УДК 581.1

МЕХАНИЗМ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ КАЛЬЦИЕВОЙ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ У РАСТЕНИЙ ПРИ ДЕЙСТВИИ ТЕПЛОВОГО СТРЕССА. РОЛЬ МИТОХОНДРИЙ В ЭТОМ ПРОЦЕССЕ

© 2014 г. Е. Г. Рихванов, И. В. Федосеева, Д. В. Пятрикас, Г. Б. Боровский, 

В. К. Войников

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН, Иркутск

Поступила в редакцию 07.05.2013 г.

Мягкий тепловой стресс индуцирует экспрессию белков теплового шока (БТШ), которые защищают растения от гибели при повреждающем тепловом воздействии. Предполагалось, что появление в клетке денатурированных белков является триггером запуска экспрессии БТШ, но полученные в последнее время результаты показывают, что денатурация белков не является обязательным условием для этого процесса. В данной работе обсуждается гипотетический механизм активации экспрессии БТШ при действии теплового стресса, который активируется в результате кратковременного повышения уровня Ca2+ в цитозоле. Согласно предлагаемой гипотезе, длительное повышение уровня Ca2+ оказывает отрицательный эффект на экспрессию БТШ. Поэтому кальций транспортируется из цитозоля во внутриклеточные компартменты, в том числе, в митохондрии. Поступление Ca2+ в митохондрии сопровождается гиперполяризацией внутренней митохондриальной мембраны и усилением продукции активных форм кислорода. В условиях мягкого теплового стресса усиление продукции АФК способствует активации экспрессии БТШ, но в условиях жесткого теплового шока это является причиной гибели растений. Таким образом, митохондрии, а также, возможно, другие органеллы, регулируя содержание Ca2+ в цитозоле и продукцию АФК, определяют жизнь и смерть растительной клетки при тепловом воздействии.

-------------------------------

Сокращения: БТШ – белки теплового шока (или HSP, heat shock protein); мтΔψ – потенциал на внутренней митохондриальной мембране; пмΔψ – потенциал на плазматической мембране; ПКГ – программируемая клеточная гибель; ФТШ – фактор теплового шока; ЭПР – эндоплазматический ретикулум; CaM – кальмодулин; [Ca2+]цит – цитоплазматический Ca2+; [Ca2+]мит – митохондриальный Ca2+; CCCP – карбонил-цианид m-хлорфенилгидразон (от carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone); HSE  элемент теплового шока (от heat shock element).

Адрес для корреспонденции: Федосеева Ирина Владимировна. 664033 Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 317. Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН. Электронная почта: fedoseeva@sifibr.irk.ru

Ключевые слова: высшие растения – ионы кальция – митохондрии – термотолерантность – белки теплового шока

ВВЕДЕНИЕ

Чтобы защитить себя от повреждающего воздействия высоких температур, растения синтезируют белки теплового шока (БТШ или HSP, от heat shock protein) [13]. БТШ, действуя в качестве шаперонов, восстанавливают поврежденные при нагревании белки или, если это невозможно, способствуют их деградации [1]. Тем не менее, на сегодняшний день нет четкого ответа, как инициируется экспрессия БТШ? Описаны транскрипционные факторы теплового шока (ФТШ или Hsf, от heat shock factor), активирующие экспрессию БТШ, установлены промоторные последовательности, с которыми взаимодействуют ФТШ, но о первопричинах активации экспрессии можно только догадываться. Согласно классической модели [4, 5], ФТШ в обычных условиях находится в инертном, мономерном состоянии в результате взаимодействия с HSP90 и HSP70. При повышении температуры появляются денатурированные белки, которые связываются с HSP90/HSP70. В результате ФТШ освобождается из комплекса, олигомеризуется, транспортируется в ядро, где и активирует экспрессию БТШ [4, 5]. Но эта модель не объясняет, почему агенты, не вызывающие денатурацию белков, тем не менее, активируют экспрессию БТШ [2, 3, 68]. Более того, при повышении температуры экспрессия БТШ может происходить независимо от появления денатурированных белков [6, 7]. Следовательно, появление денатурированных белков является достаточным, но не обязательным условием для экспрессии БТШ. Вместе с тем, получены данные, свидетельствующие, что усиление генерации АФК и кратковременное повышение уровня Ca2+ в цитозоле может играть важную роль в активации экспрессии БТШ при действии теплового стресса [2, 6, 7, 911].

В обзоре рассмотрено функционирование кальциевой сигнальной системы растений при повышении температуры, а также ее роль в активации экспрессии БТШ. На основании проведенного анализа сформулирована гипотеза, согласно которой митохондрии растений играют одну из ключевых ролей в регуляции кальциевого сигнала.

 

ИНДУЦИРОВАННАЯ ТЕРМОТОЛЕРАНТНОСТЬ И ЭКСПРЕССИЯ БТШ

Кратковременное повышение температуры до 3738°С, которое не оказывает негативного влияния, назовем это явление “тепловой стресс”, повышает способность растений переносить последующее повреждающее тепловое воздействие или “тепловой шок”. Это явление известно как индуцированная или приобретенная термотолерантность [1, 2]. Индуцированная термотолерантность зависит от экспрессии БТШ. Тепловой стресс 37°С индуцирует синтез БТШ в культуре клеток Arabidopsis thaliana (рис. 1а) и одновременно повышает их устойчивость к повреждающему тепловому шоку 50°С (рис. 1в). Повышение температуры до 39°С подавляет синтез БТШ, и развития индуцированной термотолерантности не происходит (рис. 1б) [12].

Основную роль в индуцированной термотолерантности растений играет HSP101 [13]. HSP101 принадлежит к семейству белков HSP100/ClpB, которые используют энергию гидролиза АТФ для диссоциации агрегированных белков и передачи развернутых полипептидов для последующего рефолдинга HSP70 и HSP40. Белки HSP100/ClpB тесно взаимодействуют с низкомолекулярными БТШ, которые при тепловом шоке включаются в состав белковых агрегатов и, тем самым, способствуют дезагрегирующей активности HSP100/ClpB [14].

 

КАЛЬЦИЙ В ОТВЕТНОЙ РЕАКЦИИ НА ТЕПЛОВОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ

Ионы Ca2+ играют важную роль на всех этапах онтогенеза растений, а также в адаптации к неблагоприятным условиям существования [15]. Стрессовые воздействия приводят к кратковременному повышению уровня Ca2+ в цитозоле ([Ca2+]цит) [15, 16]. Бияшева и соавт. [17], используя протопласты гороха, пожалуй, впервые показали повышение [Ca2+]цит при тепловом воздействии. Впоследствии эти результаты были подтверждены с использованием других растительных объектов [2, 7, 1822].

Повышение [Ca2+]цит играет важную роль в активации экспрессии БТШ [2], а ингибирование этого процесса подавляет защитный ответ растительной клетки [7, 2025]. Положительная связь между [Ca2+]цит и экспрессией БТШ подтверждается в экспериментах с агентами, повышающими [Ca2+]цит. Обработка CaCl2 активировала синтез БТШ [19, 23, 2629] и индуцировала термотолерантность [18, 29]. Аналогичным образом амиодарон, препарат, обладающий фунгицидной активностью, а также протонофор CCCP (от carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone) повышали [Ca2+]цит и одновременно активировали экспрессию гена HSP101 [30].

Несмотря на то, что повышение [Ca2+]цит играет важную роль в развитии защитных реакций, превышение его уровня может иметь неблагоприятные последствия [15, 31]. Хотя принято считать, что основной причиной гибели при действии жесткого теплового шока является денатурация (агрегация) клеточных белков и усиление продукции АФК [1, 2], очевидно, что чрезмерное повышение [Ca2+]цит является еще одной причиной гибели. Повышение [Ca2+]цит наблюдается не только при мягком тепловом стрессе, но и при более жестком, повреждающем тепловом шоке [18, 32]. Подавление поступления Ca2+ в клетку защищало протопласты A. thaliana от гибели при жестком тепловом воздействии [33].

Токсичность кальция, вероятно, обусловлена тем, что ионы Ca2+ образуют комплексы с отрицательно заряженными молекулами, например, фосфатами [15]. Кроме того, кальций может регулировать развитие программируемой клеточной гибели (ПКГ). Повышение [Ca2+]цит при действии теплового шока активирует в растениях A. thaliana MAP киназу 6 (MPK6), которая необходима для активации экспрессии гена γVPE. Ген γVPE кодирует вакуолярный процессирующий фермент, который обладает каспазной активностью и участвует в запуске ПКГ [32]. Таким образом, становится очевидным, что Ca2+ играет двойную роль в реакции растений на повышение температуры. С одной стороны, он активирует экспрессию БТШ и может защищать растение от гибели, с другой стороны, он может эту гибель стимулировать.

 

КАЛЬЦИЙ-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ

Физиологический эффект кальция зависит от его способности взаимодействовать со специальными Ca2+-связывающими белками. Большинство таких белков содержат последовательность, состоящую их 12 аминокислот (EF-мотив), которая связывает ионы Ca2+ с высокой специфичностью [15, 16]. В число белков, содержащих EF-мотив, входят кальмодулин (CaM), кальмодулин-подобные белки, кальценеврин B-подобные белки и Ca2+-зависимые протеинкиназы (Ca2+-dependent protein kinase, CPK или CDPK) [34]. Кроме того, существуют такие белки, как аннексины и белки с C2 доменом, которые не имеют EF-мотива, но, тем не менее, способны связываться с Ca2+ [15, 16].

Согласно данным работы [16], белки, содержащие EF-мотив, можно условно разделить на две группы: белки, передающие сигнал (sensor relays), и белки, воспринимающие сигнал (sensor responders). Как правило, белки, передающие сигнал, не имеют собственной ферментативной активности. Но при связывании с ионами Ca2+ они взаимодействуют с другими белками и модулируют их активность. За небольшим исключением CaM и кальценеврин B-подобные белки являются белками, передающими сигнал. Напротив, белки, воспринимающие сигнал, например, CPK, непосредственно изменяют свою активность при связывании с Ca2+ [16]. Неизвестно, какую роль выполняют кальценеврин B-подобные белки в ответе растений на повышение температуры, но некоторая информация имеется для CaM и CPK.

 

Кальмодулин

Кальмодулин (CaM) – это небольшой белок, который обнаружен у всех изученных эукариотических организмов [16]. При повышении уровня Ca2+ в растительной клетке CaM связывается с ним, в результате чего приобретает способность модулировать активность других белков. У растений обнаружено более 50 белков, имеющих сайт связывания с CaM. Эти белки либо непосредственно контролируют метаболизм, либо являются транскрипционными факторами [34]. Некоторые БТШ также способны взаимодействовать с CaM, например, HSP70 [35, 36]. Очевидно, активность HSP90 также зависит от CaM. Белки FKBP62 (ROF1), FKBP73 и FKBP77 содержат сайты связывания с CaM и влияют на активность HSP90 [2, 3, 37].

У арабидопсиса функционируют 9 генов CaM [38]. Экспрессия некоторых из них активируется при действии теплового стресса [19, 23, 38]. Функционирование CaM имеет большое значение для экспрессии БТШ, поскольку ингибиторы CaM, а также мутация в гене AtCaM3 подавляют этот процесс [19, 21, 23, 39, 40]. Наоборот, повышение экспрессии AtCaM3 арабидопсиса [40] или CaM1-1 риса [21] активирует экспрессию БТШ. Очевидно, что CaM регулирует экспрессию БТШ в результате связывания со своими белками мишенями, такими как серин/треониновая фосфатаза PP7 и Ca2+/CY-связывающая протеинкиназа CBK3 [21, 41, 42]. Вероятно, CaM3 играет важную роль не только в активации экспрессии БТШ, но и в развитии ПКГ [32]. Поскольку развитие ПКГ при тепловом шоке подавляет экспрессию БТШ [12, 39], не исключено, что CaM может как активировать, так и ингибировать экспрессию стрессовых генов.

 

Ca2+-зависимые протеинкиназы

Активность Ca2+-зависимых протеинкиназ, CPK, непосредственно регулируется ионами Ca2+. Кроме EF-мотива CPK имеет киназный домен. При связывании с Ca2+ CPK изменяет свою активность [16]. Мутации в генах, кодирующих CPK3 и CPK13, снижали экспрессию генов HSP101 и HSP15.7-CI, а также термотолерантность растений [43].

 

КАЛЬЦИЙ-ЗАВИСИМАЯ АКТИВАЦИЯ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ

У всех эукариот экспрессию БТШ при повышении температуры регулирует фактор теплового шока, ФТШ [25]. В арсенале арабидопсиса находится более двадцати различных типов ФТШ [5]. Кроме того, у растений функционируют альтернативные регуляторные системы активации экспрессии БТШ: транскрипционные факторы WRKY, а также DREB2A и DREB2C [5].

В общем виде процесс активации ФТШ можно представить следующим образом. При тепловом стрессе ФТШ перемещаются в ядро, где связываются с элементами теплового шока HSE (от heat shock element), присутствующими в промоторах большинства генов БТШ [4, 5]. Связывание ФТШ с HSE недостаточно для активации экспрессии БТШ. Чтобы ФТШ начал свою работу необходимо, чтобы он подвергся пострансляционной модификации, включающей в себя избирательное фосфорилирование, дефосфорилирование, сумоилирование и ацетилирование [4].

ФТШ растений не содержат CaM-связывающего сайта и не входят в число Ca2+-связывающих белков [34, 36]. Тем не менее, существуют результаты, указывающие, что Ca2+ может активировать ФТШ (рис. 2). Обработка ионами Ca2+ стимулировала связывание ФТШ с элементом HSE в экстрактах клеток кукурузы [44]. Поскольку активация и инактивация ФТШ определяется степенью его фосфорилирования и дефосфорилирования [4], то очевидно, что Ca2+ активирует ФТШ косвенным образом, модулируя активность протеинкиназ и фосфатаз.

К транскрипционной активности HSF1 человека приводит фосфорилирование остатка серина в положении 230. Этот процесс осуществляет Ca2+/CY-зависимая киназа II (CaMK II) [45]. Очевидно, что Ca2+/CY-связывающие протеинкиназы (CBK) и Ca2+-зависимые протеинкиназы (CPK) растений выполняют аналогичную функцию. Показано, что CBK3 фосфорилирует HSFA1a [42], а CPK3 и CPK13 фосфорилируют HSFB2a [43, 46], что приводит к активации экспрессии БТШ A. thaliana при действии теплового стресса. MAP киназа, активируемая нагреванием (HAMK, heat-activated MAP kinase), также может принимать участие в фосфорилировании ФТШ. Показано, что HAMK является Ca2+-зависимой киназой. Она активируется при действии теплового стресса в культуре клеток табака и необходима для экспрессии HSP70 [24].

Дефосфорилирование ФТШ по определенным аминокислотным остаткам серина также приводит к его активации. У A. thaliana эту функцию осуществляет серин/треониновая фосфатаза PP7. Показано, что PP7 взаимодействует и с CaM, и с ФТШ. Мутация в гене PP7 ингибирует экспрессию БТШ при действии теплового стресса [41].

Предполагается, что экспрессию БТШ регулируют HSP70 и HSP90, которые подавляют активность ФТШ в обычных условиях. При повышении температуры взаимодействие HSP70/HSP90 с ФТШ снижается, что и приводит к экспрессии БТШ [4, 5]. Не исключено, что способность HSP70 и HSP90 регулировать активность ФТШ зависит от [Ca2+]цит. Как отмечалось выше, HSP70 содержит CaM-связывающий сайт [35, 36]. Такого сайта нет у HSP90, но его активность может модулироваться адаптерными белками, имеющими CaM-связывающий сайт [2, 3, 37].

Активацию экспрессии БТШ у растений кроме ФТШ могут определять транскрипционные факторы, относящиеся к семейству WRKY [5]. Некоторые члены этого семейства могут взаимодействовать с Ca2+ или CaM [34]. Кроме WRKY существует более 90 транскрипционных факторов A. thaliana, имеющих сайты связывания с CaM. Среди них можно выделить кальмодулин-связывающие транскрипционные активаторы CAMTAs (от calmodulin binding transcription activators). Экспрессия генов, кодирующих эти белки, возрастает в ответ на тепловой стресс [16], но неизвестно, имеет ли это какое-либо значение для экспрессии БТШ.

 

Ca2+-ПРОНИЦАЕМЫЕ КАНАЛЫ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ

Хелатирование внеклеточного Ca2+ или блокирование Ca2+-проницаемых каналов на плазматической мембране подавляет повышение [Ca2+]цит при действии теплового стресса [7, 2025]. Поскольку концентрация свободного Ca2+ в апопласте составляет 0.33 мМ, что гораздо выше, чем в цитозоле (100 нМ) [47], очевидно, что одним из источников повышения [Ca2+]цит является апопласт.

Анализ последовательности генома показывает, что у A. thaliana насчитывается около 150 белков, которые потенциально могут принимать участие в транспорте катионов через плазматическую мембрану [48]. В ходе электрофизиологических исследований у растений были обнаружены механо-чувствительные каналы MCC (от mechanosensitive Ca2+ channel), каналы, открываемые при деполяризации (DACC, от depolarization-activated Ca2+ channel), и каналы, открываемые при гиперполяризации (HACC, от hyperpolarization-activated Ca2+ channel). В большинстве случаев белки, образующие эти каналы, не идентифицированы [15, 31, 4951].

Существование активируемых при действии теплового стресса Ca2+-проницаемых каналов на плазматической мембране впервые было показано у мха Physcomitrella patens. Через 10 с после повышения температуры до 38°С наблюдалось открытие Ca2+-проницаемого канала, а уже через 3060 с канал закрывался, несмотря на продолжающееся тепловое воздействие [7]. Таким образом, Ca2+-проницаемые каналы открываются на непродолжительное время, достаточное для повышения [Ca2+]цит и запуска стрессовой реакции. Это положение согласуется с результатами измерения [Ca2+]цит в проростках табака. Тепловой стресс вызывал временное повышение [Ca2+]цит. Однако повторный тепловой стресс уже не приводил к такому эффекту, несмотря на то, что проростки сохранили способность повышать [Ca2+]цит в ответ на механический стресс и снижение температуры [18]. В зависимости от температуры теплового воздействия у мха могут открываться, по крайней мере, три различных Ca2+-проницаемых канала [51]. Следовательно, растения используют различные каналы для транспорта Ca2+ в зависимости от жесткости теплового воздействия.

Потенциальными кандидатами, транспортирующими Ca2+ через плазматическую мембрану при повышении температуры, являются каналы CNGC (cyclic nucleotide gated channels), управляемые циклическими нуклеотидами. В геноме A. thaliana содержатся 20 генов, кодирующих CNGC [48, 51]. Известно, что мутации dnd1 и dnd2 (defense, no death) в генах CNGC2 и CNGC4 ингибируют реакцию гиперчувствительности при заражении A. thaliana авирулентными патогенами [48]. Оказалось, что нарушение функционирования CNGC2 и CNGC4 снижает порог теплового воздействия, необходимый для активации экспрессии БТШ [51]. К аналогичному эффекту приводила делеция гомологичного гена CNGCb мха P. patens [51], причем утрата CNGCb не снижала, а даже повышала [Ca2+]цит при действии теплового стресса. Авторы полагают, что различные белки CNGC образуют гетеромерные каналы, а нарушение структуры канала может либо блокировать, либо активировать поступление Ca2+ в цитозоль [51].

Возможно, что в состав таких гетеромерных каналов плазматической мембраны у A. thaliana могут входить белки CNGC6 [22] и CNGC16 [25]. Показано, что мутация в гене CNGC6 подавляла мембранный ток Ca2+ при действии теплового стресса и ингибировала активацию экспрессии БТШ [22]. Если ген CNGC6 экспрессируется одинаково во всех органах [22], то ген CNGC16 экспрессируется исключительно в пыльце A. thaliana [25]. Однако, так же как и в случае CNGC6, делеция CNGC16 ингибировала экспрессию БТШ и снижала термотолерантность пыльцы [25].

Какое событие приводит к открытию Ca2+-проницаемых каналов на плазматической мембране? Есть основания полагать, что в этом процессе принимают участие циклические нуклеотиды цАМФ [22] и цГМФ [25]. Показано, что цАМФ активирует мембранный ток Ca2+ в протопластах A. thaliana, который зависит от присутствия CNGC6 [22]. На активацию Ca2+-проницаемых каналов могут оказывать влияние изменения структуры плазматической мембраны. Тепловое воздействие повышает текучесть плазматической мембраны и изменяет состав ее липидов [2, 7, 52]. Предполагается, что это событие вызывает активацию механо-чувствительных каналов, в результате чего наблюдается повышение [Ca2+]цит [2, 52]. Действительно, обработка бензиловым спиртом  агентом, усиливающим текучесть мембраны, приводит к повышению [Ca2+]цит [6, 7, 24, 39].

Функционирование ряда Ca2+-проницаемых каналов (voltage-gated Ca2+-channel) зависит от потенциала на плазматической мембране (пмΔψ). Они открываются либо при снижении пмΔψ, либо при его повышении [15, 31, 50]. Никто не исследовал эффект теплового стресса на изменение пмΔψ, но косвенные данные указывают, что этот показатель повышается. При тепловом стрессе в листьях гороха наблюдалось усиление активности H+-АТФазы плазматической мембраны [53], что теоретически должно приводить к повышению пмΔψ.

Активность потенциал-управляемых Ca2+-проницаемых каналов зависит от продукции АФК. НАДФН-оксидаза является одним из источников АФК. Понижение ее активности подавляет поступление Ca2+ в цитозоль из апопласта [50]. Неизвестно, как этот фермент влияет на повышение [Ca2+]цит при действии теплового стресса, но показано, что НАДФН-оксидаза имеет важное значение для индуцированной термотолерантности [54].

 

ВАКУОЛЬ И ЭПР КАК ИСТОЧНИК ПОВЫШЕНИЯ УРОВНЯ Ca2+

Как правило, повышение [Ca2+]цит при действии теплового стресса происходит в результате транспорта Ca2+ из апопласта. Однако больше всего (0.2–5.0 мМ) свободного Ca2+ содержится в вакуоли. Несколько меньше (0.050.50 мМ) в ЭПР [47]. Может ли повышение [Ca2+]цит, наблюдаемое при действии теплового стресса, происходить за счет его выхода из вакуоли или ЭПР? Полученные данные противоречивы. Так, повышение [Ca2+]цит при действии теплового стресса в проростках табака блокировали как ингибиторы Ca2+-проницаемых каналов плазматической мембраны, так и ингибиторы внутриклеточных каналов [18]. Напротив, у риса хелатирование внеклеточного Ca2+ или блокирование Ca2+-проницаемых каналов на плазматической мембране подавляло повышение [Ca2+]цит, но такого эффекта не наблюдалось при использовании внутриклеточных ингибиторов кальциевых каналов [21].

Электрофизиологические исследования показали наличие четырех Ca2+-проницаемых каналов в тонопласте, которые теоретически могут участвовать в повышении [Ca2+]цит. Один канал регулируется инозитол-1,4,5-трифосфатом (IP3), второй  циклической АДФ-рибозой (цАДФР), третий является вакуолярным потенциал-управляемым каналом, а четвертый  медленным вакуолярным каналом [49]. Мало что известно о белках, образующих данные каналы, но показано, что IP3 и цАДФР вызывают освобождение Ca2+ из вакуолей и ЭПР [15, 47, 49, 50].

Поскольку при действии теплового стресса у растений происходит повышение уровня IP3 [55, 56], есть основания полагать, что IP3 стимулирует выход Ca2+ из вакуоли и ЭПР. Образование IP3 катализирует фосфолипаза С, активность которой возрастает при повышении температуры [55], что оказывается важным для активации экспрессии БТШ [56]. Делеция гена PLC9 A. thaliana, кодирующего одну из изоформ фосфолипазы С, подавляла накопление IP3 и экспрессию БТШ при действии теплового стресса. Одновременно делеция PLC9 подавляла повышение [Ca2+]цит, хотя и не ингибировала его полностью. Это указывает на то, что PLC9 способствует освобождению Ca2+ из внутриклеточных компартментов [56].

Таким образом, анализ литературных данных указывает, что источниками повышения [Ca2+]цит при тепловом воздействии может быть как апопласт, так и внутриклеточные компартменты. Есть основания полагать, что в ряде случаев активацию экспрессии БТШ может вызывать выход Ca2+ из митохондрий (смотри ниже).

 

СИГНАТУРА КАЛЬЦИЯ

Хотя обработка агентами, повышающими [Ca2+]цит, в ряде случаев активировала экспрессию БТШ [2, 6, 7, 26, 27, 30], отнюдь не любое повышение [Ca2+]цит приводит к такому же эффекту. Например, обработка проростков A. thaliana антагонистами CaM повышала [Ca2+]цит и активировала экспрессию 162 генов, но при этом не было зарегистрировано экспрессии генов БТШ [57]. Возникает вопрос, каким образом различные воздействия, используя Ca2+ как сигнальную молекулу, приводят к активации специфического набора генов?

В зависимости от типа воздействия наблюдается различное число пиков повышения [Ca2+]цит, которые, в свою очередь, различаются по времени появления, амплитуде, продолжительности и пространственной локализации, что в сумме образует уникальную для данного воздействия сигнатуру Ca2+ [15]. Считается, что именно от определенной сигнатуры кальция зависит активация набора генов, специфичного для данного воздействия [16, 49]. В проростках табака максимальный уровень [Ca2+]цит наблюдался спустя 1015 мин теплового воздействия, а затем возвращался на исходный уровень [18]. Подобная динамика изменения [Ca2+]цит наблюдалась у мха P. patens [7, 51]. У арабидопсиса повышение [Ca2+]цит достигало максимума после 9 мин теплового воздействия и не снижалось до конца эксперимента [22, 55]. В проростках риса наблюдалось два пика [Ca2+]цит: первый  с максимумом после 10 мин теплового воздействия, второй  после 25 мин [20]. Очевидно, что сигнатура Ca2+ зависит не только от вида стрессового воздействия, но и органа растения. Тепловая обработка проростков и корней риса приводила к двухфазному повышению [Ca2+]цит, но в клетках эпикотиля и листа риса наблюдался всего один пик [21].

Амплитуда, время появления, продолжительность, количество пиков [Ca2+]цит имеют критическое значение для активации экспрессии БТШ. Используя электрическую стимуляцию, исследователям [58] удалось регулировать число и продолжительность пиков [Ca2+]цит в проростках A. thaliana. Наибольшее количество генов (256) активировалось в случае повторяющихся осцилляций [Ca2+]цит и в эту группу вошли почти все гены БТШ. Длительное повышение [Ca2+]цит активировало экспрессию только 10 генов, среди них не было генов БТШ [58]. Другие исследователи [7], изменяя соотношение ЭГТА и CaCl2 в среде инкубации, регулировали время повышения [Ca2+]цит. Оказалось, что повышение [Ca2+]цит в первые минуты теплового воздействия имеет критическое значение для экспрессии БТШ. Если транспорт Ca2+ в цитозоль подавить в течение первых 25 мин теплового стресса, то экспрессии БТШ не происходит [7].

Хотя в работе [7] наблюдалась зависимость между интенсивностью [Ca2+]цит и экспрессией БТШ, очевидно, что повышение [Ca2+]цит выше определенного уровня уже не активирует экспрессию БТШ. В культуре клеток табака уровень [Ca2+]цит линейно возрастал по мере усиления теплового воздействия с 39 до 47°С [18], но синтез БТШ регистрировался при температуре 39°С, а при 42°С его уже не было [39]. Предположение, что для экспрессии БТШ необходим определенный уровень [Ca2+]цит, подтверждается изучением комбинированного эффекта протонофора CCCP и теплового стресса. Обработка CCCP при обычной температуре инкубации повышала [Ca2+]цит и активировала экспрессию AtHSP101. Аналогичным образом повышение [Ca2+]цит и экспрессия AtHSP101 наблюдалась при действии теплового стресса. Однако комбинированное воздействие теплового стресса и CCCP повышало [Ca2+]цит гораздо сильнее, чем каждый из изученных факторов в отдельности, что сопровождалось блокированием экспрессии AtHSP101 [30].

 

РЕГУЛЯЦИЯ [Ca2+]цит

Таким образом, чтобы увеличение [Ca2+]цит активировало экспрессию БТШ, необходимо, чтобы это повышение происходило в определенное время [7], было кратковременным [58] и не превышало определенного уровня [30]. Эти обстоятельства подразумевают, что для эффективной экспрессии БТШ необходимо не только повышение [Ca2+]цит, но и быстрое его удаление из цитозоля.

Поддержание необходимого уровня [Ca2+]цит достигается в результате согласованного функционирования Ca2+-АТФаз и Ca2+/H+-антипортеров, которые выкачивают избыток Ca2+ из цитозоля в апопласт или депонируют его в вакуоль или ЭПР [15, 49]. Мутанты с делецией генов, кодирующих Ca2+-АТФазы, характеризуются нарушением сигнатуры [Ca2+]цит и снижением устойчивости к стрессовым воздействиям [31, 47, 49]. Вероятно, что Ca2+-АТФазы, а также белки, влияющие на их активность, определяют сигнатуру Ca2+ при повышении температуры, а, следовательно, и экспрессию БТШ, но экспериментальных доказательств этого к настоящему времени не получено.

 

РОЛЬ МИТОХОНДРИЙ В МОДУЛЯЦИИ Ca2+ СИГНАЛА ПРИ ТЕПЛОВОМ СТРЕССЕ

Долгое время митохондрии рассматривались исключительно как энергетические станции клетки. Однако производство АТФ не единственная функция митохондрий. Митохондрии млекопитающих принимают активное участие в регуляции уровня цитозольного кальция. Повышение [Ca2+]цит, наблюдаемое при различных воздействиях, сопровождается транспортом Ca2+ в митохондрии ([Ca2+]мит) [5961]. Согласно данным работы [60], поступление Ca2+ в митохондрии необходимо: а) для регуляции энергетического метаболизма; б) для предотвращения повышения [Ca2+]цит до токсичного уровня; в) для активации ПКГ при чрезмерном накоплении [Ca2+]мит. Таким образом, митохондрии млекопитающих определяют сигнатуру [Ca2+]цит и, соответственно, оказывают значительное влияние на функционирование кальциевой сигнальной системы. Есть основания полагать, что митохондрии и хлоропласты растений функционируют аналогичным образом [47, 6264].

 

Механизм митохондриального транспорта Ca2+

В клетках млекопитающих механизм входа Ca2+ в митохондрии и его выхода достаточно хорошо изучен. Кальций в митохондрии транспортирует митохондриальный кальциевый унипортер MCU (mitochondrial calcium uniporter), активность которого зависит от митохондриального потенциала (мт∆ψ) и модулируется дополнительным белком MICU1 (mitochondrial Ca2+ uptake 1). Кроме того, клетки млекопитающих могут поглощать кальций с помощью Ca2+/H+-антипортера LETM1. Выход кальция из митохондрий осуществляется в результате функционирования LETM1 в обратном направлении или через Na+/Ca2+-антипортер. Выход кальция из митохондрий может происходить также при открытии митохондриальной поры, которая активируется в случае превышения определенного порога уровня кальция [5961].

В отличие от млекопитающих, мало что известно о механизме митохондриального транспорта Ca2+ у растений. В геноме A. thaliana есть шесть еще не охарактеризованных генов, которые гомологичны MCU млекопитающих. Пять продуктов этих генов, по-видимому, локализуются в митохондриях, а один  в хлоропластах. Кроме того, в митохондриях локализуется белок, гомологичный LETM1 [47]. Так же, как и у млекопитающих, в митохондриях растений показано наличие Ca2+-зависимой митохондриальной поры [65, 66]. Литературные данные указывают [47, 6264], что митохондрии растительной клетки могут активно влиять на уровень [Ca2+]цит, но остается неизвестным ни механизм этого процесса, ни то, как эти события влияют на экспрессию БТШ.

 

Деполяризация митохондриальной мембраны и экспрессия БТШ

У растений, так же как и у млекопитающих, повышение [Ca2+]цит, как правило, сопровождается транспортом кальция в митохондрии. Показано, что низкотемпературный и осмотический стрессы [61], а также обработка внеклеточной АТФ [64] повышали [Ca2+]мит у растений. Однако в ряде случаев наблюдается обратный процесс. В культуре клеток кукурузы аноксия вызывала повышение [Ca2+]цит за счет выхода кальция из митохондрий [62]. Выход кальция из митохондрий  обязательное условие для активации экспрессии генов алкогольдегидрогеназы и сахарозосинтазы, что необходимо для адаптации растений к недостатку кислорода [62]. Между тем, при аноксии наблюдается и активация экспрессии БТШ [11, 67]. Поскольку повышение [Ca2+]цит является одним из условий экспрессии БТШ при тепловом стрессе [2, 3], очевидно, что по этой же причине запускается экспрессия БТШ и при аноксии.

Очевидно, что причиной выхода Ca2+ из митохондрий растений в условиях аноксии является деполяризация митохондриальной мембраны. Хорошо известно, что в клетках млекопитающих снижение мт∆ψ вызывает выход Ca2+ из митохондрий [5961]. Очевидно, что то же правило справедливо для растений. Действительно, обработка клеток кукурузы СССР, агентом, снижающим мт∆ψ, приводила к выходу Ca2+ из митохондрий [62]. Ряд литературных данных указывают на связь между деполяризацией и экспрессией БТШ. Так, снижение мт∆ψ в результате обработки элиситором харпином [68], СССР [30], а также мутаций в митохондриальной ДНК [69] сопровождалось активацией экспрессии БТШ при обычной температуре инкубации. Представляется вероятным, что во всех вышеперечисленных случаях экспрессия БТШ происходила в результате повышения [Ca2+]цит за счет выхода кальция из митохондрий. Эти результаты дали основания предполагать, что при тепловом стрессе наблюдается снижение мт∆ψ, что является причиной экспрессии БТШ [68, 69]. Однако экспериментальных доказательств этому не получено. Напротив, экспрессии БТШ при действии теплового стресса в культуре клеток A. thaliana предшествовало повышение мт∆ψ [12, 30, 70, 71]. Более того, если при обычной температуре инкубации CCCP активировал экспрессию HSP101, то при тепловом стрессе, наоборот, подавлял [30]. Принимая во внимание вышеизложенные обстоятельства, можно сделать вывод, что если в обычных условиях снижение мт∆ψ действительно может активировать экспрессию БТШ, то при действии теплового стресса этот процесс инициируется в результате функционирования совершенно другого механизма.

 

Зависит ли активация экспрессии БТШ при тепловом стрессе 

от поступления кальция в митохондрии?

Как отмечалось выше, в клетках млекопитающих [5961] и растений [63, 64] повышение [Ca2+]цит, наблюдаемое при ряде воздействий, сопровождается транспортом Ca2+ в митохондрии. Согласно предлагаемой гипотезе, при тепловом стрессе наблюдается аналогичная ситуация. Тепловой стресс вызывает повышение [Ca2+]цит за счет его поступления из апопласта и вакуолей, далее Ca2+ транспортируется в митохондрии. В результате митохондрии регулируют пространственную и временную сигнатуру [Ca2+]цит, необходимую для оптимальной экспрессии БТШ.

В митохондриях млекопитающих функционирование унипортера MCU зависит от митохондриального потенциала. Снижение мт∆ψ подавляет транспорт Ca2+ в митохондрии, что приводит к чрезмерному повышению [Ca2+]цит, и, соответственно, к нарушению сигнатуры кальция [5961]. Очевидно, аналогичная ситуация справедлива и для митохондрий растений. Обработка СССР, а также тепловой стресс приводили к повышению [Ca2+]цит в культуре клеток A. thaliana. Но комбинированное действие СССР и теплового стресса вызывало аддитивный эффект. При совместном действии двух факторов наблюдался наиболее высокий уровень [Ca2+]цит, который превышал эффект теплового стресса и СССР на этот показатель по отдельности [30]. Одновременно, обработка СССР при обычной температуре активировала экспрессию HSP101, но при действии теплового стресса добавление СССР, наоборот, ингибировало экспрессию этого гена. На основании того, что известно об участии митохондрий в функционировании кальциевой сигнальной системы [5964], полученные данные можно интерпретировать следующим образом. Обработка СССР при обычной температуре инкубации вызывает выход Ca2+ в цитозоль из митохондрий, что и приводит к активации экспрессии HSP101. При действии же теплового стресса повышение [Ca2+]цит происходит за счет транспорта Ca2+ из апопласта [22, 25, 51] или его освобождения из вакуоли [56]. При тепловом стрессе, во-первых, СССР блокирует поступление Ca2+ в митохондрии, а во-вторых, вызывает выход митохондриального Ca2+ в цитозоль [5961, 62]. В результате [Ca2+]цит повышается до критического уровня, при котором ингибируется тепловая активация экспрессии БТШ. Эти результаты указывают, что транспорт кальция в митохондрии растений имеет критическое значение для экспрессии БТШ при тепловом стрессе. Очевидно, аналогичное правило справедливо в случае других воздействий. Подавление поступления Ca2+ в митохондрии A. thaliana в результате обработки рутением красным ингибировало активацию экспрессии гена AOX1A при засолении [72]. Следует отметить, что митохондрии млекопитающих контролируют поступление Ca2+ не только внутрь самих себя, но и оказывают влияние на поступление кальция в другие клеточные компартменты, включая ЭПР и ядро [61]. По аналогии можно предположить, что нарушение поступления кальция в митохондрии растений модулирует также транспорт Ca2+ в вакуоль и ЭПР.

 

Связь между гиперполяризацией митохондриальной мембраны и Ca2+

Как отмечалось выше, тепловой стресс вызывает повышение мт∆ψ в культуре клеток A. thaliana, что сопровождается активацией экспрессии БТШ [12, 30, 70, 71]. Аналогичным образом тепловой стресс вызывал повышение мт∆ψ и экспрессию БТШ в культуре клеток млекопитающих [6] и дрожжей Saccharomyces cerevisiae [73, 74]. Вероятно, повышение мт∆ψ является следствием повышения [Ca2+]цит. Наблюдается положительная связь между [Ca2+]цит и мтΔψ в культуре клеток млекопитающих [6] и растений [30] при тепловом стрессе. Ряд данных, полученных при использовании других стрессовых воздействий и других объектов, подтверждает эту зависимость. Стимуляция гепатоцитов вазопрессином приводила к повышению [Ca2+]цит, что сопровождалось синхронным повышением [Ca2+]мит, активацией пируватдегидрогеназы, усилением образования НАД(Ф)H и повышением мт∆ψ [75]. Обработка амиодароном клеток S. cerevisiae [76] и A. thaliana [30] увеличивала содержание Са2+ в цитозоле и повышала мтΔψ. Обработка внеклеточным АТФ вызывала повышение как [Ca2+]цит и [Ca2+]мит, так и мтΔψ в культуре клеток тополя [64]. Хотя точный механизм повышения мт∆ψ у растений остается неизвестным, тем не менее, результаты, полученные в работе [64], указывают на связь между этим показателем и кальциевой сигнальной системой растений. Блокирование Ca2+-проницаемых каналов на плазматической мембране подавляло не только повышение [Ca2+]цит/[Ca2+]мит, но и повышение мтΔψ при обработке клеток тополя внеклеточным АТФ. Следовательно, повышение мт∆ψ у растений, так или иначе, зависит от изменения уровня внутриклеточного кальция.

 

Зависимость между продукцией АФК и потенциалом 

на внутренней митохондриальной мембране

Повышение температуры вызывает в клетках растений усиление митохондриальной продукции АФК [11, 77, 78]. Повышение мтΔψ [12, 30, 70, 71] и продукции АФК [2, 9, 10] являются необходимыми условиями для активации экспрессии БТШ при действии теплового стресса. Митохондриальные ингибиторы и разобщители подавляли повышение мтΔψ и ингибировали активацию экспрессии БТШ при повышении температуры, несмотря на то, что те же самые агенты в ряде случаев активировали экспрессию БТШ в отсутствие теплового стресса [12, 30]. Аналогичным образом, добавление антиоксидантов подавляло экспрессию БТШ при тепловом стрессе [2, 3, 9].

Вероятно, продукция АФК при тепловом стрессе связана как с изменением [Ca2+]цит, так и с гиперполяризацией митохондриальной мембраны. С одной стороны, наблюдается связь между [Ca2+]цит и митохондриальной продукцией АФК [79]. С другой стороны, известно, что скорость генерации АФК в митохондриях млекопитающих возрастает с повышением мтΔψ [80]. Очевидно, что аналогичное правило может выполняться и в клетках растений. Повышение мтΔψ в результате обработки внеклеточным АТФ [64] и кампомицином [81] приводило к усилению продукции АФК, а добавление протонофора CCCP, снижающего мтΔψ, этот процесс подавляло. Таким образом, значение мтΔψ может быть одним из факторов, определяющих образование АФК при действии теплового стресса, а митохондрии растительной клетки могут участвовать в регуляции экспрессии БТШ, не только регулируя уровень [Ca2+]цит, но и генерацию АФК.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Приведенный выше анализ позволяет предположить следующую гипотетическую схему активации экспрессии БТШ в результате функционирования кальциевой сигнальной системы (рис. 3). Тепловой стресс вызывает повышение уровня цАМФ и цГТФ, которые стимулируют открытие каналов CNGC [22, 25, 51]. По-видимому, активация Ca2+-проницаемых каналов наблюдается и в результате повышения текучести плазматической мембраны [2, 3, 7, 52]. Одновременно (или последовательно) в растительной клетке активируется фосфолипаза С, которая повышает содержание IP3 [55, 56]. Далее IP3 стимулирует освобождение Ca2+ из вакуолей/ЭПР [15, 47, 49]. В итоге в цитозоле растительной клетки повышается уровень Ca2+ [22, 25, 51, 56].

Ионы Ca2+, оказавшись в цитозоле, активируют Ca2+-зависимые протеинкиназы CPK3 и CPK13 [43, 46], а также CaM [2, 3] и HAMK [24]. CaM взаимодействует с Ca2+/CY-зависимой протеинкиназой 3 CBK3 [21, 41], серин/треониновой фосфатазой PP7 [21, 41], пептидил-пролил-цис/транс-изомеразой ROF1 (AtFKBP62) [37], HSP70 [35, 36], а также WRKY39 [34]. Все эти события потенциально могут приводить к активации транскрипционных факторов, запускающих экспрессию БТШ.

Повышение температуры выше критического уровня вызывает чрезмерное повышение [Ca2+]цит [18]. В этом случае экспрессия БТШ ингибируется, и развивается ПКГ [12, 32, 39]. Развитие ПКГ определяется способностью ионов Ca2+ активировать MAP киназу 6 (MPK6), которая индуцирует экспрессию гена γVPE, кодирующего вакуолярный процессирующий фермент (цистеиновую протеазу), обладающий каспазоподобной активностью [32]. Поэтому, чтобы повышение уровня [Ca2+]цит активировало экспрессию БТШ необходимо, чтобы это повышение происходило в определенное время [7], было кратковременным [58] и не превышало определенного уровня [30]. Необходимый уровень [Ca2+]цит достигается в результате согласованного функционирования Ca2+-АТФаз и Ca2+/H+-антипортеров, которые выкачивают избыток Ca2+ из цитозоля в апопласт или депонируют его в вакуоль или ЭПР [15, 49].

Так же, как и в клетках животных [5961], митохондрии растительной клетки являются временным депо Ca2+ в стрессовых условиях [63, 64], а также, возможно, регулируют поступление кальция в другие клеточные органеллы. При тепловом стрессе кальций транспортируется из цитозоля в митохондрии в зависимости от мтΔψ [5961]. В результате формируется определенная сигнатура Ca2+, необходимая для оптимальной активации экспрессии БТШ. Если транспорт кальция в митохондрии подавить в результате обработки митохондриальными ингибиторами или разобщителями, то он аккумулируется в цитозоле до критического уровня, при котором экспрессия БТШ ингибируется [12, 30, 39].

Поступление кальция в митохондрии сопровождается повышением мт∆ψ [64, 75], что, в свою очередь, способствует усилению генерации митохондриальных АФК [64, 76, 80, 81]. Повышение генерации АФК до определенного уровня активирует экспрессию БТШ [7, 9, 10]. Чрезмерное повышение концентрации Ca2+ в митохондриях приводит к открытию митохондриальной поры, деполяризации внутренней митохондриальной мембраны, выходу цитохрома с из митохондрий в цитозоль, и, в конечном счете, к активации ПКГ [65, 66]. Здесь митохондрии выступают как передатчик и реле кальциевого сигнала, модулируют уровень Ca2+ в цитозоле и, вероятно, в других клеточных органеллах, а также стимулируют продукцию АФК. В результате митохондрии определяют жизнь и смерть растения при тепловом воздействии.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 10-04-00921-а) и Министерства образования и науки РФ (соглашение № 8266).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Vierling E. The roles of heat-shock proteins in plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1991. V. 42. P. 579–620.

2.Saidi Y., Finka A., Goloubinoff P. Heat perception and signalling in plants: a tortuous path to thermotolerance // New Phytol. 2011. V. 190. P. 556565.

3.Mittler R., Finka A., Goloubinoff P. How do plants feel the heat? // Trends Biochem. Sci. 2012. V. 37. P. 118125.

4.Voellmy R., Boellmann F. Chaperone regulation of the heat shock protein response // Adv. Exp. Med. Biol. 2007. V. 594. P. 8999.

5.Scharf K.D., Berberich T., Ebersberger I., Nover L. The plant heat stress transcription factor (Hsf) family: structure, function and evolution // Biochim. Biophys. Acta. 2012. V. 1819. P. 104119.

6.Balogh G., Horvath I., Nagy E., Hoyk Z., Benko S., Bensaude O., Vigh L. The hyperfluidization of mammalian cell membrane acts as a signal to initiate the heat shock protein response // FEBS J. 2005. V. 272. P. 6077–6086.

7.Saidi Y., Finka A., Muriset M., Bromberg Z., Weiss Y.G., Maathuis F.J., Goloubinoff P. The heat shock response in moss plants is regulated by specific calcium-permeable channels in the plasma membrane // Plant Cell. 2009. V. 21. P. 28292843.

8.Finka A., Mattoo R.U., Goloubinoff P. Meta-analysis of heat- and chemically-upregulated chaperone genes in plant and human cells // Cell Stress Chaperones. 2011. V. 16. P. 15–31.

9.Volkov R.A., Panchuk I.I., Mullineaux P.M., Schoffl F. Heat stress-induced H2O2 is required for effective expression of heat shock genes in Arabidopsis // Plant Mol. Biol. 2006. V. 61. P. 733746.

10.Miller G., Mittler R. Could heat shock transcription factors function as hydrogen peroxide sensors in plants? // Ann. Bot. 2006. V. 98. P. 279288.

11.Pucciariello C., Banti V., Perata P. ROS signaling as common element in low oxygen and heat stresses // Plant Physiol. Biochem. 2012. V. 59. P. 310.

12.Rikhvanov E.G., Gamburg K.Z., Varakina N.N., Rusaleva T.M., Fedoseeva I.V., Tauson E.L., Stupnikova I.V., Stepanov A.V., Borovskii G.B., Voinikov V.K. Nuclear-mitochondrial cross-talk during heat shock in Arabidopsis cell culture // Plant J. 2007. V. 52. P. 763778.

13.Queitsch C., Hong S.W., Vierling E., Lindquist S. Heat shock protein 101 plays a crucial role in thermotolerance in Arabidopsis // Plant Cell. 2000. V. 12. P. 479492.

14.Rikhvanov E.G., Romanova N.V., Chernoff Y.O. Chaperone effects on prion and nonprion aggregates // Prion. 2007. V. 1. P. 217222.

15.Медведев С.С. Кальциевая сигнальная система растений // Физиология растений. 2005. Т. 52. C. 283–305.

16.Reddy A.S., Ali G.S., Celesnik H., Day I.S. Coping with stresses: roles of calcium- and calcium/calmodulin-regulated gene expression // Plant Cell. 2011. V. 23. P. 20102032.

17.Бияшева А.Э., Молотковский Ю.Г., Мамонов Л.К. Повышение уровня свободного Са2+ в цитозоле растительных протопластов в ответ на тепловой стресс: связь с Са2+-гомеостазом // Физиология растений. 1993. Т. 40. С. 613618.

18.Gong M., van der Luit A., Knight M., Trewavas A. Heat-shock-induced changes in intracellular Ca2+ level in tobacco seedlings in relation to thermotolerance // Plant Physiol. 1998. V. 116. P. 429437.

19.Liu H.T., Li B., Shang Z.L., Li X.Z., Mu R.L., Sun D.Y., Zhou R.G. Calmodulin is involved in heat shock signal transduction in wheat // Plant Physiol. 2003. V. 132. P. 11861195.

20.Wu H.C., Jinn T.L. Heat shock-triggered Ca2+ mobilization accompanied by pectin methylesterase activity and cytosolic Ca2+ oscillation are crucial for plant thermotolerance // Plant Signal Behav. 2010. V. 5. P. 12521256.

21.Wu H.C., Luo D.L., Vignols F., Jinn T.L. Heat shock-induced biphasic Ca2+ signature and OsCaM1-1 nuclear localization mediate downstream signalling in acquisition of thermotolerance in rice (Oryza sativa L.) // Plant Cell Environ. 2012. V. 35. P. 15431557.

22.Gao F., Han X., Wu J., Zheng S., Shang Z., Sun D., Zhou R., Li B. A heat-activated calcium-permeable channel  Arabidopsis cyclic nucleotide-gated ion channel 6 - is involved in heat shock responses // Plant J. 2012. V. 70. P. 10561069.

23.Liu H.T., Sun D.Y., Zhou R.G. Ca2+ and AtCaM3 are involved in the expression of heat shock protein gene in Arabidopsis // Plant Cell Environ. 2005. V. 28. P. 1276–1284.

24.Suri S.S., Dhindsa R.S. A heat-activated MAP kinase (HAMK) as a mediator of heat shock response in tobacco cells // Plant Cell Environ. 2008. V. 31. P. 218226.

25.Tunc-Ozdemir M., Tang C., Ishka M.R., Brown E., Groves N.R., Myers C.T., Rato C., Poulsen L.R., McDowell S., Miller G., Mittler R., Harper J.F. A cyclic nucleotide-gated channel (CNGC16) in pollen is critical for stress tolerance in pollen reproductive development // Plant Physiol. 2013. V. 161. P. 10101020.

26.Kuznetsov V.V., Andreev I.M., Trofimova M.S. The synthesis of Hsps in sugar beet suspension culture cells under hyperthermia exhibits differential sensitivity to calcium // Biochem. Mol. Biol. Int. 1998. V. 45. P. 269278.

27.Trofimova M.S., Andreev I.M., Kuznetsov V.V. Calcium is involved in regulation of the synthesis of Hsps in suspension-cultured sugar beet cells under hyperthermia // Physiol. Plant. 1999. V. 105. P. 6773.

28.Larkindale J., Knight M.R. Protection against heat stress-induced oxidative damage in Arabidopsis involves calcium, abscisic acid, ethylene, and salicylic acid // Plant Physiol. 2002. V. 128. P. 682695.

29.Колупаев Ю.Е., Акинина Г.Е., Мокроусов А.В. Индукция теплоустойчивости колеоптилей пшеницы ионами кальция и ее связь с окислительным стрессом // Физиология растений. 2005. Т. 52. С. 227232.

30.Пятрикас Д.В., Рихванов Е.Г., Федосеева И.В., Варакина Н.Н., Русалева Т.М., Таусон Е.Л., Степанов А.В., Боровский Г.Б., Войников В.К. Митохондриальная ретроградная регуляция экспрессии HSP101 Arabidopsis thaliana при тепловом стрессе и действии амиодарона // Физиология растений. 2014. Т. 61. С. .

31.Spalding E.P., Harper J.F. The ins and outs of cellular Ca2+ transport // Curr. Opin. Plant Biol. 2011. V. 14. P. 715720.

32.Li Z., Yue H., Xing D. MAP kinase 6-mediated activation of vacuolar processing enzyme modulates heat shock-induced programmed cell death in Arabidopsis // New Phytol. 2012. V. 195. P. 8596.

33.Scott I., Logan D.C. Mitochondrial morphology transition is an early indicator of subsequent cell death in Arabidopsis // New Phytol. 2008. V. 177. P. 90101.

34.Kim M.C. Calcium and calmodulin-mediated regulation of gene expression in plants // Mol. Plant. 2009. V. 2. P. 1321.

35.Sun X.T., Li B., Zhou G.M., Tang W.Q., Bai J., Sun D.Y., Zhou R.G. Binding of the maize cytosolic Hsp70 to calmodulin, and identification of calmodulin-binding site in Hsp70 // Plant Cell Physiol. 2000. V. 41. P. 804810.

36.Reddy V.S., Ali G.S., Reddy A.S. Genes encoding calmodulin-binding proteins in the Arabidopsis genome // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 98409852.

37.Meiri D., Breiman A. Arabidopsis ROF1 (FKBP62) modulates thermotolerance by interacting with HSP90.1 and affecting the accumulation of Hsfa2-regulated sHsps // Plant J. 2009. V. 59. P. 387399.

38.Al-Quraan N.A., Locy R.D., Singh N.K. Expression of calmodulin genes in wild type and calmodulin mutants of Arabidopsis thaliana under heat stress // Plant Physiol. Biochem. 2010. V. 48. P. 697702.

39.Königshofer H., Tromballa H.W., Löppert H.G. Early events in signalling high-temperature stress in tobacco BY2 cells involve alterations in membrane fluidity and enhanced hydrogen peroxide production // Plant Cell Environ. 2008. V. 31. P. 17711780.

40.Zhang W., Zhou R.G., Gao Y.J., Zheng S.Z., Xu P., Zhang S.Q., Sun D.Y. Molecular and genetic evidence for the key role of AtCaM3 in heat-shock signal transduction in Arabidopsis // Plant Physiol. 2009. V. 149. P. 17731784.

41.Liu H.T., Li G.L., Chang H., Sun D.Y., Zhou R.G., Li B. Calmodulin-binding protein phosphatase PP7 is involved in thermotolerance in Arabidopsis // Plant Cell Environ. 2007. V. 30. P. 156164.

42.Liu H.T., Gao F., Li G.L., Han J.L., Liu D.L., Sun D.Y., Zhou R.G. The calmodulin-binding protein kinase 3 is part of heat shock signal transduction in Arabidopsis thaliana // Plant J. 2008. V. 55. P. 760773.

43.Kanchiswamy C.N., Muroi A., Maffei M.E., Yoshioka H., Sawasaki T., Arimura G. Ca2+-dependent protein kinases and their substrate Hsfb2a are differently involved in the heat response signaling pathway in Arabidopsis // Plant Biotechnol. 2010. V. 27. P 469473.

44.Li B., Liu H.T., Sun D.Y., Zhou R.G. Ca2+ and calmodulin modulate DNA-binding activity of maize heat shock transcription factor in vitro // Plant Cell Physiol. 2004. V. 45. P. 627–634.

45.Holmberg C.I., Hietakangas V., Mikhailov A., Rantanen J.O., Kallio M., Meinander A., Hellman J., Morrice N., MacKintosh C., Morimoto R.I., Eriksson J.E., Sistonen L. Phosphorylation of serine 230 promotes inducible transcriptional activity of heat shock factor 1 // EMBO J. 2001. V. 20. P. 38003810.

46.Kanchiswamy C.N., Takahashi H., Quadro S., Maffei M.E., Bossi S., Bertea C., Zebelo S.A., Muroi A., Ishihama N., Yoshioka H., Boland W., Takabayashi J., Endo Y., Sawasaki T., Arimura G. Regulation of Arabidopsis defense responses against Spodoptera littoralis by CPK-mediated calcium signaling // BMC Plant Biol. 2010. V. 10. P. 97.

47.Stael S., Wurzinger B., Mair A., Mehlmer N., Vothknecht U.C., Teige M. Plant organellar calcium signalling: an emerging field // J. Exp. Bot. 2012. V. 63. P. 15251542.

48.Moeder W., Urquhart W., Ung H., Yoshioka K. The role of cyclic nucleotide-gated ion channels in plant immunity // Mol. Plant. 2011. V. 4. P. 442452.

49.McAinsh M.R., Pittman J.K. Shaping the calcium signature // New Phytol. 2009. V. 181. P. 275294.

50.Ward J.M., Mäser P., Schroeder J.I. Plant ion channels: gene families, physiology, and functional genomics analyses // Annu. Rev. Physiol. 2009. V. 71. P. 5982.

51.Finka A., Cuendet A.F., Maathuis F.J., Saidi Y., Goloubinoff P. Plasma membrane cyclic nucleotide gated calcium channels control land plant thermal sensing and acquired thermotolerance // Plant Cell. 2012. V. 24. P. 33333348.

52.Horváth I., Glatz A., Nakamoto H., Mishkind M.L., Munnik T., Saidi Y., Goloubinoff P., Harwood J.L., Vigh L. Heat shock response in photosynthetic organisms: membrane and lipid connections // Prog. Lipid Res. 2012. V. 51. P. 208220.

53.Liu Y., Liu H., Pan Q., Yang H., Zhan J., Huang W. The plasma membrane H+-ATPase is related to the development of salicylic acid-induced thermotolerance in pea leaves // Planta. 2009. V. 229. P. 10871098.

54.Larkindale J., Hall J.D., Knight M.R., Vierling E. Heat stress phenotypes of Arabidopsis mutants implicate multiple signaling pathways in the acquisition of thermotolerance // Plant Physiol. 2005. V. 138. P. 882897.

55.Liu H.T., Gao F., Cui S.J., Han J.L., Sun D.Y., Zhou R.G. Primary evidence for involvement of IP3 in heat-shock signal transduction in Arabidopsis // Cell Res. 2006. V. 16. P. 394400.

56.Zheng S.Z., Liu Y.L., Li B., Shang Z.L., Zhou R.G., Sun D.Y. Phosphoinositide-specific phospholipase C9 is involved in the thermotolerance of Arabidopsis // Plant J. 2012. V. 69. P. 689700.

57.Kaplan B., Davydov O., Knight H., Galon Y., Knight M.R., Fluhr R., Fromm H. Rapid transcriptome changes induced by cytosolic Ca2+ transients reveal ABRE-related sequences as Ca2+-responsive cis elements in Arabidopsis // Plant Cell. 2006. V. 18. P. 27332748.

58.Whalley H.J., Sargeant A.W., Steele J.F., Lacoere T., Lamb R., Saunders N.J., Knight H., Knight M.R. Transcriptomic analysis reveals calcium regulation of specific promoter motifs in Arabidopsis // Plant Cell. 2011. V. 23. P. 40794095.

59.Walsh C., Barrow S., Voronina S., Chvanov M., Petersen O.H., Tepikin A. Modulation of calcium signalling by mitochondria // Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1787. P. 13741382.

60.Olson M.L., Chalmers S., McCarron J.G. Mitochondrial organization and Ca2+ uptake // Biochem. Soc. Trans. 2012. V. 40. P. 158167.

61.Kornmann B. The molecular Hug between the ER and the mitochondria // Curr. Opin. Cell Biol. 2013. March 8. doi 10.1016/j.ceb.2013.02.010 pii: S0955-0674(13)00033-1.

62.Subbaiah C.C., Bush D.S., Sachs M.M. Mitochondrial contribution to the anoxic Ca2+ signal in maize suspension-cultured cells // Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 759771.

63.Logan D., Knight M.R. Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants // Plant Physiol. 2003. V. 133. P. 2124.

64.Sun J., Zhang C.L., Deng S.R., Lu C.F., Shen X., Zhou X.Y., Zheng X.J., Hu Z.M., Chen S.L. An ATP signalling pathway in plant cells: extracellular ATP triggers programmed cell death in Populus euphratica // Plant Cell Environ. 2012. V. 35. P. 893916.

65.Arpagaus S., Rawyler A., Braendle R. Occurrence and characteristics of the mitochondrial permeability transition in plants // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 17801787.

66.Virolainen E., Blokhina O., Fagerstedt K. Ca2+-induced high amplitude swelling and cytochrome c release from wheat (Triticum aestivum L.) mitochondria under anoxic stress // Ann. Bot. 2002. V. 90. P. 509516.

67.Banti V., Mafessoni F., Loreti E., Alpi A., Perata P. The heat-inducible transcription factor HsfA2 enhances anoxia tolerance in Arabidopsis // Plant Physiol. 2010. V. 152. P. 14711483.

68.Krause M., Durner J. Harpin inactivates mitochondria in Arabidopsis suspension cells // Mol. PlantMicrobe Interact. 2004. V. 17. P. 131139.

69.Kuzmin E.V., Karpova O.V., Elthon T.E., Newton K.J. Mitochondrial respiratory deficiencies signal up-regulation of genes for heat shock proteins // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 20 672–20 677.

70.Павлова Е.Л., Рихванов Е.Г., Таусон Е.Л., Варакина Н.Н., Гамбург К.З., Русалёва Т.М., Боровский Г.Б., Войников В.К. Влияние салициловой кислоты на развитие индуцированной термотолерантности и индукцию синтеза БТШ в культуре клеток Arabidopsis thaliana // Физиология растений. 2009. Т. 56. С. 7884.

71.Пуляевская М.А., Варакина Н.Н., Гамбург К.З., Русалёва Т.М., Степанов А.В., Войников В.К., Рихванов Е.Г. Фторид натрия подавляет синтез БТШ в культуре клеток Arabidopsis thaliana, подвергнутых воздействию теплового стресса // Физиология растений. 2011. Т. 58. С. 533–541.

72.Vanderauwera S., Vandenbroucke K., Inzé A., van de Cotte B., Mühlenbock P., de Rycke R., Naouar N., van Gaever T., van Montagu M.C., van Breusegem F. AtWRKY15 perturbation abolishes the mitochondrial stress response that steers osmotic stress tolerance in Arabidopsis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. V. 109. P. 20 113-20 118.

73.Rikhvanov E.G., Varakina N.N., Rusaleva T.M., Rachenko E.I., Knorre D.A., Voinikov V.K. Do mitochondria regulate the heat-shock response in Saccharomyces cerevisiae? // Curr. Genet. 2005. V. 48. P. 4459.

74.Федосеева И.В., Пятрикас Д.В., Варакина Н.Н., Русалёва Т.М., Степанов А.В., Рихванов Е.Г., Боровский Г.Б., Войников В.К. Эффект амиодарона на термотолерантность и синтез Hsp104p у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Биохимия. 2012. Т. 77. С. 99109.

75.Robb-Gaspers L.D., Burnett P., Rutter G.A., Denton R.M., Rizzuto R., Thomas A.P. Integrating cytosolic calcium signals into mitochondrial metabolic responses // EMBO J. 1998. V. 17. P. 49875000.

76.Pozniakovsky A.I., Knorre D.A., Markova O.V., Hyman A.A., Skulachev V.P., Severin F.F. Role of mitochondria in the pheromone- and amiodarone-induced programmed death of yeast // J. Cell Biol. 2005. V. 168. P. 257269.

77.Suzuki N., Koussevitzky S., Mittler R., Miller G. ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress // Plant Cell Environ. 2012. V. 35. P. 259270.

78.Креславский В.Д., Лось Д.А., Аллахвердиев С.И., Кузнецов Вл.В. Сигнальная роль активных форм кислорода при стрессе у растений // Физиология растений. 2012. Т. 59. С. 163178.

79.Гордеева А.В., Лабас Ю.А., Звягильская Р.А. Апоптоз одноклеточных организмов: механизмы и эволюция // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 13011313.

80.Korshunov S.S., Skulachev V.P., Starkov A.A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria // FEBS Lett. 1997. V. 416. P. 1518.

81.Weir I.E., Pham N.A., Hedley D.W. Oxidative stress is generated via the mitochondrial respiratory chain during plant cell apoptosis // Cytometry A. 2003. V. 54. P. 109117.

Подписи к рисункам

 

Рис. 1. Тепловой стресс при 37°С индуцирует синтез БТШ и защищает культуру клеток A. thaliana от гибели при повреждающем тепловом шоке 50°С [12].

а  синтез БТШ после теплового воздействия различной интенсивности. Развитие индуцированной термотолерантности, определяемое по восстановлению ТТХ (б) и возобновлению роста клеток (в).

 

Рис. 2. Механизм кальций–зависимой активации транскрипционных факторов Hsf при тепловом стрессе у растений.

 

Рис. 3. Функционирование кальциевой сигнальной системы в клетках растений при действии теплового стресса. 

а  содержание свободного Ca2+ в отсутствие стресса [47]; б  гипотетический механизм функционирования кальциевой сигнальной системы при действии теплового стресса. Этап 1. Действие теплового стресса приводит к двум одновременным (или последовательным) событиям: к повышению уровня циклических нуклеотидов, стимулирующих открытие Ca2+-проницаемых каналов на плазматической мембране и к повышению количества IP3, который вызывает освобождение Ca2+ из вакуолей и ЭПР. Этап 2. За счет поступления Ca2+ из апопласта, ЭПР и вакуолей происходит повышение [Ca2+]цит. Этап 3. Кратковременное повышение [Ca2+]цит активирует транскрипционные факторы теплового шока (ФТШ). Этап 4. Далее Ca2+ либо выходит из клетки, либо транспортируется в вакуоль, ЭПР и митохондрии. Повышенное содержание Ca2+ в митохондриях сопровождается гиперполяризацией внутренней мембраны митохондрий и усилением генерации АФК. Этап 5. Повышение уровня АФК также активирует ФТШ. Этап 6. Активированный ФТШ перемещается в ядро, где связывается с элементами теплового шока (HSE) и активирует экспрессию генов БТШ.