УДК 581.143:575.143:575.15:575.17
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ДВУХ CONSTANS-LIKE ГЕНОВ У КАРТОФЕЛЯ
© 2009 г. П. Е. Дробязина, Э. Е. Хавкин
Институт сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук, Москва
Поступила в редакцию 14.08.2008 г.
Известно, что у многих видов растений ген CONSTANS и его ортологи CONSTANS-LIKE1 (COL1) контролируют связанный с длиной дня переход к цветению; однако роль этих генов в развитии растений рода Solanum изучена недостаточно. Ранее мы охарактеризовали две формы генов CONSTANS-LIKE1, sCOL1 и lCOL1, у картофеля (Solanum tuberosum ssp. tuberosum). Чтобы доказать, что эти гены функциональны, мы исследовали их экспрессию у картофеля сорта Early Rose методом ПЦР в реальном времени. Для обоих генов в условиях длинного и короткого дня мы наблюдали характерную динамику экспрессии на свету и в темноте. Два гена резко различались по профилю и амплитуде экспрессии, а максимум экспрессии sCOL1 на порядок величины превосходил соответствующую величину для lCOL1.

Ключевые слова: Solanum tuberosum – CONSTANS – переход к цветению – экспрессия генов  фотопериодическая регуляция   картофель.
_________________________________________________
Сокращения: ДД – длинный день; КД – короткий день; НД – растения, нейтральные по отношению к длине дня; CO – CONSTANS; COL1 – CONSTANS-LIKE1; EST  маркерные экспрессирующиеся последовательности (от expressed sequence tags); FT  FLOWERING LOCUS T.
Адрес для корреспонденции: Хавкин Эмиль Ефимович. 127550 Москва, Тимирязевская ул., 42. Институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН. Факс: 007 (495) 977-09-47; электронная почта: emil@iab.ac.ru

 ВВЕДЕНИЕ

Ключевая роль двух генов, CONSTANS (CO) and FLOWERING LOCUS T (FT) в фотопериодической регуляции цветения прочно установлена у длиннодневного (ДД) модельного растения Arabidopsis thaliana [1, 2]. Значительно слабее изучена генетическая регуляция перехода к цветению у культурных растений, включая экономически важные виды Solanum, например, картофель и томат.
Ранее ортологи CO и FT были охарактеризованы у нейтрального по отношению к длине дня (НД) томата (Solanum lycopersicon) и короткодневного (КД) картофеля andigena (Solanum tuberosum ssp. andigena) [36]. В нашей лаборатории при изучении гомологов CO у Solanum, включая ДД картофель tuberosum (Solanum tuberosum ssp. tuberosum), были обнаружены два CONSTANS-LIKE1 (COL1) гена. Эти гены различаются по длине экзона 2 на 18 нуклеотидов за счет количества повторов AAC/AAT и CAA/CAG, кодирующих полиаспарагиновые и полиглутаминовые участки в белке COL1 [7, 8]. Соответственно мы назвали эти гены коротким и длинным (sCOL1 и lCOL1). Следующий очевидный шаг заключался в выяснении, экспрессируются ли эти гены.
В этом сообщении описан характер экспрессии sCOL1 и lCOL1 у ДД/НД картофеля tuberosum, сорт Early Rose. Мы показали, что обоим генам в условиях ДД и КД свойственны колебания экспрессии, характерные для смены дня и ночи, хотя профиль и амплитуда этих колебаний у двух генов резко различаются. Эти данные позволяют предполагать, что оба гена функциональны и, вероятно, участвуют в фотопериодической регуляции развития картофеля. Такое предположение подтверждается присутствием в базе маркерных экспрессирующихся последовательностей (expressed sequence tags, EST) фрагментов, гомологичных обоим генам.

МЕТОДИКА

Растительный материал. Early Rose, выдающийся сорт Solanum tuberosum L. ssp. tuberosum, который мы находим в родословных большинства раннеспелых сортов картофеля, происходит от формы Garnet Chile, представителя ДД аборигенных tuberosum с равнин юга Чили, которые считают предками современных европейских и североамериканских сортов картофеля [9]. Клубни сорта Early Rose (номер по каталогу 24035) были получены из Института растениеводства им. Н.И. Вавилова (С.-Петербург). Растения выращивали при двух режимах света и темноты (16/8 ч и 8/16 ч соответственно для ДД и КД) и комнатной температуре, и листья отбирали для выделения РНК на протяжении суток от условного начала "ночи" (0 ч) с промежутками в 23 ч.
Выделение РНК и обратная транскрипция. РНК экстрагировали из свежесобранных листьев, используя TRIzol® Reagent ("Invitrogen", США), следуя протоколу, рекомендуемому фирмой-производителем. Обратную транскрипцию проводили с помощью обратной транскриптазы PowerScript™ ("Clontech", США) и oligo(dT) праймера в соответствии с рекомендуемым протоколом.
Праймеры и зонды. Все олигонуклеотиды, использованные в данной работе (таблица), были синтезированы фирмой "Синтол" (Москва, Россия, www.syntol.ru).
ПЦР в реальном времени. Для проведения ПЦР в реальном времени использовали анализатор нуклеиновых кислот АНК-32 (Институт аналитического приборостроения, Россия) и стандартный протокол с TaqMan зондами (http://www.molbiol.ru/protocol/12_07_01.html). Каждая проба содержала 500 нг кДНК, 0.4 мкл (5 ед./мкл) Taq ДНК-полимеразы ("Синтол"), 2.5 мкл 10 ПЦР буфера ("Синтол"), содержавшего 25 мМ MgCl2, 2.5 мкл dTTP (по 2.5 мМ) и по 10 пмолей каждого из праймеров; 2.5 пмолей TaqMan зондов (таблица) и стерильную воду до конечного объема 25 мкл. ПЦР проводили в двукратной повторности по следующей программе: один цикл продолжительностью 10 мин при 95oC; 50 циклов по 20 с при 95oC для денатурации ДНК и 50 с для отжига при 62oC. Два гена COL1 амплифицировали с праймерами, специфичными для каждого варианта, COlong-F/COlong-R и COshort-F/COshort-R, и универсальным CO-TaqMan зондом. Пороговые значения (Ct) для двух генов COL1 нормализовали против значений Ct для генов актина картофеля, используя праймеры Ac-F и Ac-R и зонд actin-TaqMan. Все расчеты, включая определение ошибки измерения, проводили с помощью пакета программ Q-Gene [10].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование экспрессии COL1 в листьях Early Rose с помощью ПЦР в реальном времени выявило динамику, характерную для "дня" и "ночи". В условиях ДД (16/8 ч свет/темнота) кривые экспрессии двух генов были сходными (рис. 1а) с максимумом "на рассвете" и 14-кратным соотношением экспрессии sCOL1/lCOL1. В течение дня, когда lCOL1, в отличие от sCOL1, давал дополнительный пик экспрессии, это соотношение снижалось до 79 (рис. 1в).
В условиях КД (8/16 ч свет/темнота) sCOL1 давал два пика экспрессии: после 10-часового периода темноты и в конце периода освещения (рис. 1б). Дневной пик sCOL1 мРНК превосходил ночной пик почти в два раза. После 6 ч темноты экспрессия lCOL1 падала до минимального значения и снова достигала максимума "на рассвете", когда lCOL1 мРНК накапливалась до уровня, десятикратно превышающего "ночной" минимум (рис. 1б). Таким образом, на КД динамика экспрессии двух генов была сходна в дневное время и резко различалась ночью. В этих условиях по количеству накапливаемой мРНК sCOL1 преобладал над lCOL1 в 22 раза в темноте и в девять раз на свету (рис. 1в).
Сопоставление кривых экспрессии CO/COL1 генов у различных ДД и КД видов (рис. 2) свидетельствует о том, что динамика экспрессии двух COL1 генов у ДД картофеля сорта Early Rose во многих отношениях напоминает суточные колебания, характерные для тех видов растений, у которых установлена связь экспрессии CO/COL1 генов с переходом к цветению. Профиль экспрессии sCOL1 у Early Rose на КД сходен с ДД профилями экспрессии lCOL1 у Early Rose, CO арабидопсиса [2] и conz1 кукурузы [11], где наблюдались два максимума экспрессии  ночью и в конце дня. Однако темновой период экспрессии sCOL1 у Early Rose оказался более продолжительным, чем у других CO/COL1 генов, а ночной максимум экспрессии lCOL1 у Early Rose был сдвинут к "рассвету".
В условиях ДД профиль экспрессии sCOL1 с одним максимумом напоминал динамику экспрессии на КД, характерную для CO арабидопсиса [2], Hd1 риса [2], conz1 кукурузы [11] и StCOL3 у картофеля andigena, при том, что ночной максимум, характерный для первых трех видов растений, был сдвинут у sCOL1 и StCOL3 к границе дня и ночи. В этой связи следует подчеркнуть, что и по своей первичной структуре белок sCOL1 картофеля Early Rose ближе к StCOL3 картофеля andigena, чем к lCOL1 [8]. Таким образом, по влиянию длины дня на экспрессию генов CO/COL1 растения Solanum заметно отличаются от модельных растений – ДД арабидопсиса и КД риса. К такому же выводу пришли исследователи, которые изучали динамику экспрессии PnCO, гомолога CO у КД растения Pharbitis nil (из того же порядка Solanales, что и картофель) [2].
Мы склонны заключить, что функциональными являются оба гена, sCOL1 и lCOL1, и этот вывод подтверждают результаты нашего поиска в NCBI EST database (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi): фрагменты мРНК, найденные в листьях картофеля (номера регистрации в Генбанке DN588901 и DR037627) и каллусной ткани картофеля (CK249622) представляют как sCOL1, так и lCOL1. Значительные различия двух генов по динамике и уровню экспрессии позволяют предположить, что функции sCOL1 и lCOL1 неодинаковы, хотя, возможно, они скоординированы. Белок CONSTANS не в состоянии непосредственно связываться с ДНК, и чтобы функционировать как регулятор транскрипции, который связывается с промотором FT, CONSTANS нуждается в белках-партнерах, образующих вместе с ним cis-регуляторный модуль [2, 3, 12]. Асинхронное накопление белков sCOL1 и lCOL1, различающихся по строению, может влиять на стабильность такого модуля и его связывание с промотором FT и таким образом участвовать в тонкой регулировке перехода растений к цветению.
Авторы признательны S. Prat (Centro Nacional de Biotecnologia-CSIC, Madrid, Spain), которая любезно познакомила их с неопубликованной последовательностью белка andigena StCOL3, а также Н.Л. Клячко и Г.В. Новиковой (ИФР РАН) за конструктивные замечания при обсуждении рукописи.
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект 06-04-48932a) и ISTC-USDA-ARS (проект 3714p).

 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Kobayashi Y., Weigel D. Move on up, It’s Time for Change  Mobile Signals Controlling Photoperiod-Dependent Flowering // Genes Dev. 2007. V. 21. P. 2371-2384.
2. Turck F., Fornara F., Coupland G. Regulation and Identity of Florigen: FLOWERING LOCUS T Moves Center Stage // Annu. Rev. Plant Biol. 2008. V. 59. P. 573–594.
3. Ben-Naim O., Eshed R., Parnis A., Teper-Bamnolker P., Shalit A., Coupland G., Samach A., Lifschitz E. The CCAAT Binding Factor Can Mediate Interactions between CONSTANS-Like Proteins and DNA // Plant J. 2006. V. 46. P. 462-476.
4. Lifschitz E., Eviatar T., Rozman A., Shalit A., Goldshmidt A., Amsellem Z., Alvarez J.P., Eshed Y. The Tomato FT Ortholog Triggers Systemic Signals That Regulate Growth and Flowering and Substitute for Diverse Environmental Stimuli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 6398-6403.
5. Lifschitz E., Eshed Y. Universal Florigenic Signals Triggered by FT Homologues Regulate Growth and Flowering Cycles in Perennial Day-Neutral Tomato // J. Exp. Bot. 2006. V. 57. P. 3405-3414.
6. Rodrıguez-Falcon M., Bou J., Prat S. Seasonal Control of Tuberization in Potato: Conserved Elements with the Flowering Response // Annu. Rev. Plant Biol. 2006. V. 57. P. 151-180.
7. Дробязина П.Е., Хавкин Э.Е. Структурный гомолог гена CONSTANS у картофеля // Физиология растений. 2006. Т. 53. С. 786-789.
8. Drobyazina P.E., Khavkin E.E. Structural Homologs of CONSTANS and LEAFY in Potato and Its Wild Relatives // Acta Hort. 2007. V. 745. P. 411-419.
9. Ames M., Spooner D.M. DNA from Herbarium Specimens Settles a Controversy about Origins of the European Potato // Am. J. Bot. 2008. V. 95. P. 252-257.
10. Simon P. Q-Gene: Processing Quantitative Real-Time RT-PCR Data // Bioinformatics. 2003. V. 19. P. 1439-1440.
11. Miller T.A., Muslin E.H., Dorweiler J.E. A Maize CONSTANS-Like Gene, conz1, Exhibits Distinct Diurnal Expression Patterns in Varied Photoperiods // Planta. 2008. V. 227. P. 1377-1388.
12. Song Y.H., Song N.Y., Shin S.Y., Kim H.J., Yun D.-J., Lim C.O., Lee S.Y., Kang K.Y., Hong J.C. Isolation of CONSTANS as a TGA4/OBF4 Interacting Protein // Mol. Cells. 2008. V. 25. P. 559-565.
 

Олигонуклеотиды, использованные для изучения экспрессии COL1 методом ПЦР в реальном времени

Праймеры/

зонды

Последовательности

 

Назначение

 

COlong-F

5’-ATC-CTC-CTG-TTA-AGA-ATA-ACA-ATA-AGA-ACA-A-3’

амплификация lCOL1

COlong-R

5’-GAA-CTG-GCA-CAA-CAC-TAT-CTT-CAA-CA-3’

COshort-F

5’-CCT-CCT-GTT-AAG-AAG-AAC-AAT-AAG-ACC-TT-3’

амплификация sCOL1

COshort-R

5’-GAC-TTT-GTT-GTT-GCT-GCT-GTT-GGT-3’

Ac-F

5’-CWG-GAT-TTG-CGG-GAG-ATG-A-3’

амплификация гена актина

Ac-R

5’-TAC-CAG-TTG-TAC-GTC-CAC-TRG-C-3’

poly(T)

5’-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-NN-3’

обратная транскрипция

CO-TaqMan

FAM-CGA-TCA-GTA-CAG-TGT-TAA-TCA-GCA-GCA-BHQ1

зонд для определения COL1

Ac-TaqMan

ROX-TGC-CAA-ATC-TTC-TCC-ATG-TCA-TCC-BHQ2

зонд для определения гена актина

 


 ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

Рис. 1. Динамика экспрессии sCOL1 и lCOL1 у ДД/НД картофеля, сорт Early Rose.
Накопление COL1 мРНК в расчете на мРНК актина на ДД (а) и КД (б); соотношение величин экспрессии sCOL1 к lCOL1 на ДД и КД (в). Черным и белым обозначены периоды "ночи" и "дня". а: 1  sCOL1; 2  lCOL1; черный фон  темнота; белый фон  свет; б: 3  КД; 4  ДД.

Рис. 2. Суточный ритм экспрессии CO/COL1 у различных видов растений в условиях КД и ДД (схема на основе рис. 4 из [6]).
Черным и белым обозначены периоды "ночи" и "дня".