УДК 581.1:577.15
ОНТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ЗАВИСИМОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ РАЗЛИЧНЫХ
МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦИКЛА БЕНСОНА–КАЛЬВИНА В
ЛИСТЬЯХ ХЛОПЧАТНИКА
© 2010 г. М. А. Бабаджанова*, А. К. Мирзорахимов*, М. П. Бабаджанова**, Ш. А. Эсаналиева**
* Кафедра физиологии растений Таджикского государственного национального
университета, Душанбе
** Институт физиологии растений и генетики Академии наук Республики Таджикистан,
Душанбе
Поступила в редакцию 08.12.2008 г.
Из листьев хлопчатника (Gossypium hirsutum L.) одного яруса (3–4-й сверху) и одного
возраста (15–25-дневные) в фазе 5–6 настоящих листьев выделен один электрофоретически
гомогенный препарат свободного мультиферментного комплекса с мол. м. 520 ± 20 кД, а в
фазах бутонизации и цветения – два с мол. м. 520 ± 20 и 480 ± 15 кД. Проведены
сравнительные исследования онтогенетических изменений рибозофосфатизомеразной,
фосфорибулокиназной и рибулозобисфосфаткарбоксилазной активности.
Мультиферментные комплексы почти не различались по рибозофосфатизомеразной
активности. Различия мультиферментных комплексов по фосфорибулокиназной и
рибулозобисфосфаткарбоксилазной активности при использовании в качестве субстрата
рибозо-5-фосфата + АТФ составляли 14–17%, в присутствии же собственных специфических
субстратов – 6–7%. Онтогенетическая зависимость образования мультиферментных
комплексов цикла Бенсона–Кальвина с различными функциональными свойствами, по-
видимому, обусловлена возрастанием потребности эпигенетических процессов в
ассимилятах в период формирования репродуктивных органов.

----------------------------------------
Сокращения: МФК – мультиферментный комплекс; ПВП – поливинилпирролидон 25 000;
РФИ – рибозофосфатизомераза; ФРК – фосфорибулокиназа.
Адрес для корреспонденции: Бабаджанова Мухаббат Абдурахмановна. 734042 Душанбе, ул.
Бухоро, 22. Институт астрофизики АН Республики Таджикистан. Электронная почта:
jamshed@agroinvestbank.tj; pb@tajik.net

Ключевые слова: Gossypium hirsutum – мультиферментные комплексы – цикл Бенсона–
Кальвина – онтогенез – ферментативная активность

ВВЕДЕНИЕ
К настоящему времени многими исследователями показано, что ферменты цикла
Бенсона–Кальвина могут образовывать мультиферментные комплексы с различным числом
ферментов – от двух до восьми, которые различаются по молекулярной массе и
функциональным свойствам [1–3].
Из листьев хлопчатника были выделены свободные мультиферментные комплексы с
мол. м. 520 и 240 кД [4]. Мультиферментный комплекс с мол. м. 240 кД был выделен в
денатурирующих условиях, как и комплекс из листьев шпината с мол. м. 284 кД [5]. Разные
величины молекулярных масс мультиферментных комплексов, выделенных в
денатурирующих условиях из листьев шпината и хлопчатника, могут быть обусловлены как
спецификой объектов, так и различиями в методике выделения и очистки комплексов.
Денатурирующие условия при выделении мультиферментных комплексов были
использованы для диссоциации их на мультиферментные комплексы с меньшими
величинами молекулярных масс.
При сравнительном исследовании онтогенетических изменений функциональной
активности мультиферментных комплексов с молекулярной массой 520 и 240 кД
обнаружено, что наибольшие величины ферментативных активностей комплексы проявляли
в фазах бутонизации и цветения растений [4].
Для хлопчатника наиболее высокие величины интенсивности фотосинтеза,
содержания водорастворимых белков и активности ферментов карбоксилирующей фазы
фотосинтеза – рибозофосфатизомеразы (РФИ, КФ 5.3.1.6), фосфорибулокиназы (ФРК, КФ
2.7.1.19) и РБФК/О, характерны также для этих фаз развития растений [6–8].
Ранее [4, 9] при выделении мультиферментного комплекса из листьев хлопчатника в
фазах бутонизации и цветения на профиле элюции свободных белков при ионообменной
хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе суммарный белок выходил в виде двух отчетливых
пиков, резко различавшихся по содержанию белка. Фракция с наибольшим содержанием
белка представляла собой мультиферментный комплекс с мол. м. 520 кД. Во фракции с
меньшим содержанием белка нами не была определена ни величина молекулярной массы, ни
ферментативные активности.
В работе [10] установлено, что свободные мультиферментные комплексы цикла
Бенсона–Кальвина элюировались в широком диапазоне концентраций KCl – 0–600 мМ.
Молекулярная масса мультиферментных комплексов составляла от 200 до 1000 кД. Для того,
чтобы показать, что эти мультиферментные комплексы существуют in vivo не имеют
артефактное происхождение и не являются результатом процедуры выделения и очистки,
был проведен иммуноблоттинг, который показал, что ферменты цикла Бенсона–Кальвина в
неочищенных хлоропластных экстрактах образуют мультиферментные комплексы в самых
разнообразных сочетаниях. Кроме того, антитела реагировали со своими ферментами и в
мультиферментном комплексе, выделенном при нативном ПААГ-электрофорезе [5, 10].
Целью настоящей работы являлось выделение мультиферментных комплексов цикла
Бенсона–Кальвина из листьев хлопчатника разного возраста, а также исследование и
сравнение активности трех ферментов РФИ, ФРК и РБФК/О во всех отчетливых пиках,
полученных при ионообменной хроматографии свободных белков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растения хлопчатника (Gossypium hirsutum L.) сорта 108-Ф выращивали в полевых
условиях с выполнением всех агротехнических мероприятий на экспериментальном участке
Института физиологии растений и генетики АН Республики Таджикистан. Объектом
исследования служили листья с наибольшей фотосинтетической активностью 3–4-й сверху
(15–25-дневного возраста), взятые у растений в фазе 5–6 настоящих листьев, а также листья в
фазе массовой бутонизации и цветения.
При выделении свободного мультиферментного комплекса фрагменты листьев (50 г)
без срединной жилки выдерживали при –5?С в течение 30 мин, затем измельчали и
гомогенезировали в охлажденной фарфоровой ступке с 75 мл 0.1 М Трис-HCl-буфера, рН
8.5, содержавшего 10 мМ ДТТ, 10 мМ MgCl2, 5 мМ ЭДТА, 10 мМ NaHCO3, 20 мМ NaCl и 1%
поливинилпирролидона 25000 (ПВП) (буфер А). Гомогенат фильтровали через капроновую
ткань и центрифугировали в течение 30 мин при 15000 g на центрифуге с охлаждением
марки К-24 (VEB MLV, “Medizin technic”, Германия); осадок отбрасывали. Супернатант
наносили на колонку с молекулярным ситом Сефадекс G-50 (60 ? 2 см), уравновешенную
буфером того же состава, с которым растирали листья, но при pH 8.0 и без ПВП (буфер Б).
Элюат фракционировали сульфатом аммония. Фракцию белков, осажденных при 35–50%
насыщении сульфатом аммония, подвергали очистке сначала на колонке с сефадексом G-150
(45 ? 2.5 см), затем на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (20 ? 3 см) в условиях, подробно
описанным в работе [9].
Количественное определение белка проводили с реактивом Бенедикта [11].
Активность РФИ определяли по методу [12, с. 84], с необходимым тройным контролем: на
реактивы и на присутствие кетопентоз в ферментном препарате и препарате рибозо-5-
фосфата. При определении активности ФРК использовали метод [12, с. 89]. Количество
фосфора, гидролизуемого щелочью, определяли по методу [12, с. 90], используя в качестве
восстановителя аскорбиновую кислоту. Карбоксилазную активность РБФК/О определяли
спектрофотометрически по методике, описанной Романовой [12, с. 51]. Измерения
содержания белка и активности ферментов РФИ, ФРК и РБФК/О проводили на
высокочувствительном спектрофотометре ULTROCPEC II (“LKB”, Швеция) с полной
шкалой от 0 до 0.001 ед. экстинции. Аналитический диск-электрофорез в 7.5% ПААГ
использовали для определения гомогенности ферментных препаратов и их молекулярных
масс [13].
Калибровочный график для определения молекулярных масс мультиферментных
комплексов строили по относительной электрофоретической подвижности стандартных
белков с известной величиной молекулярной массы (кД): тироглобулина (660), ферритина
(450), глутаматдегидрогеназы (290), а также тетрамера (268), тримера (201), димера (134) и
мономера (67) БСА и яичного альбумина (45).
В работе использовали следующие реактивы: рибозо-5-фосфат, рибулозо-5-фосфат,
РБФ, АТФ, трис, ДТТ, БСА, ЭДТА, ПВП, стандартные белки ("Sigma", США); сефадекс G-
25, G-50, G-150 (“Pharmacia”, Швеция); ДЭАЭ-целлюлозу (“Serva”, Германия), другие
реактивы были марки х.ч. (Россия).
На рисунках и в таблицах приведены данные типичных опытов, которые
воспроизводились при 15–20-кратном повторении экспериментов. В таблицах приведены
среднеарифметические величины и их стандартные отклонения для 4 биологических
повторностей в каждой фазе развития растения.

РЕЗУЛЬТАТЫ

На рис. 1 представлен профиль элюции при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-
целлюлозе свободных белков, выделенных из листьев хлопчатника в фазе 5–6 настоящих
листьев. Видно, что суммарный белок выходил в виде одного отчетливого пика. Наибольшее
количество белка элюировалось во фракциях 3, 4, 5 при концентрациях NaCl 100, 150 и 200
мМ соответственно.
На рис. 2 изображен профиль элюции при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-
целлюлозе свободных белков, выделенных из листьев растений в фазе массовой
бутонизации. Видно, что белки элюировались в виде двух отчетливых пиков, резко
различавшихся по содержанию белка. В первом пике наибольшее количество белка
элюировалось при концентрации NaCl 150–160 мМ (фракция 4), а во втором пике – при
концентрации NaCl 370–380 мМ (фракция 8). При выделении свободного
мультиферментного комплекса из листьев хлопчатника в фазе массового цветения профиль
элюции белков был такой же, как на рис. 2. Белки фракций 4 и 8 (рис. 2) отбирали для
определения молекулярной массы и активности ферментов.
Для определения величин молекулярных масс белковые фракции 4 и 8 по отдельности
и их смесь подвергали диск-электрофорезу в 7.5% ПААГ. На рис. 3а видно, что смесь белков
фракций 4 и 8 (рис. 2) разделилась на две полосы. Белки фракции 4, а также фракции 8,
нанесенные по отдельности, проявились в виде одной полосы (рис. 3б и 3в). Молекулярная
масса белков фракции 4 (рис. 3б) и составляла 520 ± 20 кД. Белок фракции 8 (рис. 3в) имел
бoльшую электрофоретическую подвижность по сравнению с белком фракции 4 (рис. 3б), и
его мол. м. равнялась 480 ± 15 кД.
В табл. 1 приведены результаты определения ферментативной активности
мультиферментных комплексов с мол. м. 520 и 480 кД, выделенных из листьев хлопчатника
на различных фазах развития растений. Из представленных в табл. 1 данных видно, что на
всех фазах развития растений активности ФРК и РБФК/О мультиферментных комплексов
были выше при использовании рибозо-5-фосфата в сочетании с АТФ, а не в присутствии
собственных специфических субстратов – рибулозо-5-фосфата в сочетании с АТФ и РБФ.
По сравнению с фазой 5–6 настоящих листьев в фазе массовой бутонизации
активность РФИ мультиферментного комплекса с мол. м. 520 кД возросла на 16%. Величина
активности ФРК этого мультиферментного комплекса при использовании в качестве
субстрата рибозо-5-фосфата в сочетании с АТФ была выше на 20%, а в присутствии
собственного специфического субстрата рибулозо-5-фосфата с АТФ – на 15%.
Карбоксилазная активность мультиферментного комплекса в присутствии рибозо-5-фосфата
с АТФ увеличилась на 39%, при использовании же собственного специфического субстрата
РБФ – на 36%.
В фазах массовой бутонизации и цветения появлялся так же второй
мультиферментный комплекс с мол. м. 480 кД, который не был обнаружен в листьях
растений в фазе 5–6 настоящих листьев.
По сравнению с фазой бутонизации в фазе цветения активность РФИ у обоих
мультиферментных комплексов увеличилась на 10%. Активность же ФРК у обоих
мультиферментных комплексов как в присутствии рибозо-5-фосфата с АТФ, так и при
использовании собственного специфического субстрата почти не изменилась. Активность
РБФК/О в мультиферментном комплексе с мол. м. 520 кД независимо от субстрата была
выше на 7–10%, чем в комплексе с мол. м. 480 кД. При этом активность комплекса 520 кД в
присутствии собственного специфического субстрата также увеличилась на 20%, а при
использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата в сочетании с АТФ – на 26%.
Таким образом, независимо от величины молекулярной массы ферментативная
активность мультиферментных комплексов была наибольшей в фазе цветения растений.

ОБСУЖДЕНИЕ

Из листьев хлопчатника на различных фазах развития растений – 5–6 настоящих
листьев, массовой бутонизации и цветения, одним и тем же методом выделяли
мультиферментный комплекс цикла Бенсона–Кальвина. В фазе развития растений 5–6
настоящих листьев был выделен один мультиферментный комплекс с молекулярной массой
520 ± 20 кД. Начиная с фазы бутонизации растений, обнаруживался второй
мультиферментный комплекс с мол. м. 480 ± 15 кД.
Независимо от величины молекулярной массы и фазы развития растений, величины
активностей ФРК и РБФК/О у обоих мультиферментных комплексов при использовании в
качестве субстрата рибозо-5-фосфата в сочетании с АТФ были значительно выше, чем в
присутствии собственных специфических субстратов: рибулозо-5-фосфата с АТФ для ФРК и
РБФ – для РБФК/О.
Меньшая скорость протекания фосфорибулокиназной и рибулозобисфосфаткарбок-
силазной реакции при использовании собственных специфических субстратов по сравнению
с суммарной реакцией при добавлении рибозо-5-фосфата – первого субстрата
метаболической цепи:
           РФИ         ФРК
рибозо-5-фосфат   >   рибулозо-5-фосфат + АТФ   >   РБФ +
                                                     РБФК/О
                        +  СО2   >   (2)3-фосфоглицериновая кислота,

свидетельствует о “каналировании” интермедиатов без выхода их за пределы
микрокомпартмента мультиферментного комплекса. Превращения интермедиатов
происходят на конвейере активных центров, что исключает потерю времени на диффузию
интермедиатов к своим ферментам и значительно ускоряет их превращение [14–18].
В фазах бутонизации и цветения мультиферментные комплексы почти не различались
между собой по активности РФИ. Активность ФРК мультиферментного комплекса с мол. м.
520 кД была выше активности мультиферментного комплекса с мол. м. 480 кД в присутствии
рибозо-5-фосфата с АТФ на 16–17%, а при использовании собственного специфического
субстрата рибулозо-5-фосфата с АТФ – на 6%. По карбоксилазной активности
мультиферментный комплекс с мол. м. 520 кД превосходил мультиферментный комплекс с
мол. м. 480 кД в присутствии рибозо-5-фосфата с АТФ в фазе бутонизации на 14%, а в фазе
цветения – на 10%. Активность РБФК/О мультиферментного комплекса с мол. м. 520 кД при
использовании собственного специфического субстрата РБФ на обеих фазах развития
растений была выше активности мультиферментного комплекса с мол. м. 480 кД на 6–7%.
В работе [4] установлено, что при использовании в качестве субстрата рибозо-5-
фосфата в сочетании с АТФ мультиферментный комплекс с мол. м. 520 кД по
карбоксилазной активности РБФК/О превосходил комплекс с мол. м. 240 кД у растений в
фазе бутонизации на 34%, в фазе цветения – на 22%. В табл. 2 представлены данные о
кинетических параметрах свободной РБФК/О и встроенной в мультиферментные комплексы
с различными величинами молекулярных масс.
Из приведенных в табл. 2 данных видна четкая зависимость кинетических параметров
РБФК/О (Vmax, KМ) от ее структурной организации. Свободная РБФК/О, выделенная из
листьев шпината [19], имела 8 больших (L) и 8 малых (S) субъединиц (L8S8) и обладала в
сравнении с РБФК/О, встроенной в мультиферментный комплекс и имевшей структуру L2S4,
вдвое меньшим сродством к своему субстрату РБФ и в 5 раз меньшую максимальную
скорость (Vmax) в расчете на один активный центр.
Сравнение кинетических параметров РБФК/О из листьев хлопчатника [4, 20],
встроенной в различные мультиферментные комплексы, показало, что с увеличением
молекулярной массы мультиферментных комплексов возрастали и максимальная скорость
карбоксилазной реакции, и сродство фермента к субстрату. Следует отметить, что
наибольшие величины Vmax и наименьшие величины KМ достигались при использовании в
качестве субстрата рибозо-5-фосфата в сочетании с АТФ, а не РБФ. Повышение рибозо-5-
фосфатом – субстратом первого фермента комплекса величины Vmax, последующих реакций
и снижение величины KМ для субстратов второй и третьей реакции данной метаболической
цепи является проявлением координированных регуляторных эффектов [14–17].
В работе [4] была предложена схема иерархии механизмов регуляции активности
свободных ферментов цикла Бенсона–Кальвина и различных форм их надмолекулярной
организации. Представленные в табл. 2 данные свидетельствуют о функциональной
значимости диссоциативного и координированного механизмов регуляции активности
РБФК/О, встроенных в мультиферментные комплексы с различной величиной молекулярной
массы.
На основании представленных в настоящей статье и полученных нами ранее
экспериментальных данных [4] можно считать, что онтогенетическая зависимость
образования мультиферментных комплексов цикла Бенсона–Кальвина с различными
функциональными свойствами обусловлена возрастанием потребности эпигенетических
процессов в ассимилятах, особенно в период формирования репродуктивных органов.


СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Романова А.К., Павловец В.В. Надмолекулярные комплексы ферментов
автотрофной ассимиляции углекислоты при фотосинтезе // Физиология растений. 1997. Т. 44.
С. 264-274.
2. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П., Бабаджанова М.П. Функциональные свойства
мультиферментного комплекса цикла Кальвина // Физиология растений. 2000. Т. 47. С. 27-36.
3. Gontero B., Lebreton S., Graciet E. Multienzyme Complexes Involved in the Benson–
Calvin Cycle and in Fatty Acid Metabolism // Annu. Plant Reviews / Eds Mc. Manus M.T., Laing
W., Allan A. New York: Sheffield Academic Press, 2002. V. 7. P. 120-150.
4. Бабаджанова М.П., Бабаджанова М.А., Алиев К.А. Онтогенетические изменения
ферментативных активностей свободных мультиферментных комплексов цикла Бенсона–
Кальвина // Физиология растений. 2006. Т. 53. С. 38-44.
5. Rault M., Guidici-Orticoni M.-T., Gontero B., Ricard J. Structural and Functional
Properties of a Multi-Еnzyme Complex from Spinach Chloroplasts. 1. Stoichiometry of the
Polypeptide Chains // Eur. J. Biochem. 1993. V. 217. P. 1065-1073.
6. Якубова М.М., Юлдашев Х.Ю. Фотосинтетический метаболизм углерода в
онтогенезе листа хлопчатника // Научн. докл. высш. шк. Сер. биол. наук. 1984. С. 60-63.
7. Бабаджанова М.А., Гиясов Т.Д. Онтогенетические изменения содержания белка и
активности pибулозодифосфаткаpбоксилазы листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта
Дуплекс // Докл. АН ТаджССР. 1984. Т. 27. С. 533-536.
8. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П. Онтогенетические изменения содержания и
активности рибозофосфатизомеразы из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта
Дуплекс // Докл. АН ТаджССР. 1989. Т. 29. С. 120-123.
9. Бабаджанова М.П., Бабаджанова М.А., Алиев К.А. Свободный и
мембраносвязанный мультиферментный комплекс цикла Кальвина листьев хлопчатника //
Физиология растений. 2002. Т. 49. С. 663-667.
10. Suss K.-H., Arcona C., Manteuffel R., Adler K. Calvin Cycle Multienzyme Complexes
Are Bound to Chloroplast Thylakoid Membranes of Higher Plants in situ // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 1993. V. 90. P. 5514-5518.
11. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высш. шк., 1980.
272 с.
12. Романова А.К. Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганизмов. М.:
Наука, 1980. 158 с.
13. Маурер Г. Диск-электрофорез. М.: Мир, 1971. 360 с.
14. Фpидpих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные
комплексы. М.: Миp, 1986. 374 с.
15. Курганов Б.И. Роль мультиферментных комплексов в интеграции клеточного
метаболизма // Молекуляр. биология. 1986. Т. 20. С. 1530-1538.
16. Keleti Т., Ovadi J., Batke J. Kinetic and Physical-Сhemical Analysis of Enzyme
Complexes and Their Possible Role in the Control of Metabolism // Prog. Biophys. Mol. Biol.
1989. V. 53. P. 105-152.
17. Куpганов Б.И., Любаpев А.Е. Проблемы биохимической организации //
Биохимия. 1991. Т. 56. С. 19-32.
18. Еpмаков Г.Л. Надмолекуляpная оpганизация феpментных систем. 1.
Структурный аспект проблемы // Биохимия. 1993. Т. 58. С. 659-674.
19. Gontero B., Mulliert G., Rault M., Guidici-Orticoni M.-T., Ricard J. Structural and
Functional Properties of a Multi-Enzyme Complex from Spinach Chloroplasts. 2. Modulation of the
Kinetic Properties of Enzymes in the Aggregated State // Eur. J. Biochem. 1993. V. 217. P. 1075-
1082.
20. Бабаджанова М.П. Надмолекулярные комплексы ферментов цикла Кальвина
из листьев хлопчатника // Изв. АН Респ. Таджикистан. 2001. Т. 1. С. 137-146.


Подписи к рисункам

Рис. 1. Профиль элюции белков, выделенных их листьев хлопчатника в фазе 5–6 настоящих
листьев, при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ–целлюлозе с линейным градиентом
NaCl.

Рис. 2. Профиль элюции белков, выделенных их листьев хлопчатника в фазе бутонизации,
при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ–целлюлозе с линейным градиентом NaCl.

Рис. 3. Электрофорез в 7.5% ПААГ белков, выделенных при ионообменной хроматографии
на ДЭАЭ-целюлозе из листьев хлопчатника в фазе бутонизации.
а – смесь белков фракции 4 и 8; б – фракция 4; в – фракция 8.