УДК 588.1 577.5
ОНТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОДХОД ПРИ ОЦЕНКЕ МЕТОДОМ ИНДУКЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛОРОФИЛЛА РЕАКЦИИ РАСТЕНИЙ ЧУФЫ НА УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
© 2011 г. В. Н. Шихов, В. В. Величко, Т. В. Нестеренко, А. А. Тихомиров
Учреждение Российской академии наук Институт биофизики Сибирского отделения РАН, Красноярск
Поступила в редакцию 15.03.2010 г.
Работа посвящена применению ранее предложенного авторами онтогенетического подхода для оценки устойчивости растений чуфы (Cyperus esculentus L.) к различным по освещенности и типу минерального питания условиям светокультуры. Показано, что использование биологического почвоподобного субстрата не позволяло увеличить продуктивность растений путем повышения уровня ФАР, а также сокращало срок жизни листьев чуфы до 11 суток, в сравнении с 18 сутками на нейтральном субстрате. Анализ изменений параметров индукции флуоресценции хлорофилла: Fv/Fm, Yield = (Fm' ( Ft)/Fm' и ETR = 0.5 ( 0.84 ( Yield ФАР, при помощи онтогенетического подхода демонстрирует возможность выявлять таким способом неоптимальные для растений условия культивирования.

Ключевые слова: Cyperus esculentus ( индукция флуоресценции хлорофилла - минеральное питание - облученность ФАР - онтогенез

---------------------------------------------------
Сокращения: ИФХ - индукция флуоресценции хлорофилла; ППС - почвоподобный субстрат; ФСА - фотосинтетический аппарат.
Адрес для корреспонденции: Шихов Валентин Николаевич. 660036 Красноярск, Академгородок, 50/50. Институт биофизики Сибирского отделения РАН. Факс: 007 (391) 243-34-00; электронная почта: ubflab@ibp.ru


ВВЕДЕНИЕ
Проблема определения оптимальности условий формирования фотосинтетического аппарата (ФСА) растений различных видов является актуальной как для естественных, так и для искусственных условий выращивания, в частности условий полной светокультуры, и для замкнутых систем жизнеобеспечения [1]. При этом некоторые виды культурных растений, например, чуфа, включенные в систему жизнеобеспечения человека [2, 3], не используются достаточно широко в современном сельском хозяйстве и поэтому во многих отношениях изучены слабее. Ранее в опытах Лисовского было показано, что при выращивании в условиях полной светокультуры на нейтральном субстрате растения чуфы положительно отвечали на удлинение светового дня вплоть до круглосуточного освещения, на повышение интенсивности света и хорошо росли в условиях гидропоники [4]. Дальнейшее развитие технологий культивирования растений в условиях светокультуры и создание новых типов почвенных субстратов поставило задачу экспериментальной оценки возможности использования высокой интенсивности ФАР (до 250 Вт/м2) для повышения продуктивности растений чуфы.
Для интегральной оценки состояния ФСА листьев растений в настоящей работе был выбран широко известный метод индукции флуоресценции хлорофилла а (ИФХ). Метод ИФХ широко используется для оценки состояния ФСА растений, в том числе в стрессовых и неблагоприятных для культивирования условиях [5]. При оценке эффективности тех или иных условий культивирования, с точки зрения получения хозяйственно-полезной биомассы, одним из серьезных препятствий для применения этого метода является вопрос о переходе на более высокие иерархические уровни организации ФСА от листа к растению. В частности, нами уже были продемонстрированы существующие ограничения в использовании методов ИФХ при попытках перехода от листового к ценотическому уровню организации ФСА [6]. Однако, по-нашему мнению, при помощи онтогенетического подхода с использованием метода ИФХ [7] в ряде случаев можно избежать трудностей при решении проблемы перехода от листа на более высокий уровень организации ФСА. Так, для растений, культивирование которых в хозяйственных целях происходит исключительно в вегетативной фазе развития, а листовой аппарат не дифференцирован по физиологической роли различных листьев, применение онтогенетического подхода может дать некоторую информацию не только об исследуемых листьях, но и о состоянии всего растения. К таким культурам относится и чуфа.
Ранее на основании применения онтогенетического подхода нами было показано, что в качестве количественных оценок степени устойчивости ФСА растений к длительно действующему неблагоприятному фактору при выращивании растений помимо вариабельности флуоресцентных параметров в этот период [8, 9] может также рассматриваться наличие или отсутствие в их динамике стационарного состояния, а также его длительность [7, 10(12]. Поскольку реакции ФСА, оцениваемые с помощью ИФХ, на стрессовые воздействия разной природы имеют неспецифический характер [11], критерии общей устойчивости ФСА растений могут применяться при оценке устойчивости к неблагоприятным воздействиям разной природы и для определения оптимальности условий формирования ФСА.
Целью настоящей работы являлось использование метода ИФХ в сочетании с онтогенетическим подходом для оценки реакции ФСА растений чуфы на повышенный уровень ФАР в зависимости от типа минерального питания.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растения чуфы (Cyperus esculentus L.) выращивали в условиях светокультуры в вегетационной камере методом гидропоники на керамзите (нейтральный субстрат) и на почвоподобном субстрате - ППС (биологический субстрат), приготовленном по методике, указанной в работе Manukovsky с соавт. [13]. ППС является продуктом биологической минерализации несъедобных растительных остатков под действием микрофлоры и вермикультуры [13]. Свежеприготовленный ППС имеет относительно большую буферность по содержанию в нем минеральных элементов, которые преимущественно находятся в связанном состоянии и высвобождаются в процессе жизнедеятельности микрофлоры и червей [14].
Температуру воздуха круглосуточно автоматически поддерживали на уровне 24 ± 1°С. Относительная влажность воздуха составляла 65-75%. Облученность растений составляла 150 и 250 Вт/м2 ФАР.
В качестве питательного раствора для нейтрального субстрата был использован еженедельно сменяемый раствор Кнопа с добавлением цитрата Fe, обеспечивая снятие всех лимитов по минеральному питанию. Питательным раствором в варианте ППС являлась отстоянная водопроводная вода с экстрагируемыми из этого субстрата минеральными веществами. Этот раствор не меняли на протяжении всего эксперимента.
В качестве индикатора начала наступления минерального дефицита был выбран азот, который является основным лимитирующим элементом для растений, растущих на органических почвах, к которым относится и ППС [15]. Азот определяли по методике, взятой из практикума по биохимии растений [16].
Измерения флуоресценции хлорофилла проводили с помощью специализированного флуориметра РАМ-2100 ("Walz", Германия) по стандартной для этого прибора методике [17(19]. Измерения проводили на средней части нативной, неотделенной от растения листовой пластинки одного и того же листа в динамике от момента полного выхода листа из основной "розетки" до отмирания. Перед измерениями растения предварительно адаптировали в темноте в течение 30 мин [17]. Измерения флуоресценции проводили в 4 повторностях для каждого исследуемого варианта.
Стандартные параметры флуоресценции хлорофилла а определяли с помощью флуориметра РАМ-2100. По отношению вариабельной флуоресценции (Fv = Fm ( F0) к максимальной (Fm), измеренной на адаптированных к темноте образцах, ( Fv/Fm оценивали максимальный квантовый выход первичного разделения зарядов в ФС II. По значению Yield, определяемому как (Fm´ ( Ft)/Fm´, оценивали реальный квантовый выход ФС II на постоянном действующем свету, что позволяет дать приблизительную характеристику общего квантового выхода фотосинтеза. Скорость транспорта электронов определяли на основании стандартного параметра ETR, рассчитываемого по формуле ETR = 0.5 ( 0.84 ( Yield(ФАР.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка продукционных характеристик показала, что выращивание растений чуфы на керамзите и на ППС при облученности ФАР 150 Вт/м2 не привело к существенным различиям в продуктивности съедобной биомассы между вариантами (таблица). Тем не менее, у растений, выращенных на ППС, отмечали увеличение сухой биомассы листьев на 28%, в результате чего Кхоз у них стал ниже по сравнению с растениями, выращенными на керамзите.
Повышение облученности ФАР до 250 Вт/м2 увеличило продуктивность растений чуфы как на керамзите, так и на ППС, но степень увеличения зависела от способа выращивания растений. Так, урожай клубеньков на керамзите увеличился на 47.6%, а на ППС - на 17.3%. Увеличение несъедобной биомассы на керамзите составило 46.4%, а на ППС - 15.3%. Меньшая степень увеличения продуктивности чуфы, выращенной на ППС, связана, предположительно, с лимитированием содержания доступных минеральных элементов в субстрате. Несмотря на значительное содержание в ППС минеральных элементов, они, как уже было отмечено, находятся в связанном состоянии. Скорость перехода минеральных элементов в доступные для растений формы имеет определенное конечное значение, тогда как запросы растущих растений в отношении минеральных элементов будут возрастать по мере роста и тем сильнее, чем выше интенсивность ФАР. В результате через определенное время вегетации запросы растений и скорость поступления минеральных элементов уже не будут совпадать и, следовательно, растения начнут испытывать дефицит минерального питания.
Это предположение подтверждается данными рис. 1. Видно, что на 19-е сутки вегетации растений концентрация нитратной формы азота в растворе (в варианте 250 Вт/м2 ППС) понизилось до 98 мг/л, тогда как при 150 Вт/м2 она составляла - 170 мг/л. Дальнейшее культивирование растений на ППС привело к постепенному снижению уровня доступного азота в растворах обоих вариантов практически до нуля. Это может указывать на то, что скорость превращения в ППС связанных форм минеральных элементов (на примере азота) в доступные для растений формы, уже на 19-е сутки вегетации не соответствует потребностям растений [20]. Более того, как следует из рис. 1, к 30 суткам от начала культивирования содержание нитратной формы азота в растворах на ППС сравнялось независимо от режима облученности растений. Данный факт свидетельствует о достижении лимита по минеральному питанию.
Влияние условий выращивания на состояние ФСА растений чуфы было прослежено в ходе онтогенеза одновозрастных листьев. Сигналом для начала проведения измерений флуоресценции стало уже отмеченное снижение содержания нитратной формы азота в питательных растворах из-под ППС до 100 мг/л (рис. 1), что является минимально допустимым уровнем [20]. Возраст растений на момент начала исследований составлял 26 суток.
Одним из основных отличий между выбранными листьями растений чуфы, выращенных при различной интенсивности ФАР, было время их жизни. Так, у растений, выращиваемых на керамзите, было возможно проследить онтогенез до 18 суток жизни листа, тогда как у растений на ППС листья того же яруса старели значительно быстрее. Кроме того, листовые пластинки у чуфы достаточно жесткие, и листья при выращивании растений на ППС оказались более хрупкими и легко ломались. В результате срок жизни листьев чуфы на ППС составил только 11 суток.
На рис. 2 показаны изменения параметров импульсно модулированной флуоресценции листьев. Если рассматривать эти данные традиционным образом, сравнивая величины измеренных параметров и диапазон их изменений, то на протяжении большей части онтогенеза листьев чуфы каких-либо достоверных и значимых отличий между разными вариантами культивирования растений не просматривалось. Более того, попытка сопоставить значения параметров ИФХ листьев и показатели продуктивности чуфы в очередной раз наглядно показывает невозможность прямого перехода с листового на ценотический уровень организации ФСА. Из этого можно было бы сделать ошибочный вывод, что использование метода ИФХ для оценки влияния режимов культивирования растений, оказывающих влияние преимущественно на интегральные ценотические характеристики, бесперспективно.
Однако, используя онтогенетический подход для интерпретации этих же самых данных, мы можем получить совсем другие результаты. Сам характер поведения параметров флуоресценции в онтогенезе листьев заметно отличается в зависимости от вариантов выращивания. Так, максимальный квантовый выход ФС II (параметр Fv/Fm) у листьев растений, выращиваемых на керамзите, в течение онтогенеза листьев оставался практически постоянным. В то время, как у растений, выращиваемых на ППС, на протяжении первой недели не наблюдали достоверных отличий от контрольных вариантов, уже к 9(11-м суткам жизни выбранных листьев наблюдали достоверное снижение значений максимального квантового выхода ФС II ниже 0.75 отн. ед. Такое снижение является одним из показателей нахождения листа в стрессовых условиях, либо интенсивного старения [21, 22]. Реальный квантовый выход ФСII (параметр Yield) демонстрирует классическую куполообразную динамику в онтогенезе листьев чуфы. При этом сам диапазон изменений данного параметра одинаков у всех исследованных вариантов культивирования растений. Но если для листьев растений на керамзите при облученности 150 Вт/м2 ФАР этот "купол" растянут на все 18 суток и спад вследствие старения лишь слабо намечен, то у растений, выращиваемых на ППС, этот "купол" обозначен очень четко и сильно сжат во времени - резкий спад при старении происходит на 9(11-е сутки, что опять-таки свидетельствует об ускоренном онтогенезе, т.е. неблагоприятных для листа условиях [7, 11, 21]. При облученности 250 Вт/м2 ФАР незначительные различия между листьями растений на разных субстратах оставались теми же, но куполообразная динамика была выражена слабее. При этом в обоих вариантах при увеличении уровня освещенности, как и следовало ожидать, реальный квантовый выход уменьшался. Скорость транспорта электронов (параметр ETR по [22]) также имеет сходную куполообразную динамику изменений в онтогенезе и указывает на ускоренное старение листьев у растений на ППС, но в этом случае листья растений, выращиваемых при облученности 250 Вт/м2 ФАР имели более высокие значения ETR, в сравнении с вариантом 150 Вт/м2 ФАР.
Сопоставляя возрастную динамику флуоресцентных параметров с динамикой содержания азота в растворах и конечной продуктивностью исследованных растений, можно заметить, что листовой аппарат растений чуфы реагирует на отмеченные особенности в минеральном питании на ППС независимо от уровня облученности ценоза. Это выражается в ускоренном прохождении листом онтогенеза и его раннем старении. Однако при уровне облученности 150 Вт/м2 ФАР ППС в качестве питательного субстрата обеспечивает продуктивность растений, превышающую таковую на нейтральном субстрате даже несмотря на существенное снижение в растворе уровня нитратной формы азота. При повышенной облученности неоптимальные для растений чуфы условия культивирования на ППС, выявляемые при онтогенетическом подходе, напрямую выражаются в проигрыше по продуктивности растений в сравнении с аналогичными показателями на нейтральном субстрате. Важным моментом здесь является также и то, что неоптимальность условий культивирования на ППС была обнаружена не только по показателям ИФХ, но и по динамике содержания нитратной формы азота в питательных растворах.
Таким образом, обнаруженное нами ускорение онтогенеза листьев чуфы на ППС не зависело от уровня освещенности. Онтогенетический подход в данном случае дает возможность оценить потенциально возможные проблемы, которые могут возникнуть при попытках интенсифицировать выращивание чуфы на ППС. Причем, как видно из наших результатов, это предупреждение, будучи полученным в нормальных условиях культивирования, говорит о том, что произойдет, если мы попытаемся, к примеру, увеличить скорость запроса растениями питательных веществ из субстрата. Кроме того, получение данных при помощи методов ИФХ, не просто оперативно, но возможно практически на любом этапе роста растений, тогда как продукционные характеристики можно оценить только после получения хозяйственно-полезной биомассы. Для таких долго вегетирующих растений, как чуфа, с периодом вегетации 90(120 суток, этот подход может использоваться в качестве экспресс-диагностики для корректировки условий культивирования с целью повышения урожайности.
Работа была выполнена при поддержке проекта Сибирским отделением Российской академии наук (грант № 132).


СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.Gitelson I.J., Lisovsky G.M., MacElroy R.D. Manmade Closed Ecological Systems. London, New York: Taylor & Francis, 2003. 402 p.
2.Моторин Н.В., Тихомиров А.А., Ушакова С.А., Величко В.В. Толерантность растений чуфы к воздействию факторов внешней среды применительно к БСЖО // Авиакосм. и экол. медицина. 2008. № 6/1. С. 47-48.
3.Моторин Н.В., Тихомиров A.А., Ушакова С.А., Гаврилова B.А., Конькова Н.Г. Испытания сортов чуфы (Cyperus esculentus L.) применительно к биорегенеративной системе жизнеобеспечения Биос-3 // Масличные культуры / Научно-техн. бюлл. ВНИИМК. 2009. Вып. 1 (140). С. 150-152.
4.Gitelson I.J., Lisovsky G.M., Tikhomirov A.A. Optimal Structure of Plant Conveyor for Human Life Support in a Closed Ecosystem "Bios-3" // Plant Production in Closed Ecosystems / Eds Goto. E., et al. Dordrecht: Kluwer, 1997. P. 297-300.
5.Maxwell K., Johnson G.N. Chlorophyll Fluorescence - a Practical Guide // J. Exp. Bot. 2000. V. 51. P. 659-668.
6.Шихов В.Н., Нестеренко Т.В., Тихомиров А.А. О возможности использования метода термоиндукции флуоресценции для оценки функционального состояния ценозов культурных растений // Физиология и биохимия культ. растений. 2003. Т. 35. С. 349-357.
7.Нестеренко Т.В., Тихомиров А.А. Онтогенетический подход в оценке устойчивости растений к стрессовым воздействиям методом индукции флуоресценции // Докл. АН. 2003. Т. 15. С. 119-122.
8.Веселова Т.В., Веселовский В.А., Власенко В.В., Мацкивский В.И., Пеньков Ф.М., Чернавский Д.С. Вариабельность как тест перехода клетки в состояние стресса в условиях интоксикации // Физиология растений. 1990. Т. 37. С. 733-738.
9.Lazár D., Nauš J. Statistical Properties of Chlorophyll Fluorescence Induction Parameters // Photosynthetica. 1998. V. 35. P. 121-127.
10.Nesterenko T.V., Tikhomirov A.A., Shikhov V.N. Ontogenetic Approach to the Assessment of Plant Resistance to Prolonged Stress Using Chlorophyll Fluorescence Induction Method // Photosynthetica. 2006. V. 44. P. 321-332.
11.Нестеренко Т.В., Тихомиров А.А., Шихов В.Н. Индукция флуоресценции хлорофилла и оценка устойчивости растений к неблагоприятным воздействиям // Журн. общ. биологии. 2007. Т. 68. С. 455-469.
12.Нестеренко Т.В., Шихов В.Н., Тихомиров А.А. Термоиндукция флуоресценции хлорофилла и возрастное состояние листьев высших растений // Физиология растений. 2001. Т. 48. С. 282-290.
13.Manukovsky N.S., Kovalev V.S., Rygalov V.Ye., Zolotukhin I.G. Waste Bioregeneration in Life Support CES: Development of Soil Organic Substrate // Adv. Space Res. 1997. V. 20. P. 1827-1832.
14.Gros J.-B., Lasseur C., Tikhomirov A.A., Manukovsky N.S., Ushakova S.A., Zolotukhin I.G., Gribovskaya I.B., Kovalev V.S. Soil-Like Substrate for Plant Growing Derived from Inedible Plant Mass: Preparing, Composition, Fertility // Acta Hort. (ISHS). 2004. V. 644. P. 151-155.
15.Мишустин Е.Н. Микроорганизмы и продуктивность земледелия. М.: Наука, 1972. 343 с.
16.Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений. М.: Колос, 1976. 254 с.
17.Roháček K., Barták M. Technique of the Modulated Chlorophyll Fluorescence: Basic Concepts, Useful Parameters, and Some Applications // Photosynthetica. 1999. V. 37. P. 339-363.
18.Roháček K. Chlorophyll Fluorescence Parameters: The Definitions, Photosynthetic Meaning, and Mutual Relationships // Photosynthetica. 2002. V. 40. P. 13-29.
19.Lichtenthaler H.K., Bushmann C., Knapp M. How to Correctly Determine the Different Chlorophyll Fluorescence Parameters and the Chlorophyll Fluorescence Decrease Ratio DFd of Leaves with the PAM Fluorometer // Photosynthetica. 2005. V. 43. P. 379-393.
20.Алиев Э.А. Выращивание овощей в теплицах без почвы. Киев: Урожай, 1971. 230 с.
21.Thomas H., Stoddart J.L. Leaf Senescence // Annu. Rev. Plant Physiol. 1980. V. 31. P. 83-111.
22.Van Kooten O., Snel J.F. The Use of Chlorophyll Fluorescence Nomenclature in Plant Stress Physiology // Photosynth. Res. 1990. V. 25. P. 147-150.


ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

Рис. 1.Динамика содержания нитратной формы азота в питательных растворах из-под растений, произрастающих на ППС при разных интенсивностях ФАР.
Концентрация нитратной формы азота в растворе Кнопа составляла 150 мг/л. 1 - 150 Вт/м2 ФАР; 2 - 250 Вт/м2 ФАР.

Рис. 2.Онтогенетические зависимости показателей импульсно-модулированной флуоресценции хлорофилла в листьях растений чуфы, выращенной при различных световых условиях на двух типах субстратов.
Возраст растений на момент начала исследований 26 суток. а - Fv/Fm, максимальный квантовый выход ФС II; б - Yield, реальный квантовый выход ФС II; в - ETR, скорость транспорта электронов. 1 - керамзит в качестве субстрата, облученность 150 Вт/м2 ФАР; 2 - керамзит в качестве субстрата, облученность 250 Вт/м2 ФАР; 3 - ППС в качестве субстрата, облученность 150 Вт/м2 ФАР; 4 - ППС в качестве субстрата, облученность 250 Вт/м2 ФАР. На графиках для значений параметров приведены величины биологического разброса.



© 2011 г. В. Н. Шихов, В. В. Величко, Т. В. Нестеренко, А. А. Тихомиров
Учреждение Российской академии наук Институт биофизики Сибирского отделения РАН, Красноярск
Поступила в редакцию 15.03.2010 г.
Работа посвящена применению ранее предложенного авторами онтогенетического подхода для оценки устойчивости растений чуфы (Cyperus esculentus L.) к различным по освещенности и типу минерального питания условиям светокультуры. Показано, что использование биологического почвоподобного субстрата не позволяло увеличить продуктивность растений путем повышения уровня ФАР, а также сокращало срок жизни листьев чуфы до 11 суток, в сравнении с 18 сутками на нейтральном субстрате. Анализ изменений параметров индукции флуоресценции хлорофилла: Fv/Fm, Yield = (Fm' ( Ft)/Fm' и ETR = 0.5 ( 0.84 ( Yield ФАР, при помощи онтогенетического подхода демонстрирует возможность выявлять таким способом неоптимальные для растений условия культивирования.

Ключевые слова: Cyperus esculentus ( индукция флуоресценции хлорофилла - минеральное питание - облученность ФАР - онтогенез

---------------------------------------------------
Сокращения: ИФХ - индукция флуоресценции хлорофилла; ППС - почвоподобный субстрат; ФСА - фотосинтетический аппарат.
Адрес для корреспонденции: Шихов Валентин Николаевич. 660036 Красноярск, Академгородок, 50/50. Институт биофизики Сибирского отделения РАН. Факс: 007 (391) 243-34-00; электронная почта: ubflab@ibp.ru


ВВЕДЕНИЕ
Проблема определения оптимальности условий формирования фотосинтетического аппарата (ФСА) растений различных видов является актуальной как для естественных, так и для искусственных условий выращивания, в частности условий полной светокультуры, и для замкнутых систем жизнеобеспечения [1]. При этом некоторые виды культурных растений, например, чуфа, включенные в систему жизнеобеспечения человека [2, 3], не используются достаточно широко в современном сельском хозяйстве и поэтому во многих отношениях изучены слабее. Ранее в опытах Лисовского было показано, что при выращивании в условиях полной светокультуры на нейтральном субстрате растения чуфы положительно отвечали на удлинение светового дня вплоть до круглосуточного освещения, на повышение интенсивности света и хорошо росли в условиях гидропоники [4]. Дальнейшее развитие технологий культивирования растений в условиях светокультуры и создание новых типов почвенных субстратов поставило задачу экспериментальной оценки возможности использования высокой интенсивности ФАР (до 250 Вт/м2) для повышения продуктивности растений чуфы.
Для интегральной оценки состояния ФСА листьев растений в настоящей работе был выбран широко известный метод индукции флуоресценции хлорофилла а (ИФХ). Метод ИФХ широко используется для оценки состояния ФСА растений, в том числе в стрессовых и неблагоприятных для культивирования условиях [5]. При оценке эффективности тех или иных условий культивирования, с точки зрения получения хозяйственно-полезной биомассы, одним из серьезных препятствий для применения этого метода является вопрос о переходе на более высокие иерархические уровни организации ФСА от листа к растению. В частности, нами уже были продемонстрированы существующие ограничения в использовании методов ИФХ при попытках перехода от листового к ценотическому уровню организации ФСА [6]. Однако, по-нашему мнению, при помощи онтогенетического подхода с использованием метода ИФХ [7] в ряде случаев можно избежать трудностей при решении проблемы перехода от листа на более высокий уровень организации ФСА. Так, для растений, культивирование которых в хозяйственных целях происходит исключительно в вегетативной фазе развития, а листовой аппарат не дифференцирован по физиологической роли различных листьев, применение онтогенетического подхода может дать некоторую информацию не только об исследуемых листьях, но и о состоянии всего растения. К таким культурам относится и чуфа.
Ранее на основании применения онтогенетического подхода нами было показано, что в качестве количественных оценок степени устойчивости ФСА растений к длительно действующему неблагоприятному фактору при выращивании растений помимо вариабельности флуоресцентных параметров в этот период [8, 9] может также рассматриваться наличие или отсутствие в их динамике стационарного состояния, а также его длительность [7, 10(12]. Поскольку реакции ФСА, оцениваемые с помощью ИФХ, на стрессовые воздействия разной природы имеют неспецифический характер [11], критерии общей устойчивости ФСА растений могут применяться при оценке устойчивости к неблагоприятным воздействиям разной природы и для определения оптимальности условий формирования ФСА.
Целью настоящей работы являлось использование метода ИФХ в сочетании с онтогенетическим подходом для оценки реакции ФСА растений чуфы на повышенный уровень ФАР в зависимости от типа минерального питания.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растения чуфы (Cyperus esculentus L.) выращивали в условиях светокультуры в вегетационной камере методом гидропоники на керамзите (нейтральный субстрат) и на почвоподобном субстрате - ППС (биологический субстрат), приготовленном по методике, указанной в работе Manukovsky с соавт. [13]. ППС является продуктом биологической минерализации несъедобных растительных остатков под действием микрофлоры и вермикультуры [13]. Свежеприготовленный ППС имеет относительно большую буферность по содержанию в нем минеральных элементов, которые преимущественно находятся в связанном состоянии и высвобождаются в процессе жизнедеятельности микрофлоры и червей [14].
Температуру воздуха круглосуточно автоматически поддерживали на уровне 24 ± 1°С. Относительная влажность воздуха составляла 65-75%. Облученность растений составляла 150 и 250 Вт/м2 ФАР.
В качестве питательного раствора для нейтрального субстрата был использован еженедельно сменяемый раствор Кнопа с добавлением цитрата Fe, обеспечивая снятие всех лимитов по минеральному питанию. Питательным раствором в варианте ППС являлась отстоянная водопроводная вода с экстрагируемыми из этого субстрата минеральными веществами. Этот раствор не меняли на протяжении всего эксперимента.
В качестве индикатора начала наступления минерального дефицита был выбран азот, который является основным лимитирующим элементом для растений, растущих на органических почвах, к которым относится и ППС [15]. Азот определяли по методике, взятой из практикума по биохимии растений [16].
Измерения флуоресценции хлорофилла проводили с помощью специализированного флуориметра РАМ-2100 ("Walz", Германия) по стандартной для этого прибора методике [17(19]. Измерения проводили на средней части нативной, неотделенной от растения листовой пластинки одного и того же листа в динамике от момента полного выхода листа из основной "розетки" до отмирания. Перед измерениями растения предварительно адаптировали в темноте в течение 30 мин [17]. Измерения флуоресценции проводили в 4 повторностях для каждого исследуемого варианта.
Стандартные параметры флуоресценции хлорофилла а определяли с помощью флуориметра РАМ-2100. По отношению вариабельной флуоресценции (Fv = Fm ( F0) к максимальной (Fm), измеренной на адаптированных к темноте образцах, ( Fv/Fm оценивали максимальный квантовый выход первичного разделения зарядов в ФС II. По значению Yield, определяемому как (Fm´ ( Ft)/Fm´, оценивали реальный квантовый выход ФС II на постоянном действующем свету, что позволяет дать приблизительную характеристику общего квантового выхода фотосинтеза. Скорость транспорта электронов определяли на основании стандартного параметра ETR, рассчитываемого по формуле ETR = 0.5 ( 0.84 ( Yield(ФАР.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка продукционных характеристик показала, что выращивание растений чуфы на керамзите и на ППС при облученности ФАР 150 Вт/м2 не привело к существенным различиям в продуктивности съедобной биомассы между вариантами (таблица). Тем не менее, у растений, выращенных на ППС, отмечали увеличение сухой биомассы листьев на 28%, в результате чего Кхоз у них стал ниже по сравнению с растениями, выращенными на керамзите.
Повышение облученности ФАР до 250 Вт/м2 увеличило продуктивность растений чуфы как на керамзите, так и на ППС, но степень увеличения зависела от способа выращивания растений. Так, урожай клубеньков на керамзите увеличился на 47.6%, а на ППС - на 17.3%. Увеличение несъедобной биомассы на керамзите составило 46.4%, а на ППС - 15.3%. Меньшая степень увеличения продуктивности чуфы, выращенной на ППС, связана, предположительно, с лимитированием содержания доступных минеральных элементов в субстрате. Несмотря на значительное содержание в ППС минеральных элементов, они, как уже было отмечено, находятся в связанном состоянии. Скорость перехода минеральных элементов в доступные для растений формы имеет определенное конечное значение, тогда как запросы растущих растений в отношении минеральных элементов будут возрастать по мере роста и тем сильнее, чем выше интенсивность ФАР. В результате через определенное время вегетации запросы растений и скорость поступления минеральных элементов уже не будут совпадать и, следовательно, растения начнут испытывать дефицит минерального питания.
Это предположение подтверждается данными рис. 1. Видно, что на 19-е сутки вегетации растений концентрация нитратной формы азота в растворе (в варианте 250 Вт/м2 ППС) понизилось до 98 мг/л, тогда как при 150 Вт/м2 она составляла - 170 мг/л. Дальнейшее культивирование растений на ППС привело к постепенному снижению уровня доступного азота в растворах обоих вариантов практически до нуля. Это может указывать на то, что скорость превращения в ППС связанных форм минеральных элементов (на примере азота) в доступные для растений формы, уже на 19-е сутки вегетации не соответствует потребностям растений [20]. Более того, как следует из рис. 1, к 30 суткам от начала культивирования содержание нитратной формы азота в растворах на ППС сравнялось независимо от режима облученности растений. Данный факт свидетельствует о достижении лимита по минеральному питанию.
Влияние условий выращивания на состояние ФСА растений чуфы было прослежено в ходе онтогенеза одновозрастных листьев. Сигналом для начала проведения измерений флуоресценции стало уже отмеченное снижение содержания нитратной формы азота в питательных растворах из-под ППС до 100 мг/л (рис. 1), что является минимально допустимым уровнем [20]. Возраст растений на момент начала исследований составлял 26 суток.
Одним из основных отличий между выбранными листьями растений чуфы, выращенных при различной интенсивности ФАР, было время их жизни. Так, у растений, выращиваемых на керамзите, было возможно проследить онтогенез до 18 суток жизни листа, тогда как у растений на ППС листья того же яруса старели значительно быстрее. Кроме того, листовые пластинки у чуфы достаточно жесткие, и листья при выращивании растений на ППС оказались более хрупкими и легко ломались. В результате срок жизни листьев чуфы на ППС составил только 11 суток.
На рис. 2 показаны изменения параметров импульсно модулированной флуоресценции листьев. Если рассматривать эти данные традиционным образом, сравнивая величины измеренных параметров и диапазон их изменений, то на протяжении большей части онтогенеза листьев чуфы каких-либо достоверных и значимых отличий между разными вариантами культивирования растений не просматривалось. Более того, попытка сопоставить значения параметров ИФХ листьев и показатели продуктивности чуфы в очередной раз наглядно показывает невозможность прямого перехода с листового на ценотический уровень организации ФСА. Из этого можно было бы сделать ошибочный вывод, что использование метода ИФХ для оценки влияния режимов культивирования растений, оказывающих влияние преимущественно на интегральные ценотические характеристики, бесперспективно.
Однако, используя онтогенетический подход для интерпретации этих же самых данных, мы можем получить совсем другие результаты. Сам характер поведения параметров флуоресценции в онтогенезе листьев заметно отличается в зависимости от вариантов выращивания. Так, максимальный квантовый выход ФС II (параметр Fv/Fm) у листьев растений, выращиваемых на керамзите, в течение онтогенеза листьев оставался практически постоянным. В то время, как у растений, выращиваемых на ППС, на протяжении первой недели не наблюдали достоверных отличий от контрольных вариантов, уже к 9(11-м суткам жизни выбранных листьев наблюдали достоверное снижение значений максимального квантового выхода ФС II ниже 0.75 отн. ед. Такое снижение является одним из показателей нахождения листа в стрессовых условиях, либо интенсивного старения [21, 22]. Реальный квантовый выход ФСII (параметр Yield) демонстрирует классическую куполообразную динамику в онтогенезе листьев чуфы. При этом сам диапазон изменений данного параметра одинаков у всех исследованных вариантов культивирования растений. Но если для листьев растений на керамзите при облученности 150 Вт/м2 ФАР этот "купол" растянут на все 18 суток и спад вследствие старения лишь слабо намечен, то у растений, выращиваемых на ППС, этот "купол" обозначен очень четко и сильно сжат во времени - резкий спад при старении происходит на 9(11-е сутки, что опять-таки свидетельствует об ускоренном онтогенезе, т.е. неблагоприятных для листа условиях [7, 11, 21]. При облученности 250 Вт/м2 ФАР незначительные различия между листьями растений на разных субстратах оставались теми же, но куполообразная динамика была выражена слабее. При этом в обоих вариантах при увеличении уровня освещенности, как и следовало ожидать, реальный квантовый выход уменьшался. Скорость транспорта электронов (параметр ETR по [22]) также имеет сходную куполообразную динамику изменений в онтогенезе и указывает на ускоренное старение листьев у растений на ППС, но в этом случае листья растений, выращиваемых при облученности 250 Вт/м2 ФАР имели более высокие значения ETR, в сравнении с вариантом 150 Вт/м2 ФАР.
Сопоставляя возрастную динамику флуоресцентных параметров с динамикой содержания азота в растворах и конечной продуктивностью исследованных растений, можно заметить, что листовой аппарат растений чуфы реагирует на отмеченные особенности в минеральном питании на ППС независимо от уровня облученности ценоза. Это выражается в ускоренном прохождении листом онтогенеза и его раннем старении. Однако при уровне облученности 150 Вт/м2 ФАР ППС в качестве питательного субстрата обеспечивает продуктивность растений, превышающую таковую на нейтральном субстрате даже несмотря на существенное снижение в растворе уровня нитратной формы азота. При повышенной облученности неоптимальные для растений чуфы условия культивирования на ППС, выявляемые при онтогенетическом подходе, напрямую выражаются в проигрыше по продуктивности растений в сравнении с аналогичными показателями на нейтральном субстрате. Важным моментом здесь является также и то, что неоптимальность условий культивирования на ППС была обнаружена не только по показателям ИФХ, но и по динамике содержания нитратной формы азота в питательных растворах.
Таким образом, обнаруженное нами ускорение онтогенеза листьев чуфы на ППС не зависело от уровня освещенности. Онтогенетический подход в данном случае дает возможность оценить потенциально возможные проблемы, которые могут возникнуть при попытках интенсифицировать выращивание чуфы на ППС. Причем, как видно из наших результатов, это предупреждение, будучи полученным в нормальных условиях культивирования, говорит о том, что произойдет, если мы попытаемся, к примеру, увеличить скорость запроса растениями питательных веществ из субстрата. Кроме того, получение данных при помощи методов ИФХ, не просто оперативно, но возможно практически на любом этапе роста растений, тогда как продукционные характеристики можно оценить только после получения хозяйственно-полезной биомассы. Для таких долго вегетирующих растений, как чуфа, с периодом вегетации 90(120 суток, этот подход может использоваться в качестве экспресс-диагностики для корректировки условий культивирования с целью повышения урожайности.
Работа была выполнена при поддержке проекта Сибирским отделением Российской академии наук (грант № 132).


СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.Gitelson I.J., Lisovsky G.M., MacElroy R.D. Manmade Closed Ecological Systems. London, New York: Taylor & Francis, 2003. 402 p.
2.Моторин Н.В., Тихомиров А.А., Ушакова С.А., Величко В.В. Толерантность растений чуфы к воздействию факторов внешней среды применительно к БСЖО // Авиакосм. и экол. медицина. 2008. № 6/1. С. 47-48.
3.Моторин Н.В., Тихомиров A.А., Ушакова С.А., Гаврилова B.А., Конькова Н.Г. Испытания сортов чуфы (Cyperus esculentus L.) применительно к биорегенеративной системе жизнеобеспечения Биос-3 // Масличные культуры / Научно-техн. бюлл. ВНИИМК. 2009. Вып. 1 (140). С. 150-152.
4.Gitelson I.J., Lisovsky G.M., Tikhomirov A.A. Optimal Structure of Plant Conveyor for Human Life Support in a Closed Ecosystem "Bios-3" // Plant Production in Closed Ecosystems / Eds Goto. E., et al. Dordrecht: Kluwer, 1997. P. 297-300.
5.Maxwell K., Johnson G.N. Chlorophyll Fluorescence - a Practical Guide // J. Exp. Bot. 2000. V. 51. P. 659-668.
6.Шихов В.Н., Нестеренко Т.В., Тихомиров А.А. О возможности использования метода термоиндукции флуоресценции для оценки функционального состояния ценозов культурных растений // Физиология и биохимия культ. растений. 2003. Т. 35. С. 349-357.
7.Нестеренко Т.В., Тихомиров А.А. Онтогенетический подход в оценке устойчивости растений к стрессовым воздействиям методом индукции флуоресценции // Докл. АН. 2003. Т. 15. С. 119-122.
8.Веселова Т.В., Веселовский В.А., Власенко В.В., Мацкивский В.И., Пеньков Ф.М., Чернавский Д.С. Вариабельность как тест перехода клетки в состояние стресса в условиях интоксикации // Физиология растений. 1990. Т. 37. С. 733-738.
9.Lazár D., Nauš J. Statistical Properties of Chlorophyll Fluorescence Induction Parameters // Photosynthetica. 1998. V. 35. P. 121-127.
10.Nesterenko T.V., Tikhomirov A.A., Shikhov V.N. Ontogenetic Approach to the Assessment of Plant Resistance to Prolonged Stress Using Chlorophyll Fluorescence Induction Method // Photosynthetica. 2006. V. 44. P. 321-332.
11.Нестеренко Т.В., Тихомиров А.А., Шихов В.Н. Индукция флуоресценции хлорофилла и оценка устойчивости растений к неблагоприятным воздействиям // Журн. общ. биологии. 2007. Т. 68. С. 455-469.
12.Нестеренко Т.В., Шихов В.Н., Тихомиров А.А. Термоиндукция флуоресценции хлорофилла и возрастное состояние листьев высших растений // Физиология растений. 2001. Т. 48. С. 282-290.
13.Manukovsky N.S., Kovalev V.S., Rygalov V.Ye., Zolotukhin I.G. Waste Bioregeneration in Life Support CES: Development of Soil Organic Substrate // Adv. Space Res. 1997. V. 20. P. 1827-1832.
14.Gros J.-B., Lasseur C., Tikhomirov A.A., Manukovsky N.S., Ushakova S.A., Zolotukhin I.G., Gribovskaya I.B., Kovalev V.S. Soil-Like Substrate for Plant Growing Derived from Inedible Plant Mass: Preparing, Composition, Fertility // Acta Hort. (ISHS). 2004. V. 644. P. 151-155.
15.Мишустин Е.Н. Микроорганизмы и продуктивность земледелия. М.: Наука, 1972. 343 с.
16.Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений. М.: Колос, 1976. 254 с.
17.Roháček K., Barták M. Technique of the Modulated Chlorophyll Fluorescence: Basic Concepts, Useful Parameters, and Some Applications // Photosynthetica. 1999. V. 37. P. 339-363.
18.Roháček K. Chlorophyll Fluorescence Parameters: The Definitions, Photosynthetic Meaning, and Mutual Relationships // Photosynthetica. 2002. V. 40. P. 13-29.
19.Lichtenthaler H.K., Bushmann C., Knapp M. How to Correctly Determine the Different Chlorophyll Fluorescence Parameters and the Chlorophyll Fluorescence Decrease Ratio DFd of Leaves with the PAM Fluorometer // Photosynthetica. 2005. V. 43. P. 379-393.
20.Алиев Э.А. Выращивание овощей в теплицах без почвы. Киев: Урожай, 1971. 230 с.
21.Thomas H., Stoddart J.L. Leaf Senescence // Annu. Rev. Plant Physiol. 1980. V. 31. P. 83-111.
22.Van Kooten O., Snel J.F. The Use of Chlorophyll Fluorescence Nomenclature in Plant Stress Physiology // Photosynth. Res. 1990. V. 25. P. 147-150.


ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

Рис. 1.Динамика содержания нитратной формы азота в питательных растворах из-под растений, произрастающих на ППС при разных интенсивностях ФАР.
Концентрация нитратной формы азота в растворе Кнопа составляла 150 мг/л. 1 - 150 Вт/м2 ФАР; 2 - 250 Вт/м2 ФАР.

Рис. 2.Онтогенетические зависимости показателей импульсно-модулированной флуоресценции хлорофилла в листьях растений чуфы, выращенной при различных световых условиях на двух типах субстратов.
Возраст растений на момент начала исследований 26 суток. а - Fv/Fm, максимальный квантовый выход ФС II; б - Yield, реальный квантовый выход ФС II; в - ETR, скорость транспорта электронов. 1 - керамзит в качестве субстрата, облученность 150 Вт/м2 ФАР; 2 - керамзит в качестве субстрата, облученность 250 Вт/м2 ФАР; 3 - ППС в качестве субстрата, облученность 150 Вт/м2 ФАР; 4 - ППС в качестве субстрата, облученность 250 Вт/м2 ФАР. На графиках для значений параметров приведены величины биологического разброса.