамики Fm' и F. Видно, что тушению Fm' предшествовало возрастание фактической флуоресценции F. Последующее снижение F происходило параллельно с уменьшением Fm’. Сравнение кривых 1 на рис. 1а и рис. 1б говорит о том, что возрастание F совпадало по времени со стадией возрастания Fm' на слабом свету. Таким образом, моменту прохождения “облученной” цитоплазмы через область измерения соответствует начальное возрастание флуоресценции F, которое наблюдалось как при низких, так и при относительно высоких интенсивностях фоновой подсветки.

На рис. 2 показаны зависимости амплитуды и знака изменений Fm', наблюдаемых в аналогичных опытах, от интенсивности общего освещения клетки. Видно, что изменения Fm' разной полярности в ответ на локальное приложение светового импульса в стороне от области измерения разделяются резкой границей. При плотности потока квантов 10-30 мкмоль/(м2 с) наблюдали только возрастание Fm' (“реакция слабого света”), а при световых потоках свыше 50 мкмоль/(м2 с) проявлялись изменения противоположного знака с большой амплитудой. Область, разделяющая реакции слабого и умеренного света, примерно соответствовала порогу резкого возрастания NPQ при стационарном общем освещении клетки. Плавный ход световой кривой для реакции слабого света указывает на то, что стадия возрастания Fm' сохранялась и при более высокой освещенности, но маскировалась противоположно направленными изменениями Fm' с большой амплитудой. По-видимому, изменения Fm' при надпороговых интенсивностях освещения представляют результат суперпозиции сдвинутых по времени изменений противоположного знака. 

По данным опытов, аналогичных показанным на рис. 1а, были построены зависимости времени достижения пика Fm' на слабом свету (tmax) и максимального тушения Fm' на свету повышенной интенсивности (tmin) от расстояния d между центром локального освещения и областью измерения флуоресценции (рис. 3). Обе зависимости представлены прямыми линиями 1 и 2 примерно равного наклона. Чем больше расстояние между центрами освещения и измерения, тем дольше был временной интервал от начала освещения до прихода сигнального фактора с потоком цитоплазмы в анализируемую область. Величина, обратная тангенсу угла наклона, соответствует скорости распространения медиатора с потоком цитоплазмы от места локального освещения по длине интернодальной клетки. Скорости распространения медиаторов, вызывающих возрастание и снижение Fm', составили соответственно 58 ± 2 и 55 ± 3 мкм/с по измерениям на разных клетках (n = 4). Эти величины типичны для скорости течения цитоплазмы у харовых водорослей [1], хотя и не достигают максимальных значений ~100 мкм/с. Точки пересечения прямых с осью ординат tmax (d = 0) и tmin (d = 0) отражают время полного цикла образования интермедиата и трансформации сигнала без учета затрат времени на латеральный перенос медиатора. Совпадение углов наклона для кривых tmin и tmax говорит о том, что интермедиаты, ответственные за возрастание и тушение Fm', распространяются вдоль клетки с близкими скоростями, примерно равными скорости течения цитоплазмы, а смещение кривых по оси ординат свидетельствует о более быстром цикле образования и потребления интермедиата, ответственного за возрастание Fm'. 

Характерные времена tmax (d = 0) и tmin (d = 0) для реакций слабого и умеренного света составили 10.5 ± 1.3 и 23.0 ± 1.9 с (n = 4). Такое расхождение может означать как участие нескольких медиаторов, которые попадают в цитоплазму в зоне интенсивного освещения после лаг-периодов разной длительности, так и последовательное чередование противоположно направленных изменений одного параметра, например, возрастание и снижение pH цитоплазмы.

 

Фотоиндуцированные сдвиги pH в перфузируемой клетке

Ранее было установлено, что освещение вызывает двухфазные изменения pH у поверхности интактных одиночных хлоропластов [9] и в цитоплазме клеток мезофилла [12]. На рис. 4 показаны фотоиндуцированные изменения pH, которые были выявлены в перфузируемых клетках харовой водоросли. Предварительно в неповрежденные междоузлия вводили pH-микроэлектрод и приближали его кончик к слою хлоропластов вдали от места введения микроэлектрода. После отрезания узлов и внутриклеточной перфузии раствором, разрушающим тонопласт, клетку промывали средой без буфера. Фотоиндуцированные изменения pH на качественном уровне совпали с результатами измерений на других объектах. В течение первых 10 с после включения света наблюдали возрастание pH, которое в дальнейшем сменялось стадией закисления; выключение света сопровождалось двухфазными изменениями pH с начальным отклонением pH в кислую сторону. Небольшая амплитуда изменений pH, по-видимому, связана с такими факторами, как трудность точного расположения кончика микроэлектрода вблизи слоя хлоропластов в малопрозрачной области на краю цилиндрической клетки, а также постоянное протекание перфузионного раствора через вакуолярное пространство. Полученные кинетические кривые позволяют предполагать, что начальное возрастание Fm' в ответах клетки на локальное освещение (реакция слабого света, рис. 1, кривая 1) обусловлено переходным возрастанием pH цитоплазмы. 

 

Влияние pH на флуоресценцию хлорофилла в перфузируемой клетке

Для проверки указанного выше предположения были измерены зависимости уровня NPQ от величины pH перфузионного раствора, заменяющего цитоплазму клетки после отрезания ее торцов. На рис. 5 представлены данные о влиянии света и pH на максимальную флуоресценцию Fm' и флуоресценцию F, измеряемую при фоновом освещении всей клетки. На рис. 5а показана pH-зависимость нефотохимического тушения, в которой значения Fm' при разных pH отнесены к максимальной флуоресценции Fm, наблюдаемой в условиях темновой адаптации при варьировании pH в диапазоне 6.0-8.5. Из рисунка видно, что величина NPQ минимальна в области щелочных pH и возрастает при понижении pH перфузионного раствора. Видно также, что помещение клетки на более яркий свет вызывает возрастание NPQ, причем повышение pH ослабляет NPQ и в этом случае. 

На рис. 5б показана зависимость отношения фактической флуоресценции F на действующем свету к минимальной флуоресценции F0, измеряемой в темноте при разных фиксированных уровнях pH перфузионного раствора. Зависимость характеризуется минимумом при pH в области 7.0. Освещение клетки в этих условиях вызывало снижение фактической флуоресценции примерно на 10%. Это снижение происходило параллельно со снижением Fm', что характерно для тушения в фотосинтетической антенне. При кислых и щелочных значениях pH освещение вызывало возрастание F, отражающее восстановление переносчиков в акцепторной части ФС II. Из рис. 5 следует, что щелочной сдвиг pH цитоплазмы в освещенной клетке должен сопровождаться снятием нефотохимического тушения (снижение NPQ, возрастание Fm') и ослаблением фотохимического тушения (возрастание F, свидетельствующее о восстановлении первичного акцептора Qa в ФС II). Именно такие изменения флуоресценции, показанные кривыми 1 на рис. 1а и 1б, составляют начальную стадию ответной реакции на локальное освещение удаленного участка клетки.

 

Обсуждение

В работе установлено, что локальная фотостимуляция, трансформируемая в дальнодействующие изменения состава подвижной цитоплазмы, может по-разному влиять на утилизацию ФАР в разных частях клетки, находящихся в близких, но не равных световых условиях (рис. 1). Полученные результаты имеют прямое отношение к проблеме формирования неоднородного профиля фотосинтетической активности в освещенных клетках харовых водорослей [17, 18]. Природа возникновения такой неоднородности активно обсуждается, однако до сих пор полностью не раскрыта. На наш взгляд, существенную роль в возникновении областей с низкой и высокой активностью фотосинтеза могут играть неоднородности освещения на микроскопическом уровне, обусловленные анатомическими особенностями интернодальных клеток. Известно, что встречные потоки кругового движения цитоплазмы на разных сторонах клетки разделены двумя узкими “индифферентными зонами”, лишенными хлоропластов [1, 4]. Эти прозрачные линии проходят вдоль клетки по спиральной траектории, создавая “окна” для проникновения света через экранирующий верхний слой хлоропластов. Благодаря просветам экранирующего слоя в верхней части клетки, освещенность на уровне нижнего слоя хлоропластов распределена неравномерно даже при идеально равномерной интенсивности падающего света. Поэтому распространение фотоиндуцированного “эффекторного” сигнала с потоком цитоплазмы может вызывать ослабление тушения в слабо освещенных зонах и вызывать сильное тушение флуоресценции в зонах повышенной освещенности. В связи с этим, следует отметить, что противоположные изменения максимальной флуоресценции были отмечены при очень небольших различиях в световых потоках (пороговый характер изменения знака ответной реакции) (рис. 2). Это может служить основой для возникновения неравномерного профиля фотосинтетической активности в условиях равномерного распределения падающей на клетку ФАР. Не исключено, что степень закрученности спиральной линии разделения потоков определяет минимальную периодическую длину между зонами с разной активностью фотосинтеза.

Результаты работы позволяют также предполагать, что начальные стадии изменений флуоресценции, вызываемых распространением фотоиндуцированного сигнала с потоком цитоплазмы (возрастание F и Fm'), опосредованы повышением pH текущей цитоплазмы. Буферная емкость цитоплазмы в клетках C. corallina в физиологических условиях минимальна и составляет 14.2 мМ/pH при pH 7.22 [19]. Низкая величина буферной емкости, по-видимому, обеспечивает возможность эффективной регуляции pH цитоплазмы. Существуют предположения, что изменения рНцит в ответ на различные воздействия могут протекать в секундном интервале и достигать 1 ед. pH [19]. 

Быстрое повышение pH у поверхности хлоропластов и в цитоплазме при освещении описано в ряде работ [9, 12]. Следует отметить, что в капле протоплазмы Nitella, содержащей хлоропласты, фотоиндуцированное защелачивание цитоплазмы отмечали лишь после повреждения поверхностной мембраны [20]. В данной работе быстрое повышение pH при освещении хлоропластов выявлено на качественном уровне в перфузируемых клетках Chara (рис. 4). Мы полагаем, что в текущей цитоплазме изменения могут составлять десятые доли ед. pH, т.е. заметно больше, чем в наших опытах. Действительно, в малом объеме текущей цитоплазмы эффекты разбавления обмениваемых компонентов должны быть выражены слабее, чем в клетке, лишенной тонопласта. В целом данные, представленные на рис. 4, подтверждают преобладающее представление о том, что освещение харовой водоросли индуцирует быстрое начальное повышение pH цитоплазмы в связи с поглощением H+ тилакоидами из стромы и оттоком протонов из цитоплазмы в строму [10]. 

В опытах с перфузируемыми клетками повышение pH внутриклеточной среды от физиологических значений ~7.5 сопровождалось ослаблением NPQ (возрастание Fm') и повышением уровня F (рис. 5). Этот факт служит основным доводом в пользу того, что быстрая стадия флуоресцентного ответа на приток цитоплазмы из области локального освещения связана с повышением рНцит. Характерное время повышения pH вблизи слоя хлоропластов при освещении (t1/2 ~5 с на рис. 4) составило примерно половину от времени достижения максимума Fm' при нулевом зазоре между световодом и центром анализируемой зоны (tmax (d = 0) = 10.5 с; найдено при аппроксимации прямой 1 на рис. 3 до пересечения с осью ординат). Это согласуется с предлагаемой точкой зрения о том, что интервал tmax соответствует суммарному времени, затрачиваемому на выделение интермедиата из ярко освещенных хлоропластов в цитоплазму и на развитие флуоресцентного ответа при поступлении интермедиата в затененные пластиды, без учета временных затрат на транспорт медиатора с потоком цитоплазмы.

Природа тушения флуоресценции при надпороговой интенсивности фонового освещения представляется менее ясной. Это тушение может быть связано как с закислением среды после начального щелочного сдвига, так и с влиянием других факторов. Следует также отметить, что закисление цитоплазмы часто сопровождается значительным повышением концентрации Ca2+ [21], что объясняют конкурентным взаимодействием протонов и Ca2+ с отрицательно заряженными группами буферной системы цитоплазмы. Повышение уровня Ca2+ в цитоплазме рассматривают в качестве возможной причины переходного тушения флуоресценции и подавления фотосинтеза при генерации потенциала действия в возбудимых клетках [17, 18]. Нельзя также исключать зависимость фотосинтеза и уровня флуоресценции от таких факторов, как возможное истощение в зоне локального освещения неорганического фосфора и углерода (СО2), а также фотоиндуцированный обмен органических метаболитов между хлоропластами и цитозолем [22, 23]. 

Исходя из полученных данных, возрастание уровня F, предшествующее тушению флуоресценции при передаче фотоиндуцированного сигнала с потоком цитоплазмы, можно рассматривать как показатель щелочного сдвига рНцит. Этот сдвиг может служить сигналом для открывания H+- или OH–-проводящих каналов плазмалеммы. Такая активация выведения OH– из клетки или поступления H+ внутрь из внешней среды, сопровождаемая образованием щелочных зон на поверхности клетки, препятствует чрезмерному защелачиванию цитоплазмы, и может служить одним из элементов в системе регуляции pH цитоплазмы. 

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 10-04-00968).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Камия Н. Движение протоплазмы. Москва: ИЛ, 1962. 306 с.

2. Allen N.S., Allen R.D. Cytoplasmic Streaming in Green Plants // Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 1978. V. 7. P. 497-526. 

3. Pickard W.F. The Role of Cytoplasmic Streaming in Symplastic Transport // Plant Cell Environ. 2003. V. 26. P. 1-15.

4. Verchot-Lubicz J., Goldstein R.E. Cytoplasmic Streaming Enables the Distribution of Molecules and Vesicles in Large Plant Cells // Protoplasma. 2010. V. 240. P. 99-107.

5. Булычёв А.А., Додонова С.О. Роль циклозиса в асимметричном формировании щелочных зон на границах освещаемого участка клеток Chara // Физиология растений. 2011. Т. 58. С. 202-207. 

6. Dodonova S.O., Bulychev A.A. Cyclosis-Related Asymmetry of Chloroplast–Plasma Membrane Interactions at the Margins of Illuminated Area in Chara corallina Cells // Protoplasma. 2011. V. 248. P. 737-749. 

7. Bulychev A.A., Dodonova S.O. Effects of Cyclosis on Chloroplast–Cytoplasm Interactions Revealed with Localized Lighting in Characean Cells at Rest and after Electrical Excitation // Biochim. Biophys. Acta. 2011. V. 1807. P. 1221-1230.

8. Додонова С.О., Булычёв А.А. Влияние движения цитоплазмы на фотосинтетическую активность хлоропластов в междоузлиях Chara corallina // Физиология растений. 2012. Т. 59. С. 40-47.

9. Remis D., Bulychev A.A., Kurella G.A. Photo-Induced pH Changes in the Vicinity of Isolated Peperomia metallica Chloroplasts // J. Exp. Bot. 1988. V. 39. P. 633-640.

10. Hansen U.-P., Moldaenke C., Tabrizi H., Ramm D. The Effect of Transthylakoid Proton Uptake on Cytosolic pH and the Imbalance of ATP and NADPH/H+ Production as Measured by CO2- and Light-Induced Depolarisation of the Plasmalemma // Plant Cell Physiol. 1993. V. 34. P. 681-695. 

11. Johnson C.H., Shingles R., Ettinger W.F. Regulation and Role of Calcium Fluxes in the Chloroplast // The Structure and Function of Plastids / Eds Wise R.R., Hoober J.K. Dordrecht: Springer-Verlag, 2006. P. 403-416.

12. Felle H., Bertl A. Light-Induced Cytoplasmic pH Changes and Their Interrelation to the Activity of the Electrogenic Proton Pump in Riccia fluitans // Biochim. Biophys. Acta. 1986. V. 848. P. 176-182. 

13. Harada A., Shimazaki K. Measurement of Changes in Cytosolic Ca2+ in Arabidopsis Guard Cells and Mesophyll Cells in Response to Blue Light // Plant Cell Physiol. 2009. V. 50. P. 360-373. 

14. Johnson M.P., Ruban A.V. Restoration of Rapidly Reversible Photoprotective Energy Dissipation in the Absence of PsbS Protein by Enhanced ΔpH // J. Biol. Chem. 2011. V. 286. P. 19 973-19 981. 

15. Tazawa M. Cell Physiological Aspects of the Plasma Membrane Electrogenic H+ Pump // J. Plant Res. 2003. V. 116. P. 419-442.

16. Булычёв А.А., Камзолкина Н.А. Влияние потенциала действия на фотосинтез и пространственно распределенные потоки H+ в клетке и хлоропластах Chara corallina // Физиология растений. 2006. Т. 53. С. 5-14. 

17. Krupenina N.A., Bulychev A.A., Roelfsema M.R.G., Schreiber U. Action Potential in Chara Cell Intensifies Spatial Patterns of Photosynthetic Electron Flow and Non-Photochemical Quenching in Parallel with Inhibition of pH Banding // Photochem. Photobiol. Sci. 2008. V. 7. P. 681-688. 

18. Krupenina N.A., Bulychev A.A., Schreiber U. Chlorophyll Fluorescence Images Demonstrate Variable Pathways in the Effects of Plasma Membrane Excitation on Electron Flow in Chloroplasts of Chara Cells // Protoplasma. 2011. V. 248. P. 513-522.

19. Takeshige K., Tazawa M. Measurement of the Cytoplasmic and Vacuolar Buffer Capacities in Chara corallina // Plant Physiol. 1989. V. 89. P. 1049-1052.

20. Svintitskikh V.A., Andrianov V.K., Bulychev A.A. Photoinduced H+ Transport between Chloroplasts and the Cytoplasm in a Protoplasmic Droplet of Characeae // J. Exp. Bot. 1985. V. 36. P. 1414-1429.

21. Plieth C., Sattelmacher B., Hansen U.-P. Cytoplasmic Ca2+–H+-Exchange Buffers in Green Algae // Protoplasma. 1997. V. 198. P. 107-124. 

22. Noguchi K., Yoshida K. Interaction between Photosynthesis and Respiration in Illuminated Leaves // Mitochondrion. 2008. V. 8. P. 87-99.

23. Facchinelli F., Weber A.P.M. The Metabolite Transporters of the Plastid Envelope: An Update // Front. Plant Sci. 2011. doi 10.3389/fpls.2011.00050

ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

 

Рис. 1. Изменения максимальной (Fm') и фактической (F) флуоресценции хлорофилла, вызванные распространением сигнала из области локального освещения (диаметр освещаемой зоны 400 мкм, плотность потока квантов 500 мкмоль/(м2 с), длительность импульса 30 с) в зону измерения, расположенную на расстоянии d = 1 мм вниз по течению цитоплазмы. 

а - изменения Fm' разного знака, вызванные локальным освещением удаленного участка при интенсивности общей фоновой подсветки 40 (1) и 70 (2) мкмоль/(м2 с). Сплошные линии отражают аппроксимацию экспериментальных данных гауссовыми кривыми; б - поступление сигнала из области локального освещения сопровождается возникновением пика флуоресценции F (черные символы, толстая линия 1) и последующим тушением Fm' (светлые символы, тонкая линия 2); условия измерений соответствуют записи 2 на рис. 1а. Вертикальными стрелками отмечены моменты включения точечного освещения. Представлены усредненные нормированные кривые, рассчитанные по пяти измерениям на одной клетке, и стандартные ошибки средних значений.

 

Рис. 2. Зависимость величины и знака изменений Fm', вызываемых локальным освещением удаленного участка клетки (d = 1 мм), от интенсивности фоновой подсветки всей клетки. 

Светлыми (1) и черными (2) символами показаны, соответственно, амплитуды и площади гауссовых аппроксимирующих кривых. Положительные и отрицательные значения на графике соответствуют возрастанию и снижению Fm'.

 

Рис. 3. Зависимости времени достижения максимума (tmax, линия 1) и минимума (tmin, линия 2) на кинетических кривых изменений Fm', представленных записями 1 и 2 на рис. 1а, от расстояния d между зоной локального освещения и областью измерения флуоресценции. 

За нулевой момент времени для отсчета tmax и tmin принято начало локального освещения удаленного участка клетки 30-секундным импульсом белого света. Прямые линии аппроксимированы до пересечения с осью ординат.

 

Рис. 4. Фотоиндуцированные изменения pH, измеряемые pH-микроэлектродом вблизи слоя хлоропластов внутри клетки C. corallina, перфузируемой средой без добавления буфера. 

Стрелками С и Т отмечены моменты включения и выключения действующего света (100 мкмоль/(м2 с)). Кривая изменений рН получена путем усреднения четырех записей на одной клетке. Данные представлены в виде средних значений и их стандартных ошибок.

Рис. 5. Влияние pH перфузионной среды на нефотохимическое тушение (NPQ) флуоресценции (а) и отношение фактической флуоресценции F на свету к уровню F0 в условиях темновой адаптации (б).

Сплошная (1) и пунктирная (2) кривые на рис. 5а соответствуют данным, полученным при измерениях, выполненных при интенсивностях общего освещения клетки 28 и 50 мкмоль/(м2 с); кривая на рис. 5б построена для интенсивности освещения 28 мкмоль/(м2 с). Данные представлены в виде средних значений и их стандартных ошибок, полученных в независимых опытах на 4–5 клетках.