УДК 581.174.1/2:582.263:577.344

ВОЗМОЖНОСТИ И ОГРАНИЧЕНИЯ НЕДЕСТРУКТИВНОГО ОПТИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА КУЛЬТУР ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ ПРИ СБАЛАНСИРОВАННОМ РОСТЕ 1

©   2015 г. К. А. Чеканов*, А. Е. Соловченко*,**

*Биологический факультет Московского государственного университета 

им. М.В. Ломоносова, Москва

**Федеральное государственное бюджетное учреждение науки 

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва

Поступила в редакцию 13.05.2014 г.

Для исследования физиологического состояния и кинетики роста суспензионных культур одноклеточных водорослей важно оперативное получение информации о ключевых параметрах, таких как накопление сухого веса, число клеток и содержание в них пигментов (хлорофиллов и каротиноидов). Показана возможность недеструктивного определения этих параметров по спектрам оптической плотности (ослабления света вследствие его поглощения пигментами и рассеяния света содержащими их клетками) суспензий одноклеточных зеленых водорослей Ettlia carotinosa Komarek и Haematococcus pluvialis Flotow (Chlorophyceae). Установлено, что для надежного определения содержания пигментов у морфологически гетерогенных культур, таких как H. pluvialis, необходима компенсация вклада светорассеяния в измеренную величину оптической плотности. С другой стороны, использование сигнала светорассеяния у культур с низкой морфологической гетерогенностью применимо для оценки накопления сухого веса и числа клеток. Определены спектральные области, чувствительные к различным параметрам культуры, созданы линейные алгоритмы для расчета искомых параметров. Обсуждаются возможности и ограничения применимости оптического недеструктивного мониторинга состояния культур в условиях сбалансированного роста, а также потенциал разработанного подхода для биотехнологии микроводорослей.

-----------------------------

1 Представлено на Международной конференции “Физиология и биотехнология оксигенных фототрофных микроорганизмов: взгляд в будущее” (2730 мая 2014 г.).

-----------------------------

Сокращения: Кар – каротиноид(ы); МВ – микроводоросли; ОП – оптическая плотность; СВ – сухой вес; Хл – хлорофилл(ы); NIR – ближняя ИК-область; RMSE – среднеквадратичная ошибка определения.

Адрес для корреспонденции: Соловченко Алексей Евгеньевич. 119234 Москва ГСП-1, Ленинские горы, 1, корп. 12. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра биоинженерии. Факс 007 (495) 939-38-07; электронная почта: solovchenko@mail.bio.msu.ru

Ключевые слова: Haematococcus pluvialis – Ettlia carotinosa – оптическая плотность – светорассеяние – коэффициент корреляции

 

ВВЕДЕНИЕ

Культура одноклеточных водорослей (микроводорослей, МВ) является распространенной модельной системой в физиологии, биохимии и молекулярной биологии фотоавтотрофных организмов, а также важным объектом биотехнологии [1, 2]. Для рутинного наблюдения за ростом и физиологическим состоянием культур как правило применяют ручной, реже автоматизированный подсчет клеток, гравиметрическое определение сухого веса, а для регистрации изменений пигментного состава  экстракцию неполярными растворителями с последующим спектрофотометрическим или хроматографическим анализом [3]. Эти методы трудоемки, отнимают много времени и подвержены ошибкам, автоматизированные же разновидности таких методов требуют дорогостоящего оборудования (проточные цитофлуориметры, счетчики Култера, системы обработки изображений и т.д.). 

В связи с этим, практикуются методы, основанные на измерении оптической плотности (ОП) суспензий без разрушения клеток. В частности, показана применимость оптических методов для оценки стрессовых реакций пигментного и липидного метаболизма МВ, таких как Heamatococcus pluvialis (Chlorophyceae) [4], Parietochloris incisa (Trebouxiophyceae) [5] и Nannochloropsis oceanica (Eustigmatophyceae) [6]. Однако использование этих методов также сопряжено с трудностями из-за сложности оптических свойств клеточных суспензий и несовершенства спектрофотометрической техники. В частности, спектры суспензий клеток МВ характеризуются значительными искажениями вследствие высокого и, как правило, неопределенного вклада светорассеяния в результате частичного преломления луча на поверхности клеток и внутриклеточных структур, а также специфической упаковки пигментов [713]. Как следствие количественные расчеты на основании ОП клеточных суспензий не отличаются высокой точностью, а спектры суспензий, записанные на разных приборах, невозможно сравнивать напрямую. 

Для снижения влияния светорассеяния на спектры предлагались различные подходы, основанные на получении спектров обесцвеченных клеток с последующим вычитанием его из спектра оптической плотности суспензии, гомогенизации, анализа оптических свойств каждой отдельной клетки и использовании интегрирующих сфер (сфер Ульбрихта) [8, 9, 13, 14]. Также рассеянный свет несет ценную информацию о суспензии МВ, связанную с числом, размерами и формой клеток. Таким образом, для оптического мониторинга состояния суспензий МВ необходим метод, учитывающий поглощение и рассеяние света образцом и обладающий при этом высокой чувствительностью и точностью.

Весьма эффективным в отношении многих видов МВ оказался подход к компенсации вклада светорассеяния в спектры ОП клеточных суспензий, разработанный в нашей лаборатории Мерзляком с соавт. [13, 14]. Он основан на допущении, что оптическая плотность суспензии (D()) может быть приближенно представлена как сумма независимых друг от друга вкладов светопоглощения и светорассеяния:

D()  Ã() + S(),

где Ã()  вклад светопоглощения, S()  вклад светорассеяния при длине волны λ [8, 14]. Данное выражение для оптической плотности можно получить при допущениях, что частиц в суспензии не слишком много (т.е. они поглощают свет независимо друг от друга), все они имеют форму куба одинакового объема, а интенсивность поглощенного и рассеянного каждой отдельной клеткой света не слишком велика [8].

Применение такого подхода позволяет разделять и анализировать по отдельности вклады поглощения света пигментами и светорассеяния в общее ослабление света суспензией клеток. Однако до настоящего времени этот подход не применялся для количественного недеструктивного анализа содержания пигментов и иных параметров культур МВ. В настоящей работе предпринята попытка разделения вкладов поглощения света и светорассеяния и использования этого подхода в сочетании с методологией анализа пигментов по оптическим спектрам, ранее разработанной и успешно примененной Гительсоном и Мерзляком [15, 16] при работе с листьями и плодами высших растений.

Согласно этой методологии, исследование связи спектров поглощения суспензий с основными параметрами культур включало три этапа: получение массива данных, содержащего спектры и соответствующие им параметры культуры; поиск спектральных индексов, чувствительных к искомым параметрам; выбор модели (функции, связывающей спектральные индексы поглощения суспензий с содержанием в ней каротиноидов и хлорофиллов, сухим весом и числом клеток), а также проверку (валидацию) полученного алгоритма на независимо полученном массиве данных.

Объектами исследования служили МВ Ettlia carotinosa [17] и Haematococcus pluvialis [18]. Интерес к этим видам обусловлен их способностью накапливать при действии стрессоров высокие количества ценного кетокаротиноида астаксантина, широко применяемого при производстве косметических и лекарственных средств, пищевых и кормовых добавок [18]. В результате была показана возможность количественного определения содержания суммы хлорофиллов (Хл), отношения Хл и каротиноидов (Кар) в клетках, а также (для E. carotinosa) сухого веса (СВ) и числа клеток (Nc) в единице объема суспензии на всех фазах сбалансированного роста культуры. 

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Изолят каротиногенных МВ, идентифицированных как Haematococcus pluvialis Flotow (Генбанк, ID JQ867352), выделен Е.С. Лобаковой (МГУ им. М.В. Ломоносова) в супралиторальной зоне бассейновой части Белого моря (66°29'48" в.д., 33°24'22" с.ш.). Культура Ettlia carotinosa MAINX была предоставлена сотрудниками Института биологии южных морей им. А.О. Ковалевского Национальной академии наук Украины.

Клетки МВ культивировали в фотобиореакторах закрытого типа в 0.6-литровых стеклянных колоннах диаметром 40 мм в 400 мл среды BG-11 [19] при постоянной температуре (27°C), интенсивности света 40 мкЕ ФАР/(м2 с) и продувании атмосферным воздухом (400 мл/мин).

Пигменты экстрагировали из клеток МВ диметилсульфоксидом (ДМСО). Аликвоту суспензии центрифугировали в течение 5 мин при 3000 g, супернатант удаляли, клеточный осадок ресуспендировали в ДМСО, затем инкубировали 5 мин при 70°C и интенсивном встряхивании. На стационарной фазе роста (1214 суток культивирования) клетки обладали более плотной стенкой, поэтому для обеспечения полноты экстракции длительность инкубации в ДМСО увеличивали до 15 мин, экстракцию повторяли дважды и экстракты объединяли. Концентрацию Хл a и b, а также суммы Кар в экстракте определяли спектрофотометрически [5]. Сухой вес определяли весовым методом [20], подсчет клеток производили в камере Горяева.

Спектры поглощения в диапазоне 400800 нм снимали в 1-сантиметровых кварцевых кюветах на спектрофотометре Agilent Cary 300 (“Agilent”, США), оснащенном 150-миллиметровой интегрирующей сферой CA-30I того же производителя, и корректировали на рассеяние, как описано в работе [13]. Для предотвращения оседания в процессе развертки спектра клетки непосредственно перед снятием спектра переносили из среды культивирования в смесь глицерина с водой (1 : 1, по объему).

На всех стадиях роста состояние культур МВ контролировали методом световой микроскопии с использованием моторизованного цифрового фотомикроскопа Eclipse 90i (“Nikon”, Япония).

Все измерения проводили в трех аналитических проворностях, на рисунках представлены усредненные данные. Для измерений отбирали пробы (n = 10) на различных этапах роста культуры (проведено не менее трех независимых экспериментов для каждого из видов).

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изменение морфологии и пигментного состава клеток в процессе культивирования

 

На различных этапах роста в культуре Н. pluvialis было отмечено присутствие клеток четырех морфологических типов. Первый тип  небольшие двужгутиковые зооспоры (15 мкм), преобладавшие на экспоненциальной стадии роста. Второй тип  сферические, близкие по размеру к зооспорам неподвижные клетки без жгутиков. Такие клетки преобладали в первые дни культивирования после пересева и при переходе к стационарной фазе роста. Третий тип  крупные сферические клетки (4050 мкм) с утолщенной клеточной стенкой. С преобладанием таких клеток в культуре могут быть связаны отмеченные нами трудности при экстракции пигментов. Четвертый тип  делящиеся клетки. После деления клеток Н. pluvialis образовывались тетраспоры, в которых под общей оболочкой находилось по четыре коккоидных клетки. Также в культуре встречались мертвые неокрашенные клетки. Следует отметить, что на всех стадиях роста были обнаружены клетки всех трех типов, что свидетельствовало о существенной морфологической гетерогенности культуры Н. pluvialis.

У E. carotinosa изменения морфологии клеток на разных стадиях роста были менее выраженными. В течение всего периода роста наблюдали присутствие небольших коккоидных клеток диаметром около 10 мкм. Лишь в первые дни культивирования при сильном разведении культуры наблюдали присутствие небольшого числа монадных клеток с двумя жгутиками.

Содержание Хл (CХл) и Кар (CКар) увеличивалось приблизительно в 10 раз за 12 суток, достигая 3035 и 911 мг/л культуры соответственно. В течение всего периода культивирования содержание Хл и Кар увеличивалось строго пропорционально (r2 = 0.99 и 0.89 для H. pluvialis и E. carotinosa соответственно). Как следствие соотношение этих групп пигментов оставалось довольно стабильным на всех фазах роста: CХл/CКар = 0.21 ± 0.06 и 0.36 ± 0.07 для H. pluvialis и E. carotinosa соответственно. В наших экспериментальных условиях индукции синтеза вторичных Кар (главным образом астаксантина) не наблюдалось.

 

Особенности поглощения и рассеяния света 

клеточными суспензиями исследованных культур

 

Спектры суспензии клеток исследованных МВ (рис. 1) обладали типичной для представителей Chlorophyta формой [4, 5, 13] и содержали полосы фотосинтетических пигментов в красной (максимум при 678 нм, обусловленный совместным поглощением Хл a и b) и сине-зеленой области спектра (максимум при 436 нм, обусловленный совместным поглощением Хл и Кар). Спектры ОП H. pluvialis, не компенсированные на светорассеяние (D(λ), рис. 1а), характеризовались более высокой амплитудой по сравнению с полученными из них компенсированными спектрами (Ã(λ); рис. 1а, кривые 1–4). Амплитуда спектров D(λ) в ближней ИК-области (NIR, 720800 нм) была заметно выше нуля (тонкие линии 1–4 на рис. 1a). Поскольку пигменты не обладают поглощением в этом диапазоне, данный эффект может быть обусловлен неполным сбором света детектором спектрофотометра вследствие рассеяния [8, 14]. Действительно спектры Ã(λ) имели в данном диапазоне амплитуду, близкую к нулю (рис. 1а, кривые 14). Спектры Ã(λ), нормированные по длинноволновому максимуму Хл (678 нм), были близки по форме (рис. 1а, кривые 1′4′), что согласуется с незначительными изменениями отношения Кар/Хл в исследованных культурах. Для образцов с высоким содержанием пигментов (Хл > 20 мг/л) было характерно уплощение максимумов, в частности при 650 нм и в синей области (ср. кривые 1′ и 4′ на рис. 1а). Предположительно эти различия связаны с нарушением независимого поглощения света пигментами вследствие эффектов упаковки (взаимного затенения молекул) [16, 18, 20]. Аналогичные результаты были получены для E. carotinosa (рис. 1б; исходные спектры D(λ) не приводятся).

Спектральные вклады ослабления света вследствие рассеяния, S(λ), представлены на рис. 1в и 1г. В NIR, где отсутствует поглощение пигментов, форма спектров S(λ) соответствовала теоретической зависимости интенсивности рассеянного света от длины волны S(λ)  1/λ, где 4    0 [12, 21]. В полосах поглощения пигментов в видимой области спектра амплитуда S(λ) снижалась, также присутствовали спектральные детали, свидетельствующие о частичном поглощении рассеянного света пигментами и вероятно о вкладе эффектов селективного светорассеяния [22]. Следует также отметить, что в случае H. pluvialis амплитуда спектров S(λ) не всегда была пропорциональной содержанию пигментов, что может быть связано с выраженной морфологической гетерогенностью этой культуры. Напротив, у менее гетерогенной культуры E. carotinosa данная пропорциональность существовала и была особенно выраженной в NIR и зеленой области спектра, менее зависимой от влияния поглощения пигментов (рис. 1в и 1г).

 

Связь содержания пигментов в клетках и оптических свойств суспензии

Использованная нами методология разработки моделей, связывающих оптические свойства с содержанием пигментов в клетках фотоавтотрофных организмов, основана на анализе так называемых спектральных сигнатур пигментов (подробнее см. в работе [15]). С этой целью сопоставляют массивы спектральной и биохимической информации об одних и тех же объектах. В результате определяют спектральные области, поглощение света в которых чувствительно к содержанию искомых пигментов, т.е. пропорционально ему. Во многих случаях чувствительность анализа удается повысить путем устранения помех от факторов, не связанных с содержанием искомого пигмента (влияние размеров, формы частиц, присутствие светопоглощающих примесей, таких как другие пигменты). В рамках этой методологии анализировали корреляцию основных параметров культур МВ c корректированным и некорректированными спектрами ОП, а также со спектральным вкладом светорассеяния. Силу линейной зависимости между параметрами культуры и спектральными параметрами оценивали по величине коэффициента линейной корреляции Пирсона (r). Критическое значение r для выборки, содержащей 10 измерений при уровне значимости P = 0.95, равно 0.63. Результаты такого анализа для суммы Хл представлены на рис. 2.

На рис. 2 видно, что величина корреляции содержания Хл с оптическими параметрами существенно различается и имеет выраженную спектральную зависимость, характер которой зависит от вида МВ. В случае H. pluvialis (рис. 2а) максимальной была корреляция в видимой области В случае H. pluvialis (рис. 2а) максимальной была корреляция в видимой области между СХл и корректированной ОП, r{СХл, Ã(λ)} (рис. 2а, кривая 1). Корреляция между СХл и некорректированной ОП, r{СХл, D(λ)} (рис. 2а, кривая 2) была ниже, наименьшие по модулю значения в видимой области имела корреляция между содержанием Хл и величиной вклада светорассеяния r{СХл, S(λ)} (рис. 2а, кривая 3). 

Для D и Ã максимальные значения корреляции с СХл наблюдали в дальней красной (700–715 нм) и зеленой области спектра (530–570 нм; рис. 2в). Следует отметить, что в зеленых листьях и плодах высших растений максимальная и близкая по силе корреляция между СХл и поглощением либо отражением света также наблюдается в полосах с максимумами при 550 и 700 нм [16]. Напротив, в полосах сильного поглощения пигментов корреляция ослабевала, минимумы корреляции совпадали с максимумами поглощения. Судя по данным, представленным на рис. 2г, этот эффект можно объяснить нелинейностью связи между оптическими свойствами суспензии и содержанием пигментов при высоких (> 30 мг/л в наших экспериментальных условиях) значениях последнего.

Существенно, что в NIR корреляция с параметром, зависящим только от поглощения пигментов (Ã) и не связанным с рассеянием, была слабой (|r| < 0.2). В то же время параметры, включающие компонент светорассеяния (D и S) в этой области спектра коррелировали с СХл намного сильнее (r > 0.6), несмотря на отсутствие поглощения пигментов в NIR. Вероятно, этот факт отражает взаимосвязь между величиной светорассеяния, количеством рассеивающих частиц (клеток) и содержанием Хл в суспензии. С другой стороны, корреляция между факторами, определяющими светорассеяние суспензии (числом и размерами клеток), у H. pluvialis не столь высока, как корреляция между и поглощением света; это видно, в частности, на рис. 1а и 1в. Как следствие, сама по себе величина светорассеяния слабо коррелирует с СХл в видимой области (рис. 2а, кривая 3), а устранение вклада светорассеяния из D(λ), напротив, приводит к усилению корреляции с СХл в видимой области и к ослаблению ее в NIR (рис. 2а, кривая 1).

Иная картина наблюдалась в случае культур E. carotinosa (рис. 2б). Для этой культуры была характерна высокая (r > 0.9) корреляция Ã(λ) и СХл во всей видимой области спектра (рис. 2, кривая 1). Существенного снижения корреляции и линейности зависимости Ã(λ) от СХл в полосах поглощения пигментов не наблюдали (рис. 2д и 2e). Корреляция между D(λ) и СХл была в целом высокой (r > 0.8) и незначительно снижалась в максимумах поглощения (рис. 2б, кривая 2). Важно, что корреляция между S(λ) и СХл в полосах слабого поглощения пигментов была столь же сильной, как r{СХл, D(λ)} и r{СХл, Ã(λ)}, но резко ослабевала в полосах сильного поглощения Хл и Кар (рис. 2б, кривая 3). Это наблюдение может быть связано среди прочего с аномальной дисперсией света в областях сильного поглощения пигментов. 

С учетом вышеописанных особенностей оптических свойств исследованных культур для определения были выбраны спектры ОП, компенсированные на вклад светорассеяния. Линейные алгоритмы, основанные на спектральных максимумах корреляции r{СХл, Ã(λ)} (700 и 692 нм для H. pluvialis и E. carotinosa соответственно), позволили с точностью, достаточно высокой для рутинных наблюдений (RMSE = 1.8 мг/л для всего диапазона), проводить определения в суспензии исследованных видов МВ на любой стадии роста (таблица).

Характерной особенностью пигментного состава клеток МВ, растущих в оптимальных условиях, является синхронность изменений СХл и СКар. Данная закономерность является следствием консервативности стехиометрии Хл и Кар в составе пигментбелковых комплексов фотосинтетического аппарата, нарушается она только в неблагоприятных условиях. Так, рост СКар/СХл за счет снижения содержания Хл и (или) накопления вторичных Кар является характерной чертой реакции фотосинтетического аппарата МВ на действие различных стрессоров, включая свет высокой интенсивности и дефицит азота [46]. Кроме того, помехи от сильного поглощения Хл, перекрывающегося со спектрами Кар, ослабляют во всем оптическом диапазоне корреляцию между СКар и оптическими параметрами до уровня, недостаточного для надежного определения этих пигментов (таблица). В силу этих обстоятельств селективное определение в культурах МВ при сбалансированном росте представляется затруднительным.

С другой стороны, если соотношение СКар/СХл известно и стабильно в течение всего периода культивирования, как в исследованных нами культурах, возможен формальный расчет по значениям СХл. Альтернативный подход к определению отношения СКар/СХл заключается в использовании спектров Ã(λ), нормированных по значению Ã в полосе, максимально чувствительной к содержанию Хл (700 и 662 нм для H. pluvialis и E. carotinosa соответственно). Подробнее о методологии недеструктивного анализа Кар см. в работах [15, 16]. Для исследованных нами культур максимум спектра корреляции СКар и нормированных спектров Ã(λ) располагался в области 510 нм. Использование индексов Ã510/Ã700 и Ã510/Ã662 позволило с достаточной точностью определять отношение СКар/СХл в клетках исследованных культур на всех фазах роста (таблица).

 

Связь сухого веса, числа клеток и светорассеяния суспензии

Известно, что количество света, рассеянного культурой, зависит в первую очередь от числа рассеивающих частиц (клеток), их формы, среднего размера, вида распределения по размеру и сложности внутренней структуры [7, 1012]. При этом количество рассеянного частицами света пропорционально показателю преломления клеток nc, который связан с плотностью вещества  соотношением ЛоренцаЛоренца: (nc2  1)/(nc2 + 2)  . При условии, что (nc2  1)/(nc2 + 2) слабо меняется с изменением nc, данное выражение можно заменить более простым соотношением ГлэдстоунаДэйла [23], связывающего nc с массой вещества в единице объема C: nc = kC + b, где k и b  константы. Данное выражение широко используется при определении массы фитопланктона [24, 25]. В настоящей работе мы предприняли попытку использовать некорректированную ОП, D(λ), и вклад в нее светорассеяния, S(λ), для определения СВ и числа клеток (Nc) в единице объема суспензии (рис. 3). Сильнее всего величина СВ коррелировала со светорассеянием в NIR (750800 нм) (рис. 3а и 3б, кривая 1). При этом следует отметить значительное снижение корреляции в полосах поглощения пигментов. Напротив, корреляция СВ и спектров Ã(λ), не содержащего вклада светорассеяния, в NIR была очень низкой (рис. 3а и 3б, кривая 3). Таким образом, для определения параметров культуры, влияющих преимущественно на ее светорассеяние, предпочтительны спектральные области, свободные от влияния поглощения света пигментами. Соответственно, линейные алгоритмы расчета СВ по величине светорассеяния для обеих культур были основаны на величине S750 (таблица).

Для культуры E. carotinosa выявлена высокая корреляция Nc с оптическими параметрами с учетом вклада светорассеяния и слабая  с учетом вклада поглощения. Максимальная корреляция зарегистрирована с параметром S(λ) в NIR, где отсутствует заметное поглощение (данные не приводятся). Как и в случае r{Nc, S(λ)}, в полосах поглощения пигментов наблюдали резкое снижение корреляции (см. рис. 3б). Для алгоритма расчета Nc по вкладу светорассеяния также была выбрана полоса с λ = 750 нм (таблица).

В отличие от E. carotinosa в морфологически гетерогенных культурах H. pluvialis в течение культивирования сильно менялось не только число клеток, но и их геометрические характеристики (объем и форма). Как следствие у этой культуры нарушалась пропорциональность изменений вклада светорассеяния и числа клеток (рис. 2в), что не позволило вывести линейное уравнение, связывающее число клеток с параметрами спектра поглощения суспензии H. pluvialis в наших условиях.

 

Проверка разработанных алгоритмов

Для валидации (проверки точности и эффективности) разработанных алгоритмов расчета основных параметров роста культуры по спектральным параметрам поглощения и рассеяния света клеточными суспензиями использовали независимо полученные массивы данных. С помощью стандартного F-теста (P = 0.95) было установлено, что применение полученных алгоритмов дает расчетные значения, отличия которых от экспериментальных статистически незначимы (рис. 4, таблица).

 

Возможности и ограничения разработанного подхода к мониторингу культур микроводорослей

Задача определения ключевых параметров культуры МВ, таких как накопление биомассы и фотосинтетических пигментов, по оптическим спектрам интактных клеточных суспензий важна для разработки простых и чувствительных методов, позволяющих оперативно получать ценные сведения о состоянии лабораторных и промышленных культур. Однако оптические свойства клеточных суспензий радикально отличаются от таковых для истинных растворов. Поэтому такая задача существенно сложнее традиционного анализа пигментов в экстрактах, полученных с помощью органических растворителей, из-за оптической гетерогенности клеточных суспензий, эффектов светорассеяния и неполного светосбора детектором, а также влияния упаковки и различия коэффициентов экстинкции пигментов in vivo и in vitro.

Предложенный нами подход позволяет в значительной степени устранять неопределенности, связанные со вкладом светорассеяния в общее ослабление света клеточными суспензиями МВ, обеспечивая пропорциональность ОП суспензии и содержания пигментов в определенном диапазоне. Необходимо отметить, что для точного определения содержания пигментов в морфологически гетерогенных суспензиях, таких как H. pluvialis, поправка на вклад светорассеяния оказывается необходимой. Создание алгоритма для недеструктивного определения содержания пигментов также требует тщательного подхода. В общем случае требуется найти спектральную полосу с максимальной амплитудой изменений, линейно связанных с изменением содержания искомых пигментов во всем его диапазоне. Как и в случае высших растений, максимальную точность определения пигментов в широком диапазоне их содержания обеспечивает использование ОП на склонах основных полос их поглощения. Напротив, использование ОП в области максимумов поглощения пигментов нежелательно из-за нелинейности вследствие быстрого насыщения зависимости ОП от их содержания [16].

Данные о вкладе светорассеяния несут в себе важную информацию, в частности о количестве рассеивающих свет частиц в суспензии, на этих данных основана рутинная оценка числа клеток микроорганизмов и содержания СВ в суспензиях. Однако следует иметь в виду, что светорассеяние суспензии МВ зависит от множества факторов, включая состав, содержание и упаковку пигментов в клетках; размер и распределение клеточной популяции по размерам; форму клеток, сложность внутриклеточной организации, наличие и толщину покровных структур и т.д. [7, 1012]. Значительная гетерогенность этих параметров может приводить к нарушению линейности связи числа клеток с количеством рассеянного света, проявляющемуся на различных этапах роста культуры, как в случае исследованной нами культуры H. pluvialis. Поэтому при разработке методов недеструктивного анализа состояния культур по светорассеянию важно охватить полный спектр ее состояний, значительно отличающихся на разных фазах роста и стадиях жизненного цикла. Существенно также, что поглощение и рассеяние света, вообще говоря, не являются независимыми процессами, и учет их взаимного влияния также может быть важным для корректного анализа связи оптических свойств с другими параметрами культур МВ.

Вследствие особенностей динамики пигментного состава МВ при сбалансированном росте (синхронность изменения содержания Хл и Кар в клетках) попытки селективного определения пока не увенчались полным успехом вследствие сильного перекрывания спектров поглощения Кар и Хл, хотя в определенной степени эта проблема решается нормировкой спектров на поглощение Хл. Аналогичные трудности существуют при селективном определении Хл a и b по спектрам поглощения суспензий. Более перспективным представляется использование оптических методов для мониторинга вторичного каротиногенеза и стрессовых реакций пигментного аппарата МВ [46]. Тем не менее, результаты настоящей работы свидетельствуют, что оптические методы с учетом вышеописанных ограничений обеспечивают достаточно точную для рутинных наблюдений оценку роста культуры (по накоплению сухого веса и в некоторых случаях по числу клеток), а также изменений содержания Хл и отношения Кар/Хл, характеризующего физиологическое состояние культуры.

В заключение следует отметить, что предложенный в настоящей работе подход, сочетающий преимущества оригинальных методов регистрации и обработки спектральных данных для сильно рассеивающих биологических объектов [13, 14] с достижениями в области дистанционного зондирования фотоавтотрофных организмов [15], имеет значительный потенциал для автоматизации лабораторного и промышленного культивирования МВ. В частности алгоритмы для недеструктивного оптического мониторинга могут использоваться для создания оптических сенсоров, автоматизирующих наблюдение за состоянием культур МВ в фотобиореакторах различной конструкции.

Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ (грант № 2014-14-585-0002-7899).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Lv H., Qu G., Qi X., Lu L., Tian C., Ma Y. Transcriptome analysis of Chlamydomonas reinhardtii during the process of lipid accumulation // Genomics. 2013. V. 101. P. 229237.

2.Zittelli G.C., Biondi N., Rodolfi L., Tredici M.R. Photobioreactors for mass production of microalgae // Handbook of Microalgal Culture: Applied Phycology and Biotechnology / Eds. Richmond A., Hu Q. Oxford: Wiley-Blackwell, 2013. P. 225266.

3.Цоглин Л.Н., Пронина Н.А. Биотехнология микроводорослей. Москва: Научный мир, 2013. 184 с.

4.Solovchenko A., Aflalo C., Lukyanov A., Boussiba S. Nondestructive monitoring of carotenogenesis in Haematococcus pluvialis via whole-cell optical density spectra // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013. V. 97. P. 45334541.

5.Solovchenko A., Merzlyak M., Khozin-Goldberg I., Cohen Z., Boussiba S. Coordinated carotenoid and lipid syntheses induced in Parietochloris incisa (Chlorophyta, Trebouxiophyceae) mutant deficient in Δ5 desaturase by nitrogen starvation and high light // J. Phycol. 2010. V. 46. P. 763772.

6.Solovchenko A., Khozin-Goldberg I., Recht L., Boussiba S. Stress-induced changes in optical properties, pigment and fatty acid content of Nannochloropsis sp.: implications for non-destructive assay of total fatty acids // Mar. Biotechnol. 2011. V. 13. P. 527535.

7.Duysens L. The flattening of the absorption spectrum of suspensions, as compared to that of solutions // Biochim. Biophys. Acta. 1956. V. 19. P. 112.

8.Amesz J., Duysens L., Brandt D. Methods for measuring and correcting the absorption spectrum of scattering suspensions // J. Theor. Biol. 1961. V. 1. P. 5974.

9.Latimer P., Eubanks C. Absorption spectrophotometry of turbid suspensions: a method of correcting for large systematic deviations // Arch. Biochem. Biophys. 1962. V. 98. P. 274285.

10.Morel A., Bricaud A. Theoretical results concerning light absorption in a discrete medium, and application to specific absorption of phytoplankton // Deep Sea Research. Part A / Oceanographic Res. Papers. 1981. V. 28. P. 13751393.

11.Bricaud A., Bédhomme A.-L., Morel A. Optical properties of diverse phytoplanktonic species: experimental results and theoretical interpretation // J. Plankton Res. 1988. V. 10. P. 851873.

12.Morel A. Optics of marine particles and marine optics // Particle Analysis in Oceanography / NATO ASI Ser. 1991. V. 27. P. 141188.

13.Мерзляк М.Н., Чивкунова О.Б., Маслова И.П., Накви К.Р., Соловченко А.Е., Клячко-Гурвич Г.Л. Спектры поглощения и рассеяния света клеточными суспензиями некоторых цианобактерий и микроводорослей // Физиология растений. 2008. Т. 55. С. 464470.

14.Merzlyak M.N., Naqvi K.R. On recording the true absorption spectrum and the scattering spectrum of a turbid sample: application to cell suspensions of the cyanobacterium Anabaena variabilis // J. Photochem. Photobiol. B: Biology. 2000. V. 58. P. 123129.

15.Gitelson A.A., Keydan G.P., Merzlyak M.N. Three-band model for noninvasive estimation of chlorophyll, carotenoids, and anthocyanin contents in higher plant leaves // Geophys. Res. Lett. 2006. V. 33 (L11402). doi 10.1029/2006GL026457

16.Мерзляк М.Н., Гительсон А.А., Чивкунова О.Б., Соловченко А.Е., Погосян С.И. Использование спектроскопии отражения в анализе пигментов высших растений // Физиология растений. 2003. Т. 50. С. 785792.

17.Челебиева Э., Минюк Г., Дробецкая И., Чубчикова И. Физиолого-биохимические характеристики микроводоросли Ettlia carotinosa Komarek 1989 (Chlorophyceae) в условиях экспериментального стресса // Морской экол. журн. 2013. Т. 12. С. 7887.

18.Han D., Li Y., Hu Q. Biology and commercial aspects of Haematococcus pluvialis // Handbook of Microalgal Culture: Applied Phycology and Biotechnology / Eds. Richmond A., Hu Q. Oxford: Wiley-Blackwell, 2013. P. 388405.

19.Rippka R., Deruelles J., Waterbury J.B., Herdman M., Stanier R.Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria // J. General Microbiol. 1979. V. 111. P. 161.

20.Pal D., Khozin-Goldberg I., Cohen Z., Boussiba S. The effect of light, salinity, and nitrogen availability on lipid production by Nannochloropsis sp. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011. V. 90. P. 14291441.

21.Morel A. Diffusion de la lumière par les eaux de mer. résultats expérimentaux et approche théorique // Optics Sea. AGARD Lect. Ser. 1973. V. 61. P. 3.1.13.1.76.

22.Naqvi K.R., Merzlyak M.N., Melø T.B. Absorption and scattering of light by suspensions of cells and subcellular particles: an analysis in terms of Kramers-Kronig relations // Photochem. Photobiol. Sci. 2004. V. 3. P. 132137.

23.Gladstone J.H., Dale T. Researches on the refraction, dispersion, and sensitiveness of liquids // Phil. Trans. R. Soc. London. 1863. V. 153. P. 317343.

24.Stramski D. Refractive index of planktonic cells as a measure of cellular carbon and chlorophyll a content // Deep Sea Research. Part I / Oceanographic Res. Papers. 1999. V. 46. P. 335351.

25.Aas E. Refractive index of phytoplankton derived from its metabolite composition // J. Plankton Res. 1996. V. 18. P. 22232249.

Линейные алгоритмы* для определения параметров культур исследованных микроводорослей по их оптическим спектрам

* Алгоритмы вида Y = kx + C, где Y  параметр культуры, k , C  константы.

** Коэффициент корреляции; при данном размере выборки (n = 10) и уровне значимости P = 0.95 для надежного определения искомого параметра минимальное значение |r| = 0.63.

*** Число образцов, использованное для проверки алгоритма и расчета RMSE.

 

ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

Рис. 1. Средние спектры поглощения (а, б) и рассеяния (в, г) клеточных суспензий H. pluvialis (a, в) и E. carotinosa (б, г) для образцов с различным содержанием хлорофилла. 

На панелях (а) и (б) показаны спектры оптической плотности до (14, тонкие линии) и после компенсации вклада светорассеяния (14, жирные линии) и нормировки на длинноволновый максимум хлорофилла (1'–4'). Диапазоны содержания хлорофилла (мг/л) в образцах указаны цифрами: 1  < 10, 2  10–20, 3  20–30, 4  30–40.

Рис. 2. Спектры коэффициента линейной корреляции (а, б) суммарного содержания хлорофиллов с компенсированной (1) и некомпенсированной (2) оптической плотностью суспензии и вкладом светорассеяния (3), а также зависимости корректированной оптической плотности от содержания хлорофиллов в некоторых спектральных диапазонах (в–е) для культур H. pluvialis (а, в, г) и E. carotinosa (б, д, е). На (в): ■  Ã700, ★  Ã 550.

Рис. 3. Спектры коэффициента линейной корреляции содержания сухого веса клеток H. pluvialis (а) и E. carotinosa (б) с вкладом светорассеяния (1), некомпенсированной (2) и компенсированной (3) оптической плотностью суспензии. На врезках: зависимость вклада светорассеяния (S) в NIR от сухого веса.

Рис. 4. Соответствие полученных экспериментально и рассчитанных для H. pluvialis (темные символы) и E. carotinosa (светлые символы) по спектральным индексам содержания хлорофилла (а), сухого веса культуры (б) и для E. carotinosa числа клеток (в).