ХРОМОСОМНЫЕ ОБЛАСТИ, АССОЦИИРОВАННЫЕ  С АКТИВНОСТЬЮ ЛИПОКСИГЕНАЗЫ В ГЕНОМЕ D Triticum aestivum L. ПРИ ВОДНОМ ДЕФИЦИТЕ

© 2017 г. М. Д. Пермякова, А. В. Пермяков, С. В. Осипова, Т. А. Пшеничникова,

А. А. Шишпарёнок, Е. Г. Рудиковская, А. В. Рудиковский, В. В. Верхотуров, 

А. Бёрнер 

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений, Иркутск

 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение “Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук”, Новосибирск

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования “Национальный исследовательский Иркутский государственный технический университет”, Иркутск 

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования “Иркутский государственный университет”, Иркутск, 

Лейбниц-Институт генетики растений и исследования возделываемых культур,   Гатерслебен, Германия

Поступила в редакцию 06.05.2016 г.

С использованием интогрессивных линий  мягкой пшеницы Triticum aestivum L. Чайниз Спринг (Синтетик 6х) по хромосомам генома D были обнаружены локусы количественных признаков (ЛКП), ассоциированные с фенотипическим проявлением активности разных форм липоксигеназы (ЛОГ) при водном дефиците. ЛКП, связанный с активностью растворимой ЛОГ семян идентифицирован на коротком плече хромосомы 4D. У проростков активность мембраносвязанной формы фермента была картирована на коротком плече, а растворимой формы - на длинном плече хромосомы 5D. Две области, ответственные за активность растворимой формы ЛОГ в листьях, обнаружены на коротком плече хромосомы 2D. На этой же хромосоме были найдены три ЛКП, связанных с активностью хлоропластной ЛОГ: активность растворимой формы была сцеплена с маркерами Xgwm261 и Xgwm539, а мембранной – с маркером Xgdm93.  В центромерном регионе хромосомы 7D идентифицированы ЛКП для активности как растворимой, так и связанной с мембранами ЛОГ листьев. На коротком плече этой хромосомы активность двух мембранных форм фермента в листьях оказалась сцеплена с маркером Xgdm130. Локусы, ассоциированные с активностью разных форм ЛОГ, были солокализованы с ЛКП для массы побега, параметров газообмена, флюоресценции хлорофилла, содержания фотосинтетических пигментов и зерновой продуктивности пшеницы. Обнаружена корреляционная связь между этими параметрами и активностью ЛОГ и показано, что различные формы фермента дифференцированно вовлечены в адаптацию растений пшеницы к водному дефициту. В статье обсуждается их предполагаемая физиологическая роль.

Ключевые слова: Triticum aestivum  локусы количественных признаков - водный дефицит  липидный метаболизм  активность липоксигеназы  газообмен  флуоресценция хлорофилла  пигменты фотосинтеза  засухоустойчивость. 

Сокращения: ВД  водный дефицит; ДС  длина стебля; ЖАК  жасмоновая кислота; ИЛ -интрогрессивные линии; ИУ  индекс устойчивости; Кар  каротиноиды; ККК  количество колосков в колосе; листMЛОГ  мембраносвязанная ЛОГ листьев; листРЛОГ  растворимая ЛОГ листьев; ЛКП  локус количественного признака; ЛОГ  липоксигеназа; МЗК  масса зерна в колосе; МП  масса побега; НВО  нормальное водообеспечение; ПНЖК  полиненасыщенные жирные кислоты; прMЛОГ  мембраносвязанная ЛОГ проростков; прРЛОГ  растворимая ЛОГ проростков; СА  скорость ассимиляции СО2; семРЛОГ  растворимая ЛОГ семян; СТ  скорость транспирации; СЭТ  скорость электронного транспорта; УП  устьичная проводимость; Хл – хлорофилл; хлМЛОГ  ЛОГ, связанная с мембранами хлоропластов; хлРЛОГ  растворимая ЛОГ хлоропластов; ЭИВ  эффективность использования воды; ЭФКВ(II)  эффективный фотохимический квантовый выход ФС II.

1Адрес для корреспонденции: Пермякова Марина Диомидовна. 664033, Иркутск-33, а/я  317. 

e-mail: marperm@rambler.ru

ВВЕДЕНИЕ

Засуха  наиболее суровый природный фактор, значительно ограничивающий зерновую продуктивность пшеницы. В настоящее время широко изучаются генетические механизмы, вовлеченные в реакции ответа растения на засуху [1]. При помощи картирующих популяций пшеницы в ее геноме были идентифицированы локусы количественных признаков (ЛКП), влияющие на водный статус растений, физиологические параметры и урожайность при водном дефиците [2, 3, 4].

Интенсификация процессов окисления мембранных липидов, в том числе перекисное окисление липидов (ПОЛ), является универсальным сигнальным механизмом, запускающим развитие адаптивных программ клетки при разных видах стресса, включая засуху. Ферментативно ПОЛ инициируется α-диоксигеназами и липоксигеназами. Липоксигеназа (линолеат: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.13.11.12, ЛОГ) катализирует присоединение молекулярного кислорода по местам двойных связей углеродной цепи полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) у растений, отличаясь позиционной специфичностью окисления в С-9 (9-ЛОГ) либо в С-13 (13-ЛОГ). Многообразие изоферментов ЛОГ дает начало нескольким направлениям метаболического пути  катаболизма ПНЖК с образованием множества промежуточных оксигенированных производных ЖК  оксилипинов, участвующих в процессах прорастания семян, роста, развития, старения растений, защите при патогенезе и абиотическом стрессе. Среди продуктов метаболизма ЛОГ встречаются такие фитогормоны, как травматиновая и жасмоновая (ЖАК) кислоты [5]. ЛОГ  каскад является одной из важнейших систем клеточной сигнализации у растений, известной как ЖАК  зависимая сигнализация [6].

Субстратами ЛОГ могут быть как свободные ПНЖК, так и находящиеся в составе запасных триацилглицеринов, гликолипидов и фосфолипидов клеточных мембран. При водном дефиците изоферменты ЛОГ сои вызывали окислительную модификацию мембранных липидов, увеличивая содержание гидроперекисей в этерифицированных жирных кислотах липидного бислоя, а также увеличение уровня транскриптов фермента [7]. Исследование протеома листьев пшеницы в условиях засухи показало увеличение ЛОГ и индуцированных жасмонатами белков [8]. Ранее мы показывали дифференцированное участие трех молекулярных форм ЛОГ в адаптации растений пшеницы к засухе [9]. 

Хотя многие изоферменты ЛОГ были идентифицированы у семейства  злаков, их физиологическая роль до сих пор не установлена. Неизвестно о функциональном значении и генетической вариабельности активности различных форм фермента, локализованных в разных органах растений в изменяющихся условиях окружающей среды. Целью работы было картирование ЛКП, ассоциированных с активностью растворимых и мембраносвязанных ЛОГ семян, проростков и листьев в геноме D пшеницы при водном дефиците, что может представить информацию о хромосомной локализации неизвестных генов, связанных с липидным метаболизмом, которые влияют на устойчивость растений  к почвенной засухе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служила картирующая популяция интогрессивных линий (ИЛ) пшеницы Triticum aestivum L. Чайниз Спринг (Синтетик 6х) по геному D (ЧС(Син)), каждая из которых несёт сегмент генома дикого злака Aegilops taushii и генотипирована с помощью микросателлитных маркеров [10]. В результате предварительных исследований полной серии линий ЧС (Син) с замещением отдельных пар хромосом [9] для картирования активности ЛОГ были выбраны 2, 4, 5 и 7 хромосомы генома D. Для картирования активности ЛОГ семян были исследованы 8 линий по хромосоме 4D; проростков – 8 линий по хромосоме 5D; листьев  8 линий по хромосоме 5D, 20 линий по хромосоме 2D и 13 линий по хромосоме 7D. У родителей ИЛ сорта Чайниз Спринг (ЧС) и синтетического гексаплоида Синтетик 6x (Син) были изучены все формы ЛОГ.

Семена ИЛ и их родителей были получены на экспериментальном участке Лейбниц-Института генетики растений и исследования возделываемых культур (Гатерслебен, Германия). Растения пшеницы выращивали в контролируемых условиях фитотрона СИФИБР СО РАН в двух местоположениях: в теплице (1) и проходной климатической камере (CLF Plant Climatic GMBH, Вертинген, Германия) (2) при двух контрастных режимах водообеспечения: нормальном (НВО) и вододефицитном (ВД). Условия выращивания растений и определение параметров газообмена, фотосинтеза и зерновой продуктивности  описаны в деталях ранее [11, 12]. В листьях определяли содержание хлорофиллов a и b (Хл a, Хл b) и их сумму (Хл (а+b)) в мг; содержание каротиноидов (Кар) в мг; отношение Хл (а+b)/Кар; скорость транспирации (СТ); устьичную проводимость (УП); скорость ассимиляции СО2 или нетто-фотосинтез (СА); эффективность использования воды (ЭИВ) как отношение СА/СТ; эффективный  фотохимический квантовый выход ФС II (ЭФКВ(II)); параметры, характеризующие скорость электронного транспорта (СЭТ) в ФС II: СЭТ при160 μmol photons/(m2∙s) (СЭТ160); начальный наклон световой кривой, связанный с максимальным выходом электронного транспорта ФС II в условиях ограниченного света (α);  максимальную скорость электронного транспорта (СЭТmax); интенсивность света при котором линии α и СЭТ пересекаются, выражающая начало насыщения ФАР (Lk). Кроме того в местоположении 1 измеряли массу побега (МП) в г; длину стебля (ДС) в см; количество колосков в колосе (ККК); массу зерна в колосе (МЗК) в г. Индекс устойчивости (ИУ) каждой линии по каждому из изученных параметров определяли в % по формуле ИУ=СрВД/СрНВО∙100, где СрВД  среднее значение параметра данной линии в условиях водного дефицита, СрНВО  среднее значение параметра данной линии в условиях нормального водообеспечения. 

Проростки пшеницы были получены проращиванием семян в течение трех суток на воде (контрольный вариант) и в условиях осмотического стресса на 12% растворе ПЭГ 6000, имитирующих водный дефицит.

Ферментные экстракты листьев приготавливали растиранием в ступке в течение 25 мин замороженных в жидком азоте листьев с тройным количеством 0.1 М трисНСI буферного раствора, содержащего 1 мМ ЭДТА (рН 7.5). Субклеточные фракции ЛОГ были получены последовательным центрифугированием фильтрата листьев при 1000 g в течение 20 мин (для получения хлоропластных фракций), а затем  при 105000 g в течение 120 мин (для получения растворимой и микросомальной фракций листьев). Были исследованы следующие белковые фракции: 1) растворимая фракция листьев, обогащенная цитозольными ЛОГ, листРЛОГ (супернатант после центрифугирования при 105000 g); 2) микросомальная фракция листьев, обогащенная мембраносвязанными формами ЛОГ, листМЛОГ (ресуспендированный в том же буферном растворе осадок после центрифугирования при 105000 g); 3) растворимая фракция ЛОГ хлоропластов, хлРЛОГ (отцентрифугированный при 8000 g ресуспендированный осадок после центрифугирования при 1000 g);  4) фракция, обогащенная связанными с мембранами хлоропластов формами ЛОГ, хлМЛОГ (ресуспендированный в том же буферном растворе осадок после центрифугирования при 105000 g растворимой фракции хлоропластов, получение которой описано в пункте 3). 

 Экстракты растворимой и мембраносвязанной ЛОГ проростков (прРЛОГ и прМЛОГ) получали аналогично листРЛОГ и листМЛОГ, исключив предварительное осаждение хлоропластов при 1000 g. 

Для получения экстракта растворимой ЛОГ семян (семРЛОГ) непросеянную муку в течение  30 мин экстрагировали тем же буферным раствором в соотношении 1:10. Гомогенат центрифугировали при 8000 g в течение 30 мин. Супернатант использовали для определения содержания белка и активности фермента.

Активность ЛОГ определяли, измеряя скорость образования пероксидов жирных кислот на микропланшетном ридере Infinite M200 PRO (Tecan Group Ltd, Männedorf, Switzerland) при 234 нм в 3 биологических и 4-6 аналитических повторностях, используя УФ-прозрачные микропланшеты (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany). Субстратом служила эмульсия линолевой кислоты в этаноле (1:1), растворенная  в 0.1 М трис-HCl буферном растворе, рH 7.5. Концентрация линолевой кислоты в реакционной смеси 56.7 мкМ/мл. Реакционная среда объемом 200 мкл содержала 5 мкл ферментного экстракта с известным содержанием белка, которое определяли по Bradford с использованием бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich, Germany) в качестве стандарта. Активность ферментов представлена в мкМ субстрата на мг белка в минуту при 25° C.

Статистическая обработка данных была выполнена с использованием Microsoft Exсеl 2010. Рассчитывали выборочную среднюю ± средняя ошибка выборочной средней ( ̅x ± S ̅x) всех параметров для каждого из местоположений выращивания в условиях нормального и недостаточного водообеспечения  и их ИУ, а также ̅x ± S ̅x двух местоположений и их  ИУ. Достоверность различий между средними значениями у ЧС и Син оценивали по t- критерию Стъюдента. Корреляционный анализ проводили, используя данные средних значений  обоих местоположений.

Ассоциации между определенным молекулярным маркером и вариабельностью по фенотипическому проявлению количественных признаков и картирование ЛКП выявляли с использованием программы QGENE [13]. Учитывали ЛКП с десятичным логарифмом вероятности (LOD) ≥ 1.9 (соответствие вероятностям P ≤ 0.01). Для сравнительного анализа принимали во внимание ЛКП с LOD 1.6 и 1.7 (P ≤ 0.02). 

РЕЗУЛЬТАТЫ

Значения параметров при нормальном и ограниченном водообеспечении и их ИУ

У обоих родителей изученных интогрессивных линий Triticum aestivum (Чайниз Спринг (Синтетик 6х) по геному D) формы ЛОГ различались по уровню активности (табл. 1). Независимо от условий водного режима наибольшей активностью отличалась семРЛОГ, а наименьшей - хлоропластные формы фермента. У проростков активность мембранной формы фермента была значительно  выше, чем растворимой. При нормальном водообеспечении активность листМЛОГ и обеих хлоропластных форм у Син была выше, чем у ЧС. Однако ЧС превосходил Син по МП, содержанию фотосинтетических пигментов, СТ, УП, ДС и МЗК,  уступая только по Хл (а+b)/Кар. В условиях водного стресса активность  семРЛОГ была выше у ЧС, значения прРЛОГ и хлРЛОГ значимо не различались, по остальным формам ЛОГ Син значительно превосходил ЧС. По МП, содержанию хлорофиллов и ДС Син уступал ЧС. Среди ИЛ по всем параметрам наблюдалась высокая вариабельность значений независимо от водного режима. Наибольший размах значений был обнаружен по активности ЛОГ (кроме прМЛОГ), а наименьший – по ЭФКВ(II).

По данным табл. 2 у обоих родителей ИУ параметров МЛОГ листьев, МП, СТ, УП, СА, α, ДС, ККК, МЗК были ниже 100%. ИУ параметров семРЛОГ, прМЛОГ, листРЛОГ, хлРЛОГ, содержания хлорофиллов, каротиноидов и их отношения, а также ЭИВ, СЭТ и Lk были выше 100%. ИУ прРЛОГ у ЧС был ниже 100%, а у Син – выше. Кроме этого параметра, ЧС и Син показали значимые различия по ИУ семРЛОГ, ЭИВ и МЗК. Среди ИЛ по ИУ параметров наблюдался большой размах значений с отношением max/min  от 1.6 для ЭФКВ(II) до 489.7 для листМЛОГ.

Корреляционные взаимосвязи параметров

Как показано в табл. 3, МП при оптимальном водном режиме была положительно связана с Кар и ЭИВ, а при недостаточном водообеспечении – положительно с содержанием фотосинтетических пигментов, параметрами СТ, УП, СЭТ и Lk. Независимо от водного режима содержание всех пигментов было тесно связано между собой, а также с СЭТ, α и Lk, однако с параметрами газообмена оно показало положительную корреляцию только в условиях засухи. Параметры газообмена СТ, УП и  ЭИВ тоже были взаимосвязаны независимо от водного режима, но связь СТ и УП с ЭФКВ(II), СЭТ и Lk проявилась лишь в условиях водного дефицита. При любом водном режиме оба параметра СЭТ были положительно связаны между собой и с Lk, и отрицательно с α.

Между ферментативной активностью разных форм ЛОГ было обнаружено немного значимых корреляционных связей. Была найдена положительная корреляция между растворимой и мембранной формами ЛОГ листьев в условиях водного стресса, а также между двумя мембранными формами (листьев и хлоропластов), как при оптимальном, так и при недостаточном водообеспечении. Наибольшее число достоверных корреляций обнаружено для активности листРЛОГ. Независимо от условий выращивания растений она была положительно связана с СТ и УП, содержанием хлорофиллов и СЭТ. Однако характер ее корреляций с МП и Кар зависел от водного режима: при нормальном водообеспечении  корреляция была отрицательной, а при недостаточном – положительной. Активность листMЛОГ при нормальном водном режиме показала достоверную положительную корреляцию только с СА и ЭИВ. Знак корреляций с данными параметрами  при нормальном водном режиме отличался у листРЛОГ и листМЛОГ, однако в условиях вододефицита эти две формы ЛОГ показали сходный характер корреляций с содержанием пигментов, СЭТ, МП, и, в конечном счете, с компонентами урожая зерна. В условиях засухи активность листМЛОГ обнаружила положительную корреляцию с МЗК (r = 0.48), а активность семРЛОГ  с ДС (r = 0.57) и МЗК (r = 0.28). 

В отличие от листРЛОГ и листМЛОГ, активность хлРЛОГ показала отрицательные корреляции  с МП, с отношением Хл (a+b)/Кар и СЭТ в условиях вододефицита. Активность мембранной ЛОГ хлоропластов показала схожие корреляционные тенденции, но, в отличие от хлРЛОГ, независимо от водного режима, она имела положительные корреляции с содержанием всех пигментов фотосинтеза. Обе хлоропластные формы фермента отрицательно коррелировали с МП в условиях засухи, а активность хлРЛОГ была отрицательно связана с компонентами урожая зерна ДС, ККК и МЗК (r = -0.51, -0.61 и -0.46 соответственно). 

Анализ ЛКП, ассоциированных с активностью разных форм ЛОГ

Локусы, ассоциированные с ферментативной активностью ЛОГ в отдельных органах и клеточных компартментах  пшеницы в разных условиях выращивания, представлены в таблице 4. Активность семРЛОГ  была картирована на коротком плече хромосомы 4D в области маркеров Xgdm129 - Xgwm3000 как при оптимальном водоснабжении, так и при водном дефиците. 

У проростков в условиях, имитирующих засуху с использованием ПЭГ, активности растворимой и мембранной форм ЛОГ были картированы в разные регионы хромосомы 5D. ЛКП для активности прРЛОГ был обнаружен на длинном плече хромосомы 5D в области, ограниченной маркерами Xgwm1122 и Xgwm182.  ЛКП, ассоциированный с активностью прМЛОГ был найден на коротком плече хромосомы 5D и оказался сцепленным с маркерами Xgwm190, Xgwm205, Xgwm1252.  

ЛКП для активности листРЛОГ при недостаточном водообеспечении в теплице (1) был ассоциирован с маркерами Xgwm1002, Xgwm44, Xgwm111  хромосомы 7D. В климатической камере (2) локусы активности как растворимой, так и мембраносвязанной  ЛОГ, были связаны с маркерами Xgwm1672, Xgwm1002, Xgwm44. Таким образом, маркеры Xgwm1002 и Xgwm44 при водном дефиците оказались сцепленными с активностью листРЛОГ независимо от различий условий двух местоположений выращивания растений.

 Активность листРЛОГ в условиях засухи, кроме хромосомы 7D, была картирована в центромерной области хромосомы 2D и была связана с маркерами Xgwm102 и Xgwm988. Локус для ИУ листРЛОГ был обнаружен в дистальном участке короткого плеча этой хромосомы в области фланкирующих маркеров Xgwm721- Xgwm296. 

Недалеко от локуса для ИУ листРЛОГ была картирована активность хлРЛОГ в условиях водного дефицита, которая была связана с маркером Xgwm261.

Всего было обнаружено 8 ЛКП с LOD от 1.9 до 2.9, ассоциированных с активностью как растворимых, так и мембраносвязанных форм фермента. За исключением ЛКП для активности ЛОГ семян, все локусы проявились только при неблагоприятных условиях выращивания растений. 

Кроме того, на 2 и 7 хромосомах генома D пшеницы в условиях засухи были обнаружены несколько локусов для активности ЛОГ с LOD 1.6 и 1.7. На хромосоме 2D активность растворимой формы ЛОГ хлоропластов была связана с маркером Xgwm539, а ИУ мембранной формы хлоропластов  с Xgdm93. На хромосоме 7D активности двух мембранных форм листМЛОГ и хлМЛОГ были сцеплены с маркером Xgdm130. Эти ЛКП невысокой достоверности были включены для анализа солокализации признаков. Как будет сказано далее, кластеры ЛКП для нескольких физиологических параметров в условиях засухи оказались ассоциированы с каждым из трех маркеров. 

Анализ ЛКП показал, что при засухе в листьях пшеницы активность растворимой формы ЛОГ имела как раздельный, так и общий с активностью мембранной формы генетический контроль. В проростках пшеницы активности мембранной и растворимой форм фермента контролировались независимо, также как, активности растворимой и связанной с мембранами ЛОГ хлоропластов и растворимой ЛОГ семян. Это, вероятно, объясняется их специфическими функциями в условиях водного стресса.

Солокализация признаков

Все обнаруженные в данной работе ЛКП для физиологических параметров, включая активность ЛОГ, оказались сгруппированы в кластеры в нескольких хромосомных областях генома D, независимо от местоположения выращивания растений и режима водообеспечения. ЛКП для активности разных форм ЛОГ были солокализованы с физиологическими параметрами пшеницы (табл. 4). 

ЛКП для параметра ЭИВ при нормальном водообеспечении был обнаружен на коротком плече хромосомы 4D в области локуса для активности семРЛОГ. В хромосоме 5D, в районе маркера Xgwm1122, были ассоциированы локусы активности растворимой формы ЛОГ проростков в условиях, имитирующих засуху пи помощи ПЭГ 6000 и параметры МП, Кар, СЭТ160 при водном дефиците в одном из двух местоположений. ЛКП, ассоциированный с активностью мембраносвязанной ЛОГ проростков на коротком плече хромосомы 5D в районе маркера Xgwm190 оказался солокализованным с тремя параметрами газообмена и ЭФКВ(II) при нормальном водном режиме, ДС в условиях засухи и ИУ нескольких параметров: МП, СЭТ160, α, ДС, ККК, МЗК. Центромерная область хромосомы 7D (Xgwm1002- Xgwm111), кроме активности листРЛОГ и листМЛОГ, была связана с содержанием пигментов при нормальном водоснабжении, параметрами ЭИВ и СА в условиях водного дефицита, а также ИУ СА. 

На хромосоме 2D локус для активности листРЛОГ в области маркера Xgwm102 оказался солокализованным с двумя параметрами электронного транспорта, а локус для ИУ этой формы фермента, связанный с Xgwm455, с СЭТ и параметрами газообмена при водном дефиците. С маркером Xgwm261 на хромосоме 2D была ассоциирована активность хлРЛОГ в условиях водного дефицита и параметры газообмена листьев в условиях нормального водоснабжения. С маркером Xgwm539 были сцеплены параметры СТ, УП, ЭИВ, МП и α при  водном дефиците в местоположении 2 и их ИУ (кроме ИУα), а также второй локус для активности хлРЛОГ невысокого уровня значимости (LOD 1.6).  ЛКП для активности хлМЛОГ (LOD 1.6), сцепленный с маркером Xgdm93, был солокализован с параметром ЭИВ в условиях водного дефицита во втором местоположении. Этот же параметр ЭИВ ВД2 был картирован на коротком плече хромосомы 7D, ассоциированный с маркером Xgdm130,  где был солокализован с содержанием пигментов в условиях нормального водоснабжения и  локусами невысокого уровня значимости для активности листМЛОГ и хлМЛОГ.

ОБСУЖДЕНИЕ

Формы  ЛОГ различались у родителей интрогрессивных линий Triticum aestivum Чайниз Спринг (Синтетик 6х) сорта Чайниз Спринг и синтетического гексаплоида Синтетик 6х конституционным уровнем активности, а также характером его изменения при водном дефиците. В условиях водного стресса активность большинства форм ЛОГ увеличивалась или оставалась на том же уровне, кроме активности листМЛОГ, которая значительно уменьшалась у обоих родительских генотипов и активности прРЛОГ, которая уменьшалась только у ЧС. Наблюдаемые различия между родителями по уровню активности отдельных форм фермента, содержанию фотосинтетических пигментов, параметрам газообмена и зерновой продуктивности при нормальном и (или) недостаточном водообеспечении, могут свидетельствовать о разных адаптивных стратегиях, что находит отражение в различии их ИУ по параметрам ЭИВ и МЗК. ИУ активности семРЛОГ и хлоропластных форм ЛОГ были выше у ЧС, в то время как по ИУ растворимых и мембранных форм ЛОГ проростков и листьев Син превосходил ЧС. Вероятно, устойчивость и адаптация к засухе у ЧС, связана с увеличением активности хлоропластных ЛОГ, а у Син с растворимыми и мембранными формами ЛОГ проростков и листьев.

Корреляционный анализ между всеми изучаемыми параметрами в целом отразил генетические данные картирования и солокализации признаков. Наибольшее число положительных корреляций с физиологическими признаками обнаружила активность листРЛОГ, что свидетельствует о преимуществе ее положительного влияния на адаптацию к засухе среди всех форм ЛОГ. Разный характер корреляций со многими параметрами  при нормальном водном режиме у листРЛОГ и листМЛОГ может говорить о различии их влияния на газообмен и ЭИВ растений пшеницы. Однако при водном дефиците эти две формы ЛОГ показали сходный характер корреляций с МП, содержанием пигментов и СЭТ, что позволяет предполагать их синергическое действие в условиях стресса, направленное на защиту фотосинтеза и сохранение биомассы. Вероятно, листРЛОГ и листМЛОГ связаны с синтезом жасмонатов и других оксилипинов, участвующих в защитной сигнализации.

В отличие от листРЛОГ и листМЛОГ, активность растворимой хлоропластной формы фермента показала отрицательные корреляции с МП и СЭТ в условиях вододефицита. Так как уменьшение скорости транспорта электронов в ФСII сопровождается увеличением окисления липидов тилакоидных мембран [14], можно предположить, что хлРЛОГ участвует в этом процессе. 

Известно о причастности ЖАК к деградации хлорофилла, вследствие старения и абиотического стресса [15]. Отрицательные корреляции активности хлРЛОГ с отношением Хл (a+b)/Кар могут косвенно свидетельствовать об участии этой формы ЛОГ не только в  окислении липидов тилакоидных мембран, но и в деградации хлорофиллов. 

Продукты ЛОГ способны разрушать каротиноиды [5], но с 90-х годов пошлого века известно, что ЛОГ не участвует в окислении каротиноидов в виолаксантиновом цикле и синтезе АБК. Однако положительная корреляция активности хлМЛОГ с Кар может предполагать ее причастность на регуляторном уровне к нефотохимическому тушению хлорофилла, защищающему фотосинтетический аппарат от деструкции АФК, вследствие существующего “перекрестного разговора” между АБК и ЖАК [16]. 

На основании данных по вариабельности активности ЛОГ в нескольких белковых фракциях у ИЛ пшеницы было обнаружено восемь ЛКП с LOD от 1.9 до 2.9 и четыре ЛКП с LOD 1.6 и 1.7. Все локусы проявились при неблагоприятных условиях выращивания растений. Исключение составляет ЛКП, ассоциированный с активностью растворимой ЛОГ семян на коротком плече хромосомы 4D, который  проявился независимо от условий водообеспечения. Вероятно, этот локус связан с присутствием в данном регионе трех известных структурных генов биосинтеза изоферментов 9-ЛОГ [17], и не имеет прямого отношения к засухоустойчивости. 

У проростков в условиях, имитирующих засуху, активности растворимой и мембранной форм ЛОГ были картированы в разные области хромосомы 5D на длинном и коротком плечах, что, несомненно, связано различием их физиологических функций. Известно, что один из локусов, ответственных за уровень свободных полярных липидов семян пшеницы Fpl-1 расположен на коротком плече, в то время как второй локус Fpl-2 – на длинном плече хромосомы 5D [18]. Оба локуса находятся  в сходном положении с обнаруженными нами ЛКП для активности прРЛОГ и прМЛОГ. Это свидетельствует о причастности  обеих форм фермента к метаболизму полярных липидов при водном дефиците. ЛКП, связанный с активностью растворимой ЛОГ на 5DL, может совпадать с известным структурным геном 13-ЛОГ [17] и ЛКП различных параметров развития растений пшеницы [10]. 

Локус прМЛОГ на коротком плече хромосомы 5D может играть роль в регулировании текстуры эндосперма, его мягкости или твердости. В настоящее время молекулярными маркерами мягкозерности считают расположенные на поверхности крахмальных гранул эндосперма липид-трансферные белки пуроиндолины Pina и Pinb, которые, как и ЛОГ, обладают сильными антигрибными и антипатогенными свойствами [19]. Результаты известных геномных исследований показывают солокализацию генов Pina-D1,  Pinb-D1 и Fpl-2 в главном локусе, контролирующем твердозерность (Ha) в дистальном конце хромосомы 5D [20]. В этой же области находится кластер ЛКП параметров текстуры эндосперма и качества клейковины, сцепленный с маркером Xgwm190 [21]. Найденный нами локус для активности прМЛОГ находится в той же позиции и сцеплен с тем же маркером. Это может быть связано с участием этой формы фермента в определении текстуры эндосперма. Наше предположение основано также на высокой вероятности физиологической взаимосвязи между липид-деградирующим ферментом ЛОГ, липидными переносчиками пуроиндолинами  и поверхностно-крахмальными полярными липидами, жирнокислотный состав которых [22] позволяет им быть предпочтительным субстратом для ЛОГ. Кроме того, нами была выявлена отрицательная корреляционная взаимосвязь активности ЛОГ семян с твердозерностью и стекловидностью в нескольких популяциях пшеницы (неопубликованные данные).

В листьях пшеницы в условиях засухи активность, как растворимой, так и мембраносвязанной ЛОГ, была связана с центромерной областью хромосомы 7D, ограниченной маркерами Xgwm1002 и Xgwm111. В том же самом регионе были картированы параметры газообмена пшеницы в условиях водного дефицита в климатической камере, а ранее нами были идентифицированы ЛКП для  главных компонент (PC), а также активности ферментов аскорбат пероксидазы и дегидроаскорбат редуктазы [11]. 

Эта область на хромосоме 7D, вероятно, тоже имеет отношение к текстуре эндосперма: ЛКП для мукомольного выхода муки, зависящего от степени твердозерности, был найден в аналогичном положении, сцепленный с маркером Xgwm111 [23]. В нашей работе активность листРЛОГ в местоположении 1 была сцеплена с тем же маркером, а Chen с сотрудниками обнаружили гомеоаллели вариантных форм Pin b на всех хромосомах седьмой гомеологичной группы [24]. 

Кроме того, этот хромосомный регион, ассоциированный с активностью листРЛОГ и листМЛОГ, может быть ответственен и за устойчивость к биотическому стрессу: ЛКП устойчивости к Septoria tritici blotch был сцеплен с теми же маркерами Xgwm1002 и Xgwm 44 [25]. Все вышеперечисленные сведения свидетельствуют о важности центромерной области хромосомы 7D в определении устойчивости и адаптации к разным видам стресса. 

На дистальном участке короткого плеча хромосомы 7D были идентифицированы ЛКП для активности листМЛОГ и хлМЛОГ, ассоциированные с одним маркером Xgdm130, с невысокими LOD. Однако, по нашему мнению, их следует учитывать, так как, с данным маркером может быть связан регуляторный фактор, общий для активности обеих мембранных форм фермента. Этот фактор, вероятно, может определять их синергическое действие в условиях  водного дефицита, связанное с пигментами фотосинтеза, которое подтверждается положительной корреляцией их активности между собой и с содержанием пигментов. 

На хромосоме 2D было найдено пять областей, определяющих вариабельность физиологических параметров, включая активность листРЛОГ и ее ИУ, а также активность хлоропластных форм ЛОГ. Хлоропластные формы ЛОГ были связаны с отдельными маркерами Xgwm261, Xgwm539, Xgdm93. Другие авторы обнаружили на хромосоме 2D локусы  массы 1000 зерен [26] и устойчивости к желтой ржавчине пшеницы [27] ассоциированные с маркером Xgwm261. В предыдущей работе [12] в области  Xgwm539 нами был обнаружен самый большой кластер, включающий ЛКП для разных физиологических параметров. Шоева с соавторами [28]  показали, что с этим маркером связан транскрипционный фактор MYC4, который наряду с MYC2 является участником ЖАК - зависимой сигнализации [5]. С маркером Xgdm93 в предыдущей работе [12]  были связаны параметры газообмена и активность фермента глютатион редуктазы. Интересно, что второй ЛКП для активности этого фермента на хромосоме 2D, сцепленный с маркером Xgwm102, совпадает с локусом, ассоциированным с активностью другой формы ЛОГ  листРЛОГ. Солокализация ЛКП для активности ЛОГ и ферментов антиоксидантной защиты на хромосомах 2D и 7D, может подтверждать существующие сведения о том, что метаболизм аскорбата и глютатиона при водном стрессе регулирует ЖАК [29]. Перечисленные данные свидетельствуют о необходимости принимать во внимание локусы ЛОГ, ассоциированные с маркерами Xgwm539 и Xgdm93, несмотря на относительно низкие значения их LOD.

С использованием  206 рекомбинантных инбредных линий WL711/C306 на хромосоме 2D были обнаружены 5 локусов, ассоциированных с физиологическими параметрами и зерновой продуктивностью при разном водном режиме [3]. Ориентируясь на молекулярные маркеры, присутствующие и в  этой, и в нашей работе (Xgwm482, Xgwm102, Xgwm539), можно предположить, что данные локусы совпадают с обнаруженными нами на хромосоме 2D ЛКП, ассоциированными с активностью ЛОГ. А на хромосоме 7D параметры зерновой продуктивности в условиях засухи оказались сцеплены с тем же маркером (Xgwm 111), что и активность листРЛОГ.

 В популяции пшеницы, полученной от скрещивания сорта Принц и линии синтетической пшеницы W-7984, ЛКП компонентов урожая на 2, 4, 7 хромосомах  находились в тех же регионах, где обнаруженные нами кластеры ЛКП или были сцеплены с теми же маркерами Xgwm539, Xgwm129, Xgwm1002 [30]. 

Таким образом, разными авторами с использованием различных картирующих популяций пшеницы в разных условиях выращивания, были выявлены хромосомные области в геноме D для физиологических и технологических признаков, на которые  теоретически могла бы влиять активность ЛОГ. Эти области совпадают с обнаруженными нами ЛКП, ассоциированными с активностью отдельных форм фермента.

Анализ солокализации ЛКП показал, что при водном дефиците с проявлением физиологических признаков, независимо от различий условий теплицы и климатической камеры, а также у проростков в условиях имитации засухи при помощи ПЭГ6000, были связаны определенные районы хромосом генома D. В этих же хромосомных областях выявились ЛКП для многих параметров в полевых условиях выращивания растений пшеницы [21, 23, 25-27, 30].

Все выявленные в нашей работе ЛКП, ассоциированные с вариабельностью параметров фотосинтеза, газообмена, биомассы, биометрических показателей или зерновой продуктивности в условиях засухи, в то же время были связаны с вариабельностью активности ЛОГ. Вероятно, эти хромосомные области несут гены метаболических путей липидов или транскрипционных факторов, инициированных изоферментами ЛОГ, которые крайне  важны для устойчивости и адаптации растений пшеницы к стрессу.

В заключение следует сказать, что определение генетической основы взаимосвязей между активностью изоферментов ЛОГ и физиологическими признаками с использованием анализа ЛКП, может пролить свет на механизмы регуляции устойчивости растений пшеницы к водному дефициту. После верификации ЛКП, связанных с активностью разных форм ЛОГ с помощью других картирующих популяций, возможно их применение в ассоциированной с маркерами селекции (МАС) для улучшения засухоустойчивости пшеницы.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 15-04-02762) и Российского научного фонда (грант № 14-14-00734) на экспериментальной базе Байкальского аналитического центра коллективного пользования Фитотрон СИФИБР СО РАН.

 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

 

1. Cattivelli L., Rizza F., Badeck F.-W., Mazzucotelli E., Mastrangelo A.M., Francia E., Marè C., Tondelli A., Stanca A. M. Drought tolerance improvement in crop plants: An integrated view from breeding to genomics // Field Crops Research. 2008. V. 105. P. 1–14. 

2. Чесноков Ю. В., Гончарова Э. А., Ситников М. Н., Кочерина Н. В., Ловассер У., Бёрнер А. Картирование QTL водного режима у яровой мягкой пшеницы // Физиология растений. 2014. Т. 61. № 6. С. 855–863. 

3. Shukla S., Singh K., Patil R.V., Kadam S., Bharti S., Prasad P., Singh N.K., Khanna-Chopra R. Genomic regions associated with grain yield under drought stress in wheat (Triticum aestivum L.) // Euphytica. 2015. V. 203. P. 449–467. 

4. Parent B., Shahinnia F., Langridge P., Fleury D. Combining field performance with controlled environment plant imaging to identify the genetic control of growth and transpiration underlying yield response to water-deficit stress in wheat // J. Exp. Bot. 2015. V. 66 (18). P. 5481–5492. 

5.  Feussner I., Wasternack C. The Lipoxygenase Pathway // Annu. Rev. Plant Biol. 2002. V. 53. P. 275-297.

6.  Wasternack C., Hause B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development // Annals of Botany. 2013. V. 111. P. 1021–1058. 

7. Maccarrone M., Veldink G.A., Aghrò A.F.,Vliegenthart J.F.G. Modulation of soybean lipoxygenase expression and membrane oxidation by water deficit // FEBS Lett. 1995. V. 371. № 3. P. 223–226.

8. Zhang H., Zhang L., Lv H., Yu Z., Zhang D., Zhu W. Identification of changes in Triticum aestivum L. leaf proteome in response to drought stress by 2D-PAGE and MALDI-TOF/TOF mass spectrometry // Acta Physiol Plant. 2014. V. 36. P. 1385–1398. 

9. Пермякова М.Д., Пермяков А.В., Осипова С.В., Пшеничникова Т.А.            Липоксигеназы листьев пшеницы, выращенной в условиях разного                 водообеспечения // Прикладная биохимия и микробиология. 2012. Т. 48. № 1. С. 1-6. 

10. Pestsova E.G., Börner A., Röder M.S. Development and QTL assessment of Triticum aestivum - Aegilops tauschii introgression lines // Theor Appl Genet. 2006. V.112. P. 634–647.

11.  Osipova S.V., Permyakov A.V., Permyakova M.D., Davydov V.A., Pshenichnikova T.A., Börner A. Tolerance of prolonged drought among a set of bread wheat chromosome substitution lines // Cereal Research Communication. 2011. V. 39. № 3. P. 343-351. 

12. Osipova S., Permyakov A., Permyakova M., Pshenichnikova T., Verkhoturov V., Rudikovsky A., Rudikovskaya E., Shishparenok A., Doroshkov A., Börner A. Regions of the bread wheat D genome associated with variation in key photosynthesis traits and shoot biomass under both well watered and water deficient conditions // Appl Genetics. 2015. V. 56. № 4. P. 1–3.

13. Nelson J.C. QGENE: software for mapping – based genomic analysis and breeding // Mol. Breed. 1997. V. 3. P. 239-245.

14. Mishra R.K.  Singhal G. S. Function of photosynthetic apparatus of intact wheat leaves under high light and heat stress and its relationship with peroxidation of thylakoid lipids // Plant Physiol. 1992. V. 98. P.1-6. 

15. Van der Graaff E., Schwacke R., Schneider A., Desimone M., Flügge U.-I., Kunze R. Transcription analysis of arabidopsis membrane transporters and hormone pathways during developmental and induced leaf senescence // Plant Physiology. 2006. V. 141. P. 776–792.

16.  Dave A., Hernάndez M. L., He Z., Andriotis V.M.E., Vaistij F. E., Larson T. R., Graham I.A. 12-Oxo-Phytodienoic acid accumulation during seed development represses seed germination in Arabidopsis // Plant Cell 2011. V. 23. P. 583–599. 

17. Feng B., Dong Z., Xu Z., An X. Qin H., Wu N., Wang D., Wang T. Molecular analysis of lipoxygenase (LOX) genes in common wheat and phylogenetic investigation of LOX proteins from model and crop plants // J. of Cereal Science. 2010. V. 52. P. 387-394.

18.  Morrison W.R., Law C.N., Wylie L.J., Coventry A.M., Seekings J. The effect of group 5 chromosomes on the free polar lipids and breadmaking quality of wheat // J. Cereal Sci. 1989. V. 9. P. 41-51.

19. Pauly A., Pareyt B., Fierens E., Delcour J.A. Wheat (Triticum aestivum L. and T. turgidum L. ssp. durum) kernel hardness: I. Current view on the role of puroindolines and polar lipids // Compr Rev Food Sci Food Saf 2013. V. 12. P. 413-426.

20. Turnbull K.M., Rahman S. Endosperm texture in wheat // J. Cereal Sci. 2002. V. 36. P. 327−337.

21.  Nelson J.C., Andreescu C., Breseghello F., Finney P.L., Gualberto D.G., Bergman C.J., Pena R.J., Perretant M.R., Leroy P., Qualset C.O., Sorrells M.E. Quantitative trait locus analysis of wheat quality traits // Euphytica. 2006. V. 149. P. 145-159. 

22.  Finnie S.M., Jeannotte R., Morris C.F., Giroux M.J., Faubion J.M. Variation in polar lipids located on the surface of wheat starch // J. Cer. Sci. 2010. V. 51. P. 73-80.

23. Parker G.D., Chalmers K.J., Rathjen A.J., Langridge P. Mapping loci associated with milling yield in wheat (Triticum aestivum L.) // Molecular Breeding.1999. V. 5. P. 561–568. 

24. Chen F., Xu H.-X., Zhang F.-Y., Xia X.-C., He Z.-H., Wang D.-W., Dong Z.-D., Zhan K.-H., Cheng X.-Y., Cui D.-Q. Physical mapping of puroindoline b-2 genes and molecular characterization of a novel variant in durum wheat (Triticum turgidum L.) // Mol. Breeding. 2011. V. 28. P. 153-161.

25.  Simon M.R., Ayala F.M., Cordo C.A., Röder M.S., Börner A. The use of wheat/goatgrass introgression lines for the detection of gene(s) determining resistance to septoria tritici blotch (Mycosphaerella graminicola) // Euphytica. 2007. V. 154. P. 249–254. 

26. Groos C., Robert N., Bervas E., Charmet G. Genetic analysis of grain protein-content, grain yield and thousand-kernel weight in bread wheat  // Theor Appl Genet. 2003. V. 106. P. 1032–1040. 

27. Lu Y., Lan C., Liang S., Zhou X., Liu D., Zhou G., Lu Q., Jing J., Wang M., Xia X., He Z. QTL mapping for adult-plant resistance to stripe rust in Italian common wheat cultivars Libellula and Strampelli // Theor Appl Genet. 2009. V. 119. P. 1349–1359. 

28. Shoeva O.Y., Gordeeva E.I., Khlestkina E.K. The regulation of anthocyanin synthesis in the wheat pericarp // Molecules. 2014b. V. 19. P. 20266-20279.

29. Dai H., Jia G., Shan C. Jasmonic acid-induced hydrogen peroxide activates MEK1/2 in upregulating the redox states of ascorbate and glutathione in wheat leaves // Acta Physiol Plant. 2015. V. 37: 200. DOI 10.1007/s11738-015-1956-y

30. Huang X. Q., Cöster H., Ganal M. W., Röder M. S. Advanced backcross QTL analysis for the identification of quantitative trait loci alleles from wild relatives of wheat (Triticum aestivum L.) // Theor Appl Genet. 2003. V.106. P. 1379–1389. 

 

 

 Таблица 1. Значения активности разных форм липоксигеназы (ЛОГ), биомассы побега, содержания фотосинтетических пигментов, параметров газообмена и флюоресценции хлорофилла у Triticum aestivum сорта ЧС, синтетического гексаплоида Син и интрогрессивных линий ЧС(Син) при разных режимах водообеспечения

 

 Таблица 2. Индексы устойчивости параметров у Triticum aestivum сорта ЧС, синтетического гексаплоида Син и интрогрессивных линий

 

 Таблица 3. Корреляционные связи между активностью разных форм липоксигеназы (ЛОГ) листьев, биомассой побега, содержанием фотосинтетических пигментов, параметрами газообмена и флюоресценции хлорофилла у интрогрессивных линий ЧС(Син) Triticum aestivum при разных режимах водообеспечения

 

 Таблица 4. ЛКП, ассоциированные с активностью различных форм липоксигеназы (ЛОГ) и биомассой побега, содержанием фотосинтетических пигментов, параметрами газообмена и флюоресценции хлорофилла, компонентами урожая у интрогрессивных линий ЧС(Син) Triticum aestivum в разных условиях выращивания