УДК 581.1:547.426.23:582.866
ВЛИЯНИЕ ПРЕДПОСЕВНОГО γ-ОБЛУЧЕНИЯ СЕМЯН ОБЛЕПИХИ
НА СОДЕРЖАНИЕ И ЖИРНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ СУММАРНЫХ ЛИПИДОВ
 В СЕМЕНАХ ПЕРВОГО ПОКОЛЕНИЯ РАСТЕНИЙ
© 2011 г. О. В. Озеринина, В. Д. Цыдендамбаев
Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений
им. К.А. Тимирязева РАН, Москва
Поступила в редакцию 23.06.2010 г.
Изучены абсолютное содержание и жирнокислотный (ЖК-) состав липидов семян облепихи (Hippophaё rhamnoides L.) сортов Витаминная и Зырянка, относящихся к сибирскому климатипу, а также семян растений первого поколения (М1), полученных из семян, подвергнутых предпосевному (-облучению (60Со) в дозах 50 и 100 Гр (Витаминная) и 100, 250 и 500 Гр (Зырянка). Во всех опытных вариантах облучение приводило к снижению массы семян М1-растений, которое выражалось более резко у сорта Витаминная, чем у сорта Зырянка. Напротив, масличность этих семян была у сорта Витаминная близка к контрольной, а у Зырянки сильно снижалась, в особенности при дозе 500 Гр. Контрольные и опытные варианты почти не отличались друг от друга по качественному составу ЖК и по сумме ненасыщенных ЖК (88-90%). Предпосевное облучение приводило к росту индекса ненасыщенности липидов и концентрации линоленовой кислоты, причем при начальных, более низких дозах этот рост был более интенсивным. С увеличением дозы облучения содержание линоленовой кислоты у обоих сортов снижалось, а линолевой - возрастало. У сорта Зырянка, в отличие от Витаминной, облучение вызывало увеличение содержания линолеата и падение уровня олеата. Сделан вывод, что предпосевное γ-облучение семян облепихи может оказывать значительное влияние на основные количественные показатели состава семян М1-растений. Диапазон и направление вызываемых изменений определяются как дозой облучения, так и генотипом исследуемого сорта.

-------------------------------------------------
Сокращения: ЖК - жирные кислоты: 14:0 - миристиновая; 15:0 - пентадекановая; 16:0 - пальмитиновая; 16:1 - пальмитолеиновая; 17:0 - маргариновая; 18:0 - стеариновая; 18:1 - олеиновая; 18:2 - линолевая; 18:3 - линоленовая; ИН - индекс ненасыщенности смеси ЖК; МЭЖК - метиловый эфир ЖК.
Адрес для корреспонденции: Цыдендамбаев Владимир Дылыкович. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронная почта: vdt@ippras.ru

Ключевые слова: Hippophaё rhamnoides - (-облучение - дозы облучения - растения первого поколения - семена - жирные кислоты - линоленовая кислота

ВВЕДЕНИЕ

Ионизирующая радиация широко используется в генетических и селекционных работах с растениями, в том числе - и с облепихой, для выведения перспективных промышленных сортов с заданными свойствами [1-3].
Предпосевное γ-облучение семян облепихи проводили с целью получения потомства с улучшенным химическим составом плодов - для увеличения содержания масла, каротиноидов, витамина С и т.д., а также для получения мутантных растений с другими хозяйственно-ценными признаками, включающими крупноплодность, сухой и легкий отрыв плодов, слабую околюченность, зимостойкость, устойчивость к болезням и др. [1, 2, 4-6]. Такая обработка приводила к изменению массы и химического состава плодов у растений первого поколения (М1), в том числе - содержания масла в семенах [7] и гипантии плодов [8-10]. Ранее на примере рапса [11], льна [12], подсолнечника [13-15] и сои [16-18] было показано, что физические мутагены (рентгеновские и (-лучи) в зависимости от дозы влияют на содержание масла в семенах растений М1-М3 и на его жирнокислотный (ЖК-) состав.
Содержание липидов и ЖК-состава их масла в семенах облепихи в зависимости от дозы предпосевного γ-облучения и генотипа сорта ранее не изучалось. Между тем, проведение подобных исследований представило бы значительный интерес в связи с тем, что в отдельных частях плода облепихи (семенах и околоплоднике) функционируют различные системы биосинтеза ЖК и триацилглицеринов [19].
Настоящее сообщение посвящено исследованию изменений в содержании липидов и их ЖК-составе в семенах М1-растений облепихи в ответ на предпосевное (-облучение семян в зависимости от дозы облучения и генотипа сорта.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служили два перспективных сорта облепихи (Hippophaё rhamnoides L) - Витаминная и Зырянка, относящиеся к сибирскому климатипу, но имеющие различный генотип. Сорт Витаминная - алтайской селекции [2], а крупноплодный сорт Зырянка был выведен в Институте цитологии и генетики СО РАН с использованием методов радиационного (М1) и химического (М2) мутагенеза [1]. Оба эти сорта широко использовались в генетических исследованиях при получении мутантных растений [1, 2, 4-6].
Семена сорта Витаминная и семена, полученные от растений М1, выращенных из семян, облученных γ-лучами (60Со) на установке РХМ-17 (Россия) дозами 50 и 100 Гр, были предоставлены Лабораторией экспериментальной генетики ВНИИ генетики и селекции плодовых растений (Мичуринск) [4].
Семена сорта Зырянка и семена, полученные от растений М1, выращенных из семян, облученных (-лучами (60Со) на установке ГУБЭ-6000 (Россия) дозами 100, 250 и 500 Гр, были предоставлены Институтом цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск. Контролем служили растения, выращенные из необлученных семян. Анализировали семена технически зрелых плодов, собранных с одного 7-летнего растения в каждом варианте опыта и контроля. Во всех опытах опыление было свободным.
Воздушно-сухие семена (100 шт.) каждого варианта опыта и контроля измельчали, суммарные ацилсодержащие липиды экстрагировали и омыляли с внутренним стандартом (17:0), а выделенные ЖК превращали в их метиловые эфиры (МЭЖК) [20, 21]. Состав полученных МЭЖК определяли на газовом хроматографе (Tracor 540 GC, США) с пламенно-ионизационным детектором на капиллярной колонке (15 м × 0.25 мм) со стационарной фазой Silar 10C ("Alltech", США). Температурный режим колонки: 3 мин при 105(С, программирование до 140(С со скоростью 20(C/мин и далее до 220(С со скоростью 4(C/мин; температура детектора 220(С, испарителя ( 200(С, скорость газа-носителя (аргона) 4 мл/мин [21].
Расчеты индекса ненасыщенности (ИН) смеси ЖК, абсолютного содержания липидов (мкмоль ЖК в расчете на 1 семя и на 1 г воздушно-сухой массы семян), а также их концентрации (% суммарных липидов от этой массы) выполняли, как было описано ранее [20-22]. В таблицах приведены средние арифметические трех аналитических определений и их доверительные интервалы. На рисунке приведены результаты определения массы 100 семян ± стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние величины дозы предпосевного (-облучения на массу семян
и на содержание в них липидов

Предпосевная обработка семян исследованных сортов (-лучами приводила к достоверному снижению массы одного семени у М1-растений во всех опытных вариантах (рисунок). В то же время, эти сорта заметно отличались друг от друга как по данному показателю, так и по степени снижения массы семян при разных дозах облучения. Влияние радиации на уменьшение массы семян М1-растений оказалось значительно более сильным у сорта Витаминная. Так, обработка ее семян наименьшей из исследованных доз (50 Гр) снижало массу 1 семени в среднем на 24.2%, тогда как у сорта Зырянка подобное уменьшение массы (на 25.4%) достигалось лишь при максимальной дозе - 500 Гр. Соответственно, при одной и той же дозе облучения (100 Гр) падение этой величины составило для сорта Витаминная 17.2%, а для сорта Зырянка - только 9.5%. Можно видеть, что величина снижения массы семян у растений облепихи первого поколения зависела, в первую очередь, от генотипа сорта и кроме того - от дозы предпосевного (-облучения.
Содержание суммарных липидов в семенах первого поколения растений сортов Витаминная и Зырянка представлено в табл. 1. Можно видеть, что в контроле эти величины у обоих изученных сортов были почти одинаковыми. У сорта Витаминная предпосевное облучение семян (-лучами в дозах 50 и 100 Гр приводило к некоторому (на 14.5%) уменьшению этого показателя в М1 в расчете на 1 семя, но мало влияло на уровень липидов в расчете на 1 г и в мас.%. В то же время, для сорта Зырянка при дозах 100 и 250 Гр эта величина при всех способах расчета составила, соответственно, ~88% и ~85% от контроля, а при наивысшей дозе, равной 500 Гр, снижалась до ~65% в расчете на 1 г и в мас.% и даже до ~46% от контроля в расчете на 1 семя. Таким образом, у данного сорта, в отличие от Витаминной, предпосевное облучение вызывало весьма значительное падение масличности семян в потомстве.

Влияние различных доз (-облучения на жирнокислотный состав липидов

Данные качественного состава и концентрации индивидуальных видов ЖК в липидах семян первого поколения растений, выращенных из контрольных и облученных семян, приведены в табл. 2 и 3. Можно видеть, что по качественному ЖК-составу суммарных липидов семян контрольных растений оба исследованных сорта не различались между собой, если не учитывать присутствия малых количеств миристиновой, пентадекановой и пальмитолеиновой кислот у сорта Зырянка. Уровни суммы насыщенных и суммы ненасыщенных ЖК во всех вариантах составляли 10-11 и 88-90% соответственно, а концентрации полиеновых (линолевой + линоленовой) и олеиновой кислот во всех случаях, кроме одного (см. ниже), равнялись 74-76 и 14-15%.
Предпосевное облучение всегда приводило к возрастанию ИН липидов в семенах М1-растений, причем начальные, более низкие дозы облучения (50 Гр у сорта Витаминная и 100 Гр у сорта Зырянка) вызывали наибольшее увеличение этого параметра по сравнению с более высокими дозами. Полиеновые ЖК значительно превосходили остальные по степени изменчивости их концентраций в опытных вариантах. Уровни линоленовой кислоты при облучении всегда превышали контрольные у обоих сортов, тогда как концентрация линолевой была выше контрольной в семенах сорта Зырянка, но уступала ей в семенах сорта Витаминная, который всегда превосходил сорт Зырянка по величине ИН. По мере увеличения интенсивности облучения с 50 до 100 Гр содержание линолевой кислоты в липидах сорта Витаминная возрастало, а линоленовой - падало (при относительно постоянном уровне олеиновой). Кроме того, облучение индуцировало в них образование небольших количеств миристиновой и пальмитолеиновой кислот. Таким же образом, в липидах сорта Зырянка увеличение дозы облучения со 100 до 500 Гр сопровождалось возрастанием концентрации линолевой кислоты при одновременном снижении уровня линоленовой. Эти липиды отличались повышенным содержанием олеиновой кислоты в контроле (19.4%), которое возвращалось к "норме" (~15%) в опытных вариантах.

ОБСУЖДЕНИЕ
Как и в наших опытах (рисунок), проводившаяся ранее предпосевная обработка семян дикорастущей алтайской облепихи (-лучами вызвала изменение массы семян М1-растений [7]. Облучение дозами от 10 до 1000 Гр во всех вариантах опыта приводило к снижению массы 100 плодов (семена по отдельности не анализировали) у М1-растений по сравнению с контролем, причем при дозе 300 Гр снижение массы было более значительным, чем при 500, 700 и даже 1000 Гр [7-9].
Сходные с нашими результаты были достигнуты также в опытах с кукурузой при исследовании влияния предпосевного γ-облучения ее семян на рост и развитие полученных растений. Так, у одной из линий кукурузы более сильное снижение массы семян в М1 наблюдалось при 50, а не при 100 Гр; у другой линии более низкая доза радиации (50 Гр) вызывала повышение данного показателя [23]. Таким образом, изменение массы семян у М1-растений определяется не только дозой предпосевного облучения, но и генотипом исходных семян.
Как показывают результаты, представленные в табл. 1, предпосевное облучение семян сорта Витаминная независимо от дозы мало влияло на содержание суммарных липидов в семенах М1-растений. Подобные данные были получены другими авторами при обработке семян дикорастущей алтайской облепихи средними и высокими дозами γ-лучей (300, 500, 700 и 1000 Гр). Было показано, что концентрация масла в мякоти плодов 8-летних М1-растений практически не отличалась от контроля, т.е. не зависела от дозы радиации [9]. Сходным образом, после обработки семян сои Х-лучами содержание масла в семенах второго поколения растений (М2) было таким же, как и в контрольном варианте [16].
В то же время, у сорта Зырянка предпосевное облучение дозой 500 Гр приводило к значительному (более, чем вдвое) снижению уровня липидов в семенах потомства М1 (табл. 1). Аналогичные результаты были получены и в опытах с подсолнечником, в которых предпосевное γ-облучение семян приводило к снижению содержания масла в семенах М4-растений [13]. Наконец, обработка 12-дневных проростков двух генотипов подсолнечника γ-лучами в дозах 7 и 10 Гр вызвала увеличение масличности семян мутантных растений, уровень которой повышался в большей степени при более низкой дозе радиации [14]. Последний вывод согласуется с данными о содержании липидов в семенах сорта Витаминная при 50 и 100 Гр, рассчитанными на 1 г массы и в мас.% (табл. 1). Содержание масла в семенах мутантных растений исследовали также в экспериментах с растениями льна [12] и сои [16].
Таким образом, после предпосевного облучения семян содержание липидов (масла) в семенах растений первого и последующих поколений может оставаться без изменения, уменьшаться или увеличиваться. Направление и степень таких изменений могут зависеть как от внутренних, так и от внешних факторов, таких как генотип растения и доза радиации.
Действие предпосевного γ-облучения на качественный и количественный ЖК-состав липидов семян М1-поколения облепихи ранее не исследовалось. Что же касается других растений, то у подвергнутых облучению семян подсолнечника в масле мутантных форм отмечали появление минорных ЖК, которые отсутствовали в исходных семенах, но встречались у других сортов и линий этого вида растений [13, 15]. Эти результаты соответствуют нашим данным, согласно которым γ-лучи могли индуцировать новообразование миристиновой и пальмитолеиновой кислот, не обнаруженных в липидах исходных семян облепихи (табл. 2).
Характерным для облепихи был также вызванный облучением рост уровней линоленовой кислоты, которые у обоих сортов всегда превышали контрольные (табл. 2 и 3). Стимулирующий эффект γ-облучения на биосинтез этой ЖК в растении обнаруживался в нашей лаборатории и ранее, когда набухшие семена хлопчатника обрабатывали на γ-установке 60Со дозой 200 Гр, а затем проращивали в темноте в течение 1, 3, 5, 7 и 10 суток. В этих условиях, в отличие от контроля, концентрация линолената в масле семядолей между 3- и 5-ми сутками прорастания возрастала в 50 раз, достигая ~24%, а к 10 суткам снижалась почти до исходной величины [24].
Имевшая место в липидах облепихи отрицательная корреляция между уровнями линолевой и линоленовой кислот при сохранении относительно постоянного содержания суммы полиеновых ЖК наблюдалась ранее при радиационном мутагенезе с использованием физических мутагенов - γ- и Х-лучей - в семенах льна [12] и сои [16], а отрицательное соотношение между концентрациями олеата и линолеата, найденное у сорта Зырянка (табл. 3), было отмечено в опытах с подсолнечником [15], льном [12], соей [16, 17] и рапсом [11].
В целом, обработка семян растений физическими мутагенами позволила во многих случаях получать перспективные для практики мутантные линии масличных культур с измененным уровнем тех или иных ЖК в резервных липидах [11-18].
Таким образом, предпосевное γ-облучение семян облепихи может вызывать значительные изменения основных количественных показателей состава семян растений первого поколения (М1). Эти показатели включают массу семян, абсолютное содержание в них суммарных липидов и концентрацию в липидах остатков индивидуальных видов ЖК. Размах и направление вызываемых изменений определяются как дозой γ-облучения, так и генотипом исследуемого сорта.
Авторы приносят благодарность сотруднику Лаборатории экспериментальной генетики ВНИИ генетики и селекции плодовых растений Г.И. Мокроусовой за предоставление семян сорта Витаминная и двух отобранных мутантных растений (50 и 100 Гр) для проведения исследований и сотруднику Института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск Г.М. Скуридину за предоставление семян сорта Зырянка и семян растений первого поколения.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.Привалов Г.Ф. Экспериментальный мутагенез и мутационная селекция облепихи // Генетические методы в селекции растений / Под ред. Шумного В.К. Новосибирск: Наука, Сибирское отд., 1992. С. 210-237.
2.II Международный симпозиум по облепихе // Тезисы докладов / РАСХН, Сибирское отд., Новосибирск, 1993. 462 с.
3.Моргун В.В. Экспериментальный мутагенез и его использование в генетическом совершенствовании культурных растений (итоги 30-летних исследований) // Физиология и биохимия культ. растений. 1996. Т. 28. С. 53-72.
4.Жуков О.С., Мокроусова Г.И. Новые перспективные формы облепихи для ЦЧО // Физиология и биохимия культурных растений // Под ред. Елисеева И.П. Горький: ГСХИ, 1985. С. 92-96.
5.Жуков О.С., Мокроусова Г.И. Улучшение биохимического состава плодов облепихи путем радиационного мутагенеза // Биология, химия, интродукция и селекция облепихи // Под ред. Елисеева И.П. Горький: ГСХИ, 1986. С. 67-68.
6.Жуков О.С., Мокроусова Г.И. Получение ценных мутантов облепихи с использованием природных популяций // Механизмы радиационного мутагенеза / Тезисы докладов. Пущино, 1989. С. 34.
7.Привалов Г.Ф., Солоненко Л.П., Трофимова О.С. Изменчивость химического состава плодов облепихи в результате облучения семян ионизирующей радиацией в стимулирующих дозах // Изв. СО АН СССР. Сер. биол. 1971. Т. 2. С. 72-75.
8.Привалов Г.Ф., Солоненко Л.П. Изменчивость биохимического состава плодов облепихи в М1 в результате обработки семян гамма-лучами в больших дозах // Вопросы теоретической и прикладной генетики / Под ред. Салганик Р.И. Новосибирск, 1976. С. 72-73.
9.Привалов Г.Ф., Солоненко Л.П. Ионизирующая радиация как фактор отбора у облепихи // Генетика. 1977. Т. 13. С. 2045-2046.
10.Привалов Г.Ф., Скуридин Г.М., Солоненко Л.П. Влияние обработки семян мутагенами и гиббереллинами на химический состав плодов облепихи в М1 // Биология, химия и фармакология облепихи. Новосибирск: Наука, Сибирское отд., 1983. С. 49-56.
11.Laakso I., Hiltunen R., Hovinen S., Schantz M., Huhtikangas A. Selection of High Linoleic Acid Content in Summer Turnip Rape (Brassica campestris L.). I. Variation of Fatty Acids in an Irradiated Crossing Material // Acta Agric. Scandinavica. 1982. V. 32. P. 397-404.
12.Green A.G., Marshall D.R. Isolation of Induced Mutants in Linseed (Linum usitatissimum) Having Reduced Linolenic Acid Content // Euphytica. 1984. V. 33. P. 321-328.
13.Иванов П., Иванов И.Г. Мутантна линия слънчоглед с високо съдържание на палмитинова киселина // Генетика и селекция. 1985. T. 18. С. 123-127.
14.Encheva J., Ivanov P., Tsvetkova F., Nikolova V. Development of a New Initial Breeding Material in Sunflower (Helianthus annuus L.) Using Direct Organogenesis and Somatic Embryogenesis // Euphytica. 1993. V. 68. P. 181-185.
15.Garces R., Osorio J., Mancha M., Fernandez-Martinez J.M. Sunflower Mutants with Altered Fatty Acid Composition in the Seed Oil // Plant Lipid Metabolism / Eds Kader J.-C., Mazliak P. Dordrecht: Kluwer, 1995. P. 512-514.
16.Takagi Y., Hossain A.B.M.M., Yanagita T., Matsueda T., Murayama A. Linolenic Acid Content in Soybean Improved // Agric. Biol. Chem. 1990. V. 54. P. 1735-1738.
17.Rahman S.M., Takagi Y., Kubota K., Miyamoto K., Kawakita T. High Oleic Acid Mutant in Soybean Induced by X-Ray Irradiation // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1994. V. 58. P. 1070-1072.
18.Takagi Y., Rahman S.M., Joo H., Kawakita T. Reduced and Elevated Palmitic Acid Mutants in Soybean Developed by X-Ray Irradiation // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995. V. 59. P. 1778-1779.
19.Озеринина О.В., Бережная Г.А., Верещагин А.Г. Состав и строение триацилглицеринов плодов облепихи из различных районов произрастания // Физиология растений. 1997. Т. 44. С. 74-82.
20.Беленко Е.Л., Датунашвили Е.Н., Цыдендамбаев В.Д., Верещагин А.Г. Абсолютное содержание и экстрагируемость липидов виноградной ягоды // Физиология растений. 1984. Т. 31. С. 162-167.
21.Бережная Г.А., Елисеев И.П., Цыдендамбаев В.Д., Верещагин А.Г. Определение жирнокислотного состава и количественного содержания липидов в плодах облепихи // Прикладная биохимия и микробиология. 1988. Т. 24, С. 568-572.
22.Бережная Г.А., Озеринина О.В., Елисеев И.П., Цыдендамбаев В.Д., Верещагин А.Г. Динамика абсолютного содержания и жирнокислотного состава ацилсодержащих липидов в созревающих плодах облепихи // Физиология растений. 1992. Т. 39. С. 1187-1196.
23.Коробова Н.А., Котова Г.П., Попеску О.В. Сравнительная эффективность действия химических и физических мутагенов на рост и развитие растений кукурузы в М1 // Применение физических и химических мутагенных факторов в селекции и генетике полевых культур // Под ред. Унгурян В.Г. Кишинев, 1985. С. 58-63.
24.Верещагин А.Г., Ганиева М. Обмен липидов в созревающих и прорастающих семенах хлопчатника и влияние гамма-излучения на этот процесс // Биохимия. 1964. Т. 29. С. 288-299.



ПОДПИСЬ К РИСУНКУ

Влияние дозы γ-облучения на массу семян двух сортов облепихи.
1 ( сорт Витаминная; 2 ( сорт Зырянка.