УДК 581.1
ГИДРОДИНАМИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ
ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО ПОТОКА И ТУБУЛИНОВЫЙ
КОМПОНЕНТ ЦИТОСКЕЛЕТА
В КЛЕТКАХ МЕЖДОУЗЛИЯ Elodea densa
© 2010 г. В. Н. Воробьев, А. В. Анисимов
Учреждение Российской академии наук Казанский институт биохимии и
биофизики Казанского научного центра РАН, Казань
Поступила в редакцию 23.01.2009 г.

Для исследования гидродинамических показателей цитоплазматического потока методом спин-эхо ЯМР
изучали трансляционную диффузию воды цитоплазмы в клетках стебля элодеи (Elodea densa (Planch.)
Casp.), измененную действием антимитотических препаратов. Под влиянием колхицина динамика
трансляционного смещения имела вид кривой с экстремумом в первые часы наблюдения. Действие
винбластина выражалось в монотонном снижении трансляционной диффузии. Суточное воздействие
колхицина или винбластина приводило к снижению трансляционной диффузии. Все различия в действии
использованных препаратов фиксировали на фоне отсутствия изменений в скорости
цитоплазматического потока.

Ключевые слова: Elodea densa – цитоскелет – диффузия – ЯМР

Сокращения: ДЗ – диффузионное затухание; D* ? коэффициент диффузии воды
цитоплазмы, измененный цитоплазматическим течением.
Адрес для корреспонденции: Воробьев Владимир Николаевич. 420111 Казань, ул.
Лобачевского, 2/31. Учреждение Российской академии наук Казанский институт
биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН. Электронная почта:
vorobyev@mail.knc.ru

ВВЕДЕНИЕ
Важнейшим показателем функционирования растительной клетки является
цитоплазматический транспорт, который осуществляется при помощи
специализированных механохимических АТФаз, называемых моторными белками [1].
Интенсивность транспортного потока регулируется как взаимным влиянием
тубулинового и актинового компонентов цитоскелета, так и активностью моторных
белков [2?4]. Особенность транспортных процессов в цитоплазме растительной клетки
такова, что формируемый цитоплазматический поток не обеспечивает интенсивного
перемешивания, поскольку в биоколлоиде с низким числом Рейнольдса, каковым
является цитоплазма, сильны межмолекулярные взаимодействия [5]. Эффективность
перемешивания зависит от гидродинамических параметров цитоплазмы, которые
связаны с диффузией воды и растворенных в ней веществ. Именно диффузия
обеспечивает реагентами реакционные объемы субклеточных компартментов [6]. К
одному из вероятных механизмов регуляции клеткой гидродинамических параметров
ее цитоплазмы можно отнести степень структурированности цитоскелета, например,
отношение свободного тубулина к тубулину микротрубочек.
В настоящей работе исследовали зависимость трансляционной диффузии воды
цитоплазмы в цитоплазматическом потоке от целостности микротрубочкового
цитоскелета, который модифицировался винбластином или колхицином.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Строение стебля элодеи (Elodea densa (Planch.) Casp.) позволяет определять
параметры цитоплазматического потока параллельно как методом синхронного
сопровождения с использованием микроскопии [7], так и спин-эхо методом ЯМР с
использованием техники селективной регистрации диффузионного переноса только по
цитоплазме [8].
Приготовление образцов. После удаления листьев стебель нарезали на сегменты
до 1 см, которые инфильтрировали в растворах колхицина или винбластина в
концентрации 1 мМ при давлении 10 Па в течение 60 мин. После проведения
измерений сегменты помещали в исходный раствор, в котором экспонировали при
нормальных условиях. Жизнеспособность клетки определяли по наличию
цитоплазматического потока.
Визуальная оценка цитоплазматических течений. На продольном срезе
междоузлия в неповрежденных клетках, средний размер которых превышал 500 мкм,
методом синхронного сопровождения [7] определяли скорость цитоплазматического
течения. Суть метода заключалась в наложении на изображение клетки в поле зрения
микроскопа метки в виде светящейся точки. Скорость движения точки
синхронизировали со скоростью движущихся цитоплазматических включений. В
качестве метки использовали луч с экрана осциллографа, который с помощью
рисовального аппарата, закрепленного на микроскопе, заводили в окуляр. Скорость
движения луча задавали генератором пилообразного напряжения. Время прохождения
лучом определенного расстояния фиксировали частотомером, а затем с учетом
увеличения микроскопа рассчитывали скорость движения. Измерения проводили при
комнатной температуре. Значения скоростей определяли до инфильтрации, сразу после
инфильтрации и через 24 ч перед последними ЯМР-измерениями.
Метод ЯМР. Эксперименты проводили на оригинальном спин-эхо ЯМР-
релаксометре-диффузометре на частоте 16 МГц с использованием техники
импульсного градиента магнитного поля [9]. В качестве базовой использовали
импульсную последовательность стимулированного эха [10]. Получаемое
диффузионное затухание эха (ДЗ) описывается выражением:
R = exp [–?2 ?2g2 (td – 1/3 ?)D],                            (1)
где ? ? гиромагнитное отношение, D ? коэффициент самодиффузии, ? и g ? величина и
длительность импульсов градиента магнитного поля соответственно, td ? интервал
между ними ? время диффузии, R – относительная амплитуда эха, равная A(g)/A(0).
Импульсный градиент магнитного поля создавали в аксиальном направлении стебля.
ДЗ получали в условиях изменения величины g (32 шага с максимумом при 4.2 Т/м)
при фиксированных параметрах ? = 250 мкс и времени диффузии td = 15мс.
Для подавления сигнала от воды вакуоли перед диффузионными измерениями
включали инвертирующий 180? радиочастотный импульс в момент времени
релаксационного перехода намагниченности от воды вакуоли через нуль (нулевой
момент) [8, 11].
Для создания и поддержания температуры (24?25?С) была использована
жидкостная схема термостатирования с точностью поддержания температуры образца в
датчике ЯМР-релаксометра-диффузометра выше 1?С.
Обработка результатов. В оригинальном спин-эхо ЯМР-релаксометре-
диффузометре значение фактора R варьирует в зависимости от отношения сигнал/шум
в диапазоне до 10%, но усредняется по нескольким измерениям аппроксимирующей
экспонентой так, что точность определения коэффициентов диффузии лучше 5%.
Представлены средние арифметические коэффициентов диффузии из 3 независимых
экспериментов, каждый из которых проведен в 3-кратной биологической повторности,
и их стандартные отклонения. Скорости движения цитоплазмы из 9 независимых
экспериментов даны как средние арифметические и их стандартные отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В экспериментах скорость цитоплазматических течений под действием
винбластина или колхицина изменилась незначительно: в контрольных образцах
скорость движения цитоплазмы составляла 17 ± 2 мкм/с, а в опытных ? 18 ± 1.5 мкм/с,
что указывает на сохранение функционирования акто-миозинового мотора. При этом
изменение коэффициентов диффузии воды цитоплазмы было различно (рис. 1).
После инфильтрации контрольного образца в дистиллированной воде
коэффициент диффузии воды цитоплазмы (D*), измененный цитоплазматическим
течением, незначительно увеличивался (рис. 1, кривая 1). Инфильтрация образца в
растворе винбластина (кривая 3) приводила к монотонному снижению D*. Под
влиянием колхицина динамика D* имела вид кривой с экстремумом в первые часы
наблюдения (кривая 2).
Винкаалкалоиды, к которым относится винбластин, подавляют полимеризацию
микротрубочек, связываясь с тубулином как на «+», так и на «?» концах. Кроме того,
они ингибируют гидролиз ГТФ, связанной с ?-тубулином [12]. Как следствие,
концентрация немикротрубочкового тубулина в цитоплазме возрастает, что приводит к
снижению D* (рис. 1, кривая 3).
Действие колхицина на микротрубочки выражается в повышении
нуклеозидтрифосфатной активности тубулина. Комплекс этого соединения с
тубулином принимает участие в нуклеации микротрубочек, т.е. в образовании
“затравки”, с которой начинается рост. В результате концентрация колхицин-связанных
димеров тубулина в цитоплазме возрастает, а концентрация свободного тубулина
снижается, что находит отражение в сложном поведении зависимости D* от времени
(рис. 1, кривая 2), по крайней мере, в первые часы наблюдения. Присоединение
колхицин-активируемой “затравки” к «+»-концу микротрубочки блокирует
полимеризацию этого конца [13, c. 73], а последующая деструкция микротрубочек
повышает концентрацию димеров тубулина в цитоплазме.
В целом, за время наблюдения влияние колхицина или винбластина приводила к
снижению D* на 0.3 ? 10–9 и 0.5 ? 10–9 м2/с соответственно. Проведенные исследования
показали, что параметры трансляционной диффузии воды цитоплазмы зависят не
только от скорости цитоплазматического потока, но и от структурной организации
тубулинового компонента цитоскелета.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Минин А.А., Кулик А.В. Внутриклеточный транспорт. Принципы регуляции //
Успехи биол. химии. 2004. Т. 44. С. 225?262.
2. Kobayashi H., Fukuda H., Shibaoka H. Interrelation between the Spatial Disposition of
Actin Filaments and Microtubules during the Differentiation of Tracheary Elements in
Cultured Zinnia Cells // Protoplasma. 1988. V. 143. P. 29?37.
3. Takesue K., Shibaoka H. The Cyclic Reorientation of Cortical Microtubules in
Epidermal Cells of Azuki Bean Epicotyls: The Role of Actin Filaments in the Progression
of the Cycle // Planta. 1998. V. 205. P. 539?546.
4. Hasezawa S., Sano T., Nagata T. The Role of Microfilaments in the Organization and
Orientation of Microtubules during the Cell Cycle Transition from M Phase to G1 Phase in
Tobacco BY-2 Cells // Protoplasma. 1998. V. 202. P. 105?114.
5. Pickard W.F. The Role of Cytoplasmic Streaming in Symplastic Transport // Plant Cell
Environ. 2003. V. 26. P. 1?15.
6. Luby-Phelps K. Cytoarchitecture and Physical Properties of Cytoplasm: Volume,
Viscosity, Diffusion, Intracellular Surface Area // Int. Rev. Cytol. 2000. V. 192. P.
189?221.
7. Воробьев В.Н., Анисимов А.В. Особенности влияния редкоземельных ионов на
скорость ротационного движения хлоропластов // Биофизика. 1995. Т. 40. С.
551?555.
8. Vorob’ev V.N., Anisimov A.V., Dautova N.R. Contribution of the Actomyosin Motor to
the Temperature-Dependent Translational Diffusion of Water by Cytoplasmic Streaming in
Elodea canadensis Cells // Protoplasma. 2004. V. 224. P. 195?199.
9. Steiskal D., Tanner J.E. Self-Diffusion Measurements: Spin-Echoes in the Presence of a
Time Dependent Field Gradient // J. Chem. Phys. 1965. V. 42. P. 288?292.
10. Tanner J.E. Use of the Stimulated Echo in NMR Diffusion Studies // J. Chem. Phys.
1970. V. 52. P. 2523?2526.
11. Vorob’ev V.N., Anisimov A.V., Dautova N.R. Water Diffusion in Streaming in Elodea
Internodal Cells under Effect of Antimitotic Agents // Eur. Biophys. J. 2008. V. 37. P.
975?978.
12. Gupta S., Bhattacharyya B. Antimicrotubular Drugs Binding to Vinca Domain of
Tubulin // Mol. Cell Biochem. 2003. V. 253. P. 41?47.
13. Фултон А. Цитоскелет: Архитектура и хореография клетки. М.: Мир, 1987. 120 с.


ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

Зависимость коэффициента диффузии воды цитоплазмы (D*) от времени экспозиции
предварительно инфильтрированных при давлении 10 Па в течение 60 мин междоузлий
в дистиллированной воде (1); 1 мМ растворе колхицина (2) или 1 мМ растворе
винбластина (3).