УДК 581.1:582.475:2

КАЛЛУСОГЕНЕЗ И ИНДУКЦИЯ СОМАТИЧЕСКОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА 

У ГИБРИДНЫХ ЗАРОДЫШЕЙ СЕМЯН Pinus sibirica

© 2014 г. И. Н. Третьякова, Е. В. Ворошилова, Д. Н. Шуваев

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки 

Институт леса им. В.Н. Сукачева, Сибирское отделение РАН, Красноярск

Поступила в редакцию 25.03.2013 г.

Приведены результаты многолетней работы по индукции соматического эмбриогенеза у кедра сибирского (Pinus sibirica Du Tour), произрастающего в естественном древостое и на клоновой прививочной плантации в Западном Саяне. Контролируемое опыление клонов кедра сибирского оказало положительное влияние на состояние каллусных культур. Цитологический анализ эмбрионально-суспензорной массы позволил идентифицировать эмбриологические структуры, морфологически сходные с зиготическими зародышами, находящимися на ранних стадиях развития, что служило определением каллусной ткани как эмбриогенной. Выявлены растения-доноры (клоны), зиготические зародыши которых в условиях культуры in vitro могут служить источником получения эмбриогенной каллусной ткани. 

 

Ключевые слова: Pinus sibirica – кедры-акселераты с однолетним развитием женских шишек – контролируемое опыление – зиготические зародыши – гибридные зародыши – каллус – эмбрионально-суспензорная масса – соматические зародыши

 

------------------------------

Сокращения: ОЛХ – опытное лесное хозяйство; ЭК – эмбриогенный каллус; ЭСМ – эмбрионально-суспензорная масса.

Адрес для корреспонденции: Третьякова Ираида Николаевна. 660036 Красноярск, Академгородок, 50, стр. 28. Институт леса им. В.Н. Сукачева Сибирское отделение РАН. Электронная почта: culture@ksc.krasn.ru

 

ВВЕДЕНИЕ

Половая репродукция сосны сибирской (кедра сибирского, Pinus sibirica Du Tour) – единственного орехоносного вида в горах Южной Сибири, характеризуется рядом признаков, отличающих его от других представителей семейства Pinaceae. Это, во-первых, высокая полиэмбриональность семян (до 16 зародышей в одном мегагаметофите), требующих длительной стратификации (47 мес.); во-вторых, встречаемость (частота 0.2%) в природных популяциях уникальных гетерозисных генотипов деревьев – “кедров-акселератов” – с однолетним циклом развития женской шишки (от опыления до оплодотворения проходит 2 мес. вместо 1415 мес. [1, 2]). Однако размножение таких гетерозисных форм естественным путем невозможно вследствие гаметофитной несовместимости и отсутствия зародыша [3, 4].

Для изучения репродуктивного процесса сосны сибирской и сохранения ее уникальных форм наиболее перспективным направлением является проведение экспериментов по контролируемому опылению и получению хозяйственно-ценных гибридов, которые можно размножать ex situ и традиционными методами биотехнологии в культуре in vitro через соматический эмбриогенез. 

Соматический эмбриогенез – асексуальный способ микроклонального размножения, основанный на тотипотентности растительных клеток [5], был открыт 26 лет назад у Picea glauca [6]. К настоящему времени эмбриогенный каллус и соматические зародыши получены у 27 видов рода Pinus [7], и для более чем половины из них оптимизированы условия культивирования, обеспечивающие регенерацию из соматических зародышей целых растений. Как правило, в культуре ткани хвойных для индукции соматического эмбриогенеза в качестве первичных эксплантов используются незрелые зародыши, находящиеся на кливажной стадии развития (культура мегагаметофитов) и предсемядольной стадии развития (культура зародышей) [8, 9]. Частота инициации эмбриогенного каллуса у большинства изученных видов рода Pinus оказалась невысокой. У P. taeda она колебалась от 2 до 25% [10], у P. strobus от 52.9 [11] до 76% [9], у P. pinea от 0.5 до 7.2% [12], у P. pinaster в пределах 15% [13]. Выявлено, что инициация эмбриогенного каллуса и образование соматических зародышей у P. strobus [14], P. monticola [15], P. taeda [10], P. sylvestris [16, 17], P. pinea [12] идет под генетическим контролем. Согласно данным [17], использование в опытах по контролируемому опылению (внутривидовая гибридизация) материнских деревьев P. sylvestris, характеризующихся высоким эмбриогенным потенциалом, позволяет значительно повысить частоту инициации эмбриогенного каллуса (ЭК), образования соматических зародышей и растений [17].

Первые результаты по индукции соматического эмбриогенеза из мегагаметофитов и незрелых зиготических зародышей у сосны сибирской нами были получены в 2009 г. [18]. При этом было показано, что инициация каллуса происходила в 58% случаев, и образование соматических зародышей в полученных каллусных культурах носило случайный характер.

Цель настоящей работы состояла в расширенном поиске растений-доноров, зиготические зародыши которых в условиях культуры in vitro могут служить надежным источником для получения эмбриогенной каллусной ткани и соматических зародышей.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили 15 деревьев кедра сибирского (Pinus sibirica Du Tour) из естественного древостоя Западного Саяна (возраст 90135 лет) и клоны кедра сибирского, произрастающие на прививочной плантации Западно-Саянского опытного лесного хозяйства (ОЛХ). Клоновая прививочная плантация располагается на территории ОЛХ Даурского лесничества вблизи поселка Ермаковское (53°16 с.ш. и 92°23 в.д., высота над уровнем моря 300320 м). Плантация занимает площадь 10 га. Каждый клон представлен прививками черенков плюсовых деревьев кедра сибирского (277, 275, 280, 281, 002, 145, 153) из естественного древостоя в Западном Саяне, выделенных Ю.А. Череповским с сотр. (личное сообщение) и состоит из 1215 деревьев (рамет). В качестве подвоя были использованы 4-летние сеянцы дерева 277. 

В 20072011 гг. на семи высокоурожайных 1520-летних клонах (277/22, 275/20, 280/25, 281/26, 002, 145/4, 153/13) проводили опыты по контролируемому опылению. Для опыления клонов собирали пыльцу с двух деревьев-акселератов с однолетним циклом развития женской шишки (деревья 106 и 107) и четырех плюсовых деревьев (492, 277, 357, 2к), характеризующихся стабильно высокой семенной продуктивностью женских шишек и крупными полиэмбриональными семенами [3]. Эти деревья произрастали в естественном древостое Западного Саяна. Возраст деревьев 100110 лет. Со всех опытных деревьев, “отцовских” и “материнских” (клоны), проводили сбор шишек и семян, полученных в результате свободного опыления, а также при контролируемом опылении клонов и их самоопылении. Гибридные семена были получены от 49 вариантов контролируемого опыления. 

Растительный материал. В качестве эксплантов для индукции каллуса использовали незрелые зиготические зародыши, длина которых не превышала 2 мм. В период с 2007 по 2011 г. от каждого дерева, клона, варианта контролируемого опыления в культуру in vitro вводили от 20 до 50 зародышей, которые вычленяли из незрелых семян. Сроки сбора семян приведены в таблице.

Мегагаметофиты извлекали из семян и стерилизовали гипохлоритом натрия или 3% раствором йода в 90% спирте, с последующим трехкратным промыванием в стерильной дистиллированной воде. В стерильных условиях зародыши извлекали из мегагаметофитов, помещали на питательную среду 1/2 нормы LV [19], с добавлением мезоинозита (0.1 г/л), L-глутамина (1.45 г/л), фитогормонов: 2,4-Д (2.0 мг/л) и 6-БАП (1.0 мг/л), сахарозы (30 г/л), а также агара (7 г/л), и культивировали в течение 30 сут. в темноте при 25° ± 1°С. Затем обросшие каллусом зародыши переносили на среду для пролиферации 1/2 нормы LV с пониженными концентрациями гормона 6-БАП (0.5 мг/л) и сахарозы (20 г/л). Культивирование проводили в тех же условиях с интервалом между пересадками 14 сут. Кроме того, в 2011 г. после сбора семена выдерживали в холодильной камере при температуре 02ºС, в течение 12 мес., и в среды для инициации и пролиферации вводили аскорбиновую кислоту в концентрации 300 мг/л.

Цитологический анализ. Идентификацию образования соматических зародышей в полученных каллусных культурах проводили на 3060-е сутки с использованием временных давленых препаратов, окрашенных водным раствором сафранина (2 мг/мл) с добавлением капли метиленового синего. Просмотр образцов осуществляли на микроскопе МИКМЕД-6 (Россия). Измерения клеток и эмбриональных структур проводили при помощи окуляр-микрометра с последующим переводом полученных единиц в микрометры. В каждом образце измеряли по 100150 клеток.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Microsoft Excel 2003. 

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Каллусогенез у зародышей семян, собранных у свободноопыленных (открытое опыление) деревьев из естественного древостоя и деревьев-клонов

 

В 2008 г. в культуру in vitro были введены зиготические зародыши от 15 деревьев, произрастающих в естественном древостое Западного Саяна. Образование каллуса наблюдалось у значительного большинства эксплантов (7580%) в области зародышевого корешка на 48-е сутки культивирования, как у зародышей семян, собранных у деревьев из естественного древостоя, так и деревьев-клонов (рис. 1а). Через 30 сут. культивирования каллусы образовывались по всей длине гипокотиля (рис. 1б). 

После 60 сут. культивирования в каллусах появились некротические образования. У эксплантов трех деревьев: 277, 357 и 358, каллусогенез продолжался в течение 710 мес., у эксплантов других деревьев  в течение 35 мес., после чего каллусы бурели и отмирали. Проводившийся на протяжении всего времени культивирования цитологический анализ не выявил каких-либо эмбриональных структур в каллусе. Каллус состоял из изодиаметрических клеток. Таким образом, у эксплантов из естественного древостоя формировались неэмбриогенные каллусы (рис. 1в). 

В 2010 г. на клоновой плантации урожай шишек практически отсутствовал. Лишь у четырех клонов отмечалось образование шишек, зародыши семян которых были введены в культуру in vitro. Частота инициации каллуса у зародышей клоновых деревьев по сравнению с зародышами деревьев из естественного древостоя уменьшалась до 4357%. После двух пассажей на пролиферационной среде (60 сут. культивирования) каллусы начинали буреть и отмирали в течение 12 мес.

В 2011 г. в культуру in vitro были введены зародыши семян, полученные от свободноопыленных материнских клонов кедра сибирского. Наблюдения за образованием каллусов из эксплантов зародышей показали, что формирование их шло слабо. На стадию пролиферации вышли только 3 из 7 свободноопыленных клонов (277/22, 002 и 153/13). К концу второго пассажа на пролиферационной среде каллусы от свободноопыленных эксплантов некротизировались.

 

Каллусогенез у зародышей гибридных семян, полученных при контролируемом опылении деревьев-клонов

Результаты 2007 г. показали, что частота инициации каллуса у гибридных зародышей, полученных при контролируемом опылении, оказалась высокой (8594%). Наиболее активный рост каллуса наблюдался в варианте контролируемого опыления 002 × 106. Каллусы данного варианта обладали рыхлой структурой, распадались на кусочки и активно пролиферировали. Продолжительность роста каллусов во всех вариантах контролируемого опыления составляла 712 мес., после чего каллусы отмирали. 

В 2011 г. в культуру in vitro были введены зародыши от 18 вариантов контролируемого опыления, опыленных пыльцой двух кедров-акселератов 106 и 107 и пыльцой плюсового дерева 2к, а также самоопыленных клонов.

Наиболее активный рост каллуса наблюдали у клона 153/13, особенно в варианте контролируемого опыления 153/13 × 107 (дерева-акселерата), в варианте 153/13 × 2к, а также у клона 002 в варианте контролируемого опыления 002 × 106. Каллусы данных вариантов приобрели рыхлую структуру, характерную для ЭК. Согласно цитологическому анализу, в данных вариантах контролируемого опыления шло активное образование эмбрионально-суспензорной массы (ЭСМ). Экспланты от самоопыленных клонов, введенные в культуру, характеризовались слабым каллусообразованием. Каллусы остальных пяти самоопыленных клонов некротизировались после первого же пассажа на среде для пролиферации. 

Таким образом, контролируемое опыление клонов кедра сибирского на клоновой прививочной плантации оказало положительное влияние на рост каллусных культур. Наиболее высокие показатели роста каллуса были отмечены в вариантах контролируемого опыления клонов 002 и 153/13, опыленных пыльцой дерева-акселерата и плюсовым деревом 2к.

 

Цитологическое исследование образования каллуса и соматических зародышей

Цитологические исследования показали, что при инициации каллуса в области зародышевого корешка, прилегающего к корневому чехлику (58 сут. культивирования) клетки, первоначальная длина которых составляла 70.0 ± 5.8 мкм, начали увеличиваться в длину (рис. 2а). На 1012-е сутки культивирования каллусообразование шло по всей поверхности гипокотиля. Длина клеток, из которых состоял каллус, составила 300 ± 25 мкм. На 20-е сутки культивирования длина клеток в каллусе увеличилась до 700800 мкм. В удлиненных клетках просматривались дватри ядра, т.е. формировался ценоцит (рис. 2б). Такие клетки мы называли “эмбриональными трубками”. Образовавшийся каллус у кедра сибирского состоял из массы удлиненных клеток и оставался без изменения до конца инициации (30 сут.). При пересадке каллусов на пролиферационную среду у двух клонов 153/13 и 002 (2011 г.), опыленных пыльцой деревьев с однолетним циклом развития (106 и 107) и плюсовым деревом 2к, в эмбриональных трубках одно из ядер смещалось к одному из полюсов и происходило асимметричное деление с образованием эмбриональной инициали и новой эмбриональной трубки (рис. 2в, 2г). В течение последующих 57 сут. клетки эмбриональных инициалей активно делились и формировали эмбриональную глобулу, к дистальному концу которой прилегала одна эмбриональная трубка (рис. 2д, 2е). В эмбриогенном каллусе на 1215-е сутки на пролиферационной среде наблюдалось образование клеточных конгломератов, состоящих из меристематических клеток, составляющих эмбриональные глобулы, и трехчетырех эмбриональных трубок, примыкающих к дистальному концу глобулы (рис. 2ж, 2з). Клетки трубок группировались в “пучки” и образовывали суспензор. Формировалась эмбрионально-суспензорная масса (ЭСМ). Через 1 мес. культивирования на пролиферационной среде происходило вычленение соматических зародышей из ЭСМ (рис. 3).

Следует отметить, что у значительного большинства эксплантов с разными вариантами контролируемого опыления образовавшиеся в каллусе к концу инициации длинные клетки (клетки-трубки) оставались без изменения. При дальнейшем культивировании такие каллусы оставались неэмбриогенными и постепенно отмирали.

Образование ЭСМ и развитие в ней соматических зародышей у кедра сибирского в основном шло так же, как у других видов хвойных [8, 9, 20, 21]. Так, в культуре зиготических зародышей у Larix decidua, L. leptolepis × L. eurolepis инициация соматического эмбриогенеза осуществлялось из клеток суспензора, которые образовывали кластеры меристематических клеток. Из кластеров меристематических клеток создавались меристематические центры, в которых происходило формирование эмбриоидов, а на дистальном конце их шло образование клеток эмбриональных трубок – будущего суспензора [22]. В культуре мегагаметофитов L. decidua было описано растяжение соматических клеток под действием 2,4-Д. В таких клетках наблюдалось смещение клеточных органелл к одному из полюсов, затем происходило асимметричное деление ядер, приводящее первоначально к образованию 4-ядерного ценоцита и далее к образованию четырех маленьких инициальных клеток, которые формировали агрегаты активно делящихся клеток. Клетки, составляющие агрегаты, активно делились и образовывали глобулы эмбриоидов. На дистальном конце глобул возникали удлиненные клетки трубки, а затем суспензоры (суспензоиды) [23]. Эмбриогенный каллус состоял из эмбриональной массы, включающей многочисленные эмбриоиды [23]. 

Модель соматического эмбриогенеза для пролиферирующей эмбриогенной культуры была разработана для Picea abies [21]. Согласно этой модели, соматические зародыши у ели развиваются из проэмбриональной массы, в развитии которой выделяется три стадии: PEM1, PЕМ2, и PЕМ3. На стадии РЕМ1 образовываются клеточные агрегаты, состоящие из компактных клеток с густой цитоплазмой, соединенных с удлиненной вакуолизированной клеткой. РЕМ2 включала аналогичные клеточные агрегаты с несколькими вакуолизированными удлиненными клетками. Стадия РЕМ3 состояла из больших агрегатов клеток с дифференциацией их на слои протодермы и эмбриональных трубок, составляющих суспензор. На стадии РЕМ3 происходило вычленение соматических зародышей из эмбриональной массы [24]. На данной стадии развития соматических зародышей из среды исключались ауксины и цитокинины, и в среду вводили АБК. При этом у зародышей происходило отмирание суспензора в результате программированной клеточной смерти [24].

Формирование ЭСМ и образование соматических зародышей у кедра сибирского укладывалось в схему, предложенную для ели [24]. При инициации соматического эмбриогенеза у незрелых зиготических зародышей кедра сибирского in vitro образование каллуса шло по всей поверхности гипокотиля. 

В литературе неоднократно обсуждались проблемы влияния стадии развития экспланта при введении его в культуру in vitro на развитие эмбриогенного каллуса и образование соматических зародышей [8, 9, 15, 17]. У сосен отклик эксплантов на соматический эмбриогенез был отмечен в культуре зародышей на стадии инициации семядолей и в культуре мегагаметофитов на кливажной стадии развития зародыша. В наших опытах образование каллуса наблюдалось в культуре незрелых зародышей у значительного большинства эксплантов, полученных от 64 вариантов: деревьев из естественного древостоя и клоновой прививочной плантации в результате свободного и контролируемого опыления, как на стадии инициации семядолей, так и на стадии развитого семядольного кольца. Однако эмбриогенный каллус, в котором происходило асимметричное деление клеток и развитие ЭСМ, получили только на стадии инициации семядолей у двух клонов (002 и 153/13), опыленных пыльцой деревьев-акселератов с однолетним циклом развития женских шишек и высокопродуктивного дерева из естественного древостоя (2к). В образовавшихся каллусах происходило формирование пролиферирующей ЭСМ. 

Исследования, проведенные у P. sylvestris [16, 17] и P. taeda [10] показали, что зародыши семян только единичных деревьев-доноров оказались способными образовывать эмбриогенный каллус и соматические зародыши [9, 17]. В опытах по контролируемому опылению P. sylvestris [16, 17], где в качестве родительских особей были использованы материнские и отцовские деревья с разным откликом их эксплантов на соматический эмбриогенез, было показано влияние материнского генотипа на индукцию соматического эмбриогенеза. Эмбриогенные линии и соматический эмбриогенез были получены только у деревьев, используемых в контролируемом опылении, как материнские.

Можно предположить, что успешность соматического эмбриогенеза у кедра сибирского, прежде всего, обусловлена генотипом донорского дерева (в данном случае клона). Вместе с тем, использование пыльцы деревьев с однолетним циклом развития женских шишек, в контролируемом опылении клонов 002 и 153/13 стимулировало получение эмбриогенных каллусов в культуре in vitro. Вероятно, у кедра сибирского получение эмбриогенного каллуса обусловлено как генотипом материнского дерева (клона), так и деревом-опылителем. 

Таким образом, в результате культивирования кедра сибирского в культуре in vitro впервые были получены эмбриогенный каллус и соматические зародыши из незрелых половых зародышей гибридных семян, опыленных пыльцой кедров-акселератов с однолетним циклом развития. Успех получения соматических зародышей был связан с генотипом клона. Не исключено, что такими генотипами являются деревья с высоким репродуктивным потенциалом. При этом наиболее перспективным направлением является проведение работ по гибридизации с использованием пыльцы кедров-акселератов с однолетним циклом развития женских шишек. Работы по введению гибридных зародышей в культуру in vitro, получение из них эмбриогенного каллуса, соматических зародышей и растений-регенерантов будут способствовать получению высокопродуктивных чистых линий сосны сибирской, из которых будут получены сеянцы для создания орехоплодных плантаций данного вида.                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                         Работа поддержана грантом РФФИ № 11-04-00281-а и грантом р-Сибирь-а,  № 13-04-98045.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Ирошников А.И. Полиморфизм популяции кедра сибирского // Изменчивость древесных растений Сибири / Под ред. Мининой Е.Г., Ирошникова А.И. Красноярск, 1974. С. 77–103.

2.Минина Е.Г., Ларионова Н.А. Морфогенез и проявление пола у хвойных. Москва: Наука, 1979. 216 с.

3.Третьякова И.Н. Эмбриология хвойных: физиологические аспекты. Новосибирск, Наука, 1990. 157 с.

4.Третьякова И.Н., Новоселова Н.В., Череповский Ю.А. Особенности эмбрионального развития у кедра сибирского (Pinus sibirica Du Tour) с однолетним циклом развития женской шишки в горах Западного Саяна // Физиология растений. 2004. Т. 51. С. 134–141.

5.Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. Москва: Наука, 1964. 146 с.

6.Hakman I., Fowke L.C., von Arnold S., Eriksson T. The development of somatic embryos in tissue cultures initiated from immature embryos of Picea abies (Norway spruce) // Plant Sci. 1985. V. 38. P. 5359.

7.Pullman G.S., Bucalo K. Pine somatic embryogenesis using zygotic embryos as explants // Plant Embryo Cultures: Methods in Molecular Biology / Trevor A. Thorpe, Edward C. Yeung. 2011. V. 710. P. 267–291.

8.Lelu M.-A., Klimaszewska K., Charest P.J. Somatic embryogenesis from immature and mature zygotic embryos and from cotyledons and needles of somatic plantlets of Larix // Can. J. For. Res. 1994. V. 24. P. 100–106.

9.Klimaszewska K., Park Y.-S., Overton C., McEacheron I., Bonga J.M. Optimized somatic embryogenesis in Pinus strobus L. // In Vitro Cell Dev. Biol.Plant. 2001. V. 37. P. 392–399.

10.MacKay J.J., Becwar M.R., Park Y.-S., Corderro J.P., Pullman G.S. Genetic control of somatic embryogenesis initiation in loblolly pine and implications for breeding // Tree Genet. Genom. 2006. V. 2. P. 1–9.

11.Finer J.J., Kriebel H.B., Becwar M.R. Initiation of embryogenic callus and suspension cultures of eastern white pine (Pinus strobus L.) // Plant Cell Rep. 1989. V. 8. P. 203–206.

12.Carneros E., Celestino C., Klimaszewska K., Park Y.-S., Toribio M., Bonga J.M. Plant regeneration in stone pine (Pinus pinea L.) by somatic embryogenesis // Plant Cell, Tissue Organ Cult. 2009. V. 98. P. 165–178.

13.Bercetche J., Páques M. Somatic embryogenesis in maritime pine (Pinus pinaster). Somatic embryogenesis in woody plants // For. Sci. 1995. V. 44-46. P. 221–242.

14.Garin E., Isabel N., Plourde A. Screening of large numbers of seed families of Pinus strobus L. for somatic embryogenesis from immature and mature zygotic embryos // Plant Cell Rep. 1998. V. 18. P. 37–43.

15.Percy R.E., Klimaszewska K., Cyr D.R. Evaluation of somatic embryogenesis for clonal propagation of Western white pine // Can. J. For. Res. 2000. V. 30. P. 1867–1876.

16.Niskanen A.-M., Lu J., Seitz S., Keinonen K., von Weissenberg K., Pappinen A. Effect of parent genotype on somatic embryogenesis in Scots pine (Pinus sylvestris) // Tree Physiol. 2004. V. 24. P. 1259–1265.

17.Lelu-Walter M.-A., Bernier-Cardou M., Klimaszewska K. Clonal plant production from self- and cross-pollinated seed families of Pinus sylvestris (L.) through somatic embryogenesis // Plant Cell, Tissue Organ Cult. 2008. V. 92. P. 31–45.

18.Третьякова И.Н., Ижболдина М.С. Индукция соматического эмбриогенеза у кедра сибирского // Лесоведение. 2009. Т. 5. С. 4349.

19.Litvay J.D., Verma D.C., Johnson M.A. Influence of Loblolly pine (Pinus taeda L.) Culture medium and its components on growth somatic embryogenesis of the wild carrot (Daucus carota L.) // Plant Cell Rep. 1985. V. 4. P. 325328.

20.Singh H. Embryology of Gymnosperms. Berlin: Gebruder Borntraeger. 1978. 302 p.

21.Stasolla C., Yeung E.C. Recent advances in conifer somatic embryogenesis: improving somatic embryo quality // Plant Cell, Tissue Organ Cult. 2003. V. 74. P. 1535. 

22.Von Aderkas P., Bonga J., Klimaszewska K., Owens J. Comparison of larch embryogeny in vivo and in vitro // Woody Plant Biotechnol. 1992. V. 210. P. 139155. 

23.Von Aderkas P., Bonga J.M. Formation of haploid embryoids of Larix decidua: early embryogenesis // Am. J. Bot. 1988. V. 75. P. 690700. 

24.Filonova L.H., Bozhkov P.V., von Arnold S. Developmental pathway of somatic embryogenesis in Picea abies as revealed by time-lapse tracking // J. Exp. Bot. 2000. V. 51. P. 249264. 

 

Сроки сбора семян и характеристика их состояния

 

 

Подписи к рисункам

 

Рис. 1. Образование каллуса из эксплантов зародышей семян Pinus sibirica на среде 1/2 LV. 

а  индукция каллуса в области зародышевого корешка (58 сут. культивирования), б – эмбриогенный каллус (30 сут. культивирования), в – неэмбриогенный каллус (30 сут. культивирования).

 

Рис. 2. Формирование соматических зародышей. 

а – начало удлинения соматических клеток (58 сут. культивирования); б – удлиненные клетки на 20-е сутки культивирования, формирование ценоцита (стрелками указаны ядра ценоцитов); в – смещение одного из ядер “эмбриональной трубки” (ЭТ) к одному из полюсов (стрелками указаны ядра); г – образование эмбриональной инициали (ЭИ) и “эмбриональной трубки”; д, е – образование эмбриональной глобулы (ЭГ) и эмбриональной трубки на дистальном конце; ж – формирование эмбриональной глобулы и нескольких эмбриональных трубок; з – глобула соматического зародыша с эмбриональными трубками; и - торпедообразные соматические зародыши (60 сут. культивирования).