УДК 581.1

КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ МУЛЬТИБЕЛКОВЫХ РАСТВОРИМЫХ КОМПЛЕКСОВ В КЛЕТКАХ ЦИАНОБАКТЕРИЙ

© 2014 г. Е. С. Пожидаева

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва

Поступила в редакцию 26.11.2012 г.

В настоящее время функциональная протеомика белков является одним из важнейших инструментов, используемых для изучения сложных внутриклеточных процессов, вовлекающих разнообразные белки, взаимодействующие между собой с различной долей вероятности. Большинство из них, выполняя свои функции в сложной сети взаимодействий, оказывают влияние на функции других белков. Несмотря на то, что многие из компонентов таких “белковых сетей” могли быть ранее охарактеризованы индивидуально, это не давало полной информации о характере и составляющих предполагаемых взаимодействий в естественных условиях. В статье описаны методы (нативный гель-электрофорез, эксклюзионная хроматография и иммунопреципитация), наиболее эффективно применяемые в протеомике взаимодействий и оптимизированные для изучения мультибелковых растворимых комплексов в клетках фотосинтетических бактерий на примере модельного объекта одноклеточной цианобактерии Synechococcus elongatus PCC 7942.

 

Ключевые слова: Synechococcus elongatus – белковые комплексы – электрофорез – протеомика

 

-------------------------------------

Сокращения: ТВ – трис-боратный буфер; ATPγS – adenosine 5'-O-[3-thio]-triphosphate (аденозин-5'-O-[3-тио]-трифосфат); Synechococcus – Synechococcus elongatus PCC7942.

Адрес для корреспонденции: Пожидаева Елена Станиславовна. 126276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: alenapoj@mail.ru

ВВЕДЕНИЕ

Цианобактерии являются уникальными прокариотами, так как им свойственен оксигенный фотосинтез, характерный для эукариотических водорослей и растений и являющийся важным биологическим процессом, обеспечивающим преобразование и запасание солнечной энергии, а также синтез углеводов и выделение кислорода. Биологическое разнообразие среди цианобактерий сделало их привлекательным объектом для использования в прикладных целях [1]. В частности, как потенциального поставщика предшественников биологических молекул, используемых при создании биофармацевтических препаратов [2], для получения молекулярного водорода [3], поскольку цианобактерии образуют водород за счет конверсии солнечной энергии, а также для удаления из окружающей среды тяжелых металлов [4].

По данным CyanoBase [5], к настоящему времени расшифрованы нуклеотидные последовательности геномов 39 различных штаммов цианобактерий, что открывает большие возможности для дальнейших исследований, в том числе и для развития протеомики цианобактерий. В сочетании с другими научными подходами применение функциональной протеомики позволяет глубже понять ключевые аспекты биологии этих организмов и эффективно использовать их при решении различных задач. В связи с тем, что белки могут быть организованы в сложные комплексы с абсолютно разными свойствами, для изучения их состава и размера обычно применяют несколько основных методов. Важной составляющей протеомного анализа является высокое разрешение и чувствительность разделения белков, которыми обладает классический метод двумерного электрофореза (2D IEF/SDS), основанный на сочетании изоэлектрического фокусирования (IEF) [6] и SDS-PAGE [7]. К сожалению, данный метод не подходит для анализа гидрофобных белков вследствие их возможной агрегации в условиях IEF. Кроме того, он не может быть применен для анализа белков в нативном состоянии или для идентификации белков-партнеров. 

В статье описан альтернативный метод двумерного гель-электрофореза, в котором фракционирование нативных белков и белковых комплексов в первом “направлении” осуществляли с помощью: 1) бесцветного нативного электрофореза [8] в слабо щелочных условиях с использованием трис-боратного (ТВ) буфера; 2) на хроматографической колонке методом эксклюзионной хроматографии [9] с использованием ВЭЖХ и 3) методом иммунопреципитации белков [10], с последующей комбинацией перечисленных методов с SDS-PAGE во втором направлении. Предложенный комплексный подход был оптимизирован нами для изучения состава и молекулярной массы мультибелковых растворимых комплексов в клетках фотосинтетических бактерий на примере модельного объекта одноклеточной цианобактерии Synechococcus elongatus PCC 7942 [11]. Сочетание перечисленных методов позволило наиболее точно оценить молекулярную массу изучаемых комплексов и описать спектр составляющих их белков.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы и условия культивирования. Штамм дикого типа Synechococcus elongatus PCC7942 (далее Synechococcus) выращивали в климатической камере фотоавтотрофно при температуре 32°С и постоянном освещении люминесцентными лампами интенсивностью 70 мкмоль фотонов/(м2 с) на среде BG11 [12]. Для экспериментов использовали интенсивную культуру цианобактерий. Для этого клеточную культуру штаммов в логарифмической фазе роста предварительно разводили до концентрации хлорофилла 3 мкг/мл и подращивали в течение следующих 24 ч [13].

Разрушение клеток, экстракция и определение концентрации белка. Клеточный экстракт из цианобактерии Synechococcus получали методом Shukla с соавт. [14] c некоторыми модификациями. Для этого из 500 мл среды клетки Synechococcus осаждали центрифугированием (12 000 g, 4°C, 10 мин), осадок ресуспендировали в 5 мл охлажденного буфера для выделения, содержащего 50 мМ Hepes-KOH (pH 7.0), 0.5 мМ сахарозу, 15 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 2 мМ аденозин-5'-O-[3-тио]-трифосфат (ATPγS, от adenosine 5′-O-[3-thio]-triphosphate) и 0.001% раствор ингибиторов протеиназ (“Sigma”, США). К суспензии клеток добавляли равный объем охлажденных стеклянных бус диаметром 0.10–0.25 мм (“Sigma”) и разрушали клетки, встряхивая на вортексе (Мульти-вортекс V-32, “BioSan”, Россия) 3 раза по 2 мин (с перерывом на 1 мин) на льду. Неразрушенные клетки и стеклянные бусы осаждали центрифугированием (2000 g, 4°C, 1 мин), и клеточный экстракт переносили в новую пробирку. Затем клеточный экстракт центрифугировали для разделения на фракции растворимых и мембранных белков при 25 000 g и 4ºС в течение 45 мин. Супернатант отделяли и использовали для определения суммарного растворимого белка с помощью бицинхонинового метода (ВСА assay kit, “Pierce”, США) [15]. После этого образцы концентрировали с использованием центрифужных пробирок типа 10К Nanosep (“Pall Life Sciences”, США) до необходимого объема и количества белка в образцах.

Двумерный электрофорез.

Нативный гель-электрофорез. В первом (1D) направлении проводили разделение индивидуальных растворимых белковых комплексов в нативных условиях в трис-боратном (ТВ) буфере: 0.45 M Трис-HCl, pH 8.3, и 0.45 M борная кислота, при помощи 6–13% градиентного гель-электрофореза. Для этого 60 мкг суммарного белка растворимой фракции вносили в лунку 6–13% градиентного полиакриламидного геля размером 20 × 20 см (Protean II System, “BioRad”, США). Для нанесения образцов использовали ТВ-буфер, содержащий 20% глицерин и 0.02% бромфеноловый синий. Электрофорез белков проводили в присутствии охлажденного ТВ-буфера с добавлением 1 мМ ЭДТА при постоянном токе 20 мА в течение 22 ч при 4ºС. В качестве стандартов использовали белки-маркеры: ферритин (440 кД – мономер, 880 кД – димер), уреазу (272 кД – тример) и бычий сывороточный альбумин (БСА, 66 кД – мономер, 132 кД – димер) (“Sigma-Aldrich”, США).

Эксклюзионная хроматография с использованием ВЭЖХ. Эксклюзионную хроматографию проводили при 4ºС на колонке Superose 6 HR 10/30 (“GE Healthcare”, Швеция) объемом 24 мл, дающей распределение белковых молекул в диапазоне от 5 до 5000 кД. Растворимую фракцию, полученную, как описано выше, концентрировали (10K Nanosep, “Pall Life Sciences”) до 4 мг/мл суммарного белка в образцах. Затем эту фракцию фильтровали (размер фильтра 0.45 мкм, Millipore) и вводили в колонку 0.1–0.2 мл образца. В качестве элюента наносили на колонку буфер, содержащий 25 мM Hepes-NaOH (pH 7.4), 10 мМ NaCl, 10 мM MgCl2, и 5 мM АТФ. Белки разделяли со скоростью 0,3 мл/мин и фракции объемом 0.5 мл собирали с помощью коллектора автоматической хроматографической системы ВЭЖХ Akta Prime (“GE Healthcare”). Колонку калибровали стандартными белками с известной мол. м. с использованием альдолазы 158 кД, каталазы 232 кД, ферритина 440 кД, тироглобулина 669 кД и декстрана синего 2000 кД (HMW Gel Filtration Calibration Kit, “GE Healthcare”). На колонку наносили 250 мкл индивидуального белка, конечная концентрация 1 мг/мл. После хроматографирования стандартов строили график зависимости константы элюирования и логарифма молекулярной массы, по которому определяли кажущуюся молекулярную массу исследованных белковых комплексов. Каждую из элюированных фракций этих комплексов (50 мкл) наносили на нитроцеллюлозную мембрану, используя прибор для дот-блоттинга (“Scie-Plas”, Великобритания), и затем анализировали с помощью иммуноблоттинга. 

Иммунопреципитация. Фракцию растворимых белков получали, как описано выше, с использованием холодного лизисного буфера 20 мМ Hepes-NaOH (pH 8.0), 150 мМ KCl, 0.1 мМ ЭДТА, 10 мМ MgCl2, 0.2% глицерин и 2 мМ ATPγS. Затем образцы концентрировали и смешивали с равным объемом (или бόльшим) холодного фосфатно-солевого буфера (PBS: 140 мМ NaCl, 8 мМ Na2PO3, 2 мМ K2PO3, 100 мМ KCl, pH 7.4, и 0.1% БСА). БСА добавляли в PBS-буфер непосредственно перед реакцией. Иммунопреципитацию проводили по методике производителя (Seize® X Protein A Immunoprecipitation Kit, “Pierce”). Для этого на каждую колонку, заполненную аффинным сорбентом протеин А-сефарозой, наносили 150 мкг очищенных IgG против белка ClpC в объеме 300-400 мкл, предварительно разведенных в PBS-буфере. Затем на колонку наносили 400 мкл растворимой фракции, содержащей 400 мкг суммарного белка (конечная концентрация 1 мкг/мкл). После инкубации в течение часа при комнатной температуре колонку переносили в холодную комнату и инкубацию при 4°C продолжали следующие 12 ч. После этого сефарозу осаждали центрифугированием и удаляли супернатант. Смолу промывали четыре раза лизисным буфером. Остаточный объем буфера удаляли. Полученный элюат концентрировали (10K Nanosep) и анализировали с помощью иммуноблоттинга. 

SDS-PAGE. Во втором направлении проводили идентификацию индивидуальных белков в составе исследуемых комплексов. Для этого после нативного электрофореза фрагмент геля, содержащего разделенные комплексы, инкубировали в денатурирующем буфере, содержащем 0.25 мМ Трис-HCl, pH 6.8, 8% ДДС, 40% глицерин, 20% меркаптоэтанол и 1 мМ ЭДТА в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем денатурированный гель помещали на 5% концентрирующий гель SDS-PAGE и закрепляли, используя раствор 0.5% агарозы в однократном буфере для SDS-PAGE [7] с добавлением 0.02% бромфенолового синего. Денатурирующий гель-электрофорез проводили в течение ночи при 4 °C при постоянном токе. Гели окрашивали в растворе красителя (0.04% раствор Кумасси R 250 в 10% уксусной кислоте и 20% изопропаноле) и отмывали 10% уксусной кислотой при нагревании.

Для идентификации отдельных компонентов белковых комплексов, полученных после эксклюзионной хроматографии и ко-иммунопреципитации, соответствующие фракции разделяли в денатурирующих гелях системы NuPAGE (“Invitrogen”, Германия).

Иммунобллоттинг. После проведения электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (0.2 мкм; “Bio-Rad”), используя прибор для полусухого блоттинга (“BioRad”), согласно стандартному протоколу. Иммуноблоттинг белков, иммобилизованных на мембранах, проводили с помощью коммерческих реагентов (ECL Plus Western Blotting Reagents, “GE Healthcare”). В анализе использовали антитела специфичные к Clp-белкам Synechococcus. Реакцию связывания антител с целевыми белками регистрировали на приборе Typhoon Trio+ (“GE Healthcare”).

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

 

Разрушение клеток и экстракция белков

Способ и условия разрушения клеток подбирали в зависимости от исследуемых белков и последующего метода анализа. Выделяют три основных способа разрушения клеток: 1) с использованием пресса Френча; 2) стеклянных шариков; 3) ультразвука. Каждый из предложенных подходов имеет свои преимущества и недостатки, поэтому на начальном этапе исследований рекомендуется провести сравнение условий получения гомогената клеток с целью выявления наиболее оптимального способа.

В наших экспериментах было необходимо исследовать состав и молекулярные массы растворимых комплексов Clp-белков в клетках Synechococcus, чья стабильность, в первую очередь, зависела от быстроты выделения фракции растворимых белков. Поэтому предпочтительным оказалось разрушение клеток с использованием стеклянных бус, основанное на механическом разрушении клеток при очень сильном встряхивании или перемешивании. Использование стеклянных бус позволило сократить время получения растворимой фракции исследуемого образца с 5 ч в случае разрушения клеток с помощью пресса Френча до 1 ч, главным образом, из-за сокращения времени концентрирования исследуемого образца. Стабильность Clp-комплексов при выделении также достигалась добавлением в буфер аналога АТФ, 2 мМ ATPγS, который является негидролизуемым субстратом белков, обладающих АТФазной активностью, чья агрегация в комплексы повышается в присутствии ионов Mg2+ [16].

Для изучения комплексов растворимых белков в клетках цианобактерий мы применили альтернативный метод двумерного гель-электрофореза, где фракционирование нативных белков и белковых комплексов в первом “направлении” осуществляли тремя различными методами. Прежде всего, это было связано с возможностью уменьшить риск появления ложноположительных результатов из-за использования лишь одного подхода. Кроме того, каждый из описанных методов имеет ряд собственных ограничений, не позволяющих полностью охарактеризовать исследуемые комплексы.

 

Нативный электрофорез

На первом этапе, с целью определения олигомерного состояния исследуемых Clp-белков был оптимизирован неокрашенный нативный PAGE в слабощелочных условиях с использованием трис-боратного буфера (рН 8.5). Данный тип электрофореза хорошо известен и часто применяется для разделения нуклеиновых кислот или комплексов ДНК–белок. Боратные буферные смеси со значениями рН от кислых до слабощелочных способствуют как растворению, так и стабилизации белков, что позволяет не только снизить использование детергента при приготовлении образцов, но и полностью исключить его. 

Как известно [8], при нативном (1D) PAGE белки разделяются согласно размеру, а миграция белковых комплексов или белковых агрегатов остановится, когда размер пор градиентного геля будет препятствовать их дальнейшему продвижению. Поэтому, прежде всего, для установления оптимального времени проведения электрофореза были протестированы маркерные белки. Электрофорез в градиентном геле, размером 20 × 20 см, проводили в течение 22 ч при 4°C. Через 10 ч после начала электрофореза в лунки последовательно вносили смесь маркерных белков с временнόй разницей в 4 ч. Как видно из рис. 1а, высокомолекулярные комплексы, соответствующие мономеру (440 кД) и димеру (880 кД) ферритина, обладали небольшой электрофоретической подвижностью только в первые 18 ч, в то время как подвижность маркерных белков в диапазоне 66–280 кД была высокой и продолжалась в течение всего времени проведения электрофореза. В итоге, оптимальным временем проведения нативного электрофореза был выбран 20-часовой отрезок, позволяющий максимально разделить область 66–800 кД и сохранить нативные комплексы в геле. На рис. 1б представлен профиль белковых комплексов растворимой фракции после нативного электрофореза. Как видно из этого рисунка, образцы под номерами 1 и 2 различаются между собой: у образца 2 меньше стабильных комплексов. Это связано с тем, что после выделения часть растворимой фракции вносили в гель сразу после экстракции (образец 1), а другую часть замораживали при температуре –70ºС в 15% глицерине на 12 ч (образец 2). Таким образом, для получения достоверного результата рекомендуется получать растворимую фракцию непосредственно перед анализом. 

Для идентификации олигомерного состава исследуемых белков, в первую очередь, необходимо теоретически рассчитать массу всего ожидаемого комплекса. Следует учитывать, что он может быть как гомогенным, т.е. состоять из белков одного типа, так и гетерогенным и включать разные белки. Таким примером является протеаза Clp, которая в клетках Synechococcus представлена двумя типами протеолитического ядра – ClpP3/R и ClpP1/P2. Это связано с тем, что по сравнению с гетеротрофной бактерией Escherichia coli, содержащей гомогенное протеолитическое ядро ClpP, облигатный фотоавтотроф Synechococcus имеет несколько генов, кодирующих разные субъединицы Clp [17]. Каждая из субъединиц, входящих в данный комплекс, ранее была исследована индивидуально [11]. На рис. 1в представлен пример анализа ClpR-содержащего комплекса с помощью иммуноблоттинга с антителами, специфичными к данному белку. Иммуноанализ нативных комплексов растворимой фракции позволил установить относительную молекулярную массу ClpR-содержащего комплекса – 280 кД, а последующее разделение комплексов с помощью SDS-PAGE подтвердило присутствие в нем белка ClpR (рис. 1в).

 

Эксклюзионная хроматография

Как любой PAGE, нативный электрофорез не позволяет идентифицировать некоторые супрамолекулярные комплексы. В настоящее время метод гель-фильтрации, с помощью которого легко разделить вещества, отличающиеся по размерам и молекулярной массе, активно используется в протеомике взаимодействий. На рис. 2а показана хроматографическая кривая гель-фильтрации сразу после пропускания смеси белков растворимой фракции Synechococcus через носитель Superose 6 HR 10/30 (“GE Healthcare”), используемый для разделения в условиях ВЭЖХ. Первыми элюировались белки с наибольшей молекулярной массой, так как им труднее войти в поры геля и они, не задерживаясь, быстрее проходят между гранулами носителя. Это особенно четко видно при калибровке колонки окрашенными нативными белками с известной молекулярной массой. На рис. 2а последовательность элюции маркерных белков на геле Superose 6 HR 10/30 показана стрелками. Поскольку каждому белку соответствует свое значение объема элюции, то, используя зависимость между объемом элюции и молекулярной массой маркерного белка, можно достаточно легко определить молекулярную массу исследуемого белка или белкового комплекса. Относительная подвижность белков в геле выражается через коэффициент доступности Kav (рис. 2б), который рассчитывается по формуле: 

Kav= (Vi – V0)/(Vt – V0),

где Vi – объем выхода пика, V0 – свободный объем колонки, Vt – полный геометрический объем колонки. Величину V0 определяли по объему элюции голубого декстрана (мол. м. белка равна 2000 кД). После расчета коэффициента доступности для каждого из маркерных белков на основании калибровочного графика зависимости Kav (log мол. м.) был определен молекулярно-массовый диапазон хроматографической колонки Superose 6 в исследованных условиях (рис. 2б). Из полученных данных следует, что методом эксклюзионной хроматографии на носителе Superose 6 HR 10/30 можно разделять белковые молекулы с мол. м. от 150 до 2000 кД, так как в этом диапазоне Superose 6 HR 10/30 проявляет удовлетворительную разрешающую способность разделения белков по молекулярным массам. Очень удобным оказалось использование мембран после дот-блотта при анализе фракций после элюции методом вестерн-блоттинга. Комбинация иммунноанализа и денситометрической обработки результатов позволяет точнее определить значения объема элюции исследуемого белка. На рис. 2в показан результат вестерн-блоттинга с антителами против белка ClpP3, который вместе с белком ClpR образует протеолитическое ядро Clp протеазы [11]. Денситометрическая обработка показала, что ClpP3 элюируется во фракциях С7-D3 с максимумом в точке С10, что соответствует значению Vi = 14.1 мл и Kav = 0.45. Таким образом, после соответствующих расчетов было установлено, что белок ClpP3 элюировался в составе комплекса, мол. м. которого составляла 280 кД.

 

Иммунопреципитация

В тех случаях, когда идентифицировать компоненты супрамолекулярных комплексов с помощью перечисленных выше методов довольно трудно, иммунопреципитация является эффективным методом для поиска белков-партнеров, в том числе для белков HSP100 исследуемой нами Clp-протеазы. Описываемый подход позволяет осаждать из раствора или клеточного экстракта как целевые белки, так и белковые комплексы, в состав которых они входят, с использованием антител к исследуемому белку. Преципитацию образовавшихся комплексов, состоящих из смеси антитела, целевого белка и белков-партнеров осуществляли на сефарозе, конъюгированной с протеином А, специфически связывающимся с Fc-доменом иммуноглобулинов. В норме 1 мл протеин А-сефарозы связывает 10–20 мкг IgG.

Процедура иммунопреципитации включает в себя несколько этапов: 1) получение клеточного лизата; 2) иммобилизацию антител на протеин А-сефарозе и образование комплекса антитело–антиген; 3) элюцию комплекса антитело–антиген; 4) анализ преципитированных белков с помощью SDS-PAGE и (или) иммуноблоттинга. Каждый из перечисленных этапов должен быть оптимизирован применительно к конкретной задаче исследования. В настоящее время различные биотехнологические компании предлагают готовые наборы реактивов для иммунопреципитации. На рис. 3б приведен пример иммунопреципитации белков ClpR (28 кД) и ClpC (87 кД) из клеточного лизата Synechococcus на протеин А-сефарозе с иммобилизованными IgG анти-ClpC с использованием набора Seize® X Protein A Immunoprecipitation Kit (“Pierce”). При оптимизации условий иммунопреципитации было установлено, что эффективность связывания Clp белков с анти-ClpC повышалась при более длительной инкубации (12 ч) клеточного лизата с антителами при 4°С, что отличалось от условий, рекомендованных в стандартных протоколах (рис. 3).

Таким образом, в процессе исследований был оптимизирован альтернативный метод двумерного гель-электрофореза, включающий в себя сочетание нативного гель-электрофореза, эксклюзионной хроматографии, иммунопреципитации и SDS-PAGE. Этот подход может эффективно использоваться для изучения мультибелковых растворимых комплексов в клетках фотосинтетических бактерий.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (№ 09-04-00410-а, № 12-04-00049-а).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Кокшарова О.А. Применение методов молекулярной генетики и микробиологии в экологии и биотехнологии цианобактерий // Микробиология. 2010. Т. 79. С. 734–747.

2. Tan LT. Bioactive natural products from marine cyanobacteria for drug discovery // Phytochemistry. 2007. V. 68. P. 954–979.

3. Quintana N., van der Kooy F., van de Rhee M. D., Voshol G. P., Verpoorte R. Renewable energy from cyanobacteria: energy production optimization by metabolic pathway engineering // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011. V. 91. P. 471–490.

4. Shanab S., Essa A., Shalaby E. Bioremoval capacity of three heavy metals by some microalgae species (Egyptian Isolates) // Plant Signal Behav. 2012. V. 7. P. 392–399.

5. Nakao M., Okamoto S., Kohara M., Fujishiro T., Fujisawa T., Sato S., Tabata S., Kaneko T., Nakamura Y. CyanoBase: the cyanobacteria genome database update 2010 // Nucleic Acids Res. 2010. V. 38. P. 379–381.

6. Friedman D.B., Hoving S., Westermeier R. Isoelectric focusing and two-dimensional electrophoresis // Methods Enzymol. 2009. V. 463. P. 515–540.

7. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. P. 680–685.

8. Шуколюков С.А. Нативный электрофорез в протеомике клетки: BN и CN-PAGE // Цитология. 2011. Т. 53. С. 159–165.

9. Wang Y., Teraoka I., Hansen F. Y., Peters G. H., Hassager O. A theoretical study of the separation principle in size exclusion chromatography // Macromolecule. 2010. V. 43. P. 1651–1659.

10. Isono E., Schwechheimer C. Co-immunoprecipitation and protein blots // Methods Mol. Biol. 2010. V. 655. P. 377–387. 

11. Stanne T.M., Pojidaeva E., Andersson F.I., Clarke A.K. Distinctive types of ATP-dependent Clp proteases in cyanobacteria // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. P. 14 394–14 402.

12. Rippkа R. Isolation and purification of cyanobacteria // Methods Enzymol. 1988. V. 167. P. 3–27.

13. Campbell D., Zhou G., Gustafsson P., Oquist G., Clarke A.K. Electron transport regulates exchange of two forms of photosystem II D1 protein in the cyanobacterium Synechococcus // EMBO J. 1995. V. 14. P. 5457–5466.

14. Shukla V.K., Stanbekova G.E., Shestakov S.V., Pakrasi H.B. The D1 protein of the photosystem II reaction-centre complex accumulates in the absence of D2: analysis of a mutant of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 lacking cytochrome b559 // Mol. Microbiol. 1992. V. 6. P. 947–956. 

15. Stoscheck C. Quantification of protein // Methods Enzymol. 1990. V. 182. P. 50–68.

16. Wang Z.Y., Ramage R.T., Portis A.R. Mg2+ and ATP or adenosine 5'-[γ-thio]-triphosphate (ATPγS) enhances intrinsic fluorescence and induces aggregation which increases the activity of spinach Rubisco activase // Biochim. Biophys. Acta. 1993. V. 1202. P. 47–55.

17. Sokolenko A., Pojidaeva E., Zinchenko V., Panichkin V., Glaser V.M., Herrmann R.G., Shestakov S.V. The gene complement for proteolysis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 and Arabidopsis thaliana chloroplasts // Curr. Genet. 2002. V. 41. P. 291–310.

ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

 

Рис. 1. Результаты двумерного электрофореза белков растворимой фракции.

а – калибровка нативного геля маркерными белками. Через 10 ч после начала электрофореза в лунки последовательно вносили смесь маркерных белков (ферритин: 440 кД – мономер, 880 кД – димер; уреаза: 272 кД – тример и БСА: 66 кД – мономер, 132 кД – димер) с временнόй разницей в 4 ч. Для анализа взяты точки 10, 14, 18 и 22 ч. После электрофоретического разделения белки окрашивали раствором Кумасси синий R250; б – профиль белковых комплексов растворимых фракций после нативного электрофореза, окрашенных раствором Кумасси синий R 250. 1 – образец наносили сразу после экстракции; 2 – образец предварительно замораживали на 24 ч при –70ºC в 15% глицерине. Справа указаны молекулярные массы маркерных белков (М, кД); в – иммуноблоттинг после разделения белков растворимой фракции двумерным электрофорезом с использованием антител к белку ClpR. 1D – первое направление; SDS-PAGE – второе направление. Стрелкой показан сигнал, соответствующий белку ClpR. Размеры маркерных белков для нативного PAGE и SDS-PAGE указаны в кД (М).

 

Рис. 2. Хроматографическое разделение белков растворимой фракции.

а – хроматографическая кривая элюции белков растворимой фракции на геле Superose 6 HR 10/30. Стрелками указана последовательность элюции маркерных белков, соответствующая определенному объему; б – калибровочный график колонки Superose 6 HR 10/30. Для калибровки использовали маркерные белки: альдолаза 158 кД, каталаза 232 кД, ферритин 440 и 880 кД, тироглобулин 669 и 1338 кД, декстран синий 2000 кД, для которых определены коэффициенты доступности Kav; в – результаты иммуноблоттинга дот-блотта фракций с антителами к ClpP3, полученные после хроматографии на Superose 6 HR 10/30 – сефарозе, и их денситометрическая обработка. Значения А–Е (1–10) соответствуют номерам фракций, элюируемых при хроматографии.

 

Рис. 3. Иммунопреципитация белков СlpC (а) и СlpR (б) на протеин А-сефарозе с иммобилизованными IgG анти-ClpC. 

1 – контроль на неспецифическую сорбцию белков на протеин А-сефарозе с иммобилизованными IgG преиммунной сыворотки; 2 – иммунопреципитация белков в течение 1 ч при 37°С; 3 – иммунопреципитация в течение 1 ч при 37°С и 4°С 12 ч. Стрелками указана позиция исследуемых белков.