удк 581.1

ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ ЦИКЛОГЕКСИМИДА

НА КОРНИ ГОРОХА

© 2015 г. И. А. Тарчевский, А. М. Егорова

Федеральное государственное учреждение науки Казанский институт биохимии

и биофизики Казанского научного центра РАН, Казань

Поступила в редакцию 12.03.2015 г.

Проведен протеомный анализ влияния 72-часовой обработки корней проростков гороха (Pisum sativum L., сорт Труженик) 10 мкМ раствором циклогексимида (ЦГ). Обнаружено, что ЦГ вызывал снижение содержания 33 белков. Неожиданным было повышение содержания 29 белков. Возможно, что это впервые установленный факт не только ингибирования, но и активации накопления белков у эукариотических клеток под влиянием ЦГ. Поскольку бóльшая часть идентифицированных ГЦ-индуцированных белков – это ферменты синтеза фитоалексинов и лигнина, то наши исследования позволили выявить новый феномен ЦГ, а именно: накопление ферментов, участвующих в фенилпропаноидном антипатогенном защитном метаболизме. Механизм этого необычного феномена неизвестен и его выяснение является задачей будущих исследований.

 

Ключевые слова: Pisum sativum – циклогексимид – протеомы – фитоалексины – лигнин

____________________

Сокращения: ЦГ – циклогексимид; СК – салициловая кислота.

Адрес для корреспонденции: Тарчевский Игорь Анатольевич. 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31. Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН. Факс: (843) 292-73-47; электронная почта: tarchevsky@kibb.knc.ru

Введение

При ранее проведенном протеомном анализе влияния салициловой кислоты (СК) на растения мы выявили целый ряд салицилат-зависимых белков [1, 2], содержание которых или повышается, или снижается после обработки корней СК в различных концентрациях как одним из ключевых факторов фитоиммунитета. При этом чаще всего не учитывается, что изменение содержания этих белков зависит как от синтеза, так и от протеолиза. При использовании в качестве субстратов синтеза белков 14С-аминокислот мы показали, что бóльшая часть метки включается в салицилат-индуцируемые белки [3], что свидетельствовало об основном вкладе в их содержание процессов синтеза, а не ингибирования протеолиза. Другой подход к решению этой задачи – подавление синтеза белков при помощи ингибиторов трансляции. Так как большинство салицилат-индуцируемых белков кодируется ядерными генами и синтезируется рибосомами цитоплазмы, то мы решили выяснить при помощи протеомного анализа, как влияет на содержание белков растений циклогексимид (ЦГ) – ингибитор синтеза белков в 80S рибосомах. Эта задача представлялась актуальной еще и в связи с тем, что по имеющейся у нас информации, до сих пор не проводилось сравнительного анализа протеомов, основанного на 2D-электрофоретическом разделении белков, выделенных из органов интактных растительных и животных объектов, обработанных ЦГ.

Имеются лишь данные, полученные при помощи одномерного электрофоретического разделения белков в денатурирующих условиях, указывающие на отсутствие влияния ЦГ на окраску одних белковых полос и ослаблении окраски других полос [4].

В качестве объекта исследований мы использовали корни гороха, так как ранее на них в основном проводили протеомный анализ влияния СК. Кроме того, в корнях отсутствуют хлоропласты, протеом которых мог усложнить картину ответа совокупности белков на действие ЦГ.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Обработка растений. Семена гороха (Pisum sativum L., сорт Труженик) стерилизовали в течение 20 мин в растворе перманганата калия, после этого промывали дистиллированной водой и проращивали на влажной фильтровальной бумаге в темноте в течение 3 суток. Затем проростки помещали на 5 суток на 1/4 нормы питательной среды Хогланда–Арнона при 25°C и освещении люминесцентными лампами при 16-часовом световом периоде. В опытных вариантах корни 8-суточных проростков погружали на 72 ч в среду, содержавшую циклогексимид (ЦГ, 10 мкМ). Контролем служили проростки, растущие на среде Хогланда–Арнона. Выбор экспозиции (72 ч) обусловлен тем, что в ходе наших предшествующих опытов с корнями гороха было показано, что при меньших экспозициях недостаточно полно обнаруживается влияние различных соединений на содержание многих белков. Более длительные экспозиции могут привести к побочным эффектам, особенно в случае ЦГ, который, как известно, способен оказывать воздействие (вторичное) на различные физиологически процессы.

При выборе концентрации ингибитора (10 мкМ) мы учитывали полученную ранее информацию о том, что такая концентрация ЦГ вызывала относительно небольшое снижение интенсивности синтеза белков, в то время как более высокие концентрации (40–70 мкМ) приводили к существенному подавлению (на 65–90%) включения меченых аминокислот в белки [4, 5].

Через 3 суток корни отрезали и фиксировали жидким азотом.

Экстракция растворимых белков. Для выделения растворимых белков навески корней весом 1 г растирали в жидком азоте в порошок. Экстракцию растворимых белков проводили с использованием буфера 25 мМ Трис–HCl, pH 8.0, c добавлением 100 мМ ДТТ, 1 мМ ЭДТА, 1% коктейля ингибиторов протеаз при 4ºС. Полученный гомогенат центрифугировали 20 мин при 14 000 g. Супернатант отбирали и приливали к нему равный объем ледяного раствора 20% ТХУ в ацетоне с добавлением 100 мМ ДТТ. Осаждение белков проводили в холодильнике при –20ºС, после чего образцы центрифугировали 20 мин при 14 000 g. Полученный осадок промывали четыре раза холодным ацетоном с 50 мМ ДТТ, высушивали на воздухе и хранили при –85ºС. Для растворения белков использовали буфер, содержавший 6 М мочевины, 2 М тиомочевины, 50 мМ ДТТ, 2% Тритон Х-100, 2% CHAPS, 0.5% Bio-Lyte, pH 3–10 (“Bio-Rad”, США). Осадок растворяли при периодическом перемешивании в течение 2 ч, затем раствор центрифугировали 20 мин при 14 000 g. Надосадочный раствор собирали и использовали для определения содержания белка.

Количественное определение белка. Пробы объемом 5 мкл разбавляли водой и использовали для определения белка по методике, прилагающейся к коммерческому реактиву Bradford (“Bio-Rad”). В качестве стандарта использовали БСА.

Двумерный электрофорез белков. 2D-электрофорез проводили на приборе Protean IEF Cell, Protean II xi 2-D Cell (“Bio-Rad”) с использованием стрипов длиной 17 см с линейным градиентом pH 4–7 (“Bio-Rad”). Для нанесения на стрипы для изоэлектрофокусирования (ИЭФ) белки растворяли в буфере, содержавшем 6 М мочевину, 2 М тиомочевину, 4% CHAPS, 50 мМ ДТТ и 0.5% Bio-Lyte, pH 3–10 (“Bio-Rad”) и следы бромфенолового синего. Пробы для нанесения на стрипы содержали равное количество белка (550 мкг).

На первом этапе проводили активную регидратацию стрипов при 50 В в течение 12 ч. Затем обессоливали образцы при 250 В в течение 15 мин, после чего линейно повышали напряжение до 10 000 В за 5 ч, далее проводили собственно ИЭФ до 60 000 вольт-часов. Перед началом разделения белков во втором направлении стрипы уравновешивали 15 мин в буфере, содержавшем 0.125 М Трис–HCl, 2% ДДС, 2% ДТТ, 30% глицерин, 6 М мочевину и следы бромфенолового синего, затем выдерживали 15 мин в буфере, который содержал вместо ДТТ 2.5% йодацетамида. Разделение белков по молекулярным массам проводили в 12.5% ДДС-ПАГЭ (40 мА на 1 гель) [6]. Пластины геля окрашивали Кумасси G-250 с 2% ТХУ, что позволяло количественно оценить содержание белков.

Полученные гели сканировали в сканере EPSON 4990 Photo, и изображения гелей обрабатывали при помощи программы PDQuest (“Bio-Rad”). Для анализа использовали по три повторности каждого варианта. Достоверность полученных данных оценивали по t-критерию Стьюдента при p ≤ 0.05. Для идентификации выбирали пятна белков, содержание которых в опытном варианте изменялось в два раза (в большую или меньшую сторону) по сравнению с контролем. Пятна интересующих нас белков вырезали вручную и проводили трипсинолиз.

Трипсинолиз белков и их идентификация. Вырезанные кусочки геля, содержащие белки, промывали водой. Затем их промывали смесью ацетонитрила с 200 мМ гидрокарбоната аммония в соотношении 1 : 1 при 56ºC для удаления краски. После полного обесцвечивания кусочков геля проводили их дегидратацию при помощи 100% ацетонитрила. Надгелевый раствор убирали, и высушивали кусочки геля на воздухе, после чего приливали к ним раствор модифицированного трипсина (“Promega”, США) с концентрацией 10 мкг/мл в 50 мМ гидрокарбонате аммония и инкубировали в течение 1 ч при 4ºС, чтобы раствор трипсина вошел в гель. Для предотвращения высыхания кусочков гелей при трипсинолизе к пробам добавляли 50 мМ раствор гидрокарбоната аммония. Реакцию трипсинолиза проводили в течение ночи при 37ºС. Для экстракции пептидов к пробам добавляли смесь ацетонитрила с 5% муравьиной кислотой в соотношении 2 : 1 и выдерживали при перемешивании 1 ч. Надгелевый раствор использовали для идентификации белков.

Масс-спектры получали в ESI-Q-TOF масс-спектрометре MicrOTOF-Q (“Bruker Daltonics”, Германия) в режиме наноспрея, с предварительным разделением 2 мкл полученной смеси пептидов в хроматографе Ultimate 3000 (“Dionex”, Нидерланды). Образец обессоливали на предколонке в течение 3 мин в фазе А, которая состояла из 5% ацетонитрила и 95% воды с добавлением 0.1% муравьиной кислоты. Затем образец загружали на основную колонку C18 PepMap 100, 3 мкм, 100 Å, с внутренним диаметром 75 мкм и длиной 15 cм (“Dionex”). Разделение пептидов происходило в градиенте ацетонитрила (фаза В: 5% воды, 95% ацетонитрила с добавлением 0.1% муравьиной кислоты) по следующей программе: 0% В 3 мин, 50% В 40 мин, 90% В – 5 мин, 90% В – 5 мин, 0% В – 3 мин, 0% В – 12 мин; со скоростью потока 300 нл/мин. Спектры снимали в положительном режиме ионизации в диапазоне 50–3000 m/z, обрабатывали при помощи программы DataAnalisys 3.4 (“Bruker Daltonics”). Идентификацию белков осуществляли при помощи программы Mascot (www.matrixscience.com). Поиск возможных претендентов проводили по базе данных NCBInr и SwissProt, с указанием подбазы “Зеленые растения”.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

Проведенная в предварительных опытах обработка корней растений гороха ЦГ (10 мкМ) не привела к достоверному изменению общего содержания в них растворимых белков [7].

Протеомный анализ влияния ЦГ на корни гороха (рис. 1, табл. 1 и 2) позволил разделить растворимые белки на три категории. К первой относится большинство выявленных с помощью двумерного электрофореза белков, на содержание которых ЦГ не оказал влияния, что свидетельствует о достаточно медленном их обороте. В этом случае даже ингибирование их синтеза не могло существенно отразиться на их содержании.

Ко второй категории принадлежат белки с относительно высокой скоростью оборота, у которых ингибирование синтеза приводит к снижению содержания (табл. 1) в связи с продолжающимся функционированием протеаз (в дальнейшем обозначаем эти белки как ЦГ-супрессируемые). Обращает на себя внимание, что для большинства белков этой группы характерно их участие в фолдинге и модификации белков-мишеней. К третьей категории относятся белки, у которых ЦГ вызвал повышение содержания (в дальнейшем  ЦГ-индуцируемые белки).

 

ЦГ-супрессируемые белки

Было выявлено 33 белка, у которых ЦГ вызвал ожидаемое снижение содержания. Мы идентифицировали бóльшую часть этих белков (табл. 1) и подразделили их на три группы: участвующие в олигомеризации и метаболизме белков, в защитных реакциях растений и в энергетическом обмене. Ниже дается краткое описание их функций, основанное на данных, известных из литературы.

 

Белки, участвующие в олигомеризации и метаболизме белков

Ядерный антиген пролиферирующих клеток (№ 0306) – платформенный комплексообразующий ядерный белок, участвующий в дупликации и репарации ДНК.

Четыре изоформы 14-3-3 белков (№№ 0216, 0217, 0223, 0226) и 14-3-3-подобный белок (№ 1203) являются адапторными белками, которые связываются со своими белками-мишенями и модулируют их функции [8]. Известно, что 14-3-3 белки принимают участие в элиситируемых патогенами сигнальных путях, связываясь с белковыми сигнальными медиаторами и влияя на их активность.

Шаперон 70 (Hsp70) (№ 4907) участвует в фолдинге синтезируемых белков, в кооперации с другими белками – в транспорте белков в компартменты клеток, в связывании денатурированных белков, способствуя их последующей деградации.

Шаперонин 60 (Hsp60, α-субъединица) (№ 0605) – белок, участвующий в фолдинге митохондриальных и пластидных белков. Обнаружено, что в митохондриях Hsp60 связывается с α-субъединицей АТФазы.

Тиоредоксин (№ 6001) способен вызывать образование олигомерных белковых комплексов и их деградацию, катализируя тиол-дисульфидные переходы.

Дисульфидизомераза (№ 0801) – белок ЭПР, участвующий в образовании “правильных” дисульфидных связей во вновь синтезируемых белках, образующихся с помощью рибосом шероховатого ретикулума и предназначаемых для секреции.

70 кД пептидил-пролилизомераза (№ 3705) участвует в фолдинге белков и катализирует cis/trans-изомеризацию пролил-имидных связей в полипептидных цепях.

 

Участники защитных реакций против патогенов

АБК-отвечающий (ABR17) белок (№ 2004) участвует в стресс-устойчивости, а для ряда форм ABR17 характерна РНКазная активность.

Белок PHAVU (от Phaseolus vulgaris) (№ 4301) относится к защитным белкам, проявляющим хитиназную активность.

S-аденозил-L-метионинсинтаза (№ 5507) катализирует образование S-аденозил-L-метионина – донора метильных групп для различных субстратов (нуклеиновых кислот, белков, участников защитного фенилпропаноидного метаболизма и др.).

S-аденозил-L-метионин:салицилат-карбоксил-метилтрансфераза (№ 3501) катализирует синтез из СК ее транспортного метилового эфира, обеспечивающего появление системного иммунитета в участках растений, удаленных от места инфицирования патогенами.

Изофлавон-редуктаза-подобный белок (№ 7302) участвует в образовании изофлавоновой группы антипатогенных соединений – фитоалексинов.

 

Участники энергетического метаболизма

Митохондриальная сукцинил-КоА-лигаза (№ 3409) является ферментом цикла трикарбоновых кислот.

Митохондриальная АТФ-синтаза (δ-субъединица) (№ 1103) является частью АТФ-синтазного комплекса внутренней мембраны митохондрий, принимающего участие в сопряжении электронного транспорта и образования АТФ.

Короткоцепочечная алкогольдегидрогеназа А (№ 3205) принадлежит к семейству НАД(Ф)·Н-зависимых оксидоредуктаз.

Пирофосфатаза неорганическая (№ 3201) обеспечивает деградацию пирофосфата, образующегося в ходе важнейших анаболических процессов (например, при образовании аа-тРНК), что необходимо для последующего синтеза АТФ из АДФ и фосфата.

 

ЦГ-индуцируемые белки

Если снижение содержания многих белков под влиянием ингибитора трансляции на 80S рибосомах было вполне ожидаемым явлением, то обнаруженное при помощи протеомного анализа повышение содержания 29 белков можно считать крайне неожиданным. Мы подразделили эти белки на две группы (табл. 2): белки, участвующие в фенилпропаноидном антипатогенном метаболизме, и белки, участвующие в фолдинге и метаболизме белков.

 

Участники фенилпропаноидного метаболизма

Особый интерес вызывает факт повышения под влиянием ЦГ главным образом содержания белков, в той или иной степени связанных с фенилпропаноидным метаболизмом (рис. 2).

От активности локализованного в цитоплазме фермента 6-фосфоглюконат дегидрогеназы (№ 7505) окислительного пентозо-фосфатного цикла зависит образование рибозо-5-фосфата и эритрозо-4-фосфата, используемых для синтеза предшественников фенилаланина и из него – нескольких ветвей метаболизма, от которых зависит образование различных защитных соединений.

Глутаминсинтаза (№ 7422) является не только ключевым ферментом азотного метаболизма, участвующим в ремобилизации азота при деградации белков, но и связана с фенилпропаноидным метаболизмом и синтезом лигнина [9]. Были обнаружены не только структурная кооперация глютаминсинтетазы и фенилаланин-аммиак-лиазы [10], но и сходство промоторных участков генов этих ферментов [11] и их коэкспрессия [12], что предполагает общий тип регуляции ассимиляции азота и фенилпропаноидного метаболизма. Возможно, это связано с ЦГ-зависимой активацией фактора транскрипции MYB, который, как это было установлено [13], принимает участие в регуляции биосинтеза флавоноидов.

Обращает на себя внимание повышение содержания двух изоформ S-аденозилметионинсинтазы (метионин-аденозилтрансферазы) (№№ 6506, 7507) и трех изоформ S-аденозилметионин синтазоподобного белка (№№ 5505, 5510, 6507), катализирующих образование S-аденозилметионина – донора метильных групп не только для ДНК и белков, но и для промежуточные продуктов, участвующих в синтезе лигнина и фитоалексинов с помощью идентифицированной нами S-аденозилметионин-зависимой метилтрансферазы (№ 6204) (табл. 2). Одна из изоформ S-аденозилметионинсинтазы обнаруживала свойства ЦГ-супрессируемых (табл. 1), что, по-видимому, можно объяснить спецификой ее функционирования в различных компартментах клеток и в клетках различных тканей корня.

Кофеоил-КоА-метилтрансфераза (№ 2208) относится к ферментам той ветви фенилпропаноидного метаболизма, которая завершается синтезом полифенольного полимера лигнина, играющего важную роль в формировании устойчивых к действию патогенов клеточных стенок растений. При инфицировании растений патогенными микроорганизмами наблюдали индукцию ферментов синтеза лигнина (в том числе кофеил-КоА-метилтрансферазы) и лигнификацию клеточных стенок [14].

Целый ряд идентифицированных нами ферментов принимает участие в той ветви фенилпропаноидного метаболизма, которая завершается синтезом относящихся к полифенольным соединениям антиоксидантных флавоноидов, изофлавоноидов и антипатогенных фитоалексинов. К этим ферментам относятся халкон-флавонизомераза (№ 5104), две изорформы изофлавонредуктазы (№№ 5301, 6305), софоролредуктаза (№ 5402) и белок Hsr203J (№ 7405), имеющий значительное сходство структуры с ферментами изофлавононового метаболизма и считающийся маркерным белком сверхчувствительного ответа растений на инфицирование патогенами.

Сверхэкспрессия этих ферментов в трансгенных растениях приводила к накоплению различных флавонов, а у мутантов с пониженной активностью того или иного фермента этой группы наблюдали обратный эффект.

Для объяснения сходного ответа этих ферментов на ЦГ можно привлечь гипотезу, в соответствии с которой гены, кодирующие основные ферменты фенилпропаноидного метаболизма, образуют кластер, регулируемый с помощью единого механизма [10, 11, 15, 16]. Возможно, что регуляторами такого кластера генов являются транскрипционные факторы семейства MYB, способные активировать экспрессию белков, участвующих в синтезе фенилпропаноидов, флавоноидов, антоцианинов и лигнина [15, 16]. Проявлением функционирования такого кластера может быть патоген-индуцируемая однотипная индукция генов фенилаланин-аммиак-лиазы и белка Hsr203J [15, 16].

Необходимо отметить, что в отличие от ЦГ-индуцируемых двух изоформ изофлавонредуктаз (табл. 2) нами был также обнаружен ЦГ-супрессируемый изофлавон-редуктаза-подобный белок (табл. 1), что, по всей вероятности, связано с отличием осуществляемых ими функций или принадлежностью к различным тканям корней.

К защитным белкам должна быть причислена и не относящаяся к фенилпропаноидному метаболизму изопентенил-пирофосфатизомераза (№ 3208), участвующая в биосинтезе антипатогенных стеролов и терпеноидов, которые обладают детергентными свойствами и способны нарушать функционирование клеточных мембран патогенов.

В связи с тем, что ЦГ вызвал повышение содержания главным образом тех белков, которые участвуют в синтезе антипатогенных соединений, можно высказать предположение, что корни гороха способны воспринимать ЦГ как сигнал об атаке почвенных патогенов.

 

Белки, участвующие в фолдинге и метаболизме белков

Митохондриальный шаперон Нsр70 (№ 5701) – это ключевой, кодируемый ядерными генами фермент, участвующий в импорте и фолдинге митохондриальных белков. От связи с Нsр70 белками зависит “правильный” фолдинг образуемых при помощи цитозольных 80S рибосом белков, что защищает их от агрегации и позволяет транспортироваться через мембраны внутрь митохондрий.

β-субъединица шаперонина 60 (№ 4607) отличается от ЦГ-супрессируемой α-субъединицы (табл. 1) специфической способностью к олигомеризации и связыванию с другими белками, а также участием в транспорте новообразованных белков в митохондрии.

Протеасомная β-субъединица (№ 4104) является компонентом протеасом, как известно, локализованных в цитозоле и ядрах. Интересно, что протеасомы могут образовывать комплексы с рибосомами [17], что облегчает связывание и деградацию белков с нарушенной структурой, появляющейся в результате ошибок при трансляции и фолдинге.

Пролин-иминопептидазный белок (№ 6402) относится к аминопептидазам, катализирующим гидролиз пептидных связей на N-конце белков. Пролин-иминопептидазы характеризуются высокой субстратной специфичностью к остаткам пролина N-концевых последовательностей белков.

Возможно, что повышение содержания двух последних активаторов протеолиза связано с появлением в клетках белков с нарушенной структурой, вызванным снижением содержания тех участников белкового метаболизма (табл. 1), от которых зависит поддержание нативной структуры образующихся белков.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные в настоящей работе данные показывают, что более половины идентифицированных нами ЦГ-супрессируемых белков принимает участие в белковом метаболизме – в модификации, фолдинге и транспорте белков, а также в построении гетероолигомерных белковых комплексов. Это свидетельствует об их относительно малом времени жизни, что характерно для оперативных регуляторов метаболизма.

Как уже отмечалось выше, наиболее важным и неожиданным результатом наших исследований является вызванное ЦГ повышение содержания белков, участвующих главным образом в антипатогенных реакциях. Механизм повышения содержания этих белков остается неизвестным, но можно предположить несколько возможных причин обнаруженного эффекта ЦГ.

  1. В разнонаправленный ответ белков на действие ЦГ может вносить вклад специфика чувствительности различных тканей корня к ЦГ. Известно, например, что ткани различных видов растений обладают разной чувствительностью к ЦГ, в отличие от извлеченных из них рибосом [18]. По всей вероятности, делящиеся клетки корня более чувствительны к действию ЦГ, чем клетки проводящих пучков, где, как известно, сосредоточена значительная масса лигнина. Разницей в чувствительности тканей корней к ЦГ можно объяснить, например, факт снижения в корнях одних видов защитных белков и повышения других, а также разнонаправленное действие ЦГ на изоформы одного и того же белка (например, S-аденозил-метионинсинтазы).
  1. Накопление аминокислот под влиянием ЦГ [19] при подавлении синтеза одной группы белков могло приводить к субстратной активации синтеза части белков рибосомами, еще не успевшими по какой-то причине инактивироваться. Эта причина представляется маловероятной из-за ярко выраженной антипатогенной специфичности ЦГ-активируемого повышения содержания этих белков.
  1. Еще одной причиной вызванного ЦГ повышения содержания белков может быть ингибирование синтеза специфических протеаз. В результате замедляется или даже прекращается деградация их белков-мишеней, что при условии еще продолжающегося синтеза приводит к повышению их содержания, в результате чего эти белки попадают в категорию “ЦГ-индуцируемых”.
  1. Наиболее интригующей причиной можно считать существование ЦГ-активируемой сигнальной системы, включающей непосредственное узнавание ЦГ неизвестным рецепторным белком, передачу сигнала к факторам транскрипции, экспрессию генов защитных белков, транспорт образовавшихся мРНК в цитозоль и синтез белков, еще не заблокированных ЦГ рибосомами, участвующих в антипатогенных реакциях.

Необходимо учитывать, что антибиотик ЦГ в природных условиях образуется почвенными бактериями Streptomyces griseum. Бактерии рода Streptomyces являются главным образом фитопатогенами, способными продуцировать разнообразные антибиотики [20]. Мы не исключаем, что в ходе эволюции взаимоотношений с почвенными фитопатогенными бактериями рода Streptomyces корни растений выработали механизм, посредством которого осуществляется узнавание продуцируемых этими бактериями ЦГ, в результате чего “включаются” сигнальные пути, приводящие к образованию защитных соединений.

Ранее уже высказывалось предположение о возможности существования нерибосомного рецептора ЦГ [21]. Обнаружено, что влияние ЦГ на интенсивность деления клеток начинает проявляться при меньших концентрациях, чем ингибирование трансляции. Это привело автора к предположению, что первый показатель зависит от рецептора с бóльшим сродством с ЦГ, чем рибосомный. Насколько нам известно, исследования в этом направлении не получили продолжения.

5. Повышение содержания свободных аминокислот, вызванное уменьшением их использования при начинающемся ингибировании синтеза белков рибосомами цитозоля, также могло быть одной из причин обнаружения ЦГ-индуцируемых белков. В этом случае могла “включаться” глутаматная сигнализация [22, 23], предполагающая возможность выведения накапливающейся глутаминовой кислоты за пределы клеточной мембраны и ее узнавания мембранным рецептором, что сопровождается открыванием связанной с рецептором кальциевой поры и повышением содержания ионов кальция в цитозоле. Известно, что последнее может привести к лигнификации сосудов ксилемы и лигнификации вторичных клеточных стенок сосудов флоэмы [24].

6. В индукцию ЦГ ряда белков может вносить вклад обнаруженное многими авторами вызываемое ЦГ существенное повышение содержания транскриптов ядерных генов [25, 26], в том числе транскриптов, кодирующих белки, принимающие участие в функционировании защитной флавоноидной ветви фенилпропаноидного метаболизма. Повышение содержания транскриптов могло привести к усилению синтеза антипатогенных белков, еще не заблокированными ЦГ рибосомами. Причиной накопления транскриптов могло быть вызванное ЦГ ингибирование синтеза “короткоживущих” репрессоров транскрипции. Против этого свидетельствуют данные о повышении содержания транскриптов под влиянием ЦГ еще до подавления трансляции, что не предполагает ингибирования репрессора транскрипции [27]. Необходимо отметить, что ЦГ способен не только активировать образование транскриптов, но и ингибировать некоторых из них. Например, ЦГ повышал содержание большинства салицилат-индуцируемых транскриптов, но полностью блокировал салицилат-индуцируемую индукцию мРНК, кодирующую защитный белок PR1 [28].

7. Еще одной причиной избирательного отношения и чувствительности рибосом к ЦГ может быть посттрансляционная модификация определенных белков рибосом [17, 29], например, их фосфорилирование и метилирование, что может регулировать не только эффективность их функционирования, но и ответ на действие ЦГ.

8. Наконец, причиной антипатогенного феномена ЦГ могут быть различия в степени чувствительности к ЦГ у разных представителей популяции 80S рибосом in vivo, обусловленные их способностью к ассоциации с различными внерибосомными белками. Возможно, что в результате такой ассоциации может изменяться чувствительность рибосом к ЦГ и степень прекращения процесса трансляции. В последние годы особое внимание привлекает взаимодействующий с 80S рибосомами (с их 40S субъединицами) консервативный платформенный белок RACK1 (от Receptor for Activated C Kinase) [17, 30], обнаруженный у всех эукариотических организмов. У растений идентифицировано более 100 белков, которые способные связываться с RACK1 [31-34]. Эти белки вовлечены в трансляцию в ответ на фитогормоны и на патогены. Предполагается, что эти белки способны при помощи посреднической функции RACK1 осуществлять тонкую регуляцию процессов трансляции. Не исключено, что этот механизм способен регулировать и чувствительность 80S рибосом к ЦГ. Обнаружена также ассоциация рибосом с малыми РНК (sRNA), влияющая на степень чувствительности рибосом к ЦГ [35].

В настоящее время трудно отдать предпочтение какой-нибудь из перечисленных выше гипотез, объясняющих механизм повышения под влиянием ЦГ содержания белков, участвующих главным образом в антипатогенных процессах.

Естественно, возникает вопрос, ставит ли под сомнение обнаружение нами ЦГ-индукции белков парадигму ингибирующего действия ЦГ на процесс трансляции. Положительный ответ может быть дан в случае подтверждения существования ЦГ-сигнализации (вариант 4). В то же время, факты о влиянии на функции рибосом посттрансляционной модификации рибосомных белков, а также связывание рибосом с внерибосомными белками и sРНК должны учитываться исследователями при использовании ЦГ в качестве ингибитора синтеза белков.

Исследования поддержаны грантом Российского фонда фундаментальных исследований № 13-04-00324-а.

список литературы

  1. Тарчевский И., Яковлева В.Г., Егорова А.М. Протеомный анализ салицилат-индуцированных белков листьев гороха (Pisum sativum L.) // Биохимия. 2010. Т. 75. С. 689697.
  2. Тарчевский И.А., Яковлева В.П., Егорова А.М. Салицилат-индуцированная модификация протеомов у растений // Прикл. биохимия и микробиология. 2010. Т.46. С. 263275.
  3. Тарчевский И.А., Яковлева В.Г., Егорова А.М. Влияние салициловой кислоты на содержание белков и включение в них 14С-аминокислот в корнях гороха // Физиология растений. 2011. Т. 58. С. 523532.
  4. Cashmore A.R. Protein synthesis in plant leaf tissue. The sites of synthesis of the major proteins // J. Biol. Chem. 1976. V. 251. P. 2848-2853.
  5. Malhotra S.S., Solomos T., Spencer M. Effects of cycloheximide, D-threo-chloramphenicol, erythromycin and actinomycin D on de-novo synthesis of cytoplasmic and mitochondrial proteins in the cotyledons of germinating pea seeds // Planta (Berlin). 1973. V. 114. P. 169184.
  6. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. P. 680–685.
  7. Егорова А.М., Тарчевский И.А. Антипатогенный феномен циклогексимида // ДАН. 2015. Т. 461. С. 14.
  8. Тарчевский И.А., Яковлева В.Г., Егорова А.М. Индукция салициловой кислотой компонентов олигомерных белковых комплексов // Физиология растений. 2012. Т. 59. С. 532542.
  9. Seabra A.R., Silva L.S., Carvalho H.G. Novel aspects of glutamine synthetase (GS) regulation revealed by a detailed expression analysis of the entire GS gene family of Medicago truncatula under different physiological conditions // BMC Plant Biol. 2013. V. 13: e137. doi 0.1186/1471-2229-13-137
  10. Cantón F.R., Suárez M.F., Cánovas F.M. Molecular aspects of nitrogen mobilization and recycling in trees // Photosynth. Res. 2005. V. 83. P. 265–278.
  11. Gomez-Maldonado J., Canovas F.M., Avila C. Molecular analysis of the 5-upstream region of a gibberellin-inducible cytosolic glutamine synthetase gene (GS1b) expressed in pine vascular tissue // Planta. 2004. V. 218. P. 1036–1045.
  12. Suarez M.F., Avila C., Gallardo F., Canton F.R., Garcia-Gutierrez A., Claros M.F., Canovas F.M. Molecular and enzymatic analysis of ammonium assimilation in woody plants // J. Exp. Bot. 2002. V. 53. P. 891–904.
  13. Czemmel S., Stracke R., Weisshaar B., Cordon N., Harris N.N., Walker A.R., Robinson S.P., Bogs J. The grapevine R2R3-MYB transcription factor VvMYBF1 regulates flavonol synthesis in developing grape berries // Plant Physiol. 2009. V. 151. P. 15131530.
  14. Zhong R., Morrison W.H., III, Himmelsbach D.S., Poole F.L., II, Ye Z.H. Essential role of caffeoyl coenzyme A O-methyltransferase in lignin biosynthesis in woody poplar plants // Plant Physiol. 2000. V. 124. P. 563578.
  15. Mehrtens F., Kranz H., Bednarek P., Weisshaar B. The Arabidopsis transcription factor MYB12 is a flavonol-specific regulator of phenylpropanoid biosynthesis // Plant Physiol. 2005. V. 138. P. 10831096.
  16. Ambawat S., Sharma P., Yadav N.R., Yadav R.C. MYB transcription factor genes as regulators for plant responses: an overviews // Physiol. Mol. Biol. Plant. 2013. V. 19. P. 307321.
  17. Carrol A.J. The Arabidopsis cytosolic ribosomal proteome: from form to function // Front. Plant Sci. 2013. V. 4: e32. doi 10.3389/fpls.2013.00032
  18. Ellis R., MacDonald I.R. Specificity of cycloheximide in higher plant systems // Plant Physiol. 1970. V. 46. P. 227232.
  19. Oaks A., Johnson F.J. The effect of cycloheximide on amide formation in maize roots // Can. J. Bot. 2011. V. 51. P. 9195.
  20. Schrey S.D., Tarkka M.T. Friends and foes: streptomycetes as modulators of plant disease and symbiosis // Antonie Van Leeuwenhoek. 2008. V. 94. P. 11–19.
  21. Frankel J. The relationship of protein synthesis to cell division and oral development in synchronized Tetrahymena pyriformis GL-C: an analysis employing cycloheximide // J. Cell. Physiol. 1969. V. 74. P. 135–148.
  22. Tapken D., Anschuetz U., Liu L.H., Huelsken T., Seebohm G., Becker D., Hollmann M. A plant homolog of animal glutamate receptors is an ion channel gated by multiple hydrophobic amino acids // Sci. Signal. 2013. V. 6: ra47. doi 10.1126/scisignal.2003762
  23. Forde B.G., Roberts M.R. Glutamate receptor-like channels in plants: a role as amino acid sensors in plant defense? // F1000Prime Rep. 2014. V. 6: e37. doi 10.12703/P6-37
  24. Cachorro P., Ortiz A., Ros Barcelo A., Cerda A. Lignin deposition in vascular tissues of Phaseolus vulgaris roots in response to salt stress and Ca2+ ions // Phyton. 1993. V. 33. P. 3340.
  25. McMahon D. Cycloheximide is not a specific inhibitor of protein synthesis in vivo // Plant Physiol. 1975. V. 55. P. 815821.
  26. Agarwal M., Singh A., Mittal D., Sahi C., Grover A. Cycloheximide-mediated superinduction of genes involves both native and foreign transcripts in rice (Oryza sativa L.) // Plant Physiol. Biochem. 2011. V. 49. P. 9–12.
  27. Xiong L., Lee M.W., Qi M., Yang Y. Identification of defense-related rice genes by suppression subtractive hybridization and differential screening // Mol. PlantMicrobe Interact. 2001. V. 14. P. 685–692.
  28. Blanco F., Salinas P., Cecchini N.M., Jordana X., van Hummelen P., Alvarez M.E., Holuigue L. Early genomic responses to salicylic acid in Arabidopsis // Plant Mol. Biol. 2009. V. 70. P. 79102. doi 10.1007/s11103-009-9458-1
  29. Turkina M.V., Arstrand H.K., Vener A.V. Differential phosphorylation of ribosomal proteins in Arabidopsis thaliana plant during day and night // PLoS ONE. 2011. V. 6: e29307. doi 10.1371/journal.pone.0029307
  30. Sharma G., Pallesen J., Das S., Grassucci R., Langlois R., Hampton C.M., Kelly D.F., des Georges A., Frank J. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome // J. Struct. Biol. 2013. V. 181. P. 190–194.
  31. Dongping Z., Li C., Bing L.V., Jiansheng L. The scaffolding protein RACK1: a platform for diverse functions in the plant kingdom // J. Plant Biol. Soil Health. 2013. V. 1. P. 7.
  32. Speth C., Willing E.M., Rausch S., Schneeberger K., Laubinger S. RACK1 scaffold proteins influence miRNA abundance in Arabidopsis // Plant J. 2013. V. 76. P. 433–445.
  33. Wang B., Yu J., Zhu D., Chang Y., Zhao Q. Maize Zmrack1 is involved in the plant response to fungal phytopathogens // Int. J. Mol. Sci. 2014. V. 15. P. 93439359.
  34. Urano D., Czarnecki O., Wang X., Jones A.M., Chen J.G. Arabidopsis receptor of activated C kinase1 phosphorylation by WITH NO LYSINE8 KINASE // Plant Physiol. 2015. V. 167. P. 507516.
  35. Ma X., Kim E.J., Kook I., Ma F., Voshall A., Moriyama E., Cerutti H. Small interfering RNA-mediated translation repression alters ribosome sensitivity to inhibition by cycloheximide in Chlamydomonas reinhardtii // Plant Cell. 2013. V. 25. P. 985998.

 

Таблица 1. ЦГ-супрессируемые белки

 

белка1

Номер белка в базе данных2

 

Идентифицированный белок

 

Растение

ММ/pI

эксп.3

 

ММ/pI теор.4

 

Достоверность поиска5

Число совпавших пептидов6

Совпадение аминокислотной последовательности, %7

Изменение содержания белка8

Белки, участвующие в олигомеризации и метаболизме белков

0306

  1. gi|50400709
  1. ядерный антиген пролиферирующих клеток

Pisum sativum

35.6/4.8

29.4/4.69

364

5

39

3.6

0216

gi|1168189

белок 14-3-3

Vicia faba

32.7/4.6

29.4/4.71

118

9

41

2.0

0217

gi|1168196

белок 14-3-3

P. sativum

32.7/4.75

29.3/4.71

261

7

35

2.8

0223

gi|1168189

белок 14-3-3

V. faba

31.5/4.6

29.4/4.71

354

8

34

3.7

0226

gi|1168196

белок 14-3-3

P. sativum

31.5/4.81

29.3/4.71

151

3

15

2.4

1203

gi|1168192

  • 14-3-3-подобный белок
  • V. faba

    32.7/4.92

    29.5/4.82

    510

    8

    47

    2.0

    4907

  • gi|502147633
  • белок теплового шока 70 кД

    Cicer arietinum

    102/5.43

    93.8/5.22

    196

    4

    6

    2.8

    0605

    gi|1710807

  • шаперонин 60 кД, α-субъединица
  • P. sativum

    61.5/4.81

    61.9/5.15

    323

    8

    23

    3.7

    6001

    gi|27466894

  • тиоредоксин h
  • P. sativum
  • 12.6/5.67

    12.5/5.62

    93

    2

    25

    2.2

    0801

    gi|357453901

  • дисульфид-изомераза L-2
  • Medicago truncatula

    75/4.72

    62.9/4.68

    296

    5

    12

    2.9

    3705

    gi|359497288

  • пептидилпролил-изомераза 70 кД
  • Vitis vinifera
  • 72/5.37

    64.0/5.11

    99

    2

    4

    2.9

    Белки, участвующие в защите против патогенов

    2004

    gi|1703042

  • AБК-отвечающий белок ABR17
  • P. sativum

    16.9/5.01

    16.6/5.07

    142

    3

    39

    2.2

    4301

    gi|593699993

    белок PHAVU_005G153300g

  • Phaseolus vulgaris
  • 36/5.37

    35.2/5.04

    449

    8

    28

    4.2

    5507

    gi|15229033

  • S-аденозилметионинсинтаза 4
  • Arabidopsis thaliana
  • 45/5.65

    42.7/5.51

    140

    3

    18

    2.2

    3501

    gi|37725949

  • S-аденозил-L-метионин-салициловая кислота-карбоксиметилтрансфераза
  • P. sativum
  • 42.6/5.2

    40.5/5.17

    223

    7

    31

    4.8

    7302

    ALL12_OLEEU

  • изофлавон-редуктазоподобный белок
  • Olea europaea
  • 36/6.0

    34.0/5.56

    102

    2

    8

    6.0

    Белки энергетического метаболизма

    3409

    gi|356548079

  • митохондриальная сукцинил-КoA-лигаза (AДФ-образующей),
  • β-субъединица
  • Glycine max
  • 42.6/5.4

    45.3/5.83

    233

    4

    17

    2.3

    1103

    ATP4_PEA

  • митохондриальная ATФ-синтаза,
  • δ-субъединица
  • P. sativum

    20.6/4.75

    21.2/6.74

    114

    2

    29

    2.2

    3205

    gi|37051111

  • короткоцепочечная алкогольдегидрогеназа A
  • P. sativum
  • 24.2/5.41

    29.1/5.61

    268

    5

    32

    2.1

    3201

    gi|357446129

  • пирофосфатаза растворимая неорганическая
  • M. truncatula
  • 32.7/5.25

    32.4/6.02

    126

    2

    18

    2.2

    1 Номер пятна на 2D-электрофореграмме.

    2 Номер белка в базе данных NCBI и SwissProt.

    3 MM/pI эксп. – молекулярная масса белка в кД и pI из базы данных.

    4 MM/pI теор. – молекулярная масса белка в кД и pI полученная в ходе эксперимента.

    5 Достоверность поиска белков (Score) с использованием программы Mascot, где предел отсечения составлял 48 (p < 0.05) для поиска по базе данных NCBI и 29 (p < 0.05) для базы данных SwissProt.

    6 Число пептидов, по которым идентифицировали белок.

    7 Совпадение аминокислотной последовательности идентифицированного белка с белком из базы данных в процентах.

    8 Изменение содержания белка в опытном варианте по сравнению с контрольным вариантом

     

     

    Таблица 2. ЦГ-индуцируемые белки

     

    белка1

    Номер белка в базе данных2

     

    Идентифицированный белок

     

    Растение

    ММ/pI

    эксп.3

     

    ММ/pI теор.4

     

    Достовер-ность поиска5

    Число совпавших пептидов6

    Совпадение аминокислотной последовательности,%7

    Изменение содержания белка8

    Участники фенилпропаноидного метаболизма

    7505

    gi|502102108

  • 6-фосфоглюканат-дегидрогеназа декарбоксилирующая 3
  • Cicer arietinum
  • 51.4/6.09

    54.2/5.88

    260

    6

    21

    +2.5

    7422

    gi|121333

  • корневой изозим глутаминсинтазы
  • Pisum sativum
  • 41.1/6.15

    39.2/6.12

    363

    6

    30

    +2.0

    6506

    gi|1346524

  • S-аденозил-метионинсинтаза
  • Populus deltoides
  • 47/5.76

    43.2/5.59

    437

    7

    24

    +2.2

    7507

    gi|1709001

  • S-аденозил-метионинсинтаза
  • P. sativum
  • 46/6.16

    39.9/6.45

    393

    7

    39

    +3.1

    5505

    gi|502112841

  • S-аденозил-метионин-синтазоподобный белок
  • C. arietinum
  • 46.4/5.4

    43.0/5.48

    482

    8

    29

    +2.8

    5510

    gi|502112841

  • S-аденозил-метионин-синтазоподобный белок
  • C. arietinum
  • 45/5.52

    43.0/5.48

    283

    4

    19

    +15.1

    6507

    gi|502112841

  • S-аденозил-метионин-синтазоподобный белок
  • C. arietinum
  • 45/5.76

    43.0/5.48

    374

    6

    22

    +3.4

    6204

    gi|593705138

    S-аденозил-метионин-зависимая метилтрансфераза, класс I

  • Phaseolus vulgaris
  • 30.5/5.84

    27.4/5.69

    208

    3

    25

    +4.0

    2208

    gi|502152862

  • кофеоил-КoA-O-метилтрансфераза 5-подобная изоформа X2
  • C. arietinum

    29/5.2

    21.9/4.97

    206

    2

    23

    +2.1

    5104

    gi|729104

  • халкон-флавонизомераза
  • P. sativum
  • 23/5.67

    24.7/7.05

    456

    5

    30

    +3.1

    5301

    gi|1708427

  • изофлавонредуктаза
  • P. sativum
  • 36/5.56

    35.4/5.39

    853

    13

    53

    +3.8

    6305

    gi|1708427

    изофлавонредуктаза

  • P. sativum
  • 35/5.83

    35.4/5.39

    649

    9

    42

    +7.1

    5402

    gi|4346887

  • софоролредуктаза
  • P. sativum
  • 42.6/5.62

    35.6/8.34

    139

    2

    8

    +3.4

    7405

    gi|6092014

  • белок Hsr203J
  • P. sativum
  • 42.1/6.09

    38.3/5.76

    454

    9

    35

    +3.6

    Белок, участвующий в защите против патогенов

    3208

    gi|330376138

  • изопентенил-пирофосфатизомераза
  • Medicago sativa
  • 30/5.3

    33.0/6.22

    243

    5

    25

    +3.2

    Белки, участвующие в фолдинге и метаболизме белков

    5701

    gi|585272

  • митохондриальный белок теплового шока 70 кД
  • P. sativum
  • 70.5/5.64

    72.2/5.81

    360

    7

    14

    +2.3

    4607

    gi|2506277

  • шаперонин 60, β-субъединица
  • P. sativum
  • 63.8/5.53

    62.9/5.85

    254

    5

    11

    +4.3

    4104

    gi|357466571

  • β-субъединица протеосом
  • M. truncatula
  • 26/5.46

    24.8/5.27

    197

    3

    19

    +2.5

    6402

    gi|502077428

  • пролин-иминопептидазоподобный белок
  • C. arietinum
  • 39.8/5.84

    45.0/5.84

    119

    3

    8

    +2.2

    Примечание. Обозначения, как в табл. 1.

    ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

     

    Рис. 1. Электрофореграммы растворимых белков корней гороха.

    а – контроль; б – опыт, 10 мкМ ЦГ.

     

    Рис. 2. Схема участия ЦГ-индуцируемых ферментов в фенилпропаноидном защитном метаболизме.

    ФЕП – фосфоенолпируват.