УДК 581.1
КАК ЦИТОКИНИНЫ ДЕЙСТВУЮТ НА КЛЕТКУ
© 2009 г. Г. А. Романов
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 30.06.2008 г.

Лекция дает современные представления о механизмах рецепции цитокининового сигнала, его трансдукции на гены первичного и вторичного ответов, а также показывает связь быстрых молекулярных, индуцированных цитокинином процессов с вызываемыми ими физиологическими эффектами. Обсуждаются характеристики цитокининовой регуляторной системы, ее место и роль для роста и развития растительного организма.

Ключевые слова: цитокинин – рецептор – трансдукция сигнала – гены первичного ответа – регуляция экспрессии генов –дальнедистанционная коммуникация.

_______________________________________
Сокращения: ФлD – фосфолипаза Д; DZ – дигидрозеатин; iP – изопентениладенин; Z – зеатин; ARR – белки-регуляторы ответа (арабидопсиса); GUS – глюкуронидаза.
Адрес для корреспонденции: Романов Георгий Александрович. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронная почта: gar@ippras.ru, gromanov@yahoo.com
____________________________________
* По материалам Чайлахяновского чтения 2006 г.


 ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ ЦИТОКИНИНОВ

Цитокинины (названные вначале кининами**) были обнаружены в лаборатории Ф. Скуга (США) уже более полвека назад [1]; однако только сейчас, в XXI веке, начали открываться основные закономерности их молекулярного действия. Первый искусственно полученный цитокинин (кинетин) проявил свою биологическую активность вначале в стерильной культуре тканей растений как вещество, стимулирующее деление клеток и рост каллусов. С учетом того, что предположение о существовании подобных регуляторов в растениях было выдвинуто Г. Хаберландтом (Германия) еще в начале ХХ в. [2, с. 125], цитокинины были быстро причислены к основным гормонам растений. Как мы сейчас понимаем, это было сделано несколько преждевременно, так как не были строго доказаны ни присутствие кинетин-подобных соединений в растении, ни их эндогенный биосинтез.
Первый природный цитокинин зеатин из зародышей кукурузы был выделен и описан Letham с соавт. (Австралия) [4, 5] лишь спустя почти десятилетие после получения Скугом с соавт. [1] синтетического цитокинина кинетина, а биосинтез цитокининов в растениях был доказан японскими исследователями лишь в 2001 г. [6, 7], т.е. уже в XXI в.

СТРУКТУРА ЦИТОКИНИНОВ

Структура главных природных цитокининов показана на рис. 1. Цитокинины представляют собой относительно простые производные аденина или аденозина, модифицированные по атому азота в 6-м положении шестичленного гетероцикла. У большинства цитокининов в этом положении к аденину присоединена короткая алифатическая цепь остатка изопентенила. Если эта цепь остается немодифицированной, цитокинины относят к группе изопентенильных (цитокинины iP-типа). Однако в растениях существуют ферменты, гидроксилирующие алифатическую цепь по концевому атому углерода [8]. Именно цитокинины с гидроксилированной алифатической цепью получили название зеатинов (цитокинины Z-типа). Возможны два основных типа стереоизомеров зеатинов: транс- и цис-зеатин. В молекуле транс-зеатина гидроксил направлен в сторону от аденинового гетероцикла; транс-зеатин считается наиболее распространенным и активным цитокинином в растениях. У цис-зеатина концевой гидроксил, наоборот, сближен с

------------------------------------------------
** Правильнее было бы переименовать "кинины" не в "цито-", а в "фитокинины", обозначая тем самым как их функцию, так и принадлежность к царству растений (предложено Köhler и Conrad в 1966 г. [3]).
адениновым ядром, причем возможно образование водородной связи между водородом ОН-группы и атомом азота в 1-м положении аденинового гетероцикла (рис. 1) [9]. Среди других природных цитокининов широко известны такие, как дигидрозеатин (DZ), у которого восстановлена двойная связь боковой цепи, БАП, а также тополин, обнаруженный первоначально в растениях тополя ароматический цитокинин, у которого вместо алифатической цепи присутствует остаток 3-гидроксибензила [10].
Цитокинины и их аналоги могут быть получены путем относительно несложного химического синтеза; поэтому известно множество разнообразных синтетических цитокининов с различной степенью активности. На практике чаще всего применяют сравнительно легко синтезируемые и устойчивые цитокинины, такие как кинетин, БАП и/или изопентениладенин.
Помимо цитокининов  производных аденина, цитокининовая активность была обнаружена у синтетических производных фенилмочевины [11]. Некоторые из производных фенилмочевины, такие, как N-фенил-N’-(1,2,3-тидиазол-5-ил)мочевина (тидиазурон) или N-фенил-N’-(2-хлоро-4-пиридил)мочевина (4PU-30), проявляли высокую физиологическую активность, сходную с таковой наиболее активных природных цитокининов [12, 13].

РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ЦИТОКИНИНОВ

Цитокинины распространены в биосфере повсеместно в буквальном смысле слова. Они обнаруживаются практически во всех живых организмах, в том числе в организме человека, а также в воде и почве. Биосинтез цитокининов происходит в высших растениях, мхах, водорослях, ряде бактерий и даже некоторых насекомых-паразитах растений. Из этих объектов цитокинины попадают в почву и различные водные резервуары. У животных также обнаруживаются небольшие количества цитокининов, хотя эти соединения вряд ли имеют там гормональные функции. Дело в том, что отдельные изоформы тРНК содержат изопентенилированные по N6 остатки аденина по соседству с антикодоном [14]. Эти модифицированные основания обычно представляют собой цис-зеатин или изопентениладенин, а также их метилтиопроизводные. При распаде тРНК цитокинины высвобождаются и в принципе могли бы влиять на метаболизм компетентных клеток. Однако у растений тРНК, по-видимому, не является основным и существенным источником цитокининов [15]. У цитокинин-продуцирующих бактерий также обнаружены ферменты прямого, не через тРНК, биосинтеза цитокининов. В отличие от свободных iP-цитокининов, которые гидроксилируются в растениях с образованием еще более активного транс-зеатина, iP в составе тРНК гидроксилируется, напротив, с образованием малоактивного цис-зеатина [14].
Содержание цитокининов во внутренних жидкостях (соках) растений обычно невелико, на уровне наномолей или десятка наномолей. Ксилемный сок содержит больше цитокининов Z-типа (обычно в форме рибозидов) и тем отличается от флоэмного сока, содержащего больше iP-цитокининов [16].

ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ЦИТОКИНИНОВ

Цитокинины обладают многообразным физиологическим действием на растения [1719], причем характер действия этих гормонов сильно зависит от их концентрации. Одним из важнейших эффектов цитокининов, благодаря которому эти фитогормоны и были обнаружены, является стимуляция деления клеток. Многие эффекты цитокининов на организменном уровне, например, формирование сосудистых тканей в корнях, обусловлены именно их способностью стимулировать деление определенной группы клеток-предшественников.
Рост растений вдоль продольной оси, обусловленный функционированием апикальных меристем побега и корня, находится под контролем цитокининов совместно с ауксинами [2, 20, 21]. При этом цитокинины в физиологических концентрациях стимулируют апикальную меристему и рост побега, но подавляют меристему и рост корня [22, 23]. Помимо деления, цитокинины способствуют также растяжению клеток, особенно в листьях и семядолях. Наряду с ауксинами, цитокинины в значительной степени формируют фенотип растения, стимулируя рост боковых побегов, но подавляя рост боковых корней. Вместе с ауксинами и гиббереллинами цитокинины формируют донорноакцепторные отношения в растении, усиливая аттрагирующую способность отдельных органов или их частей. В культуре растительных каллусов или тканей цитокинины вызывают формирование побегов. Цитокинины способствуют фотосинтезу, активируя формирование хлоропластов, часто даже в темноте. У многих растений цитокинины задерживают старение листьев, как отделенных, так и на интактных растениях. У растений, способных к симбиозу с азотфиксирующими бактериями, цитокинины и системы их рецепции необходимы для запуска процесса образования симбиотических клубеньков [24, 25]. Также у целого ряда растений цитокинины стимулируют прорастание семян и образование пигментов. У мхов типа Funaria обработка протонемы цитокининами индуцирует формирование почек, из которых образуется облиственный спорофит [26]. В высоких концентрациях цитокинины, наоборот, проявляют рост-ингибирующее и даже апоптическое действие [27, 28]; они могут подавлять рост корней, культур клеток и даже вызывать опадение листьев.
Установленные эффекты цитокининов послужили основой для создания ряда биотестов на эти фитогормоны [29].
Физиологическое действие цитокининов на клеточном уровне суммировано ниже.
• Стимуляция клеточного деления.
• Активация притока метаболитов (аттрагирующий эффект).
• Дифференциация пластид.
• Увеличение размера клеток.
• Биосинтез пигментов.
• Задержка апоптоза (в низких концентрациях).
• Индукция апоптоза (в высоких концентрациях).
• Формирование побегов в культуре каллусов.

ПРОИЗВОДСТВО И ПРИМЕНЕНИЕ ЦИТОКИНИНОВ

Производством и/или продажей цитокининов занимаются многие крупные фирмы. Среди них такие известные международные корпорации, как "Sigma", "Dushefa", "Fluka", "Calbiochem" и др. В Чешской Республике фирма "OlChemim" специализируется на производстве различных форм сверхчистых цитокининов. Цитокинины являются важнейшими гормональными компонентами культуральных сред для растений. Их широко применяют в работах с культурами тканей и клеток растений, при микроразмножении полезных растений, при получении трансгенных растений. Цитокинины и их аналоги используют для формирования крон саженцев, смещения пола овощных культур (огурцов) в женскую сторону, задержки старения срезанных цветов и овощей, прерывания покоя семян [30]. Апоптическое действие синтетических цитокининов (тидиазурон) нашло применение для дефолиация хлопчатника [31], что существенно облегчает сбор хлопка. Экспериментально доказана возможность использования цитокининов для повышения урожайности злаковых культур, в частности риса. Имеются положительные результаты испытаний цитокининов для повышения урожайности некоторых плодовых культур (яблонь). Доказано участие цитокининов в повышении устойчивости растений к различным абиотическим стрессам, в частности к засухе, что дает большие перспективы использования этих фитогормонов в указанном направлении.
В последние годы цитокинины стали использовать в составе кремов для кожи. Согласно приводимым фирмами данным, цитокинины при длительном применении улучшают структуру кожи и уменьшают признаки старения. Однако насколько серьезны и достоверны эти результаты, судить пока рано. Наряду с этим исследования последнего десятилетия показали четкое антипролиферативное действие ряда цитокининов и их аналогов на опухолевые клетки животных, что дало основания предложить эти соединения в качестве противораковых препаратов [3234]. Некоторые из цитокинин-подобных соединений уже используют в медицинской практике.

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ЦИТОКИНИНОВ

Гены, чувствительные к цитокинину

На протяжении многих десятилетий после открытия цитокининов оставалось неясным, что представляет собой внутриклеточная мишень их действия, влияют ли они напрямую на активность генов и если да, то каков механизм передачи цитокининового сигнала. Конечно, эти вопросы активно дебатировались в научных кругах, однако убедительные данные о существовании генов первичного ответа на цитокинин и цитокининовых рецепторов появились сравнительно недавно. В 1998 г. в лабораториях Дж. Кибера (США) и Т. Сугиямы (Япония) у арабидопсиса и кукурузы были обнаружены гены, напрямую активирующиеся цитокинином [35, 36]. Одним из первых обнаруженных цитокинин-чувствительных генов был ген так называемого регулятора ответа, получивший название ARR5 (от Arabidopsis Response Regulator 5). Транскрипция данного гена быстро активировалась цитокинином, причем ингибитор трансляции циклогексимид не препятствовал этой активации, т.е. для нее не требовалось биосинтеза какого-либо белка. Таким образом, ген ARR5 – это первичная мишень для цитокинина, что предполагает чувствительность промотора данного гена к цитокинину. Действительно, изолированный ARR5-промотор, соединенный с репортерным геном GUS, придавал последнему цитокинин-зависимый характер экспрессии [37].
Для количественного тестирования экспрессии индивидуальных генов нами была адаптирована модельная система на основе водной культуры проростков арабидопсиса [38]. В опытах был использован трансгенный арабидопсис, у которого промотор цитокинин-чувствительного гена ARR5 соединен с репортерным геном GUS [37]. Эта конструкция позволяет количественно следить за экспрессией промотора и определять локализацию этой экспрессии в тканях и органах растения. В отсутствие экзогенных цитокининов экспрессию ARR5-промотора наблюдали в основном в районах, известных как сайты активного биосинтеза цитокининов (рис. 2): в кончике корня (основная область), а также в районе апикальной меристемы стебля. Заметное окрашивание наблюдали также по ходу проводящих путей корня, что, очевидно, отражает путь ксилемного транспорта цитокининов из корня в стебель. Однако большая часть тканей проростка оставалась неокрашенной.
При воздействии экзогенного цитокинина происходила повсеместная активация репортерного гена, что хорошо заметно при гистохимическом GUS-окрашивании (рис. 2). Количественные данные о временной и дозовой зависимости активации GUS при действии цитокининов, а также о специфичности этой активации представлены на рис. 3. Эти данные показывают, что активация ARR5-промотора достигает максимума при концентрации БАП 5 мкМ (рис. 3а); активацию вызывают только цитокинины, но не аденин или другие фитогормоны и регуляторы роста (рис. 3б). Кинетика индукции активности GUS обнаружила наличие определенного лаг-периода (рис. 3в). В течение этого периода можно, очевидно, ожидать изменений на уровне транскрипции. Действительно, прямые измерения содержания мРНК гена ARR5 методом нозерн-блоттинга показали, что в ходе лаг-периода происходило быстрое накопление мРНК этого гена. В наших опытах максимум такого повышения приходился примерно на 45 мин после воздействия цитокинина; однако уже через 15 мин уровень индукции составлял примерно 80% от максимального (рис. 4а). Данные наших опытов в целом хорошо соответствуют результатам аналогичных исследований на проростках арабидопсиса, выращенных и обработанных гормоном в иных условиях [35, 37]. Все эти результаты позволили предположить, что и другие гены первичного ответа будут столь же быстро отвечать на воздействие цитокинина в данной модельной системе. Действительно, анализ изменений уровня транскриптов выявил и другие гены арабидопсиса со сходным изменением профиля экспрессии под действием цитокинина (рис. 4б, [37]). При сравнении содержания транскриптов собственного гена ARR5 и трансгена GUS под контролем ARR5-промотора оказалось, что цитокинин индуцировал их накопление в сходной степени (рис. 4в, [40]). Влияние других активных соединений на накопление этих транскриптов также было практически одинаковым. Так как транскрипты чужеродного гена GUS вряд ли подвержены каким-либо специфическим воздействиям в растительной клетке, это указывает на то, что содержание мРНК гена ARR5 регулируется цитокининами исключительно на уровне транскрипции (точнее, активации транскрипции). В противном случае какие-либо цитокинин-зависимые посттранскрипционные воздействия на транскрипты ARR5-гена изменили бы картину его индукции по сравнению с чужеродным геном GUS.
Базируясь на данных кинетики активации гена ARR5, мы предприняли попытку выявления максимально полного спектра генов первичного ответа на цитокинин [41]. С этой целью были использованы микрочипы ATH1 фирмы "Affymetrix" (США), в микроячейках которых закреплены уникальные олигонуклеотиды почти 24 тыс. генов арабидопсиса, представляющие практически весь геном этого растения [42]. Для идентификации так называемых "ранних" генов, т.е. генов первичного ответа, проростки арабидопсиса были обработаны цитокинином в оптимальной концентрации в течение 15 мин. Для выявления реагирующих на цитокинин "поздних" генов проростки выдерживали вместе с гормоном в течение 2 ч. Затем из обработанных цитокинином и контрольных проростков выделяли мРНК, которые служили матрицами для синтеза флуоресцентно-меченных кДНК, а далее с помощью микрочипов анализировали содержание последних, т.е. фактически относительное содержание индивидуальных транскриптов.
Из всего количества генов арабидопсиса заметную экспрессию проявили примерно 11.5 тыс. генов, т.е. около половины всех представленных на биочипе. Удалось обнаружить примерно 80 генов, уровень транскриптов которых менялся более чем в 1.8 раза уже за 15 мин воздействия цитокининов. Это число составляет менее 1% от общего количества активных генов. Среди этих генов порядка 70 активировались цитокинином, а 11 генов, наоборот, репрессировались этим фитогормоном. Столь малый процент генов первичного ответа на цитокинин характерен не только для арабидопсиса. Ранее методами Differential Display (DD) и Representational Difference Analysis (RDA) мы исследовали быстрые эффекты цитокининов на активность генома у табака. При этом доля чувствительных к цитокининам "ранних" генов у табака также составляла менее 1% от их общего количества [43, 44].
Что можно сказать о генах арабидопсиса, напрямую активируемых цитокинином? Среди них обнаруживается группа из 7 генов регуляторов ответа, близкородственных гену ARR5 (табл. 1). Эти гены оказывают влияние на функционирование двухкомпонентной системы трансдукции сигналов, о чем речь пойдет дальше. Значительная доля непосредственно регулируемых цитокинином генов относится к генам транскрипционных факторов и других регуляторных белков (табл. 1). Эти гены кодируют такие факторы транскрипции, как APETALA2 (AP2), фактор HAT22, включающий гомеодомен и "лейциновую молнию", bHLH фактор, имеющий мотив "спиральпетляспираль", Myb-транскрипционный фактор, фактор, обладающий типичным NAC-доменом, а также белок с "цинковыми пальцами". Это белковые факторы различной структуры; они способны специфически узнавать разные нуклеотидные последовательности, т.е. взаимодействовать с промоторами самых разных генов [45, c. 124132; 46, c. 1438]. Быстрая индукция активности различных транскрипционных факторов цитокинином создает условия для массового и координированного изменения экспрессии следующей волны (так называемых поздних) генов, прямо или косвенно контролируемых этими факторами.
Помимо генов факторов транскрипции, среди ранних цитокинин-зависимых генов оказались гены регуляторных белков, обладающих протеинкиназной или фосфатазной активностью (серин-треониновая протеинкиназа, CBL-взаимодействующая протеинкиназа 3, предположительно тирозин-фосфатаза) (табл. 1). Эти белки могут участвовать в модуляции активности транскрипционных факторов и/или белков-трансдукторов сигналов и тем самым также приводить к изменению интенсивности транскрипции большого числа генов. Еще одна группа генов первичного ответа относится к генам направленной деградации белков. Эта клеточная система сейчас вызывает особый интерес в связи механизмами гормональной регуляции у растений. Недавно было обнаружено, что молекулярный механизм действия ауксинов и гиббереллинов напрямую связан с процессом деградации белков – репрессоров транскрипции гормон-зависимых генов [4749]. Для цитокининов также имеются указания на участие субъединицы 26S протеасомы в действии этих гормонов на клетку [50]. В этой связи обнаруженные изменения в экспрессии сразу 4-х генов, участвующих в направленном протеолизе белков (Е2, убиквитин-конъюгирующий фермент 16; лектин-подобный белок F-бокса; АТФ-зависимая субъединица протеазы, и взаимодействующий с белком F-бокса SKP1) могут приводить к сдвигам в содержании транскрипционных факторов в ядре и, как следствие, к изменениям интенсивности транскрипции генов, управляемых данными факторами.
Таким образом, функциональный анализ генов первичного ответа на цитокинин показывает, что функция значительной части этих генов состоит в управлении генной экспрессией. Нами был проведен анализ характера экспрессии генов арабидопсиса в более отдаленный период воздействия гормона. Как оказалось, картина генной экспрессии "поздних" генов сильно отличалась от "ранних". Прямые измерения уровня экспрессии генов через 2 ч действия цитокинина обнаружили большое число новых генов, транскрипция которых менялась к этому времени под действием гормона. Таких "поздних" генов, отвечающих на цитокинин, оказалось более 1500, что примерно в 20 раз больше, чем генов первичного ответа. Интересно отметить, что, если среди "ранних" превалировали гены, активируемые цитокининами, то среди "поздних" большинство, наоборот, составляли гены, репрессируемые цитокининами. Это означает, что в целом на уровне транскрипции структурных генов двухчасовое воздействие цитокининов вызывало не столько активацию, сколько репрессию генома. Поэтому, хотя цитокинины принято относить к гормонам-стимуляторам, вызываемая ими активация отдельных значимых метаболических путей клетки вовсе не коррелирует напрямую со степенью активации транскрипции генома в целом: причинно-следственные связи здесь гораздо сложнее. Видимо, активация неких доминирующих метаболических процессов в клетке неизбежно требует подавления многих других, т.е. определенного уменьшения метаболического разнообразия в целом.
Ранее уже выдвигалось предположение о том, что фитогормоны и, в частности, цитокинины, вызывают изменения активности генома по принципу транскрипционных каскадов [51], когда небольшое количество быстро активируемых генов, кодирующих транскрипционные факторы и/или их модуляторы, приводит в дальнейшем к изменению экспрессии большого набора генов, участвующих в реализации глобальных физиологических программ. Полученные в наших и аналогичных исследованиях данные хорошо согласуются с этим предположением. В частности, в работе [52], где были использованы микрочипы, содержащие ДНК-реплики большого (хотя далеко не полного) набора генов арабидопсиса (~ 8300 генов), обнаружено всего несколько десятков генов, транскрипция которых устойчиво менялась (увеличивалась или снижалась) под действием цитокинина. Значительная часть быстро активируемых генов продолжала реагировать на цитокинин даже в присутствии циклогексимида (блокирующего биосинтез белка). Это позволило авторам отнести эти "ранние" гены к генам первичного ответа на данный фитогормон. Среди них также были обнаружены многие гены, кодирующие белки-регуляторы транскрипции, в том числе относящиеся к классу АР2-транскрипционных факторов. В дальнейших исследованиях этой лаборатории [53] было установлено, что цитокинин стимулирует не только активацию генов AP2-факторов транскрипции, но и быстрое перемещение отдельных транскрипционных факторов в клеточное ядро.

Рецепторы цитокининов, мутанты по рецепторам

Как же цитокининовый сигнал доходит до первичных внутриклеточных мишеней, т.е. генов раннего ответа? В 1996 г. японский ученый Т. Какимото впервые высказал предположение о том, что рецептором цитокинина может быть сенсорная гистидинкиназа [54], а в 2001 г. он же, а также независимо Т. Мицуно с сотрудниками доказали, что сенсорная гистидинкиназа арабидопсиса CRE1/AHK4 является рецептором цитокининов [55, 56]. В настоящее время считается общепринятым, что арабидопсис содержит 3 близких по строению сенсорных гистидинкиназы – рецепторов цитокининов: CRE1/AHK4, AHK3 и AHK2. Сходные по структуре рецепторы цитокининов были обнаружены у эволюционно далеких от арабидопсиса видов: кукурузы и риса [5759]. Растения арабидопсиса, у которых были инактивированы все три рецептора цитокининов, теряли чувствительность к этому гормону, а гены первичного ответа переставали отзываться на цитокинины [6062]. Такие тройные мутанты представляли собой крохотные растеньица, маложизнеспособные и в основном стерильные. Интересно отметить, что у двойных и особенно тройных мутантов по рецепторам наблюдали резкий подъем эндогенной концентрации цитокининов Z-типа. Однако при этом никаких характерных признаков действия избытка цитокининов не наблюдали [62], что свидетельствует в пользу отсутствия каких-либо иных, чем три сенсорные гистидинкиназы, рецепторов цитокининов у арабидопсиса.
Структура рецептора цитокининов CRE1/AHK4 показана на рис. 5. Эта сенсорная гистидинкиназа состоит из нескольких доменов. На 5’-конце белка расположена пара гидрофобных сегментов, определяющих трансмембранную локализацию рецептора. Исходно полагали, что рецепторы цитокининов локализованы на плазмалемме клетки. В этом случае участок полипептидной цепи, располагающийся между гидрофобными сегментами, должен находиться снаружи от плазмалеммы, т.е. вне клетки. Этот участок гомологичен лиганд-связывающим доменам многих других рецепторных белков прокариот, одноклеточных эукариот и растений и получил общее название CHASE (от Cyclase/Histidine kinase-Associated Sensing Extracellular) [63, 64]. Как будет показано далее, именно CHASE-домен отвечает за узнавание и связывание цитокининов. Центральная часть белка, находящаяся внутри клетки, включает несколько доменов, один из которых представляет собой домен с активностью гистидинкиназы. На краю этого домена расположен остаток так называемого консервативного гистидина (т.е. гистидина в составе консервативной последовательности  ATVSHEIRTP-), способный акцептировать фосфат от АТФ. В С-концевой области белка располагается типичный воспринимающий домен, где имеется остаток консервативного аспартата, способный акцептировать фосфат с фосфогистидина. Согласно современным представлениям, при взаимодействии цитокининового рецептора с соответствующим гормоном происходит димеризация рецепторов и активация их гистидинкиназной активности, в результате чего вначале фосфорилируется остаток консервативного гистидина внутри гистидинкиназного домена, а затем этот высокоэнергетический фосфат перебрасывается на остаток консервативного аспартата в С-концевой части белка (рис. 5). Таким образом, в ходе рецепции гормона события внутри белка развертываются, начиная с его N-конца и далее в направлении С-конца: связывание гормона на N-конце, далее фосфорилирование белка в его срединной части, и затем переброска фосфата ближе к C-концу. Цитокининовые рецепторы арабидопсиса АНК2 и АНК3 близки по общей структуре к рецептору CRE1/AHK4 (идентичны по аминокислотным последовательностям на 5254%), но, видимо, отличаются числом трансмембранных сегментов, соседствующих с CHASE-доменом (см. ниже).
Для более детального изучения свойств рецепторов цитокининов мы взяли за основу модельную систему на основе трансгенных бактерий, экспрессирующих индивидуальные рецепторы цитокининов [56, 65, 66]. У этих бактерий (Escherichia coli) отсутствовала одна из собственных гистидинкиназ (RcsC), близкая по структуре к гистидинкиназам арабидопсиса – рецепторам цитокининов. Данная бактериальная гистидинкиназа RcsC в норме передает сигнал на промотор cps-оперона бактерии. Оказалось, что экспрессированная в бактерии сенсорная гистидинкиназа арабидопсиса CRE1/AHK4 может замещать отсутствующую бактериальную гистидинкиназу RcsC и передавать свой сигнал на cps-оперон с использованием бактериальной системы трансдукции сигнала. Однако важно отметить, что передача сигнала от CRE1/AHK4 происходила только при воздействии активных цитокининов [56, 65, 66]. Это показывает, что растительный рецептор в бактериях находится в функционально-активном состоянии и способен узнавать цитокинины. Для удобства наблюдения за активностью рецептора цитокининов бактерию снабдили также встроенным репортерным геном lacZ (галактозидазы) под контролем того же cps-промотора [56] (рис. 6). Таким образом, простое тестирование репортерной активности галактозидазы позволяло оценить степень функциональной активности цитокининового рецептора в бактериях. На основе измерения активности lacZ мы сопоставили эффективность большого количества цитокининов и структурно сходных лигандов при их воздействии на бактерии, экспрессирующих 2 различных рецептора цитокининов: AHK3 или CRE1/AHK4 [66]. Оказалось, что при общем сходстве относительных активностей различных цитокининов наблюдались и определенные различия между рецепторами по степени ответа на те или иные лиганды. Это, в частности, относится к таким соединениям, как дигидрозеатин, цис-зеатин, рибозидам и некоторым другим. Эти результаты позволили предположить наличие определенных различий лигандной специфичности между близкородственными рецепторами цитокининов из одного вида растений [66].
Этап специфического гормонрецепторного взаимодействия является ключевым при восприятии гормонального сигнала и его передаче внутрь клетки. Поэтому столь важным является знание характеристик этого взаимодействия [67]. Для более точного анализа лигандной специфичности рецепторов цитокининов, а также их основных свойств была использована способность рецепторов специфически связывать соответствующие лиганды, в данном случае цитокинины. Эти исследования мы проводили на тех же бактериальных штаммах, экспрессирующих индивидуальные цитокининовые рецепторы арабидопсиса. Экспрессируемые рецепторы были функционально активны и при этом присутствовали в концентрации, достаточной для количественного измерения их гормон-связывающей способности. Так как бактерии E. coli не имеют собственных систем специфического связывания и метаболизма цитокининов, искажающее влияние побочных процессов на получаемые данные было маловероятным.
Результаты с применением высокомеченого 3Н-транс-зеатина показали, что живые трансгенные бактерии действительно были способны специфически связывать цитокинины, однако только те клоны, которые экспрессировали гены растительных рецепторов цитокининов (рис. 7а) [68, 69]. О специфическом связывании меченого зеатина свидетельствовала существенная и достоверная разница между тотальным и неспецифическим связыванием, которая количественно зависела от типа рецептора и использованного клона, но полностью отсутствовала у контрольных клонов, экспрессирующих "пустой" вектор. Связывание цитокининов исключительно специфично: наряду с цитокининами был протестирован ряд других фитогормонов, но только цитокинины взаимодействовали с данными рецепторами (рис. 7б). Были проанализированы некоторые важные физико-химические характеристики связывания цитокининов, в том числе зависимость связывания цитокининов от величины рН (рис. 8а). Было установлено, что рецепторы CRE1/AHK4 и AHK3 различались по чувствительности к рН: связывающая способность CRE1/AHK4 была довольно стабильной в изученном диапазоне рН, тогда как связывающая способность АНК3 резко падала при снижении рН от 7 до 5. Эти рецепторы различались также по чувствительности к ионной силе. При воздействии солей моновалентных катионов (Na+ или K+) у АНК3 наблюдали подъем связывания на 2050% с максимумом при концентрации соли в интервале 100200 мМ. У CRE1/AHK4 рецептора, напротив, при повышении концентрации солей происходил монотонный спад связывающей активности. Хотя эти данные были получены на гетерологичной бактериальной системе, они, тем не менее, показали различия конкретных физико-химических свойств между этими близкородственными рецепторами цитокининов. Интересно, что двухвалентные катионы (Ca2+, Mg2+, Mn2+) в диапазоне физиологических концентраций практически не влияли на интенсивность связывания гормонов обоими рецепторами.
Связывание цитокининов рецепторами оказалось по большей части легко обратимым. Если добавить немеченый зеатин после формирования комплексов рецепторов с меченым зеатином, то происходит быстрое вытеснение метки из состава комплекса немеченым гормоном. При этом и здесь проявились различия между рецепторами. Вытеснение меченого гормона немеченым проходило гораздо полнее в случае рецептора CRE1/AHK4, чем АНК3. Величину сродства рецепторов к зеатину определяли при добавлении к ним разных доз меченого или немеченого гормона (рис. 8б) [6769]. В координатах Скетчарда были получены линейные зависимости, что указывает на присутствие однотипных сайтов связывания гормона без признаков кооперативности этого связывания. Рассчитанные константы диссоциации (KD) для зеатина составили 12 нМ для AHK3 и 24 нМ для CRE1/AHK4, что характерно для высокоаффинных гормонрецепторных взаимодействий. Более того, величины констант хорошо соответствуют данным о концентрациях цитокининов in planta. Недавние прямые измерения разных лабораторий [62, 70] у арабидопсиса дикого типа дали значения для эндогенных концентраций транс-зеатина и изопентениладенина в диапазоне 0.72.5 нМ, что близко к величинам измеренных KD.
Лигандную специфичность взаимодействия мы исследовали, исходя из способности цитокининов и их аналогов конкурировать с меченым зеатином за связывание с рецептором [68, 69], для чего был применен классический радиолигандный метод (рис. 9) [67]. Оказалось, что оба рецептора обладали наиболее высоким сродством к транс-зеатину (рис. 9а). Все модификации транс-зеатина, даже минорные, существенно снижали его способность связываться с рецепторами. Удаление у зеатина алифатической боковой цепи с образованием аденина практически лишало последний способности взаимодействовать с рецепторами. То же самое происходило при присоединении к этой боковой цепи остатка глюкозы (реакции глюкозилирования). Изомеризация ОН-группы цепи из транс- в цис-положение резко снижала связывание молекулы с рецепторами, хотя это связывание сохранялось на вполне достоверном уровне. К удивлению, БАП, аденин с ароматическим боковым радикалом, традиционно считающийся одним из самых эффективных цитокининов, показал весьма умеренную связывающую активность. Третий (минорный) рецептор АНК2 среди спектра испытанных цитокининов также отдавал предпочтение зеатину.
Наиболее значимыми представляются наши результаты по установлению различий лигандной специфичности связывания между рецепторами AHK3 и CRE1/AHK4 [69]. Цитокинины iP-типа, изопентениладенин и его рибозид, связывались с относительно высоким сродством с рецептором CRE1/AHK4, но сравнительно слабо – с рецептором АНК3. С другой стороны, DZ, продукт гидрирования двойной связи бокового радикала, гораздо сильнее взаимодействовал с АНК3 по сравнению с CRE1/AHK4. Опыт по тестированию активности этих соединений в широком диапазоне концентраций наглядно демонстрирует различия лигандной специфичности связывания между рецепторами (рис. 9б). Относительное расположение кривых вытеснения метки для лигандов IP и DZ у рецепторов АНК3 и CRE1/AHK4 взаимно инвертировано. На основе полученных конкурентных кривых были построены ряды сродства лиганд-белковых взаимодействий для каждого из изученных рецепторов (рис. 9в). Важно отметить, что эти ряды сродства оказались сходны с рядами активности, определенными в функциональном тесте по активации промотора теми же цитокининами. Полученные радиолигандным методом ряды сродства хорошо коррелируют и с ранее установленной в многочисленных биотестах физиологической активностью этих фитогормонов. Наши последние результаты указывают на высокую консервативность лигандной специфичности связывания, которая качественно не меняется даже у рецепторов с мутациями в CHASE-домене [71]. Все это говорит о том, что полученные радиолигандным методом на бактериальной системе данные о лигандной специфичности рецепторов отражают их реальные функциональные свойства в растительной клетке.
На основе полученных кривых вытеснения нам удалось рассчитать константы сродства различных цитокининов к рецепторам (табл. 2). Очевидно, что эти константы расположены в широком диапазоне значений и могут различаться для разных соединений более чем в 1000 раз. В случае некоторых молекул, например IP или DZ, наблюдались существенные различия между рецепторами по сродству к ним, эти различия достигали порядка величин.
Эти различия, естественно, зависят от особенностей строения центра связывания фитогормона на молекуле рецепторного белка. Пока еще мы не можем точно описать сайты связывания цитокининов в рецепторах. Хотя факт, что именно CHASE-домен формирует связывающий цитокинин сайт, установлен вполне надежно. К настоящему времени известно несколько мутаций рецепторов, снижающих или подавляющих специфическое связывание цитокининов. Все эти мутации, как оказалось, расположены внутри CHASE-домена (рис. 10) [72]. Если от цитокининового рецептора (в данном случае CRE1/AHK4) полностью "отрезать" всю его "цитоплазматическую" часть и экспрессировать оставшийся N-концевой фрагмент белка с CHASE-доменом в E. coli, то связывание гормона этим фрагментом сохраняется, причем на уровне, близком к уровню интактного рецептора. Напротив, отделенный С-концевой фрагмент белка практически лишен связывающей способности. Все это однозначно указывает на CHASE-домен как на гормон-связывающий участок белка. Окончательная структура связывающего сайта будет определена, по всей видимости, после кристаллизации рецепторного белка или его CHASE-содержащего фрагмента.
Сейчас мы можем строить только более или менее правдоподобные предположения о том, как именно меняется структура рецептора после связывания цитокинина. Как показано выше, сам факт высокоаффинного связывания гормона рецептором установлен вполне надежно. Таким образом, наиболее простая гипотеза действия цитокинина на рецептор состоит в том, что при образовании комплекса цитокинина с сайтом связывания, как при всяком высокоаффинном взаимодействии, увеличивается свободная энергия комплекса, которая затрачивается на изменение структуры рецепторного белка, возможно, с ликвидацией каких-либо стерических препятствий для его димеризации. Далее, как уже отмечалось выше, наиболее вероятна димеризация гормонрецепторных комплексов, причем каждый белок в составе димера может использовать другой белок (точнее – его конкретный "консервативный" гистидин) как субстрат своего гистидинкиназного домена. Затем фосфорилированный гистидин передает свой активированный фосфат на остаток аспартата на С-конце белка. Этот "активированный" фосфат и является той специфической сигнальной "меткой", служащей для передачи цитокининового сигнала внутри клетки. Но как этот "горячий" фосфат доходит до ядра и способствует там активации специфических генов первичного ответа?

Трансдукция и аттенюация цитокининового сигнала

По своей структуре сенсорные гистидинкиназы – рецепторы цитокининов – относятся к белкам так называемой двухкомпонентной системы передачи сигналов (см. рис. 5). Такие системы трансдукции сигналов основательно изучены у бактерий, где они широко представлены [73]. В своем классическом виде двухкомпонентная система состоит из сенсорной гистидинкиназы (рецептор) и регулятора ответа (транскрипционный фактор). Под влиянием специфического сигнала рецептор димеризуется, фосфорилируется и далее передает свой "горячий" фосфат на остаток аспартата регулятора ответа. Последний обладает ДНК-связывающим доменом, связывается в результате активации с определенной последовательностью ДНК в составе промотора и активирует или, наоборот, репрессирует соответствующий ген или оперон. У арабидопсиса и других растений также обнаружены факторы транскрипции со структурой, гомологичной регуляторам ответа бактерий (рис. 11) [58, 59, 7476].
Однако эти факторы, как и другие белки хроматина, локализуются в ядрах клеток, а сенсорные гистидинкиназы, согласно последним данным, встроены в клеточные мембраны: как в плазмалемму, так и во внутренние мембраны клеток [71, 77]. Поэтому для того, чтобы активированный фосфат достиг своей конечной цели, а именно факторов транскрипции двухкомпонентной системы (у арабидопсиса эти факторы называются ARR-B), он должен быть перенесен от той или иной мембраны в ядро с помощью какого-либо переносчика. У арабидопсиса идентифицировано 5 таких белков-переносчиков, получивших название фосфотрансмиттеры (рис. 11а). Эти белки принимают активированный фосфат от остатка аспартата рецептора на остаток консервативного гистидина в своей структуре, далее перемещаются в ядро и там отдают этот фосфат регуляторам ответа типа В. ARR-B имеют в своем составе так называемый GARP домен, способный к сайт-специфичному связыванию с ДНК. В результате фосфорилирования ARR-B обретают возможность связываться с ДНК и взаимодействуют со специфическими участками ДНК в составе промоторов генов (рис. 11б). Как полагают, эти консенсусные участки включают короткие АТ-богатые последовательности [52, 74, 78, 79]. Недавно установлено, что консенсусная последовательность для транскрипционного фактора ARR1 представляет собой палиндром или псевдопалиндром типа AAGATC/TTT [80]. Такая структура узнаваемого сайта предполагает взаимодействие с ДНК димерных форм ARR-B.
В результате фосфорилирования ARR-B-транскрипционных факторов несколько десятков генов, в промоторах которых присутствуют узнаваемые факторами нуклеотидные последовательности, активируются или репрессируются уже через несколько минут после воздействия цитокинином. Это и есть как раз те самые ранние гены, или гены первичного ответа, о которых шла речь выше.
Такой на сегодняшний день представляется ставшая уже "канонической" схема внутриклеточной передачи цитокининового сигнала (рис. 11). При этом цитокинины мало влияют на транскрипцию генов самой двухкомпонентной системы, непосредственно участвующих в проведении цитокининового сигнала [41, 52]. Некоторое положительное влияние отмечалось лишь для гистидинкиназы CRE1/AHK4. По всей видимости, базовая двухкомпонентная система стабильно присутствует и готова функционировать вне зависимости от того, какова концентрация цитокининов в клетке и ткани. Однако имеется один тип регуляторов ответа, также имеющих отношение к двухкомпонентной системе, на которые цитокинины оказывают большое влияние. Это регуляторы ответа типа А (ARR-A), во многом гомологичные регуляторам ответа типа В, но отличающиеся от последних отсутствием ДНК-связывающего домена [58, 59, 7476]. Очевидно, что регуляторы ответа типа А не являются непосредственными факторами транскрипции. Зато ARR-A обладают функциональным ресиверным доменом, способным воспринимать активированный фосфат с фосфотрансмиттеров аналогично ARR-B. Это и предопределяет роль ARR-A как негативных регуляторов действия цитокининов: с началом активного синтеза этих регуляторов ответа они, как предполагается, перехватывают на себя значительную часть активированных фосфатов, направляемых в ядро, и уровень цитокинин-индуцированной транскрипции снижается. Это объясняет своеобразный характер кинетики индукции транскрипции промотора типичного гена раннего ответа ARR5, в частности, следующий за резким подъемом быстрый спад количества транскриптов, что было показано нами (рис. 4) [41] и другими авторами [35, 37] в прямых экспериментах.
Однако только ли двухкомпонентная система бактериального типа участвует во внутриклеточной передаче цитокининового сигнала? Мы провели фармакологический анализ влияния различных ингибиторов и активаторов конкретных сигнальных путей эукариотического типа на модельных системах проростков амаранта [81] и ARR5::GUS арабидопсиса [38]. Среди большого количества соединений было проанализировано действие ингибиторов протеинфосфатаз и протеинкиназ, ингибиторов фосфолипаз D и C, доноров оксида азота и ингибиторов его синтазы, антагонистов кальция и кальмодулина, активаторов G-белков и многих других. Список ряда ингибиторов, проявивших или не проявивших свою действенность на модели трансгенного арабидопсиса, приведен в табл. 3. Оказалось, что первичные спирты обладали способностью подавлять действие цитокинина, тогда как близкие по свойствам вторичные спирты в этих условиях были неактивны. Известно, что свойством специфически взаимодействовать с первичными, но не со вторичными спиртами обладают фосфолипазы группы D (ФлD) [8284]. В результате взаимодействия с первичными спиртами ФлD перестает производить основной продукт катализируемой реакции – фосфатидные кислоты, а вместо этого образует фосфатидилспирты (рис. 12). Фосфатидные кислоты являются посредниками при трансдукции многих сигналов, в том числе гормональных [85, 86]. Поэтому специфическое подавление того или иного процесса жизнедеятельности первичными, но не вторичными спиртами часто служит указанием на то, что в данном процессе участвуют ФлD.
Мы провели специальное исследование возможности участия ФлD в трансдукции цитокининового сигнала. Первичные спирты (этанол, пропан-1-ол, бутан-1-ол) обладали селективной способностью в низких концентрациях (начиная с 0.10.2%) подавлять действие цитокинина. Бутан-1-ол проявил более высокую активность по сравнению со спиртами меньшего молекулярного веса (рис. 13а), что находится в согласии со свойствами типичных ФлD [87]. На модельной системе проростков амаранта с помощью кинетико-ингибиторного анализа было показано раннее действие первичных спиртов (бутан-1-ола), происходящее до начала активации транскрипции [81]. На модельной системе проростков арабидопсиса было показано подавление аккумуляции цитокинин-зависимых транскриптов в присутствии бутан-1-ола (рис. 13б, 13в) [38, 87]. Эти данные находятся в согласии с предположением о действии ФлD на стадии трансдукции цитокининового сигнала, т.е. в период до начала подъема транскрипции. Установлено также, что не только первичные спирты, но и другие ингибиторы ФлD подавляют действие цитокининов. В наших опытах известный ингибитор ФлD, LPE [88], снижал степень индукции ARR5::GUS трансгена практически до уровня контроля [89]. В других опытах на проростках амаранта, проведенных в совместном исследовании с лабораторией В.С. Кравца в рамках проекта ИНТАС, были получены прямые данные об активации ФлD в ранний период действия цитокининов, причем эта активация проявлялась уже через 10 мин после добавления фитогормона к проросткам [90, 91]. Предполагается, что чувствительная к цитокинину ФлD является зависимой от фосфатидилинозит-4,5-дифосфата (PIP2). При этом бутан-1-ол в физиологически эффективных концентрациях никакого специфического эффекта на собственно гормонрецепторное взаимодействие не оказывал [69]. Все эти и другие результаты служат важными аргументами в пользу участия ФлD именно в процессе внутриклеточной трансдукции цитокининового сигнала.
Пока еще мы не в состоянии точно обозначить конкретные место и роль ФлD в трансдукции сигнала цитокинина, для этого нужны дальнейшие исследования. Фосфатидная кислота, продукт ФлD, может прямо взаимодействовать с различными белками и влиять на их биологическую активность [92]. С другой стороны, фосфатидные кислоты способны вызывать перераспределение отдельных белков между различными клеточными компартментами, в частности, "заякоривая" белки на мембранах [93]. Такое перераспределение может облегчать или, наоборот, затруднять белокбелковые взаимодействия, участвующие в трансдукции сигналов. Таким способом фосфатидные кислоты могут регулировать, в том числе, активность каскадов фосфорилирования белков [94]. Кроме того, активность ФлD может быть необходимой для структурных перестроек самих рецепторов в мембране после их взаимодействия с гормоном.
В отношении других эффективных ингибиторов, таких, как хелаторы кальция (ЭДТА, BAPTA), полиамины (спермин) или ингибиторы NO-синтазы (L-NMMA), дополнительные исследования не подтвердили их участия на стадии трансдукции цитокининового сигнала [38, 40, 81, 95, 96], что указывает на возможность их относительно неспецифического ингибирующего действия на более поздних стадиях генного ответа. Мастопаран, пептидный активатор гетеротримерных G-белков, в широком диапазоне концентраций не воспроизводил эффекта цитокининов, что свидетельствует против участия G-белок-зависимых трансмембранных рецепторов в сигналинге цитокининов. В целом полученные данные позволяют рассматривать процесс трансдукции цитокининового сигнала как достаточно сложный, в котором участвуют не только элементы двухкомпонентной системы бактериального типа, но и компоненты систем эукариотического типа, в том числе связанные с активностью ФлD.

НЕКОТОРЫЕ СЛЕДСТВИЯ "МОЛЕКУЛЯРНЫХ" ОТКРЫТИЙ

Путь от сигнала до эффекта

Достижения последних лет позволяют лучше представить молекулярные механизмы, благодаря которым цитокинины реализуют свое физиологическое действие в растении. На примере модельного растения арабидопсис установлено, что магистральным путем восприятия цитокининового сигнала клеткой является путь с участием мембранных гистидинкиназ как рецепторов и двухкомпонентной системы для трансдукции сигналов на ограниченный спектр генов первичного ответа. Реакция этих генов на цитокинин определяется их промоторами и происходит на уровне инициации транскрипции. Этот процесс реализуется быстро, в течение минут, а интенсивность всплеска генного ответа ограничена механизмами обратной связи. При этом рецепторы могут реагировать не только на внеклеточные цитокинины в апопласте, но и, по всей видимости, на внутриклеточные гормоны в симпласте или эндопласте, так как значительная доля рецепторов обнаруживается внутри клеток. Многие гены первичного ответа на цитокинин кодируют регуляторные белки, которые вызывают вторичные глобальные изменения экспрессии генома по каскадному принципу. В этом случае возможны разные уровни регуляции. Например, известны случаи регуляции экспрессии генов цитокининами не только на уровне их транскрипции, но и на уровне стабильности мРНК [97]. Возможно также прямое влияние цитокининов на синтез белка на рибосомах [14, 98, 99] и даже посттрансляционную стабильность белка [100, 101]. У арабидопсиса цитокинины положительно влияют на экспрессию генов (AtSAHH1, AtADK1), контролирующих уровень глобального метилирования генома [102], которое, в свою очередь, во многом управляет экспрессией генов [103]. Не исключены и другие уровни действия цитокининов; однако пока они мало изучены.
Результатом передачи цитокининового сигнала являются такие изменения экспрессии генов, которые ведут к тем или иным типичным физиологическим эффектам. Пока лишь для немногих быстрых эффектов, регулируемых цитокининами, выяснены лежащие в их основе молекулярные процессы. Например, для стимуляции синтеза пигментов под действием цитокининов достаточно активации лишь небольшого числа генов. У арабидопсиса, в частности, усиливается координированная экспрессия четырех генов биосинтеза антоцианов, причем экспрессия двух генов регулируется транскрипционно, а двух других – посттранскрипционно [104].
При индукции клеточных делений требуется уже гораздо большее число молекулярных участников. У арабидопсиса в переключении G1- и G2-фаз клеточного цикла участвуют не менее 50 разных белков, среди которых идентифицировано 30 циклинов, 11 циклин-зависимых протеинкиназ и еще ряд ингибиторов этих киназ [105, 106]. В зависимости от типа клеток, цитокинины действуют по-разному: в культуре клеток, как правило, они стимулируют клеточные деления, тогда как при инициации боковых корней наоборот, блокируют деление клеток перицикла [107]. Имеются данные о том, что цитокинины могут стимулировать биосинтез отдельных циклинов и влиять на уровень фосфорилирования белков клеточного цикла; однако эти процессы еще недостаточно изучены. В сверхвысоких дозах цитокинины вызывают апоптоз клеток не только растений [27, 28], но и животных [33, 34]. Будущие исследования транскриптомов и протеомов отдельных органов, тканей и клеток помогут проследить цепочки изменений активности ключевых генов и белков, приводящих в конечном итоге к реализации физиологических программ данного фитогормона.

Участие цитокининов в дальнедистанционной коммуникации

Исполнение цитокининами гормональной роли подразумевает их биосинтез в одной части растения, а далее транспорт и сигнальное воздействие на другую часть. Однако ситуация осложняется наличием множественных мест биосинтеза цитокининов и их присутствием в обоих транспортных каналах растения, т.е. в ксилеме и флоэме [16]. Между тем цитокинины уже давно и не без оснований рассматривают как основные гормоны корня, которые передают информацию побегам (листьям) о степени его благополучия и о наличии важных питательных элементов (соединений азота) [2, 15, 20]. Как же клетки побега (листа) отличают пришедшие издалека цитокинины корня от цитокининов, образуемых в самом побеге и передвигающихся по флоэме?
Здесь следует вспомнить об особенностях общей организации цитокининовой сигнальной системы у растений. В отличие от многих других фитогормонов (ауксин, этилен, АБК), цитокинины представлены большим числом изоформ, с возможностью определенных взаимопревращений. Спектры этих изоформ в ксилеме и флоэме сильно различаются [16, 108]. Ксилемные цитокинины представлены, главным образом, цитокининами зеатинового типа (Z-тип), с превалированием транс-зеатинрибозида. Зеатиновые цитокинины образуются в основном в кончике корня, где экспрессируются ферменты CYP735A, добавляющие к боковой цепи изопентенильных цитокининов гидроксил в транс-положении [7]. Флоэмные же цитокинины гидроксилированы в меньшей степени и представлены в основном соединениями изопентенильного ряда (iP-тип), главным образом, изопентениладенинрибозидом. Содержание транс-зеатина во флоэме очень невелико. В ксилеме, и особенно во флоэме, достаточно высоко содержание также цис-зеатинрибозида; однако с учетом его низкой биологической активности вклад цис-зеатина в общую цитокининовую активность арабидопсиса вряд ли существенен.
С другой стороны, восприятие разных изоформ цитокининов клеткой зависит от того, какие именно рецепторы в ней представлены. Как обсуждалось выше, основные рецепторы цитокининов арабидопсиса, AHK3 и CRE1/AHK4, имеют сходное и высокое сродство к транс-зеатину и его рибозиду, но сильно различаются по сродству к изопентенильным формам цитокининов [69]. Рецептор CRE1/AHK4, экспрессирующийся большей частью в корне и определяющий эффекты цитокининов в подземных органах (табл. 4), имеет высокое сродство к изопентениладенину, близкое к сродству к транс-зеатину (табл. 2). Следовательно, этот рецептор чувствителен как к зеатиновым цитокининам корня, так и к изопентенильным цитокининам, которые могут доходить до корня из побега по флоэме. Рецептор AHK3, экспрессирующийся большей частью в побеге (мезофилле листа) и определяющий эффекты цитокининов в надземных органах (табл. 4), имеет низкое сродство к изопентенильным цитокининам флоэмы (табл. 2) и, следовательно, "настроен" на зеатиновые цитокинины, поступающие в побег из корня в результате дальнего транспорта по ксилеме (см. схему на рис. 14). Значит, в этом случае осуществляется дальнедистанционное действие цитокининов. Таким образом, функциональная гетерогенность рецепторов цитокининов может иметь прямое отношение к их роли в межорганной коммуникации и координировать жизнедеятельность растения как функционально целостного организма.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИГНАЛЬНЫХ СИСТЕМ

Цитокининовая система регуляции существует в растении не изолированно, а в постоянном контакте с другими регуляторными системами, в первую очередь гормональными. Давно известно о тесном взаимодействии цитокининов и ауксинов, как агонистическом, так и антагонистическом, что зависит от типа процесса, управляемого этими фитогормонами. Цитокинины и ауксины создают свойственный именно растениям противоточный регуляторный контур, во многом определяющий скорость биполярного пролиферативного роста и общую архитектонику побега и корневой системы [2, 20, 21, 108, 109]. Молекулярные основы взаимодействия цитокининовой и ауксиновой сигнальных систем, особенно в ходе регуляции пролиферативной активности клеток, сейчас интенсивно исследуются [105, 111].
Также давно известно об антагонистических взаимоотношениях цитокининов и АБК в таких процессах, как функционирование устьиц, прорастание семян, формирование хлоропластов [112]. В ходе онтогенеза цитокинин часто оппонирует и этилену, активирующему генетическую программу старения у растений [113, 114], хотя в определенных условиях может и сам увеличивать продукцию этилена [100]. Гораздо меньше известно о взаимоотношениях цитокининов с другими фитогормонами, в частности, с гиббереллинами, хотя имеются сообщения об их противоположном влиянии на некоторые биохимические и физиологические процессы [81, 115117]. Полученные нами данные по влиянию цитокининов на транскриптом у арабидопсиса [41] позволили отчасти прояснить процессы взаимодействия цитокининов с другими фитогормонами на генном уровне. Так, цитокинин повышал уровень транскриптов этиленовых рецепторов ETR2 и ERS2, а также ключевого транскрипционного фактора этилен-зависимых генов EIN3. Это указывает на возможность усиления чувствительности клеток к этилену под влиянием цитокинина. В отношении гиббереллинов цитокинины, наоборот, служили негативными регуляторами. Цитокинины подавляли экспрессию генов биосинтеза активных гиббереллинов: GA20 оксидазы и 3ß-гидроксилазы (GA4). Вдобавок цитокинины усиливали экспрессию генов GAI и RGA, продукты которых подавляют гиббереллиновый сигналинг [41].
Цитокинины нередко имитируют эффекты света [1719], хотя описаны случаи антагонистического влияния цитокининов и фитохрома В, в частности, при клубнеобразовании у картофеля [118, 119].
Исследование лиганд-связывающих свойств цитокининовых рецепторов [68, 69] показало новые возможности взаимодействия сигнальных систем на уровне рецепции гормонального сигнала. В частности, высокая чувствительность цитокинин-связывающей способности рецептора АНК3 к рН [69] предполагает возможность регуляции активности этого рецептора за счет локальных изменений кислотности среды. Например, вызываемое ауксином закисление апопласта может изменить восприимчивость к цитокининам рецептора АНК3, расположенного на плазмалемме, и тем самым повлиять на эффективность сигналинга цитокининов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Цитокинины, классические фитогормоны, представляют собой важнейший класс гормонов-стимуляторов, способствующих активному метаболизму и росту растений. Особенностью цитокининов является множественность их изоформ, и, соответственно, сложность их биосинтеза и дальнейшего метаболизма. О важности цитокининовой системы регуляции свидетельствует практическое отсутствие природных мутантов по элементам этой системы, а также большое число генов (более сотни), участвующих в функционировании системы передачи цитокининового сигнала у растений. Огромным достижением последних лет стала идентификация генов и белков цитокининовой системы регуляции, в том числе генов первичного ответа и рецепторов. Именно работы на генном уровне и получение соответствующих мутантов позволили уверенно определить биологическую функцию изучаемых белков в этой регуляторной системе.
Как уже указывалось выше, цитокининовая система регулирует физиологические процессы в растении совместно с другими гормональными и негормональными регуляторными системами. Принципы ее построения и функционирования, по-видимому, имеют много общего с принципами построения других систем гормональной регуляции у растений.
Во-первых, это полифункциональность цитокининов, т.е. большое число физиологических процессов, на которые эти гормоны оказывают свое влияние, и разнообразие эффектов, которые они способны вызвать (плейотропность действия). В принципе, многообразие действия цитокининов могло бы быть следствием множественности их изоформ, если каждый структурный вариант цитокининов отвечал бы за определенный тип метаболических процессов. Однако пока нет серьезных оснований считать цитокининовые изоформы функционально разнокачественными; наоборот, огромный экспериментальный материал свидетельствует о том, что все цитокинины функционально активны, хотя и в разной степени, в реализации одних и тех же физиологических программ. Поэтому многообразие клеточных ответов на цитокинин должно зависеть от специфики клеточных систем восприятия сигнала и от потенции клетки реагировать на цитокинин изменением экспрессии генов первичного и вторичного ответов. На примере арабидопсиса показано, что растение обладает несколькими рецепторами для одного типа фитогормонов, что эти рецепторы могут находиться как на плазмалемме, так и внутри клетки, а их соотношение зависит от типа органа и ткани. Тканевая/клеточная разнокачественность аппарата рецепции фитогормонов и каскадность транскриптомного ответа клетки являются важными факторами полифункциональности действия гормонов in planta, что позволяет объяснить известный факт, что растениям достаточно значительно меньшего разнообразия гормонов по сравнению с животными [51, 120].
Во-вторых, для цитокининовой системы характерна высокая надежность, которая проявляется на разных уровнях организации растительного организма и новые элементы которой постоянно выявляются по мере расширения методических возможностей исследователей. Надежность на клеточном уровне связана с ограничениями, как по верхнему, так и по нижнему уровням экспрессии генов первичного ответа, выход за которые может быть летальным для растения. Чрезмерная активация генов первичного ответа блокируется псевдорегуляторами транскрипции ARR типа А, а отсутствие цитокининового сигналинга может, по всей видимости, частично компенсироваться фоновым сигналингом других сенсорных гистидинкиназ, таких как CKI1 [54], или рецепторa этилена ETR1 [121]. Локальный избыток цитокининов компенсируется также индукцией активности ферментов их инактивации или катаболизма, таких как цитокининоксидаза/дегидрогеназа и других. Нарушения цитокининового гомеостаза всегда вызывают физиологические реакции растения, ведущие к восстановлению нарушенного равновесия. Например, эктопическая экспрессия цитокининоксидазы/дегидрогеназы, снижающая концентрацию эндогенных цитокининов, вызывает разрастание корневой системы [22, 23]. Увеличение объема меристематических зон корня, в свою очередь, ведет к добавочному биосинтезу цитокининов, транспортируемых далее по всему растению. С другой стороны, при недостатке цитокининов сокращается объем верхушечной меристемы, что снижает биосинтез ауксина и способствует более быстрому восстановлению ауксинцитокининового баланса. Другим примером могут служить растения с "выключенными" генами рецепторов цитокининов, у которых по мере удаления рецепторов возрастает эндогенная концентрация цитокининов [62], что должно, очевидно, в какой-то степени компенсировать ослабление аппарата их рецепции. Видимо, поэтому нокаут-мутанты арабидопсиса по двум из трех рецепторов цитокининов имеют лишь небольшие фенотипические изменения по сравнению с растениями дикого типа [6062].
В-третьих, для цитокининов, как и для других фитогормонов, характерно сочетание дальнедистанционного и локального действия. Арабидопсис является примером типичного растения, у которого синтез основной массы цитокининов происходит в кончике корня. Далее цитокинины транспортируются из корня акропетально по ксилеме по всему растению. Тем самым осуществляется передача информации о состоянии растущих частей корневой системы в надземную часть растения. При этом создается определенный градиент концентраций цитокининов вдоль вертикальной оси растения, который (совместно с градиентом ауксинов) служит "сигнальным полем" для "разметки" тканей и клеток. Однако ксилемный транспорт сильно зависит от внешних условий (температура, влажность, ветер) и поэтому нестабилен. Видимо, для того, чтобы достичь более стабильной концентрации цитокининов в тех зонах, где они особенно нужны, а именно в зонах делящихся клеток, растения сформировали локальные области биосинтеза цитокининов в побеге. Это, в первую очередь, апикальная меристема, в том числе флоральная флоэма листа, боковые почки, зоны опадения плодов и некоторые другие [16]. Это означает, что цитокинины, являясь истинными гормонами растений, сочетают свойственное гормонам эндокринное (т.е. дальнедистанционное) действие с паракринным (т.е. с локальным в месте их биосинтеза). Наличие локальных мест биосинтеза цитокининов дополнительно повышает надежность функционирования системы цитокининовой регуляции в целом.
Несмотря на кардинальные достижения последнего десятилетия в исследовании молекулярных основ передачи цитокининового сигнала, как внутриклеточного, так и в целом растении, еще остается много вопросов. Тем не менее, выявленные новые закономерности и, самое главное, гены, участвующие в восприятии цитокининового сигнала и ответе на него, открывают широкие перспективы дальнейших углубленных исследований и применения полученных знаний в практическом растениеводстве.

Автор благодарен Томасу Шмюллингу (Свободный Университет г. Берлина) за полезное обсуждение тематики обзора.
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (гранты №№ 04-04-49120, 07-04-0033, 07-04-91211-ЯФ и 08-04-90429-Укр).
 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Miller C.O., Skoog F., von Saltza N.M., Strong F.M. Kinetin, a Cell Division Factor from Deoxyribonucleic Acid // J. Am. Chem. Soc. 1955. V. 77. P. 1329-1334.
2. Полевой В.В. Фитогормоны. Л.: ЛГУ. 1982. 249 с.
3. Köhler K.-H., Conrad K. Ein Quantitativer Phytokinintest // Biol. Rundschau. 1966. V. 5. P. 36-37.
4. Letham D.S. Zeatin, a Factor Inducing Cell Division Isolated from Zea mays // Life Sci. 1963. V. 2. P. 569-573.
5. Letham D.S., Shannon J.S., McDonald, I.R. The Structure of Zeatin, a Factor Inducing Cell Division // Proc. Chem. Soc. London. 1964. P. 230-231.
6. Kakimoto T. Identification of Plant Cytokinin Biosynthetic Enzymes as Dimethylallyl Diphosphate:ATP/ADP Isopentenyltransferases // Plant Cell Physiol. 2001. V. 42. P. 677-685.
7. Takei K., Sakakibara H., Sugiyama T. Identification of Genes Encoding Adenylate Isopentenyltransferase, a Cytokinin Biosynthesis Enzyme, in Arabidopsis thaliana // J. Biol Chem. 2001. V. 276. P. 26405-26410.
8. Takei K., Yamaya T., Sakakibara H. Arabidopsis CYP735A1 and CYP735 A2 Encode Cytokinin Hydroxylases That Catalyse the Biosynthesis of trans-Zeatin // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 41866-41872.
9. Korszun Z.R., Knight C., Chen C.-M. A Stereochemical Model for Cytokinin Activity // FEBS Lett. 1989. V. 243. P. 53-56.
10. Strnad M. The Aromatic Cytokinins // Physiol. Plant. 1997. V. 101. P. 674-688.
11. Bruce M.I, Zwar J.A. Cytokinin Activity of Some Substituted Ureas and Thioureas // Proc. R. Soc. London. 1966. Ser. B. V. 165. P. 245-265.
12. Isogai Y. Cytokinin Activities of N-Phenyl-N’-(4-Pyridyl)ureas // Metabolism and Molecular Activities of Cytokinins / Eds Guern J., Peaud-Lenoel C. Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag, 1981. P. 115-128.
13. Shudo K. Chemistry of Phenylurea Cytokinins // Cytokinins. Chemistry, Activity, and Function / Eds Mok D.W.S., Mok M.C. Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo: CRC, 1994. P. 35-42.
14. Романов Г.А. Цитокинины и тРНК: новый взгляд на старую проблему // Физиология растений. 1990. Т. 37. С. 1196-1210.
15. Sakakibara H. Cytokinin Biosynthesis and Metabolism // Plant Hormones. Biosynthesis, Signal Transduction, Action! / Ed. Davies P.J. Dordrecht: Kluwer, 2004. P. 95-114.
16. Hirose N., Takei K., Kuroha T., Kamada_Nobusada T., Hayashi H., Sakakibara H. Regulation of Cytokinin Biosynthesis, Compartmentalization and Translocation // J. Exp. Bot. 2008. V. 59. P. 75-83.
17. Mok M.C. Cytokinins and Plant Development – an Overview // Cytokinins. Chemistry, Activity, and Function / Eds Mok D.W.S., Mok M.C. Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo: CRC, 1994. P. 155-166.
18. Taiz L., Zeiger E. Plant Physiology. Sunderland (USA): Sinauer Associates, 2002. 571 p.
19. Кузнецов Вл.В., Дмитриева Г.А. Физиология растений. М.: Высш. шк., 2006. 742 с.
20. Романов Г.А. Модель гормонально-организуемого пролиферативного роста: аналогии с ростом растений // Онтогенез. 1992. Т. 23. С. 228-236.
21. Romanov G.A. A Model for Bipolar Plant-Type Growth: Role of Auxin-Cytokinin Countercurrent // Progress in Plant Growth Regulation / Eds Karssen C.M. et al. Dordrecht: Kluwer, 1992. P. 459-463.
22. 22. Werner T., Motyka V., Strnad M., Schmülling T. Regulation of Plant Growth by Cytokinin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 10 487-10 492.
23. Werner T., Motyka V., Laucou V., Smets R., van Onckelen H., Schmülling T. Cytokinin-Deficient Transgenic Arabidopsis Plants Show Multiple Development Alterations Indicating Opposite Functions of Cytokinins in the Regulation of Shoot and Root Meristem Activity // Plant Cell. 2003. V. 15. P. 2532-2550.
24. Murray J.D., Karas B.J., Sato S., Tabata S., Amyot L., Szczyglowski K. A Cytokinin Perception Mutant Colonized by Rhizobium in the Absence of Nodule Organogenesis // Science. 2007. V. 315. P. 101-104.
25. Tirichine L., Sandal N., Madsen L.H., Radutoiu S., Albrektsen A.S., Sato S., Asamizu E., Tabata S., Stougaard J. A Gain-of-Function Mutation in a Cytokinin Receptor Triggers Spontaneous Root Nodule Organogenesis // Science. 2007. V. 315. P. 104-107.
26. Bopp M., Jacob H.J. Cytokinin Effect on Branching and Bud Formation in Funaria // Planta. 1986. V. 169. P. 462-464.
27. Mlejnek P., Prochazka S. Activation of Caspase-Like Proteases and Induction of Apoptosis by Isopentenyladenosine in Tobacco BY-2 Cells // Planta. 2002. V. 215. 158-166.
28. Carimi F., Zottini M., Formentin E., Terzi M., Lo Schiavo F. Cytokinins: New Apoptotic Inducers in Plants // Planta. 2003. V. 216. P. 413-421.
29. Cytokinin Bioassays // Bioassays and Other Special Techniques for Plant Hormones and Plant Growth Regulators, Ch. 4 / Eds Yopp J.H., Aung L.H., Steffens G.L. Florida (USA): Plant Growth Regul. Soc. of America, 1986. P. 63-84.
30. Сельскохозяйственная биотехнология / Под ред. Шевелухи В.С. М.: Высш. шк., 2003. 470 с.
31. Grossmann K. Induction of Leaf Abscission in Cotton Is a Common Effect of Urea- and Adenine-Type Cytokinins // Plant Physiol. 1991. V. 95. P. 234-237.
32. Veselý J., Havlíček L., Strnad M., Blow J.J., Donella-Deana A., Pinna L., Letham D.S., Kato J., Detivaud L., Leclerc S., Meijer L. Inhibition of Cyclin-Dependent Kinases by Purine Analogues // Eur. J. Biochem. 1994. V. 244. P. 771-786.
33. Ishii Y., Hori Y., Sakai S., Honma Y. Control of Differentiation and Apoptosis of Human Myeloid Leukemia Cells by Cytokinins and Cytokinin Nucleosides, Plant Redifferentiation-Inducing Hormones // Cell Growth Diff. 2002. V. 13. P. 19-26.
34. Spinola M., Colombo F., Falvella S., Dragani T.A. N6-Isopentenyladenosine: A Potent Therapeutical Agent for a Variety of Epithelial Cancers // Int. J. Cancer. 2007. V. 120. P. 2744-2748.
35. Brandstatter I., Kieber J.J. Two Genes with Similarity to Bacterial Response Regulators Are Rapidly and Specifically Induced by Cytokinin in Arabidopsis // Plant Cell. 1998. V. 10. P. 1009-1020.
36. Taniguchi M., Kiba T., Sakakibara H., Ueguchi C., Mizuno T., Sugiyama T. Expression of Arabidopsis Response Regulator Homologs Is Induced by Cytokinins and Nitrate // FEBS Lett. 1998. V. 429. P. 259-262.
37. D’Agostino I., Deruère J., Kieber J.J. Characterization of the Response of the Arabidopsis ARR Gene Family to Cytokinin // Plant Physiol. 2000. V. 124. P. 1706-1717.
38. Romanov G.A., Kieber J.J., Schmülling T. A Rapid Cytokinin Response Assay in Arabidopsis Indicates a Role for Phospholipase D in Cytokinin Signalling // FEBS Lett. 2002. V. 515. P. 39-43.
39. Зверева С.Д., Романов Г.А. Репортерные гены для генетической инженерии растений: характеристика и методы тестирования // Физиология растений. 2000. Т. 47. С. 479-488.
40. Romanov G.A., Lomin S.N., Rakova N.Yu., Heyl A., Schmülling T. Does NO Play a Role in Cytokinin Signal Transduction? // FEBS Lett. 2008. V. 582. P. 874-880.
41. Brenner W., Romanov G.A., Köllmer I., Burkle L., Schmülling T. Immediate-Early and Delayed Cytokinin Response Genes of Arabidopsis thaliana Identified by a Genome-Wide Expression Profiling Reveal Novel Cytokinin-Sensitive Processes and Suggest Cytokinin Action through Transcriptional Cascades // Plant J. 2005. V. 44. P. 314-333.
42. Redman J.C., Haas B.J., Tanimoto G., Town C.D. Development and Evaluation of an Arabidopsis Whole Genome Affymetrix Probe Array // Plant J. 2004. V. 38. P. 545-561.
43. Романов Г.А., Шеффер З., Хевельт А., Крольцик С., Шмюллинг Т. Действие цитокининов на популяцию мРНК в клетках табака // Тез. IV Съезда Общества физиологов растений России. Москва, 1999. С. 675.
44. Schäfer S., Krolzik S., Romanov G.A., Schmülling T. Cytokinin-Regulated Transcripts in Tobacco Cell Culture // Plant Growth Regul. 2000. V. 32. P. 307-313.
45. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Т. 1. Москва: Наука, 2004. 526 с.
46. Лутова Л.А., Проворов Н.А., Тиходеев О.Н., Тихонович И.А., Ходжайова Л.Т., Шишкова С.О. Генетика развития растений. С.-Петербург: Наука, 2000. 539 с.
47. Dharmasiri N., Dharmasiri S., Estelle M. The F-Box Protein 1 Is an Auxin Receptor // Nature. 2005. V. 435. P. 441-445.
48. Kepinsky S., Leyser O. The Arabidopsis F-Box Protein 1 Is an Auxin Receptor // Nature. 2005. V. 435. P. 446-451
49. Ueguchi-Tanaka M., Ashikari M., Nakajima M., Itoh H., Katoh E., Kobayashi M., Ohow T.Y., Hsing Y.I.C., Kitano H., Yamaguchi I., Matsuoka M. GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 Encodes a Soluble Receptor for Gibberellin // Nature. 2005. V. 437. P. 693-698.
50. Smalle J., Kurepa J., Yang J., Babiychuk E., Kushnir S., Durski A., Viestra R.D. Cytokinin Growth Responses in Arabidopsis Involve the 26S Proteasome Subunit RPN12 // Plant Cell. 2002. V. 14. P. 17-32.
51. Романов Г.А. Рецепторы фитогормонов // Физиология растений. 2002. Т. 49. С. 615-625.
52. Rashotte A.M., Carson S.D.B., To J.P.C., Kieber J.J. Expression Profiling of Cytokinin Action in Arabidopsis // Plant Physiol. 2003. V. 132. P. 1998-2011.
53. Rashotte A.M., Mason M.G., Hutchison C.E., Ferreira F.J., Schaller G.E., Kieber J.J. A Subset of Arabidopsis AP2 Transcription Factors Mediates Cytokinin Responses in Concert with a Two-Component Pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 11081-11085.
54. Kakimoto T. CKI1, a Histidine Kinase Homolog Implicated in Cytokinin Signal Transduction // Science. 1996. V. 274. P. 982-985.
55. Inoue T., Higuchi M., Hashimoto Y., Seki M., Kobayashi M., Kato T., Tabata S., Shinozaki K., Kakimoto T. Identification of CRE1 as a Cytokinin Receptor from Arabidopsis // Nature. 2001. V. 409. P. 1060-1063.
56. Suzuki T., Miwa K., Ishikawa K., Yamada H., Aiba H., Mizuno T. The Arabidopsis Sensor His-Kinase, AHK4, Can Respond to Cytokinins // Plant Cell Physiol. 2001. V. 42. P. 107-113.
57. Yonekura-Sakakibara K., Kojima M., Yamaya T., Sakakibara H. Molecular Characterization of Cytokinin-Responsive Histidine Kinases in Maize. Differential Ligand Preferences and Response to cis-Zeatin // Plant Physiol. 2004. V. 134. P. 1654-1661.
58. Pareek A., Singh A., Kumar M., Kushwaha H.R., Lynn A.M., Singla-Pareek S.L. Whole-Genome Analysis of Oryza sativa Reveals Similar Architecture of Two-Component Signaling Machinery with Arabidopsis // Plant Physiol. 2006. V. 142. P. 380-397.
59. Du L., Jiao F., Chu J., Chen M., Wu P. The Two-Component Signal System in Rice (Oryza sativa L.): A Genome-Wide Study of Cytokinin Signal Perception and Transduction // Genomics. 2007. V. 89. P. 697-707.
60. Higuchi M., Pischke M.S., Mähönen A.P., Miyawaki K., Hashimoto Y., Seki M., Kobayashi M., Shinozaki K., Kato T., Tabata S., Helariutta Y., Sussman M.R., Kakimoto T. In Planta Functions of the Arabidopsis Cytokinin Receptor Family // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 8821-8826.
61. Nishimura C., Ohashi Y., Sato S., Kato T., Tabata S., Ueguchi C. Histidine Kinase Homologs That Act as Cytokinin Receptors Possess Overlapping Functions in the Regulation of Shoot and Root Growth in Arabidopsis // Plant Cell. 2004. V. 16. P. 1365-1377.
62. Riefler M., Novak O., Strnad M., Schmülling T. Arabidopsis Cytokinin Receptor Mutants Reveal Functions in Shoot Growth, Leaf Senescence, Seed Size, Germination, Root Development and Cytokinin Metabolism // Plant Cell. 2006. V. 18. P. 40-54.
63. Anantharaman V., Aravind L. The CHASE Domain: A Predicted Ligand-Binding Module in Plant Cytokinin Receptors and Other Eukaryotic and Bacterial Receptors // Trends Biochem. Sci. 2001. V. 26. P. 579-582.
64. Mougel C., Zhulin I.B. CHASE: An Extracellular Sensing Domain Common to Transmembrane Receptors from Prokaryotes, Lower Eukaryotes and Plants // Trends Biochem. Sci. 2001. V. 26. P. 582-584.
65. Yamada H., Suzuki T., Terada K., Takei K., Ishikawa K., Miwa K., Yamashino T., Mizuno T. The Arabidopsis AHK4 Histidine Kinase Is a Cytokinin-Binding Receptor That Transduces Cytokinin Signals across the Membrane // Plant Cell Physiol. 2001. V. 42. P. 1017-1023.
66. Spíchal L., Rakova N.Y., Riefler M., Mizuno T., Romanov G.A., Strnad M., Schmülling T. Two Cytokinin Receptors of Arabidopsis thaliana, CRE1/AHK4 and AHK3, Differ in Their Ligand Specificity in a Bacterial Assay // Plant Cell Physiol. 2004. V. 45. P. 1299-1305.
67. Ломин С.Н., Романов Г.А. Анализ гормонрецепторного взаимодействия. Теоретические и практические аспекты // Физиология растений. 2008. Т. 55. С. 283-299.
68. Romanov G.A., Spichal L., Lomin S., Strnad M., Schmülling T. A Live Cell Hormone-Binding Assay on Transgenic Bacteria Expressing a Eukaryotic Receptor Protein // Anal. Biochem. 2005. V. 347. P. 129-134.
69. Romanov G.A., Lomin S.N., Schmülling T. Biochemical Characteristics and Ligand-Binding Properties of Arabidopsis Cytokinin Receptor AHK3 Compared to CRE1/AHK4 as Revealed by a Direct Binding Assay // J. Exp. Bot. 2006. V. 57. P. 4051-4058.
70. Takei K., Ueda N., Aoki K., Kuromori T., Hirayama T., Shinozaki K., Yamaya T., Sakakibara H. AtIPT3 Is a Key Determinant of Nitrate-Dependent Cytokinin Biosynthesis in Arabidopsis // Plant Cell Physiol. 2004. V. 45. P. 1053-1062.
71. Ломин С.Н. Лиганд-связывающие свойства и субклеточная локализация цитокининовых рецепторов: Дисс. … канд. биол. наук. М.: ИФР РАН, 2008. 190 с.
72. Heyl A., Wulfetange K., Pils B., Nielsen N., Romanov G.A., Schmülling T. Evolutionary Proteomics Identifies Amino Acids Essential for Ligand-Binding of the Cytokinin Receptor CHASE Domain // BMC Evol. Biol. 2007. V. 7. P. 62.
73. Mizuno T. HisAsp Phosphotransfer Signal Transduction // J. Biochem. 1998. V. 123. P. 555-563.
74. Heyl A., Schmülling T. Cytokinin Signal Perception and Transduction // Curr. Opin. Plant Biol. 2003. V. 6. P. 480-488.
75. Ferreira F.J., Kieber J.J. Cytokinin Signaling // Curr. Opin. Plant Biol. 2005. V. 8. P. 518-525.
76. Müller B., Sheen J. Arabidopsis Cytokinin Signaling Pathway // Science STKE 2007, cm7.
77. Lomin S.N., Sakakibara H., Romanov G.A. Two Maize Cytokinin Receptors, ZmHK1 and ZmHK2, Have Different Ligand-Binding Properties // Abst. II Int. Symp. “Plant Growth Substances: Intracellular Hormonal Signaling and Applying in Agriculture". Kiev: Polytechnika. 2007. P. 52.
78. Sakai H., Aoyama T., Oka A. Arabidopsis ARR1 and ARR2 Response Regulators Operate as Transcriptional Activators // Plant J. 2000. V. 24. P. 703-711.
79. Hosoda K., Imamura A., Katoh E., Hatta T., Tachiki M., Yamada H., Mizuno T., Yamazaki T. Molecular Structure of the GARP Family of Plant Myb-Related DNA Binding Motifs of the Arabidopsis Response Regulators // Plant Cell. 2002. V. 14. P. 2015-2029.
80. Taniguchi M., Sasaki N., Tsuge T., Aoyama T., Oka A. ARR1 Directly Activates Cytokinin Response Genes That Encode Proteins with Diverse Regulatory Functions // Plant Cell Physiol. 2007. V. 48. P. 263-277.
81. Romanov G.A., Getman I.A., Schmülling T. Investigation of Early Cytokinin Effects in a Rapid Amaranthus Seedling Test // Plant Growth Regul. 2000. V. 32. P. 337-344.
82. Yu C.H., Liu S.Y., Panagia V. The Transphosphatidylation Activity of Phospholipase D // Mol. Cell. Biochem. 1996. V. 157. P. 101-105.
83. Ella K.M., Meier K.E., Kumar A., Zhang Y., Meier G.P. Utilization of Alcohols by Plant and Mammalian Phospholipase D // Biochem. Mol. Biol. Int. 1997. V. 41. P. 715-724.
84. Wang X. Plant Phospholipases // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. V. 52. P. 211-231.
85. Munnik T. Phosphatidic Acids: An Emerging Plant Lipid Second Messenger // Trends Plant Sci. 2001. V. 6. P. 227-233.
86. Медведев С.С., Танкелюн О.В., Батов А.Ю., Воронина О.В., Мартинец Я., Махачкова И. Ионофорные функции фосфатидной кислоты в растительной клетке // Физиология растений. 2006. Т. 53. С. 45-53.
87. Romanov G.A., Getman I.A., Bolyakina Yu.P., Rakova N.Yu., Kieber J.J., Schmülling T. Primary Alcohols, Substrates for Phospholipase D-Catalyzed Transphosphatidylation, Suppress the Cytokinin Action // Phytohormones in Plant Biotechnology and Agriculture / Eds Macháčková I., Romanov G.A. Dordrecht: Kluwer, 2003. P. 129-139.
88. Ryu S.B., Karlsson B.H., Özgen M., Palta J.P. Inhibition of Phospholipase D by Lysophosphatidylethanolamine, a Lipid-Derived Senescence Retardant // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 12 717-12 721.
89. Lomin S.N., Bolyakina Yu.P., Getman I.A., Rakova N.Yu., Martinec J., Romanov G.A. Analysis of the Participation of Non-Canonic Intermediates in Cytokinin Signalling // Abst. II Intern. Symp. “Signalling Systems of Plant Cells: Role in Adaptation and Immunity". Kazan, 2007. P. 193-194.
90. Kolesnikov Ya.S., Kretinin S.V., Kravets V.S., Romanov G.A., Martinec J., Macháčková I. Participation of PIP2Phospholipase D in Cytokinin Signaling // Abst. II Intern. Symp. “Plant Growth Substances: Intracellular Hormonal Signaling and Applying in Agriculture". Kiev: Polytechnika, 2007. P. 49.
91. Кравец В.С., Колесников Я.С., Кузнецов Вл.В., Романов Г.А. Регуляторы роста растений: внутриклеточная гормональная регуляция и применение в аграрном производстве // Физиология растений. 2008. Т. 55. С. 629-640.
92. Testerink C., Dekker H.L., Lim Z.-Y., Johns M.K., Holmes A.B., de Koster C.G., Ktistakis N.T., Munnik T. Isolation and Identification of Phosphatidic Acid Targets from Plants // Plant J. 2004. V. 39. P. 527-536.
93. Testerink C., Munnik T. Phosphatidic Acid: A Multifunctional Stress Signaling Lipid in Plants // Trends Plant Sci. 2005. V. 10. P. 368-375.
94. Andresen B.T., Rizzo M.A., Shome K., Romero G. The Role of Phosphatidic Acid in the Regulation of the RAS/MEK/Erk Signaling Cascade // FEBS Lett. 2002. V. 531. P. 65-68.
95. Романов Г.А., Ракова Н.Ю., Ванюшин Б.Ф. Полиамины подавляют экспрессию цитокининзависимого трансгена у арабидопсиса // Докл. АН. 2004. Т. 398. С. 415-418.
96. Ракова Н.Ю., Романов Г.А. Полиамины препятствуют проявлению первичных эффектов цитокининов // Физиология растений. 2005. Т. 52. С. 59-67.
97. Schmülling T., Schäfer S., Romanov G. Cytokinins as Regulators of Gene Expression // Physiol. Plant. 1997. V. 100. P. 505-517.
98. Клячко Н.Л. Постранскрипционная регуляция синтеза белка фитогормонами. Дисс. … докт. биол. наук. М.: ИФР РАН, 1986. 335 с.
99. Sherameti I., Shahollari B., Landsberger M., Westermann M., Cherepneva G., Kusnetsov V., Oelmüller R. Cytokinin Stimulates Polyribosome Loading of Nuclear-Encoded mRNAs for the Plastid ATP Synthase in Etioplasts of Lupinus luteus: The Complex Accumulates in the Inner-Envelope Membrane with the CF1 Moiety Located towards the Stromal Space // Plant J. 2004. V. 38. P. 578-593.
100. Chae H.S., Faure F., Kieber J.J. The eto1, eto2, and eto3 Mutations and Cytokinin Treatment Increase Ethylene Biosynthesis in Arabidopsis by Increasing the Stability of ACS Protein // Plant Cell. 2003. V. 15. P. 545-559.
101. Романов Г.А., Медведев С.С. Ауксины и цитокинины в развитии растений. Последние достижения в исследовании фитогормонов // Физиология растений. 2006. Т. 53. С. 309-319.
102. Li C.-H., Yu N., Jiang S.-M., Shangguan X.-X., Wang L.-J., Chen X.-Y. Down-Regulation of S-Adenosyl-L-Homocysteine Hydrolase Reveals a Role of Cytokinin in Promoting Transmethylation Reactions // Planta. 2008. V. 228. P. 125-136.
103. Vanyushin B.F. DNA Methylation in Plants // Curr. Topics Microbiol. Immunol. 2006. V. 301. P. 67-122.
104. Deikman J., Hammer P.E. Induction of Anthocyanin Accumulation by Cytokinins in Arabidopsis thaliana // Plant Physiol. 1995. V. 108. P. 47-57.
105. Dewitte W., Murray J.A.H. The Plant Cell Cycle // Annu. Rev. Plant Biol. 2003. V. 54. P. 235-264.
106. Roef L., van Onckelen H. Cytokinin Regulation of the Cell Division Cycle // Plant Hormones. Biosynthesis, Signal Transduсtion, Action! / Ed. Davies P.J. Dordrecht: Kluwer, 2003. P. 241-261.
107. Li X., Mo X., Shou H., Wu P. Cytokinin-Mediated Cell Cycling Arrest of Pericycle Founder Cells in Lateral Root Initiation of Arabidopsis // Plant Cell Physiol. 2006. V. 47. P. 1112-1123.
108. Corbesier L., Prinsen E., Jackmard A., Lejeune P., van Onckelen H., Perilleux C., Bernier G. Cytokinin Levels in Leaves, Leaf Exudate and Shoot Apical Meristem of Arabidopsis thaliana during Floral Transition // J. Exp. Bot. 2003. V. 54. P. 2511-2517.
109. Романов Г.А., Суховеров В.С. Исследование кинетики роста и динамики гормональных градиентов на модельных многоклеточных структурах растительного типа – компьютерных растениях // Докл. АН. 1997. Т. 352. С. 845-848.
110. Aloni R., Aloni E., Langhans M., Ullrich C.I. Role of Cytokinin and Auxin in Shaping Root Architecture: Regulating Vascular Differentiation, Lateral Root Initiation, Root Apical Dominance and Root Gravitropism // Ann. Bot. 2006. V. 97. P. 883-893.
111. Dodueva I.E., Frolova N.V., Lutova L.A. Plant Tumorigenesis: Different Ways for Shifting Systemic Control of Plant Cell Division and Differentiation // Transgenic Plant J. 2007. V. 1. P. 17-38.
112. Kusnetsov V.V., Herrmann R.G., Kulaeva O.N., Oelmüeller R. Cytokinin Stimulates and Abscisic Acid Inhibits Greening of Etiolated Lupinus luteus Cotyledons by Affecting the Expression of the Light-Sensitive Protochlorophyllide Oxidoreductase // Mol. Gen. Genet. 1998. V. 259. P. 21-28.
113. Buchanan-Wollaston V. The Molecular Biology of Leaf Senescence // J. Exp. Bot. 1997. V. 48. P. 181-199.
114. Gan S., Amasino R.M. Making Sense of Senescence // Plant Physiol. 1997. V. 113. P. 313-319.
115. Чайлахян М.Х., Хрянин В.Н. Пол растений и его гормональная регуляция. М.: Наука, 1982. 173 с.
116. Jasinski S., Piazza P., Craft J., Hay A., Woolley L., Rieu I., Phillips A., Hedden P., Tsiantis M. KNOX Action in Arabidopsis Is Mediated by Coordinate Regulation of Cytokinin and Gibberellin Activities // Curr. Biol. 2005. V. 15. P. 1560-1565.
117. Greenboim-Wainberg Y., Maymon I., Borochov R., Alvarez J., Olszewski N., Ori N., Eshed Y., Weiss D. Cross Talk between Gibberellin and Cytokinin: the Arabidopsis GA Response Inhibitor SPINDLY Plays a Positive Role in Cytokinin Signaling // Plant Cell. 2005. V. 17. P. 92-102.
118. Аксенова Н.П., Константинова Т.Н., Гукасян И.А., Голяновская С.А., Романов Г.А. Усиление фотопериодической чувствительности PHYB-трансгенных растений снимается кинетином // Докл. АН. 2003. Т. 391. С. 416-418.
119. Аксенова Н.П., Константинова Т.Н., Ложникова В.Н., Голяновская С.А., Гукасян И.А., Гатс К., Романов Г.А. Фотопериодическая и гормональная зависимость клубнеобразования у картофеля, трансформированного геном PHYB Arabidopsis // Физиология растений. 2005. Т. 52. С. 701-707.
120. Романов Г.А. Гормон-связывающие белки растений и проблема рецепции фитогормонов // Физиология растений. 1989. Т. 36. С. 166-177.
121. Stepanova A.N., Ecker J.R. Ethylene Signaling: From Mutants to Molecules // Curr. Opin. Plant Biol. 2000. V. 3. P. 353-360.

 Подписи к рисункам

Рис. 1. Структуры типичных цитокининов.
Kin  кинетин; BA – БАП; iP – изопентениладенин; cZ – цис-зеатин; tZ – транс-зеатин; TD – тидиазурон.

Рис. 2. Трехдневные этиолированные проростки трансгенного ARR5::GUS арабидопсиса, необработанные (слева) или обработанные (справа) цитокинином (5 мкМ БАП).
Гистохимическое окрашивание на активность GUS [39]. Стрелки показывают зоны окрашивания необработанных цитокинином проростков.

Рис. 3. Количественные характеристики индукции активности ARR5-промотора у проростков ARR5::GUS арабидопсиса при воздействии цитокинина (5 мкМ БАП).
Активность GUS определена флюориметрическим методом [39]. а – дозовая зависимость; б – гормональная специфичность; в – кинетика активации ARR5-промотора. ABA – АБК; Ade – аденин; Ado – аденозин; BA – БАП; BL – эпибрассинолид; 2,4-D – 2,4-дихлорофеноксиуксусная кислота; GA3 – гибберелловая кислота; iP – изопентениладенин; iPR – изопентениладенозин; JA – жасмоновая кислота; Kin – кинетин; NAA – нафтилуксусная кислота; SA – салициловая кислота; Spm – спермин; TD – тидиазурон; tZ – транс-зеатин. Концентрация соединений 5 мкМ, за исключением SA и Spm (50 мкМ).

Рис. 4. Влияние цитокинина (5 мкМ БАП) на уровень транскриптов цитокинин-чувствительных генов проростков арабидопсиса.
а – кинетика накопления транскриптов гена ARR5 (вверху – вид нозерн-блота; внизу – результат количественного анализа); б – кинетика накопления транскриптов отдельных цитокинин-чувствительных генов; в – содержание транскриптов гена ARR5 (слева) и гена GUS под контролем промотора гена ARR5 (справа) через 35 мин воздействия БАП, в том числе в присутствии некоторых ингибиторов. NMMA (5 мМ) – ингибитор NO-синтазы; But – бутан-1-ол (1%), ингибитор генерации фосфатидных кислот фосфолипазой D.

Рис. 5. Доменная структура рецептора цитокининов CRE1/AHK4 арабидопсиса.
Домены белка: ТМ – трансмембранный; ЛС – лиганд-связывающий (CHASE); ГК – гистидинкиназный; Ак – акцепторный; Цк – цитокинины; H – остаток консервативного гистидина; D – остаток консервативного аспартата. N и C обозначают N- и C-концы белка. Стрелки справа указывают на сайт фосфорилирования и переноса высокоэнергетического фосфата (~ P).

Рис. 6. Схематическое изображение трансгенной бактериальной клетки E. coli, экспрессирующей рецепторы цитокининов и чувствительной к цитокининам.
YoiN – переносчик активного фосфата (~ P) на фактор транскрипции RscB, регулятор cps-промотора. RcsC – гибридная гистидинкиназа бактерии, аналог АНК-рецепторов.

Рис. 7. Характеристика связывания высокомеченного 3Н-транс-зеатина интактными трансгенными бактериями (E. coli), экспрессирующими рецепторы цитокининов арабидопсиса АНК3 или CRE1/AHK4.
а – тотальное (1), неспецифическое (2) и специфическое связывание (3) в АНК-экспрессирующих и контрольных клонах; б – гормональная специфичность рецепторов. ABA – АБК; cAMP – циклический АМФ; IAA – ИУК, GA3 – гибберелловая кислота, Spm – спермин; tZ – транс-зеатин. Концентрация соединений 8.6 мкМ, за исключением Spm (17.3 мкМ).

Рис. 8. Параметры взаимодействия 3Н-транс-зеатина с цитокининовыми рецепторами AHK3 и CRE1/AHK4.
а – рН-зависимость связывания гормона с рецепторами; б – дозовая зависимость связывания и ее анализ в координатах Скэтчарда.

Рис. 9. Лигандная специфичность цитокининовых рецепторов AHK3 и CRE1/AHK4.
а, б – конкурентные кривые вытеснения 3Н-транс-зеатина немечеными лигандами; в – ряды сродства цитокининов к рецепторам. Ade – аденин; AcZ – ацетил-О-зеатин; BA – 6-бензиладенин (БАП); cZ – цис-зеатин; DZ – дигидрозеатин; iP – изопентениладенин; iPR – изопентениладенозин; TD – тидиазурон; tZ – транс-зеатин; tZOG – транс-зеатин-О-глюкозид; tZR – транс-зеатинрибозид; б – кривые конкуренции для tZ (1), DZ (2) и iP (3).

Рис. 10. Мутации рецептора цитокининов CRE1/AHK4, нарушающие связывание цитокининов.
Кружками обозначены замены аминокислот в определенных позициях CHASE-домена. Остальные обозначения, как на рис. 5.

Рис. 11. Двухкомпонентная система трансдукции цитокининового сигнала у арабидопсиса (модифицировано из [72]).
а – структура и представленность белков системы. Слева обозначены размеры белков (количество аминокислотных остатков, аа). В скобках справа – общее количество белков данного типа. NLS – сигнал ядерной локализации; H – остаток консервативного гистидина; D – остаток консервативного аспартата. AD, F, G1, G2, GARP, N, P/Q-rich – консервативные последовательности аминокислот. Остальные обозначения – как на рис. 5; б – базовая схема внутриклеточной трансдукции цитокининового сигнала. AHK – рецепторы; AHP – фосфотрансмиттеры; ARR-B – регуляторы ответа типа В (транскрипционные факторы); ARR-A – регуляторы ответа типа А; светлые кружочки – активированные фосфаты (~ P).

Рис. 12. Схема образования фосфатидных кислот (посредников в передаче сигналов) фосфолипазой D и блокирования этого процесса первичными спиртами.

Рис. 13. Подавление действия цитокинина (БАП, 5 мкМ) первичными спиртами на модели трансгенного ARR5::GUS арабидопсиса.
а – концентрационные зависимости влияния ряда спиртов; б, в – влияние бутан-1-ола (1-бут) и бутан-2-ола (2-бут) (1%) на активность GUS (б) и на содержание транскриптов гена ARR5 (в). 1  1-бут; 2  метанол; 3  этанол; 4  2-бут.

Рис. 14. Предполагаемая схема дальнедистанционного действия цитокининов в растении (на примере арабидопсиса).
Z, ZR – цитокинины (транс-)зеатинового типа, транспортируемые из корня в побег по ксилеме; iP, iPR – цитокинины изопентенильного типа, синтезируемые в побеге и транспортируемые по флоэме. Доминирующий рецептор в побеге (листе) – AHK3, в корне – CRE1/AHK4. Жирные двусторонние стрелки обозначают сильное гормон-рецепторное взаимодействие, тонкие стрелки – относительное слабое взаимодействие.