УДК 581.1

ВОЗМОЖНОЕ УЧАСТИЕ ЦИАНОБАКТЕРИЙ В ФОРМИРОВАНИИ ГОРМОНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ РАСТЕНИЙ

© 2014 г. Г. В. Шевченко, Н. Н. Каравайко, С. Ю. Селиванкина, Н. К. Зубкова, 

Е. В. Куприянова, Д. А. Лось, В. В. Кузнецов, О. Н. Кулаева

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки 

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва

Поступила в редакцию 25.03.2013 г.

Впервые показано присутствие в цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 растворимого цитокинин-связывающего белка с мол. м. 67 кД (ЦСБ67). Выделение ЦСБ67 проводили двумя независимыми методами: с помощью аффинной хроматографии на зеатин-сефарозе и путем иммуноаффинной хроматографии с использованием моноклональных антител (мкАТ), полученных к ЦСБ70 (70 кД) кукурузы. Цитокинин-связывающие свойства ЦСБ67 установлены по его взаимодействию с антиидиотипическими антителами (АТа-и), которые были получены против АТ к зеатину и являются, по сути, АТ к зеатин-связывающему сайту белка. Показана высокая специфичность взаимодействия транс-зеатина с ЦСБ67. Взаимодействие было снижено у зеатинрибозида и цис-зеатина и отсутствовало у других фитогормонов (ауксина, гибберелловой кислоты и абсцизовой кислоты), а также у аденина. ЦСБ67 цианобактерий активировал транскрипцию in vitro в лизате Synechocystis. Совместное действие ЦСБ67 и транс-зеатина давало наибольший эффект. ЦСБ67 Synechocystis активировал также транскрипцию в лизате хлоропластов ячменя. Совокупность полученных результатов указывает на возможность существования систем восприятия сигнала цитокинина у эволюционного предшественника хлоропластов – цианобактерий, которые могли привнести эту систему в растительную клетку.

------------------------------------------

Сокращения: АТ – антитела; мкАТ – моноклональные антитела; ТФС  фосфатно-солевой буфер с Твин 20; ЦСБ – цитокинин-связывающий белок.

Адрес для корреспонденции: Шевченко Галина Васильевна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Факс: 007 (499) 977-80-18; электронная почта: gshevchenko@mail.ru

Ключевые слова: Synechocystis – хлоропласты  цитокинины – цитокинин-связывающие белки  цитокинин-зависимая регуляция транскрипции – эволюция гормональной системы

 

ВВЕДЕНИЕ

Большая роль в регуляции биогенеза хлоропластов принадлежит цитокининам. Хорошо изучена активация цитокинином структурной и биохимической дифференциации хлоропластов [13]. В хлоропластах присутствует большой набор физиологически активных цитокининов [46]. Показано, что цитокинин может активировать транскрипцию ряда хлоропластных генов [7].

Существует представление о том, что хлоропласты произошли в результате эндоцитоза древних фотосинтезирующих цианобактерий в эукариотическую клетку [8, 9]. В связи с этим, большой интерес представляет обнаружение цитокининов в цианобактериях. Stirk с соавт. [10] показали присутствие в цианобактериях изопентиниладенина. В последующем, в цианобактериях идентифицированы также транс- и цис-зеатин, зеатинрибозид и зеатин-О-глюкозид [11]. Кроме того, показано влияние транс-зеатина на активность РНК-полимеразы цианобактерий in vitro в лизате клеток Synechocystis, содержащем ДНК, регуляторные белки и РНК-полимеразу цианобактерий [12]. Существенно, что выделенный ранее из хлоропластов листьев ячменя цитокинин-связывающий белок, участвующий в цитокинин-зависимой регуляции транскрипции в хлоропластах растений и не участвующий в гормон-зависимой активации транскрипции в ядрах, усиливал реакцию на транс-зеатин в транскрипционной системе цианобактерий [12]. Эти данные позволяют предполагать, что у цианобактерий существует регуляторная система с участием цитокининов, которую они могли бы привнести в растительную клетку. Однако очевидно, что элементы этой системы могли претерпеть в растениях значительные изменения.

До настоящего времени не было работ, посвященных поиску цитокинин-связывающих белков цианобактерий, которые могли бы быть молекулярными мишенями этого фитогормона и участвовать в его влиянии на метаболизм клеток, хотя актуальность такой постановки вопроса очевидна с точки зрения анализа роли цианобактерий в эволюции гормональной системы растений.

В связи с этим, задачей нашей работы был поиск цитокинин-связывающих белков в цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 и изучение их активности.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлся штамм цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 (“Du Pont”, США). Цианобактерии культивировали в течение трех дней фотоавтотрофно в стерильных условиях на среде BG11, при температуре 34°С, при постоянном освещении 70 мкмоль/(м2 с) квантов света и барботировании газо-воздушной смесью, содержащей 2% СО2.

Выделение цитокинин-связывающих белков (ЦСБ). Выделение ЦСБ проводили из водорастворимой фракции лизата Synechocystis. Клетки разрушали механически с помощью стеклянных бус G4649 (“Sigma”, США) в среде, содержащей 50 мМ Трис-HCl (pH 8.0), 10 мМ MgCl2, 10 мМ KCl и 4 мМ 2-меркаптоэтанола, затем центрифугировали при 160 000 g в течение 2 ч при 4°С. Полученный супернатант использовали для дальнейших исследований. Для выделения ЦСБ использовали гидрофобную хроматографию на фенил-сефарозе. Фракцию белков в буфере выделения с добавлением NaCl до концентрации 2 М наносили на колонку (2.6 × 12 см) с фенил-сефарозой CL-4В (“GE Healthcare”, США), уравновешенную буфером 50 мМ Трис-HCl (рН 7.7), 10 мМ MgCl2, 2 М NaCl. Не связавшиеся белки удаляли промывкой фенил-сефарозы тем же буфером. Элюцию белков, связавшихся с фенил-сефарозой, проводили последовательно: 1) нисходящим градиентом NaCl в концентрации от 2 до 0 М в 20 мМ Трис-HCl (рН 7.7); 2) 20 мМ Трис-HCl (рН 7.7); 3) дистиллированной H2O.

Фракцию белков, содержащую ЦСБ Synechocystis, выделяли из очищенной на фенил-сефарозе фракции лизата двумя методами. 

Аффинная хроматография. При выделении методом аффинной хроматографии использовали зеатин-сефарозу, полученную иммобилизацией зеатинрибозида на АН-сефарозе 4В (“GE Healthcare”) периодатным методом [13]. Объем колонки  2.6 × 6 см. Матрикс предварительно уравновешивали 20 мМ Трис-HCl (рН 7.7) с 0.2 М NaCl, после чего наносили фракцию белков. Несвязанные белки отмывали тем же буфером, затем 1 М NaCl в 50 мМ Трис-HCl (рН 8.3). Элюцию проводили 0.2 М NaОН или транс-зеатином в концентрации 105 М в буфере, содержащем 1 М NaCl в 50 мМ Трис-HCl (рН 8.3). 

Иммуноаффинная хроматография. При выделении ЦСБ методом иммуноаффинной хроматографии использовали моноклональные АТ (мкАТ) к ЦСБ 70 кД из этиолированных проростков кукурузы, предоставленные Ф.А. Бровко (Филиал института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино Московской обл.). мкАТЦСБ70 иммобилизовали на CNBr-активированную сефарозу 4В (“GE Healthcare”) согласно методическим рекомендациям фирмы “GE Healthcare”. Белки наносили на колонку (1.4 × 3 см) в буфере, содержащем 50 мМ KCl, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ MgCl2, 20 мМ Трис-HCl (рН 8.0). Элюцию проводили 0.2 N NH4ОН.

Получение антиидиотипических Ат (АТа-и) к транс-зеатину. АТa-и выделяли при помощи двойной иммунизации кроликов. На первом этапе выделяли АТ к транс-зеатину из поликлональных сывороток, полученных на транс-зеатин с помощью аффинной хроматографии на транс-зеатин-сефарозе. Очищенные АТ к зеатину использовали для повторной иммунизации. ATа-и выделяли из полученной сыворотки с помощью хроматографии на сефарозе с иммобилизованными AT к транс-зеатину. Очищенные АТa-и использовали для ИФА в качестве АТ против зеатин-связывающего сайта белковой молекулы [14].

Детектирование ЦСБ методом твердофазного ИФА. На всех этапах работы присутствие ЦСБ устанавливали с помощью АТa-и к транс-зеатину. Детектирование ЦСБ проводили в тест-системе твердофазного ИФА. Для этого исследуемую белковую фракцию иммобилизовали при 4°С в лунках полистиролового планшета в течение ночи. Затем лунки промывали фосфатно-солевым буфером с Твин 20 (ТФС-буфер: 20 мМ фосфатный буфер рН 7.4, содержащий 150 мМ NaCl и 0.2% Твин 20), после чего в них вносили АТa-и в ТФС-буфере с добавлением 1% овальбумина и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После промывки ТФС-буфером и дистиллированной H2O в систему в том же буфере, что и АТa-и вносили ослиные противокроличьи иммуноглобулины, меченные пероксидазой хрена (“Медгамал”, Россия). После инкубации в течение 1 ч при 37°С лунки промывали ТФС-буфером и дистиллированной H2O. Активность пероксидазы измеряли, используя в качестве хромогена ортофенилендиамин. Интенсивность хромофорного сигнала измеряли при 490 нм на 8-канальном спектрофотометре вертикального сканирования Labsystems Multiscan МСС-340 (“Flow Laboratories”, Великобритания).

Определение специфичности связывания ЦСБ с фитогормонами проводили в конкурентной системе твердофазного ИФА. ЦСБ иммобилизовали в лунках полистиролового планшета в течение ночи при 4°С, не связавшиеся белки отмывали ТФС-буфером. Затем вносили АТa-и и тестируемые на связывание с белками соединения в различных концентрациях (АБК, цис-, транс-зеатин, зеатинрибозид, ИУК, ГК и аденин) и инкубировали при 4°С в течение ночи. Это позволяло определить способность соединений вытеснять АТa-и из комплекса с белком и таким путем оценить специфичность связывания цитокинина с ЦСБ. После отмывания ТФС-буфером вносили вторичные противокроличьи АT, меченные пероксидазой хрена (“Медгамал”), и измеряли хромофорный ответ при 490 нм на спектрофотометре Labsystems Multiscan МS (“Labsystems”, Великобритания).

Активность ЦСБ и цитокининов в регуляции транскрипции изучали в системе синтеза РНК in vitro, представляющей собой супернатант водорастворимой фракции лизата клеток Synechocystis, отделенный от нерастворимой фракции центрифугированием при 15 000 g в течение 30 мин. В супернатанте присутствовали ДНК, РНК-полимераза, белковые факторы, необходимые для процесса транскрипции [12]. О синтезе РНК судили по включению в нее меченного предшественника [3Н]-УМФ. Радиоактивность определяли на сцинтилляционном счетчике RIA GAMMA-1271 (“LKB”, Швеция).

Изоэлектрическое фокусирование белков в нативных условиях проводили согласно методическим указаниям фирмы Bio-Rad на аппарате MicroRotofor (“Bio-Rad”, США) с использованием амфолинов с диапазоном pH 310.

Электрофорез белков в денатурирующих условиях в 10% ПААГ проводили в системе Laemmli [15]. Гели окрашивали Кумасси R-250.

Электроперенос и иммуноблоттинг. Белки для иммуноблоттинга с незафиксированного геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C полусухим способом на приборе Multifor II NovAblot (“LKB”). Перенос проводили в 50 мМ Na-боратном буфере (pH 9.0) с 20% метанолом (анод) и 5% метанолом (катод). Окраску белков на мембране проводили смесью 19 мл 0.1% KI в 0.1 М HCl и 1 мл 1% хлорамина-Т в метаноле. Проявление окраски осуществлялось 0.1% водным раствором крахмала. Иммуноблоттинг проводили с АТa-и к транс-зеатину, для идентификации взаимодействия использовали вторичные противокроличьи флуоресцирующие АТ (НИИЭМ, Россия). Сканирование мембраны проводили на многофункциональном сканере Typhoon (“GE Healthcare”).

Наличие глутатион-связывающих сайтов у гормон-связывающих белков определяли с помощью хроматографии на глутатион-сефарозе. Глутатион иммобилизовали на сефарозу 4B (“GE Healthcare”). Белки наносили на колонку (0.6 × 3 см) в буфере, содержащем 20 мM Трис-HCl (pH 7.4), 200 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА. Элюцию проводили тем же буфером с добавлением 10 мМ дитиотрейтола (ДТТ). 

 

РЕЗУЛЬТАТЫ 

ЦСБ выделяли из супернатанта (160 000 g, 2 ч) лизата клеток Synechocystis методом, включающим в себя гидрофобную хроматографию на фенил-сефарозе CL-4B и аффинную хроматографию на зеатин-сефарозе, а также методом иммуноаффинной хроматографии с использованием мкАТ к ЦСБ70 кукурузы. На всех этапах выделения ЦСБ идентифицировали по его взаимодействию с полученными нами АТa-и к зеатину в системе твердофазного иммуноферментного анализа, поскольку АТa-и можно рассматривать как АТ против зеатин-связывающего сайта белковой молекулы [14]. 

При выделении ЦСБ методом аффинной хроматографии на зеатин-сефарозе ЦСБ67 был обнаружен во фракциях, элюируемых 0.2 М NaOH (рис. 1, I) или транс-зеатином (рис. 1, II). В последнем случае происходило конкурентное замещение зеатина, иммобилизованного на зеатин-сефарозе, на зеатин из элюирующего раствора. Такой же белок был обнаружен и при выделении ЦСБ67 с помощью иммуноаффинной хроматографии с использованием мкАТ к ЦСБ70 кукурузы (рис. 1, III), что указывает на то, что ЦСБ Synechocystis имеет общие иммунодетерминанты с ЦСБ высших растений.

Для выделения и очистки ЦСБ также применяли изоэлектрическое фокусирование в растворе в нативных условиях с использованием MicroRotofor (“Bio-Rad”). При этом ЦСБ67 концентрировался в десять раз во фракции с pH 7.5 (данные не представлены).

Для исследования специфичности взаимодействия ЦСБ67 с цитокининами мы использовали конкурентную систему твердофазного ИФА, в которой АТa-и конкурировали с исследуемыми веществами (транс-зеатин, зеатинрибозид, цис-зеатин) за образование комплекса с ЦСБ67. Рис. 2 показывает, что транс-зеатин эффективно вытеснял АТa-и из комплекса с ЦСБ67. Вытеснение зависело от концентрации транс-зеатина, проявлялось уже при его концентрации 109 М и нарастало с ее увеличением. Зеатинрибозид – производное транс-зеатина – обладал гораздо меньшей способностью вытеснять АТa-и из комплекса с белком. Только в концентрации 107 М он достигал такого же вытеснения АТa-и из комплекса с белком, как и транс-зеатин в концентрации 109 М. Следовательно его аффинность к ЦСБ67 была в 100 раз ниже, чем у транс-зеатина. Это указывает на то, что рибозилирование существенно снижало аффинность соединения с цитокинин-связывающим сайтом белка. Еще меньшая способность конкурировать с АТa-и за связывание с ЦСБ67 была обнаружена у цис-зеатина. Она была слабо выражена даже при концентрации цис-зеатина 105 М, следовательно, была в 10 000 раз слабее, чем у транс-зеатина. Аденин, который является предшественником цитокининов пуринового ряда, но не обладает цитокининовой активностью, не взаимодействовал с ЦСБ67. Ауксин, АБК и ГК также не конкурировали с АТa-и за связывание с ЦСБ67.

Таким образом, выделенный из Synechocystis ЦСБ67, проявляет способность специфически связываться с цитокининами и не связывается с другими изученными нами фитогормонами (АБК, ИУК, ГК) и неактивным предшественником цитокининов – аденином. Сродство ЦСБ67 Synechocystis к различным формам цитокининов соответствует физиологической активности этих форм в растениях. Все это указывает на специфичность взаимодействия ЦСБ67 с физиологически активным цитокинином транс-зеатином.

Для характеристики выделенного ЦСБ67 Synechocystis была исследована его способность участвовать в регуляции транскрипции в условиях in vitro. Для этого в качестве транскрипционной системы использовали лизаты клеток Synechocystis и хлоропластов листьев ячменя. В этих системах происходит элонгация транскриптов, инициированных in vivo. Как видно на рис. 3, транс-зеатин в подобранной в предварительных опытах концентрации значительно увеличивал активность транскрипции в транскрипционной системе Synechocystis, в то время как аденин не влиял на активность реакции. Это указывает на специфичность действия транс-зеатина и позволяет предположить, что в транскрипционной системе цианобактерий присутствовала мишень для действия транс-зеатина. ЦСБ67 увеличивал активность транскрипции in vitro в два раза по сравнению с контролем в транскрипционной системе Synechocystis, следовательно, в ней присутствовали все необходимые для действия белка компоненты. Добавление в транскрипционную среду Synechocystis ЦСБ67 совместно с транс-зеатином вызывало наибольшее повышение активности транскрипции (рис. 3). ЦСБ67 Synechocystis активировал также транскрипцию в лизате хлоропластов листьев ячменя. Однако, в отличие от транскрипционной системы Synechocystis, сам по себе транс-зеатин не вызывал активации транскрипции в лизате хлоропластов и не увеличивал эффекта действия ЦСБ67 цианобактерии. Таким образом, транс-зеатин и ЦСБ67, выделенный из Synechocystis, способны влиять на интенсивность элонгации транскрипции in vitro, как в лизате из клеток Synechocystis, так и в лизате хлоропластов из листьев ячменя. Вместе с тем, в реакции транскрипционной системы цианобактерий и хлоропластов высших растений (в данном случае, ячменя) на цитокинин и ЦСБ67 Synechocystis обнаружены различия.

Известно, что регуляция транскрипции может осуществляться с помощью факторов транскрипции, связывание которых с ДНК зависит от тиол-восстанавливающих агентов [16]. В связи с этим, для дальнейшей характеристики ЦСБ67 Synechocystis мы попытались выявить наличие у белка глутатион-связывающих сайтов. Для этого фракцию белков, элюированных с фенил-сефарозы водой и содержащую белок, взаимодействующий с АТa-и, наносили на глутатион-сефарозу. Элюированный с колонки при использовании ДТТ (10 мМ) белок взаимодействовал с АТa-и и имел мол. м. 67 кД (данные не представлены). Таким образом, ЦСБ67 Synechocystis имеет, кроме сайта связывания с зеатином, еще и сайт связывания с глутатионом, что может быть важным для проявления его функциональной активности в клетке.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

В работе впервые был обнаружен и охарактеризован цитокинин-связывающий белок из цианобактерий. Это представляет существенный интерес в связи с тем, что в цианобактериях найдены эндогенные цитокинины, обладающие в растениях гормональной активностью [10, 11, 17]. 

В представленной работе показано, что ЦСБ67 Synechocystis связывает природный цитокинин транс-зеатин (рис. 2), который является одним из основных функционально-активных цитокининов в растениях [18]. Производные транс-зеатина, например, зеатинрибозид, обладали гораздо меньшей аффинностью к ЦСБ67. Еще меньшая способность связываться с ЦСБ67 была выявлена у цис-зеатина, что хорошо согласуется с данными об отсутствии у него активности в регуляции транскрипции в лизате хлоропластов ячменя в присутствии хлоропластного ЦСБ [19]. Важно, что аденин, который является структурным аналогом цитокининов пуринового ряда, но не обнаруживает цитокининовой активности, не связывался с транс-зеатин-связывающим сайтов ЦСБ67. Другие исследованные в нашей работе фитогормоны (АБК, ИУК, ГК) также не связывались с ЦСБ (рис. 2). Все это показывает высокую специфичность взаимодействия транс-зеатина с ЦСБ67 Synechocystis.

ЦСБ67 Synechocystis взаимодействовал с мкАТ к ЦСБ70 из этиолированных проростков кукурузы. Brovko с соавт. [20] показали, что ЦСБ70 присутствует в этиопластах и амилопластах этиолированных проростков и в хлоропластах зеленых растений кукурузы. Взаимодействие мкАТЦСБ70 с ЦСБ67 Synechocystis позволяет думать, что в хлоропластах кукурузы и клетках цианобактерий присутствуют цитокинин-связывающие белки, имеющие общие иммунодетерминанты.

ЦСБ67 в лизате Synechocystis активировал in vitro элонгацию транскриптов, инициированных in vivo. Ранее активация элонгации транскриптов in vitro была показана для хлоропластных и ядерных ЦСБ однодольных и двудольных растений [1922]. Таким образом, активация элонгации транскрипции – общее свойство цитокинин-связывающих белков цианобактерий и высших растений.

ЦСБ67 обладает не только зеатин-связывающей, но и глутатион-связывающей способностью. Поскольку известно, что окислительно-восстановительные условия могут влиять на регуляторную активность определенных групп факторов транскрипции растений [16], глутатион-связывающий сайт ЦСБ67 может иметь значение для проявления его активности. В дальнейшем представляется важным изучить эти свойства ЦСБ67.

Ранее в работе Романко с соавт. [21] из хлоропластов листьев ячменя с помощью синтетического цитокинина 6-бензиламинопурина (БАП), иммобилизованного на эпокси-сефарозе, был выделен цитокинин-связывающий белок (ЦСБ), который в присутствии БАП активировал транскрипцию in vitro РНК-полимеразой хлоропластов ячменя. Из хлоропластов листьев ячменя был выделен другой ЦСБ на основании его аффинности к природному цитокинину транс-зеатину, который вызывал зеатин-зависимую активацию транскрипции in vitro РНК-полимеразой хлоропластов ячменя и не влиял на транскрипцию в ядре [19]. ЦСБ, активирующий в присутствии транс-зеатина транскрипцию РНК-полимеразой хлоропластов и этиопластов был показан также в этиопластах кукурузы [20]. Обнаруженный в нашей работе ЦСБ Synechocystis, активировал транскрипцию in vitro в отсутствие цитокинина в реакционной среде. Сам транс-зеатин также активировал транскрипцию in vitro в лизате цианобактерии. Подобная активация транскрипции только цитокинином или только ЦСБ также наблюдалась в лизате хлоропластов риса [23]. Причины различий в реакции транскрипционной системы in vitro в Synechocystis и хлоропластах риса [23], с одной стороны, и в хлоропластах ячменя [19, 21, 22], с другой стороны, а также в этиопластах кукурузы [20] еще предстоит выяснить в будущем. 

Результаты, полученные в этой работе, показали, что ЦСБ67 Synechocystis активировал транскрипцию в лизате хлоропластов ячменя (рис. 3). Ранее нами было показано, что ЦСБ из хлоропластов ячменя активировал in vitro элонгацию транскрипции в транскрипционной системе Synechocystis, и эффект белка возрастал в присутствии цитокинина [12]. Таким образом, транскрипционная система Synechocystis могла распознать не только ЦСБ Synechocystis, но также и ЦСБ хлоропластов и ответить на него активацией транскрипции. В свою очередь, в лизате хлоропластов в ответ на внесение ЦСБ Synechocystis увеличивалась активность транскрипции. Эти данные показывают, что у цианобактерий и хлоропластов есть общие или подобные системы регуляции транскрипции с участием ЦСБ. Это позволяет предполагать, что древние цианобактерии могли привнести в растительную клетку компоненты регуляторной системы с участием цитокининов, которая в ходе эволюции хлоропластов могла претерпеть ряд изменений.

Как известно, в ответе растений на цитокинин участвуют мембранные рецепторные гистидиновые киназы, которые воспринимают сигнал цитокинина и включают фосфатный каскад, обеспечивающий передачу сигнала в ядро и индукцию экспрессии генов первичного ответа на цитокинин ARR типа А, обеспечивающих негативный контроль реакции растительных клеток на цитокинин [24, 25]. Мембранные рецепторные гистидиновые киназы, воспринимающие цитокининовый сигнал, были также найдены во внутренних мембранах клеток проростков кукурузы, но не в хлоропластах [26]. Взаимодействие систем восприятия и передачи цитокининового сигнала через мембранные рецепторы с цитокинин-связывающими белками, участвующими в цитокинин-зависимой регуляции транскрипции, которые обсуждались в нашей работе, остается не изученным. Представленные в настоящей работе данные о ЦСБ67 Synechocystis и его подобии ЦСБ растений позволяют предполагать, что эти белки представляют собой эволюционно более древнюю систему ответа транскрипционных процессов на цитокинин. Дальнейшее изучение этой проблемы требует выяснения молекулярного механизма действия ЦСБ Synechocystis и растений в регуляции транскрипции.

Авторы благодарят д.б.н. Бровко Ф.А. (Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино) за предоставление моноклональных антител к ЦСБ70 кукурузы.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 11-04-01008 и № 10-04-00594).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 

1.Хохлова В.А. Действие цитокинина на формирование пластид на свету и в темноте в изолированных семядолях тыквы // Физиология растений. 1977. Т. 24. С. 11891193.

2.Caers M., Vendrig J.C. Benzyladenine effects on the development of the photosynthetic apparatus in Zea mays: studies on photosynthetic activity, enzymes and chloroplast ultrastructure // Physiol. Plant. 1986. V. 66. P. 685–691.

3.Kusnetsov V.V., Oelmüller R., Sarwat M.I., Porfirova S.A., Cherepneva G.N., Herrmann R.G., Kulaeva O.N. Cytokinins, abscisic acid and light affect accumulation of chloroplast proteins in Lupinus luteus cotyledons without notable effect on steady-state mRNA levels // Planta. 1994. V. 194. P. 318–327.

4.Benková E., Witters E., van Dongen W., Kolá J., Motyka V., Brzobohatý B., van Onckelen H.A., Macháčková I. Cytokinins in tobacco and wheat chloroplasts: occurrence and changes due to light/dark treatment // Plant Physiol. 1999. V. 121. P. 245–251.

5.Polanska L., Vicankova A., Novakova M., Malbeck J., Dobrev P.I., Brzobohaty B., Vankova R., Macháčková I. Altered cytokinin metabolism affects cytokinin, auxin, and abscisic acid contents in leaves and chloroplasts, and chloroplast ultrastructure in transgenic tobacco // J. Exp. Bot. 2007. V. 58. P. 637–649.

6.Hirose N., Takei K., Kuroha T., Kamada-Nobusada T., Hayashi H., Sakakibara H. Regulation of cytokinin biosynthesis, compartmentalization and translocation // J. Exp. Bot. 2008. V. 59. P. 75–83.

7.Zubo Y., Yamburenko M., Selivankina S., Shakirova F., Avalbaev A., Kudryakova N., Zubkova N., Liere K., Kulaeva O., Kusnetsov V., Börner T. Cytokinin stimulates chloroplast transcription in detached barley leave // Plant Physiol. 2008. V. 148. P. 1082–1093.

8.Margulis L. Origin of Eukaryotic Cells. New Haven: Yale University Press, 1970. 349 p.

9.Douglas S.E., Turner S. Molecular evidence for the origin of plastids from a cyanobacterium-like ancestor // J. Mol. Evol. 1991. V. 33. P. 267–273.

10.Stirk W., Ördög V., van Staden J. Identification of the cytokinin isopentenyladenine in a strain of Arthronema africanum (Cyanobacteria) // J. Phycol. 1999. V. 35. P. 89–92.

11.Hussain A., Krischke M., Roitsch T., Hasmain S. Rapid determination of cytokinins and auxin in Cyanobacteria // Curr. Microbiol. 2010. V. 61. P. 361–369.

12.Селиванкина С.Ю., Зубкова Н.К., Куприянова Е.В., Люкевич Т.В., Кузнецов В.В., Лось Д.А., Кулаева О.Н. Реакция на цитокинин у цианобактерий // Физиология растений. 2006. Т. 53. С. 851856.

13.Moore F.H. A cytokinin-binding proteins from wheat germ // Plant Physiol. 1979. V. 64. P. 594–599.

14.Marx J.L. Making antibodies without the antigens // Science. 1985. V. 228. P. 162–165.

15.Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. P. 680–685.

16.Tron A.E., Bertoncini C.W., Chan R.L., Gonzale D.H. Redox regulation of plant homeodomain transcription factors // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 34 800–34 807.

17.Stirk W.A., Ördög V., van Staden J., Jager K. Cytokinin- and auxin-like activity in Cyanophyta and Microalgae // J. Appl. Phycol. 2002. V. 14. P. 215–221.

18.Sakakibara H. Cytokinins: activity, biosynthesis and translocation // Annu. Rev. Plant Biol. 2006. V. 57. P. 431–449. 

19.Селиванкина С.Ю., Каравайко Н.Н., Черепнева Г.Н., Прищепова А.Е., Кузнецов В.В., Кулаева О.Н. Биологически активный зеатин-связывающий белок из хлоропластов листьев ячменя // Докл. АН. 1997. Т. 356. С. 830832.

20.Brovko F.A., Vasil'eva S.V., Lushnikova A.L., Selivankina S.Y., Karavaiko N.N., Boziev K.M., Shepelyakovskaya A.O., Moshkov D.A., Pavlik L.L., Kusnetsov V.V., Kulaeva O.N. Cytokinin-binding protein (70 kDa) from etioplasts and amyloplasts of etiolated maize seedlings and chloroplasts of green plants and its putative function // J. Exp. Bot. 2010. V. 61. P. 3461–3474. 

21.Романко Е.Г., Селиванкина С.Ю., Мошков И.Е., Новикова Г.В. Действие выделенных из хлоропластов цитокинин-связывающих белков на транскрипцию // Физиология растений. 1986. Т. 33. С. 10781083.

22.Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Kusnetsov V.V., Zemlyachenko Ya.V., Cherepneva G.N., Maslova G.G., Lyukevich T.V., Smith A.R., Hall M.A. Nuclear and chloroplast cytokinin-binding proteins from barley leaves participating in transcription regulation // Plant Growth Regul. 2000. V. 32. P. 329–335.

23.Люкевич Т.В., Кузнецов В.В., Каравайко Н.Н., Кулаева О.Н., Селиванкина С.Ю. Участие хлоропластного зеатин-связывающего белка в гормон-зависимой регуляции транскрипции хлоропластного генома // Физиология растений. 2002. Т. 49. С. 105112.

24.Ferreira F.J., Kieber J.J. Cytokinin signaling // Plant Biol. 2005. V. 8. P. 518–525.

25.Müller B., Shen J. Advances in cytokinin signaling // Science. 2007. V. 318. P. 6869.

26.Lomin S.N., Yonekura-Sakakibara K., Romanov G.A., Sakakibara H. Ligand-binding properties and subcellular localization of maize cytokinin receptors // J. Exp. Bot. 2011. V. 62. P. 5149–5159.

ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

 

Рис. 1. Вестерн-иммуноблот ЦСБ, выделенного из Synechocystis. 

Белки разделяли методом денатурирующего электрофореза в ПААГ с последующим Вестерн-иммуноблоттингом с использованием АТа-и против зеатина. I  белки, элюированные с зеатин-сефарозы 0.2 M NaOH; II  белки, элюированные с зеатин-сефарозы транс-зеатином (105 М); III  белки, выделенные с использованием мкАТ против ЦСБ70 кукурузы, иммобилизованных на сефарозе; M  маркеры молекулярных масс белков, кД. 

 

Рис. 2. Влияние различных фитогормонов и аденина в конкурентной системе ИФА на взаимодействие с ЦСБ67 АТа-и против транс-зеатина.

1  аденин, 2  ИУК, 3  АБК, 4  ГК, 5  цис-зеатин, 6  зеатинрибозид, 7  транс-зеатин. Данные статистического анализа обозначены звездочками: * P < 0.05, ** P < 0.01 (по критерию Стьюдента).

 

Рис. 3. Активация элонгации транскриптов транс-зеатином и ЦСБ67 из Synechocystis в лизатах Synechocyistis и хлоропластов ячменя. 

14  лизат Synechocystis с добавлением: 1  аденина (107 M); 2  транс-зеатина (107 M); 3  ЦСБ67 Synechocystis (10 мкг); 4  транс-зеатина (107 M) + ЦСБ67 Synechocystis (10 мкг); 58  лизат хлоропластов ячменя с добавлением: 5  аденина (107 M); 6  транс-зеатина (107 M); 7  ЦСБ67 Synechocystis (10 мкг); 8  транс-зеатина (107 M) + ЦСБ67 Synechocystis (10 мкг). Данные статистического анализа обозначены звездочками: * P < 0.05, ** P < 0.01 (по критерию Стьюдента).