УДК 581.1
РЕАКЦИИ ЛИШЕННОГО ХЛОРОФИЛЛА b МУТАНТА ЯЧМЕНЯ chlorina 3613 НА ПРОЛОНГИРОВАННОЕ СНИЖЕНИЕ ОСВЕЩЕННОСТИ.
2. ДИНАМИКА КАРОТИНОИДОВ В ХЛОРОПЛАСТАХ ЛИСТЬЕВ
© 2011 г. Е. В. Тютерева, О. В. Войцеховская
Учреждение Российской академии наук Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН, лаб. экологической физиологии, Санкт-Петербург
Поступила в редакцию 26.11.2010 г.
Мутант ячменя (Hordeum vulgare L.) chlorina 3613 характеризуется отсутствием хлорофилла b (Хл b), пониженным содержанием хлорофилла а (Хл a) и каротиноидов в хлоропластах, а также редукцией большинства компонентов ССК I и ССК II. Следствием неполного развития фотосинтетического аппарата chlorina 3613 является угнетенный рост и низкие относительно исходного сорта Donaria биомасса и интенсивность фотосинтеза. Отсутствие Хл b и большей части периферической антенны позволяет предположить, что этот мутант будет испытывать трудности при адаптации к продолжительному затенению, так как светособирающая роль Хл b-содержащей антенны возрастает при недостатке света. Ранее наши эксперименты, в которых взрослые растения chlorina 3613 находились в условиях затенения в течение одной недели при плотности потока фотонов ФАР 60 и 40% от таковой на полном солнечном свету, напротив, показали стимулирующий эффект затенения на рост, накопление биомассы и синтез Хл a у chlorina 3613 при отсутствии биосинтеза Хл b [1]. В настоящей работе мы подробно исследовали изменения содержания каротиноидов chlorina 3613 и установили, что у сорта Donaria при обоих исследованных уровнях освещения (60 и 40% от полного солнечного света), а также у chlorina 3613 при 60%-ном освещении происходили типичные для теневыносливых растений небольшие обратимые изменения содержания каротиноидов. У chlorina 3613 при 40%-ном уровне освещения значительно (в три раза) возрастало содержание β-каротина одновременно с накоплением Хл a. По возвращении растений на полный свет содержание β-каротина снижалось и стабилизировалось на уровне, на 38% превышающем его исходное содержание у не затенявшихся растений, который сохранялся до конца вегетации. Изменения в содержании β-каротина и Хл a у сhlorina 3613 не сопровождались ни накоплением ксантофиллов, ни изменением доли "активного" виолаксантина. Совокупность полученных данных позволяет предположить, что длительное затенение индуцировало в листьях взрослых растений chlorina 3613 образование отдельных компонентов фотосинтетического аппарата: реакционных центров и коровой части антенн фотосистем, а также белков СР26 и СР29, что способствовало частичному восстановлению фотосинтетической активности и продукционного процесса на фоне отсутствия Хл b у этого мутанта.
---------------------------------------------
Сокращения: ВЦ ( виолаксантиновый цикл; Хл a ( хлорофилл а; Хл b ( хлорофилл b.
Адрес для корреспонденции: Войцеховская Ольга Владимировна. 197397 Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 2. Ботанический институт РАН, лаб. экологической физиологии. Электронная почта: ovoitse@yandex.ru

Ключевые слова: Hordeum vulgare - chlorina 3613 - хлорофилл b - β-каротин- каротиноиды - ССК - фотосистемы - белки СР26 и СР29

ВВЕДЕНИЕ
Фотосинтетический аппарат высших растений способен к перестройкам, которые позволяют растениям гибко реагировать на изменения светового режима, обеспечивая их успешный рост и развитие в непрерывно меняющихся внешних условиях. В то же время, сами пигмент(белковые комплексы, входящие в состав фотосинтетического аппарата, характеризуются постоянством состава и структуры, а адаптивные перестройки осуществляются путем изменения их числа и соотношения в мембранах тилакоидов. Основные пигмент(белковые комплексы - ФС I, ФС II, ССК I, ССК II, цитохромный b6/f комплекс - различаются по составу входящих в них хлорофиллов и каротиноидов. Так, в состав коровых комплексов ФС I, ФС II, а также цитохромного b6/f комплекса входят Хл а и β-каротин; в состав ССК I входят Хл а, Хл b, лютеин и, возможно, виолаксантин; в состав ССК II ( Хл а, Хл b, лютеин, виолаксантин, неоксантин [2, 3]. Цитохромный b6/f комплекс содержит всего по одной молекуле β-каротина и Хл а, функция которых пока неизвестна, а ФС I содержит около 100 молекул Хл а и 20 молекул β-каротина [3]. Количество молекул пигментов на один пигмент(белковый комплекс ФС I (реакционный центр + коровая часть антенны), по-видимому, постоянно для данного вида, но проявляет видоспецифичность [2, 3]. Вероятно, это же справедливо и для других пигмент(белковых комплексов фотосинтетического аппарата высших растений [2, 3].
ФС I и ФС II организованы в крупные суперкомплексы с различным числом компонентов периферической части антенны - ССК I и ССК II. Все белки ССК I связывают гораздо больше Хл а, чем Хл b (a : b = 3(4), тогда как белки главного антенного комплекса ССК II связывают их примерно в равном соотношении, но в состав ССК II, кроме того, входят белки так называемой "малой периферической антенны" ( СР24, СР26 и СР29, которые связывают значительно больше Хл а, чем Хл b [4]. Все белки ССК содержат также ксантофиллы. Известно, что роль Хл b и связанных с ним белков ССК состоит в регуляции распределения энергии между ФС I и ФС II, в диссипации избытка поглощенной световой энергии при нефотохимическом тушении флуоресценции [5], в морфогенезе и поддержании структуры тилакоидов, а также в адаптации растений к условиям низкой освещенности за счет увеличения светосбора. Одним из продуктивных подходов при исследованиях структурно-функциональной роли Хл b стал анализ конститутивных и кондициональных мутантов, в хлоропластах которых Хл b либо отсутствует, либо его содержание снижено по сравнению с растениями исходного генотипа. Мутант ячменя chlorina 3613 был получен методом облучения рентгеновскими лучами семян ячменя сорта Donaria [6]. Этот мутант характеризуется отсутствием Хл b, пониженным содержанием Хл а (около 30% от такового у растений дикого типа [7]) и рядом других особенностей. Так, в хлоропластах этого мутанта полностью отсутствуют белки ССК I и частично редуцированы белки ССК II [7], который у chlorina 3613 представлен в основном белками "малой антенны" СР26 и СР29. Размер пула каротиноидов chlorina 3613 меньше, чем у растений дикого типа, очевидно, тоже из-за пониженного количества белков ССК, с которыми связана бóльшая часть каротиноидов в хлоропластах. Хлоропласты chlorina 3613, в отличие от хлоропластов растений дикого типа, содержат небольшие граны с малым числом тилакоидов [8], предположительно из-за низкого содержания ССК [9]. Вследствие неполного развития фотосинтетического аппарата растения chlorina 3613 отличаются медленным ростом, низкой биомассой и пониженной скоростью фотосинтетической фиксации СО2 по сравнению с исходным сортом Donaria.
Задачей данной работы было охарактеризовать изменения каротиноидов в хлоропластах взрослых растений chlorina 3613 при затенении, когда у растений дикого типа стимулируется биосинтез белков ССК и увеличивается размер Хл b-содержащей антенны. Поскольку у chlorina 3613 отсутствует Хл b и бóльшая часть периферической антенны [7], то мы предполагали, что мутант будет испытывать трудности при адаптации к пролонгированному затенению, что приведет к еще более сильному отставанию затененных растений chlorina 3613 в росте и развитии по сравнению с незатененным контролем и с родительским сортом Donaria. В наших опытах было обнаружено, что chlorina 3613, аналогично ряду других мутантов с синдромом chlorina [10], способен к восстановлению биосинтеза Хл b [1]. Однако стимулирующий эффект затенения на накопление биомассы взрослых растений chlorina 3613 был выявлен и на фоне отсутствия возобновления биосинтеза Хл b [1]. В этих опытах растения chlorina 3613, выращиваемые в открытом грунте, были затенены в течение одной недели так, что плотность потока фотонов ФАР составляла 60(40% от таковой на полном солнечном свету. В результате затенения наблюдали накопление Хл а у chlorina 3613, что, очевидно, являлось базисом для увеличения роста и накопления биомассы [1, 11]. Этот неожиданный эффект затенения до настоящего времени не был описан для мутантов c синдромом chlorina. Исследование механизмов, лежащих в основе данного эффекта, представляется важным, в том числе для изучения регуляции биосинтеза хлорофилла и биогенеза отдельных компонентов фотосинтетического аппарата.
В настоящей работе было изучено содержание каротиноидов chlorina 3613 в ходе экспериментальной адаптации растений к сниженному освещению и при последующем возврате полного естественного освещения. Также определяли размер пула "активного" виолаксантина (т.е. виолаксантина, вступающего в реакции в виолаксантиновом цикле (ВЦ) [12]), так как активный виолаксантин связан с белками СР24, СР26 и СР29 [13], а неактивный виолаксантин - с белками периферической антенны ССК II [14, 15]. На основании совокупности полученных данных анализируется направленность изменений в составе белковых комплексов фотосинтетических мембран chlorina 3613, индуцированных экспериментальными изменениями освещения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Семена мутанта ячменя (Hordeum vulgare L.) chlorina 3613 и родительского сорта Donaria (дикий тип) были получены из банка семян ин-та им. Лейбница (Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung, Гатерслебен, Германия). Растения выращивали в пределах городской черты Санкт-Петербурга в 2006(2008 гг. в открытом грунте посевной площадки Эколого-биологического центра "Крестовский остров" на целинной, среднеплодородной, легко суглинистой почве с мая по сентябрь. Растения контрольных делянок от стадии проростка и до завершения онтогенеза произрастали при естественном освещении. Растения экспериментальных делянок по достижении ими фенофазы "кущения(выхода в трубку" (июль) затеняли на 7 суток. Затенение создавали многослойными марлевыми пологами. По истечении 7 суток растениям возвращали полное естественное освещение до завершения онтогенеза. На одних экспериментальных делянках освещение снижали до 60%, на других - до 40% от полного естественного света, при котором в безоблачные полуденные часы плотность потока фотонов ФАР составляла 2000(2200 мкмоль/(м2 с). Плотность потока фотонов ФАР определяли микросенсором ФАР ("ADC Bioscientific", Великобритания).
Пигменты экстрагировали ацетоном (х.ч.), используя активно растущие листья 5- и 6-го ярусов главных побегов. Образцы вытяжек из листьев контрольных и экспериментальных растений готовили непосредственно перед установкой марлевого полога, на 3-и, 5-е и 7-е сутки пребывания под пологом, и через 7 суток после съема полога (т.е. на 14-е сутки от начала опыта). Количество Хл а и Хл b измеряли на спектрофотометре Specord UV-VIS ("Jena Zeiss", Германия) с последующими расчетами по формулам Lichtenthaler [16]. Количество каротиноидов определяли спектрофотометрически после хроматографического разделения ацетоновых вытяжек в тонком слое в системе растворителей - бензин марки "Нефрас" : ацетон : хлороформ в соотношении 6 : 5 : 4. Долю активного виолаксантина определяли ингибиторным методом с использованием салицилальдоксима в концентрации 2.5 мМ.
Эксперименты проводили в течение вегетационных сезонов 2006(2009 гг. и дали воспроизводимые результаты. В статье приводятся данные экспериментов 2006 г. Представлены средние арифметические из пяти биологических повторностей и стандартные отклонения. Достоверность различий между средними арифметическими оценивали по t-критерию Стьюдента при 95% уровне значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Исходное суммарное содержание каротиноидов у растений chlorina 3613 было более, чем в два раза ниже, чем у Donaria (табл. 1), что соответствует известным для chlorina 3613 данным [7, 15]. Помещение растений под марлевый полог по-разному повлияло на содержание каротиноидов в листьях мутанта и дикого типа. У Donaria оно возросло после затенения (на 5% после экспозиции растений на 60%-ном свету и на 12% после экспозиции на 40%-ном свету), а через семь дней после снятия полога вернулось к исходному уровню (табл. 1). У chlorina 3613 семидневная экспозиция растений при освещении 60% от полного солнечного света, как и последующий возврат полного света, практически не повлияли на суммарное содержание каротиноидов. Однако, когда растения chlorina 3613 помещали на 40%-ный свет, то через семь дней после затенения суммарное содержание каротиноидов увеличивалось на 80%. Через неделю после возвращения этим растениям полного естественного освещения суммарное содержание каротиноидов снижалось, но оставалось на уровне, на 37% превышающем содержание каротиноидов как в самих этих растениях до начала эксперимента (табл. 1), так и в контрольных, т.е. не затенявшихся растениях.
Анализ изменений количества индивидуальных каротиноидов в растениях Donaria и chlorina 3613 в ходе экспериментов с помещением растений в условия на 60%- и 40%-ный свет, соответственно, приведен на рис. 1 и рис. 2. На 60%-ном свету у растений Donaria под пологом содержание лютеина практически не изменилось, но наблюдалось обратимое увеличение содержания β-каротина (на 8%) и неоксантина (на 20%), а также снижение содержания зеаксантина на 50% и параллельный прирост содержания виолаксантина на 15% (рис. 1а, 1в, 1д, 1ж). У chlorina 3613 при аналогичном типе затенения содержание лютеина и β-каротина практически не изменялось (рис. 1б, 1г), но имела место слабая тенденция к повышению содержания неоксантина (рис. 1е). Статистически значимые изменения при затенении chlorina 3613 наблюдали только в пигментах ВЦ: количество зеаксантина при затенении снижалось на 50%, а количество виолаксантина увеличивалось на 27%. При этом зеаксантина у chlorina 3613 под пологом оставалось больше, чем у Donaria (рис. 1з). Все наблюдаемые изменения в содержании каротиноидов были обратимы как у Donaria, так и у chlorina 3613, т.е. при возврате полного естественного освещения содержание индивидуальных каротиноидов возвращалось к исходному уровню.
Динамика каротиноидов в экспериментах с помещением растений на 40%-ный свет представлена на рис. 2. У Donaria тенденция к увеличению содержания β-каротина и ксантофиллов под пологом была более ярко выражена по сравнению с предыдущим вариантом затенения (60%-ный свет). Количества лютеина и β-каротина под пологом увеличились на 23 и 20% соответственно, а содержание неоксантина изменилось слабо. Прирост виолаксантина составил 38%, а зеаксантин под пологом полностью исчез (рис. 2а, 1в, 1д, 1ж). Все наблюдаемые изменения были обратимыми, поскольку через неделю после снятия полога количества каждого из каротиноидов вернулись к исходному уровню, за исключением зеаксантина, который за неделю после снятия полога накопился лишь до уровня 60% от его начального содержания (рис. 2а, 1в, 1д, 1ж). У chlorina 3613 наиболее ярким ответом на затенение стало накопление β-каротина, которое через неделю под пологом составило 150% от исходного уровня (рис. 2г). На 25% возросло содержание лютеина, и на 50% ( неоксантина (рис. 2б, 2е). Содержание зеаксантина под пологом снизилось на 50% от исходного уровня, но полного его исчезновения не произошло (рис. 2з). Через неделю после снятия полога количества лютеина и неоксантина, а также пигментов ВЦ у chlorina 3613 вернулись к исходному уровню (рис. 2б, 2е, 2з). Однако количество β-каротина хотя и снизилось после снятия полога, но стабилизировалось на уровне, на 38% превышающем его содержание в растениях до начала эксперимента (рис. 2г).
Таким образом, помещение растений chlorina 3613 на 60%-ный свет не приводило к резким изменениям содержания каротиноидов ни во время, ни после затенения. Однако при помещении chlorina 3613 на 40%-ный свет в листьях под пологом накапливались β-каротин и ксантофиллы, а после снятия полога снизилось до исходного уровня содержание ксантофиллов, но не β-каротина. Результатом недельной экспозиции взрослых растений chlorina 3613 на 40%-ном свету стало стабильное повышение содержания β-каротина в листьях на 38% по сравнению с листьями не затенявшихся растений. Сопоставление этих данных с изученными нами ранее изменениями хлорофиллов [1, 11] показывает, что накопление β-каротина у chlorina 3613 совпадает с накоплением Хл a: такие листья накапливали дополнительно 50% Хл a по сравнению с листьями не затенявшихся растений, и после удаления полога "догоняли" по содержанию Хл a родительский сорт Donaria [1, 11].
Данные о размере пула активного виолаксантина в листьях растений Donaria и chlorina 3613 приведены в табл. 2. У мутанта общее содержание виолаксантина в листьях в контрольном и экспериментальных вариантах было ниже, чем у растений дикого типа, а доля активного виолаксантина - выше. Семидневное затенение растений не приводило к изменению доли активного виолаксантина как у Donaria, так и у chlorina 3613 (табл. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что изменения содержания и соотношения пластидных пигментов в листьях отражают изменения в пропорции различных пигмент-белковых комплексов в мембранах тилакоидов. Фотосинтетические пигменты - хлорофиллы и бóльшая часть каротиноидов - всегда присутствуют в хлоропластах в связанном с белками виде. Это достигается тонкой координацией биосинтезов пигментов и белковых субъединиц фотосинтетического аппарата, механизмы которой остаются малоизученными. Мы попытались путем определения динамики индивидуальных пластидных пигментов выявить характер изменений в составе тилакоидных мембран у лишенного Хл b мутанта ячменя chlorina 3613 при изменении световых условий произрастания растений. Наблюдения проводили в течение недели экспериментального затенения растений и последующей семидневной экспозиции при полном естественном освещении.
Затенение растений вызывает закономерные перестройки состава тилакоидов. В хлоропластах, сформировавшихся при низкой освещенности ("теневые хлоропласты"), по сравнению со "световыми хлоропластами" увеличено содержание ССК I и ССК II [17, 18]. Это отражается и в содержании пигментов: такие хлоропласты обычно содержат больше Хл b, лютеина и неоксантина, чем "световые хлоропласты" [17(19]. Соответствующие изменения ранее наблюдали и в процессе адаптации растений к измененному уровню освещенности [20]. Этим закономерностям отвечали изменения каротиноидов в листьях Donaria при затенении растений и при их последующем возврате на полный солнечный свет. У Donaria количества каротиноидов под пологом увеличивались, при этом более сильное затенение приводило к более заметным изменениям содержания каротиноидов. При возврате к исходной освещенности количество каротиноидов снижалось до исходного уровня. Таким образом, в листьях Donaria описанные изменения, очевидно, связаны с адаптацией к меняющемуся световому режиму. По-видимому, увеличение пула ксантофиллов отражает тенденцию к увеличению содержания ССК I и ССК II, а увеличение β-каротина - к увеличению содержания коровых частей фотосистем, соответственно, в мембранах тилакоидов ячменя дикого типа при низком уровне освещения. При возврате растений в условия полного естественного освещения происходила обратная перестройка.
У chlorina 3613 на 60%-ном свету изменения в составе каротиноидов практически не были выражены. Это может объясняться тем, что у chlorina 3613 не происходит образования стабильных ССК, поскольку известно, что в отсутствие Хл b белковые компоненты ССК быстро деградируют после встраивания в мембрану [21]. По сложившимся представлениям, полноценная сборка ССК невозможна в отсутствие Хл b [22], что представляет собой классический пример координации биосинтеза пигментных и белковых компонентов в фотосинтезирующей растительной клетке. Поэтому следовало ожидать, что у chlorina 3613 отсутствие синтеза Хл b влечет за собой невозможность образования под пологом дополнительных ССК, в которые могли бы встраиваться вновь синтезированные ксантофиллы. Увеличения числа комплексов фотосистем у chlorina 3613 на 60%-ном свету, по-видимому, также не происходило, и поэтому суммарный уровень каротиноидов не увеличивался. Однако при более сильном затенении картина существенно менялась. Под пологом на 40%-ном свету у chlorina 3613 имела место индукция синтеза β-каротина: его прирост к седьмому дню затенения составил 150% от исходного содержания. После снятия полога уровень β-каротина несколько снижался и стабилизировался на уровне, на 38% превышающем исходный. У Donaria при этом способе затенения также наблюдался прирост содержания β-каротина, но он был гораздо менее выражен (увеличение составило 20% от исходного содержания) и полностью обратим. Кроме того, у chlorina 3613 имел место существенный прирост содержания ксантофиллов неоксантина и лютеина (на 50 и 25% соответственно), но количества этих пигментов после снятия полога вернулись к исходному уровню. В целом полученные нами данные свидетельствуют о том, что в ходе описанных экспериментов во время сильного затенения у chlorina 3613, несмотря на отсутствие Хл b [1], имело место образование дополнительного числа компонентов фотосинтетического аппарата: фотосистем как места связывания β-каротина, и ССК как локусов связывания ксантофиллов.
Одновременно с накоплением каротиноидов у тех же растений chlorina 3613 происходило накопление Хл a: на 40%-ном свету содержание Хл а возрастало на 48% от исходного уровня до начала затенения [1, 11]. Таким образом, при этом типе затенения под пологом наблюдался прирост содержания пигментов - облигатных компонентов фотосистем (Хл а и β-каротина), а также облигатных компонентов ССК (ксантофиллов неоксантина и лютеина), а после снятия полога в листьях сохранялось повышенное содержание Хл а и β-каротина. Необходимо отметить, что на 60%-ном свету под пологом наблюдался только полностью обратимый прирост содержания Хл а на 18% [1, 11], без параллельного накопления каротиноидов.
Совокупность данных относительно динамики пигментов в листьях chlorina 3613 при затенении можно интерпретировать следующим образом. На 60%-ном свету у chlorina 3613 увеличилось число белков "малой антенны" ( СР26 и СР29, в которые встраивается дополнительное количество образовавшегося в этих условиях Хл а; после возврата растениям полного освещения размер "малой антенны" возвращался к исходному уровню. Такой сценарий представляется вероятным, поскольку белки СР26 и СР29 синтезируются у chlorina 3613, несмотря на отсутствие Хл b, и ранее было обнаружено, что при варьировании освещенности количество белков "малой антенны" у chlorina 3613 изменялось [7]. На 40%-ном свету сильный прирост содержания β-каротина и Хл а, а также ксантофиллов неоксантина и лютеина, указывает на образование дополнительных комплексов фотосистем и "малой антенны", а также, возможно, ССК, поскольку именно эти комплексы являются основным местом локализации неоксантина и лютеина. Если это предположение верно, то в ССК таких растений Хл b, возможно, замещается на Хл а. На первый взгляд, это представляется неожиданным, учитывая, что соотношение Хл b/Хл а в ССК у всех изученных к настоящему времени высших растений дикого типа строго постоянно, что могло бы указывать на невозможность замены одного типа хлорофилла другим. Однако данные недавних исследований показывают, что Хл b может функционально замещать Хл а: клонирование гена хлорофиллид а-оксигеназы позволило получить трансгенные растения, накапливающие необычно высокий уровень Хл b, который у этих растений встраивался не только в ССК, но и в коровую часть антенн фотосистем [23]. Наиболее неожиданным оказалось то, что повышение соотношения Хл b/Хл а в ССК и замещение 40% Хл а на Хл b в фотосистемах таких растений не приводило к снижению их фотосинтетической активности по сравнению с диким типом [23]. Следовательно, оба типа хлорофилла являются функционально более взаимозаменяемыми, чем это было принято считать до сих пор.
После снятия полога в опытах с 40%-ным освещением у chlorina 3613 содержание неоксантина и лютеина снизилось до исходного уровня, что предположительно указывает на уменьшение числа ССК в хлоропластах этих растений. Однако содержание комплексов, включающих β-каротин и Хл а, очевидно, стабилизировалось в мембранах тилакоидов на более высоком уровне, чем до начала экспериментов. Тот факт, что в течение недели после возврата полной освещенности на фоне прироста и стабилизации содержания Хл а имеет место некоторое снижение содержания β-каротина по сравнению с его уровнем под пологом, вероятно, объясняется тем, что β-каротин включается только в фотосистемы, а Хл а, кроме того, еще и в белки "малой антенны". В результате затенения размер пула активного виолаксантина у chlorina 3613 не изменился (табл. 2), что указывает на то, что доля "малой антенны" в "общей антенне" не изменилась. Таким образом, если биогенез ССК и имел место в данном эксперименте, то только во время затенения, но стабильного увеличения ССК в дальнейшем не произошло. Доля активного виолаксантина у растений дикого типа составляет до 80% [14]. В работе [15] у проростков chlorina 3613 описано увеличение пула активного виолаксантина (98% по сравнению с 75% у дикого типа). В наших опытах доля активного виолаксантина у chlorina 3613 была ниже, возможно, потому, что использовались листья взрослых растений, а не проростки.
В пользу предположения об индукции биогенеза фотосистем и белков "малой антенны" у chlorina 3613 в наших опытах свидетельствуют исследования кондиционального мутанта пшеницы CD3 chlorina с аналогичными функциональными нарушениями фотосинтетического аппарата [24]. В условиях полной освещенности этот мутант проявляет фенотип chlorina: в листьях не синтезируется Хл b, снижено содержание Хл а, отсутствуют белки ССК1, СР24 и СР29 [25]. Однако помещение CD3 chlorina в условия освещения, соответствующего 1/13 интенсивности солнечного света, вызывало накопление Хл b, Хл а и каротиноидов, образование Хл b-содержащей антенны и восстановление гранальной структуры хлоропластов [25]. На высоком свету у CD3 chlorina в тилакоидах хлоропластов преобладали комплексы ФС I, а на низком свету было стимулировано образование белков ССК I, СР29 и ФС II [25]. Мы предполагаем, что сходные перестройки состава мембран тилакоидов могут иметь место у chlorina 3613, как при возобновлении биосинтеза Хл b, так и в ходе экспериментов, описанных в настоящей работе, где не отмечено накопления Хл b. В последнем случае при образовании компонентов фотосинтетического аппарата, возможно, имело место частичное замещение Хл b на Хл а. Для проверки этого предположения необходимы исследования состава тилакоидных мембран с помощью антител к индивидуальным белкам-компонентам фотосинтетического аппарата. Однако имеющиеся данные уже сейчас позволяют заключить, что chlorina 3613 может стать перспективной моделью для изучения биогенеза компонентов фотосинтетического аппарата и роли света в регуляции этого процесса.
Авторы благодарны Т.Г. Масловой за методические консультации. Мы благодарим Институт им. Лейбница и Банк семян за любезно предоставленные семена, и Эколого-биологический центр "Крестовский остров" за предоставление участка для выращивания растений.
Исследование поддержано грантом Российского фонда фундаментальных исследований (№ 07-04-01707).


СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.Тютерева Е.В., Войцеховская О.В. Реакции лишенного хлорофилла b мутанта ячменя chlorina 3613 на пролонгированное снижение освещенности. 1. Динамика содержания хлорофиллов, роста и продуктивности // Физиология растений. 2011. Т. 58. С.
2.Dekker J.P., Boekema E.J. Supramolecular Organization of Thylakoid Membrane Proteins in Green Plants // Biochim. Biophys. Acta. 2005. V. 1706. P. 12-39.
3.Jensen P.E., Bassi R., Boekema E.J., Dekker J.P., Jansson S., Leister D., Robinson C., Vibe Scheller H. Structure, Function and Regulation of Plant Photosystem I // Biochim. Biophys. Acta. 2007. V. 1767. P. 335-352.
4.Melis A. Dynamics of Photosynthetic Membrane Composition // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1058. P. 87-106.
5.Ruban A.V., Berera R., Ilioaia C., van Stokkum I.H.M., Kennis J.T.M., Pascal A.A., van Amerongen H., Robert B., Horton P., van Grondelle R. Identification of a Mechanism of Photoprotective Energy Dissipation in Higher Plants // Nature. 2007. V. 450. P. 575-578.
6.Apel P. Photosynthesemessungen an Chlorophyllmutanten von Gerste (Lichtkurven, "Light-atmung", Starklichtemfindlichkeit) // Stud. Biophys. 1967. V. 5. P. 105-110.
7.Leverenz J.W., Öquist G., Winglse G. Photosynthesis and Photoinhibition in Leaves of Chlorophyll b-Less Barley in Relation to Absorbed Light // Physiol. Plant. 1992. V. 85. P. 495-502.
8.Machold O., Meister A., Sagromsky H., Hoyer-Hansen G., Wettstein D. Composition of Photosynthetic Membranes of Wild-Type Barley and Chlorophyll b-Less Mutants // Photosynthetica. 1977. V. 11. P. 240-245.
9.Armond P.A., Staehelin L.A., Arntzen C.J. Spatial Relationship of Photosystem I, Photosystem II and Light Harvesting Complex II in Chloroplast Membranes // J. Cell Biol. 1977. V. 73. P. 400-418.
10.Falbel T.G., Mehl J.B., Staehelin L.A. Severity of Mutant Phenotype in a Series of Chlorophyll-Deficient Wheat Mutants Depends on Light Intensity and the Severity of the Block in Chlorophyll Synthesis // Plant Physiol. 1996. V. 112. P. 821-832.
11.Тютерева Е.В., Иванова А.Н., Войцеховская О.В. Структурно-функциональные перестройки фотосинтетического аппарата мутантных растений ячменя chlorina 3613 при смене уровня естественной освещенности // Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века. Ч. 6 / Матер. докл. XII Съезда Русского бот. об-ва. Петрозаводск, 2008. С. 132-134.
12.Сапожников Д.И., Корнюшенко Г.А. О гетерогенности виолаксантина в листьях гороха // Физиология растений. 1969. Т. 16. С. 1038-1041.
13.Ruban A.V., Young A.J., Horton P. Dynamic Properties of the Minor Chlorophyll a/b Binding Proteins of Photosystem II, an In Vitro Model for Photoprotective Energy Dissipation in the Photosynthetic Membrane of Green Plants // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 674-678.
14.Bassi R., Pineau B., Dainese P., Marquardt J. Carotenoid Binding Proteins of Photosystem II // Eur. J. Biochem. 1993. V. 212. P. 297-303.
15.Härtel H., Lokstein H., Grimm B., Rank B. Kinetic Studies on the Xanthophyll Cycle in Barley Leaves (Influence of Antenna Size and Relations to Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching) // Plant Physiol. 1996. V. 110. P. 471-482.
16.Lichtenthaler H.K., Wellburn A.R. Determination of Total Carotenoids and Chlorophylls a and b of Leaf Extracts in Different Solvents // Biochem. Soc. Trans. 1983. V. 11. P. 591-592.
17.Anderson J. M. Photoregulation of the Composition, Function and Structure of Thylakoid Membranes. // Annu. Rev. Plant Physiol. 1986. V. 37. P. 93-136.
18.Leong T.-Y., Anderson J.M. Light-Quality and Irradiance Adaptation of the Composition and Function of Pea Thylakoid Membranes // Biochim. Biophys. Acta. 1986. V. 850. P. 57-63.
19.Lichtenthaler H.K., Meier D. Regulation of Chloroplast Photomorphogenesis by Light Intensity and Light Quality // Chloroplast Biogenesis / Ed. Ellis R.J. Cambridge: Cambridge University Press, 1984. P. 261-281.
20.Akoyunoglou G., Argyroudi-Akoyunoglou J.H. Post-Translation Regulation of Chloroplast differentiation // Regulation of Chloroplast Differentiation. Plant Biology. V. 2. / Eds Akoyunoglou G., Senger H. New York: Alan R. Liss, 1986. P. 571-582.
21.Bellmare G., Bartlett S.G., Chua N.H. Biosynthesis of Chlorophyll a/b-Binding Polypeptides in Wild Type and the chlorina f2 Mutant of Barley // J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 7762-7767.
22.Tanaka R., Tanaka A. Chlorophyll b Is Not Just an Accessory Pigment but a Regulator of the Photosynthetic Antenna // Porphyrins. 2000. V. 9. P. 240-245.
23.Hirashima M., Satoh S., Tanaka R., Tanaka A. Pigment Shuffling in Antenna Systems Achieved by Expressing Prokaryotic Chlorophyllide a Oxygenase in Arabidopsis // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 15 385-15 393.
24.Williams N.D., Joppa L., Duysen M.E., Freeman T.P. Inheritance of Three Chlorophyll-Deficient Mutants of Common Wheat // Crop Sci. 1985. V. 25. P. 1023-1025.
25.Allen K.D., Duysen M.E., Staehelin L.A. Biogenesis of Thylakoid Membranes Is Controlled by Light Intensity in the Conditional Chlorophyll b-Deficient CD3 Mutant of Wheat // J. Cell Biol. 1988. V. 107. P. 907-919.


ПОДПИСИ К РИСУНКАМ
Рис. 1. Изменения содержания β-каротина и ксантофиллов в растениях Donaria (а, в, д, ж) и chlorina 3613 (б, г, е, з) при 60%-ном освещении.
Растения затеняли с помощью марлевого полога так, что интенсивность света под пологом составляла 60% от естественного уровня. Полог устанавливали на 7 суток, после чего полог снимали и растения продолжали выращивать при полном естественном освещении. Стрелками показаны установка (стрелка вниз) и съем полога (стрелка вверх). а, б - лютеин; в, г - β-каротин; д, е - неоксантин; ж, з - виолаксантин (1) и зеаксантин (2). Данные эксперимента 2006 г.; представлены средние арифметические значения из двух биологических повторностей и их стандартные отклонения.

Рис. 2. Изменения содержания β-каротина и ксантофиллов в растениях Donaria (а, в, д, ж) и chlorina 3613 (б, г, е, з) при 40%-ном освещении.
Растения затеняли с помощью марлевого полога так, что интенсивность света под пологом составляла 40% от естественного уровня. Полог устанавливался на 7 суток, после чего полог снимали и растения продолжали выращивать при полном естественном освещении. Стрелками показаны установка (стрелка вниз) и съем полога (стрелка вверх). а, б - лютеин; в, г - β-каротин; д, е - неоксантин; ж, з - виолаксантин (1) и зеаксантин (2). Данные эксперимента 2006 г.; представлены средние арифметические значения из двух биологических повторностей и их стандартные отклонения.