УДК 581.1
ПОВЫШЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ПРОЛИНА В РАСТЕНИЯХ КУКУРУЗЫ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ФРАГМЕНТ ГЕНА ПРОЛИНДЕГИДРОГЕНАЗЫ В АНТИСМЫСЛОВОЙ ОРИЕНТАЦИИ
© 2012 г. Е. М. Моисеева*, Д. А. Агафонов**, В. А. Великов*,**,
И. В. Волохина*, М. И. Чумаков*,**
* Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов, Саратов
** Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов

Поступила в редакцию 04.02.2011 г.

Фрагмент первого экзона гена пролиндегидрогеназы арабидопсиса (Arabidopsis thaliana L.) в антисмысловой ориентации был перенесен в геном кукурузы (Zea mays L.) методом агробактериальной трансформации в условиях in planta с целью увеличения содержания свободного пролина в клетках кукурузы. Наличие генетической конструкции с антисмысловой последовательностью фрагмента гена пролиндегидрогеназы (АПГП) в геноме диплоидных проростков кукурузы подтверждено методом ПЦР. Вставки Т-ДНК с АПГП обнаружены в геноме 30 растений (1.2% от 2409 проанализированных проростков) поколения Т0. Показано достоверное увеличение в 4.6 раза содержания пролина в листьях трансформированных растений кукурузы.

Ключевые слова: Zea mays – агробактериальная трансформация – пролиндегидрогеназа – антисмысловая супрессия – свободный пролин
________________________________________________
Сокращения: АПГП – антисмысловая последовательность гена пролиндегидрогеназы; ЗМСП – линия кукурузы “Зародышевый маркер Саратовский пурпурный”.
Адрес для корреспонденции: Чумаков Михаил Иосифович. 410049 Саратов, пр. Энтузиастов, 13. Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН. Факс: 8 (8452) 97-03-83; электронная почта: chumakov@ibppm.sgu.ru
ВВЕДЕНИЕ

В сельском хозяйстве интенсивного типа все большее значение приобретают хорошо адаптированные к определенным географическим зонам сорта растений. Так как посевные площади, благоприятные для оптимального с.-х. производства, в последнее время сокращаются, есть потребность в получении устойчивых урожаев в неблагоприятных для растений зонах, в частности, в засушливых условиях. Кукуруза – одна из важнейших зерновых культур – является перспективной для освоения земель Юго-Востока России с засушливым климатом и засоленными почвами. Хотя кукуруза не относится к ксерофильным или засухоустойчивым культурам, она относительно хорошо переносит засуху до фазы выхода в трубку. Однако недостаток влаги во время цветения и молочной спелости заметно снижает урожайность [1].
Устойчивость к засухе и засолению почвы – комплексные признаки, и полный набор генов, определяющих такой фенотип, не известен. Имеется ряд исследований, связывающих эти признаки с содержанием пролина в тканях растения, который активно синтезируется в ответ на разные стрессовые воздействия (засуху, засоление, холод и др.), выступая в качестве осмопротектора [2]. Уровень пролина можно увеличить, усилив его синтез, либо снизив скорость его деградации. Предполагается, что увеличение содержания пролина может повысить устойчивость растений к засухе и повышенному содержанию соли в почве [2]. Так, повышенную неспецифическую устойчивость к засолению и засухе имели растения табака с увеличенным содержанием пролина в тканях [3]. Суперпродукция пролина в трансгенных растениях табака после введения в табак генов proA и proBosm из бактерии Escherichia coli, вовлеченных в биосинтез пролина, увеличивала устойчивость к солевому стрессу [4]. Другой подход состоит в блокировании ферментов, участвующих в деградации пролина. Пролиндегидрогеназа катализирует первый этап превращения пролина в глутаминовую кислоту. Имеется положительный опыт введения конструкции, содержащей супрессор гена пролиндегидрогеназы, в растения табака, которые в результате содержали в 1.5–3.0 раза больше свободного пролина и отличались от контрольных растений большей стрессоустойчивостью в лабораторных условиях [3, 5, 6], и в растения арабидопсиса, которые приобретали повышенную устойчивость к засолению и низким температурам [7]. Растения более солеустойчивого генотипа рапса с меньшей активностью пролиндегидрогеназы обнаруживали способность к более активной аккумуляции пролина, по сравнению с менее устойчивым генотипом [8].
Одной из хорошо зарекомендовавших себя на практике технологий доставки генов в геном растений является агробактериальная трансформация, когда доставка функциональных генов происходит в составе Т-ДНК (transfer DNA), природного вектора почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens. Для трансформации кукурузы нами был разработан и апробирован метод переноса маркерных генов в составе Т-ДНК агробактерий с активированными vir-генами в генеративные клетки кукурузы во время цветения в условиях in planta [9, 10]. Этот метод исключает стадию выращивания взрослого растения из суспензионных или каллусных клеточных культур, снижая затраты на получение трансгенных растений и ускоряя этот процесс.
Целью данной работы являлся перенос антисмысловой последовательности гена пролиндегидрогеназы (АПГП) в геном кукурузы методом агробактериальной трансформации в условиях in planta и количественная оценка содержания пролина в трансформированных растениях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Процедура трансформации. Для трансформации использовали растения кукурузы (Zea mays L.) линии АТ-3, в качестве опылителя  линию кукурузы “Зародышевый маркер Саратовский пурпурный” (ЗМСП). Обе линии любезно предоставлены В.С. Тырновым (каф. генетики Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского). На предварительно изолированные пергаментными изоляторами в период цветения пестичные нити материнской линии кукурузы наносили суспензию клеток агробактерий с активированными vir-генами. Для трансформации использовали штамм A. tumefaciens LBA4404 с бинарным вектором pBiE2 (любезно предоставлен А.В. Кочетовым, Институт цитологии и генетики СО РАН), содержащим маркерный ген неомицинфосфотрансферазы под промотором 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и фрагмент первого экзона АПГП под таким же промотором [6]. После инокуляции осуществляли искусственное опыление кукурузы пыльцой линии ЗМСП и оставляли изолированные початки до созревания зерен. Опытные и контрольные зерновки проращивали в течение 7–8 дней на среде МС с канамицином (200 мкг/мл) c добавлением 150 мМ NaCl в качестве селективного агента для оценки устойчивости к осмотическому стрессу, затем высаживали в грунт.
Проведение ПЦР. Наличие Т-ДНК в геноме проростков кукурузы, выращенных из полученных зерен, выявляли методом ПЦР с прямым и обратным праймерами на генетическую конструкцию АПГП – 5'-AACAAACTGGATCCGGCGATCTTAC-3' и 5'-GAGATGTTGGTCTAGATTTGGCAGC-3' (“Синтол”, Россия) при следующих условиях: предварительная денатурация ДНК при температуре 95ºС в течение 3 мин, цикл: 95ºС – 1 мин, 58ºС – 1 мин, 72ºС – 1 мин (35 циклов). После завершения последнего цикла проводили окончательную достройку цепей при 72ºС в течение 3 мин. Амплификацию проводили на приборе Mastercycler personal (“Eppendorf”, Швеция). Результаты ПЦР визуализировали с помощью гель-электрофореза в 1% агарозном геле. Расчетный размер ожидаемого ПЦР-продукта составляет 0.55 т.п.н.
Контроль контаминации. Чтобы исключить возможность ложноположительного результата ПЦР за счет внесенных во время обработки пестичных нитей кукурузы агробактерий, возможно присутствующих в растительных тканях, проводили контрольную ПЦР на специфические для бактерии A. tumefaciens гены virC1 и virC2, расположенные вне области Т-ДНК Ti-плазмиды [11]. Использовали прямой VCF (5'-ATCATTTGTAGCGACT-3') и обратный VCR (5'-AGCTCAAACCTGCTTC-3') праймеры при следующих условиях ДНК-амплификации: предварительная денатурация ДНК-матрицы – 3 мин при 95ºС, затем 35 циклов с денатурацией ДНК при 95ºС по 1 мин, отжигом праймеров при 55ºС – 1 мин, и элонгацией при 72ºС – 1 мин. Затем проводили окончательную достройку цепей в течение 3 мин при 72ºС. В качестве положительного контроля использовали ДНК, выделенную из A. tumefaciens. Расчетный размер ожидаемого ПЦР-продукта, перекрывающего прилегающие друг к другу участки генов virC1 и virC2, составляет 0.73 т.п.н.
Определение содержания пролина. Содержание свободного пролина в свежем растительном материале определяли с помощью метода Bates с соавт. [12] у пяти ПЦР-позитивных растений в трех биологических повторностях. Содержание свободного пролина в образцах определяли по калибровочной кривой, для чего использовали препарат L-пролина (“Aldrich”, США) в концентрациях 1, 5, 10, 15 и 20 мкг/мл. Полученные данные выражали в мкг пролина в расчете на 1 г сырой массы. Концентрацию пролина определяли в трансгенных растениях гибридов кукурузы линий АТ-3 и ЗМСП, ПЦР-анализ которых подтвердил присутствие в их геноме АПГП (таблица). В качестве контроля использовали нетрансформированные растения гибридов тех же линий.
Статистическая обработка данных. Частоту обнаружения АПГП в геноме кукурузы определяли как среднее арифметическое значение процентов ПЦР-позитивных проростков, полученных из зерен выборки (31 початок), и стандартной ошибки среднего арифметического. Эффективность трансформации рассчитывали, как процент трансформированных ПЦР-позитивных проростков от числа использованных в опыте проростков. Оценку достоверности разницы между содержанием пролина в опытных и контрольных растениях определяли при помощи коэффициента Стьюдента.


РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате эксперимента из 2409 проростков были отобраны 30 ПЦР-положительных растений (рис. 1), проявлявших устойчивость к действию антибиотика и соли. Это составляет 1.2% от общего числа проростков (таблица). При концентрации NaCl 150 мМ наблюдали угнетенное состояние контрольных нетрансформированных растений (отставание в росте, снижение биомассы). Трансгенные растения не проявляли внешних признаков угнетения роста наземной части или корней. Полную гибель контрольных и опытных растений наблюдали при проращивании на среде с добавлением NaCl в концентрации 400 мМ.
Препараты ДНК, выделенной из ПЦР-положительных на АПГП проростков кукурузы, проверяли на наличие специфических для A. tumefaciens генов virC1 и virC2, которые не переносятся с Т-ДНК в растительную клетку [11]. Ни в одном из 12 отобранных случайным образом среди 30 ПЦР-позитивных на АПГП образцов ДНК кукурузы, не были обнаружены нуклеотидные последовательности генов virC1 и virC2 (рис. 2).
Таким образом, ПЦР-положительные на АПГП проростки кукурузы содержат встройки Т-ДНК в своем геноме.
Способность вегетативных органов (особенно листьев) растений накапливать во время засухи пролин является генетически обусловленным признаком засухоустойчивости растений [2]. В ПЦР-положительных на АПГП растениях кукурузы на стадии цветения анализировали содержание свободного пролина в тканях листьев в трех биологических повторностях. Содержание свободного пролина в контрольных растениях колебалось от 24 до 77 мкг/г сырой массы, а в ПЦР-позитивных растениях – от 219 до 303 мкг/г сырой массы (рис. 3). Значение среднего арифметического содержания пролина в трансгенных растениях кукурузы, несущих антисмысловой супрессор пролиндегидрогеназы (247 ± 18 мкг/г сырой массы), превышало в 4.6 раза это значение у контрольных растений (54 ± 11 мкг/г сырой массы). Полученные данные (рис. 3) свидетельствуют о достоверном увеличении содержания свободного пролина в трансгенных растениях, несущих АПГП (P < 0.05), что позволяет говорить о супрессии гена пролиндегидрогеназы в клетках трансгенных растений кукурузы на стадии цветения.
Таким образом, в геном кукурузы впервые осуществлен перенос антисмысловой последовательности фрагмента гена пролиндегидрогеназы в составе Т-ДНК агробактерий. Эффективность трансформации составила 1.2%. ПЦР-позитивные растения кукурузы имели статистически достоверное (P < 0.05) увеличение в 4.6 раза содержания пролина в тканях листа по сравнению с контролем.
Исследование выполнено при частичной поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 11-04-01331-а).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Шмараев Г.Е., Ярчук Т.А., Орел Л.И. Культурная флора СССР // Кукуруза. Т. 6 / М.: Колос, 1982. 295 с.
2.Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция // Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 321–336.
3.Колодяжная Я.С., Титов С.Е., Кочетов А.В., Трифонова Ю.А., Романова A.В., Комарова М.Л., Коваль В.С., Шумный В.К. Оценка солеустойчивости растений табака, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы // Генетика. 2006. Т. 42. С. 278–281.
4.Сохансандж А., Неумывайкин Л.В., Мосейко Н.А., Пирузян Э.С. Перенос бактериальных генов синтеза пролина в растения и их экспрессия под контролем различных растительных промоторов // Генетика. 1997. Т. 33. С. 906–913.
5.Титов С.Е., Кочетов А.В., Коваль В.С., Шумный В.К. Трансгенез как способ повышения устойчивости растений к абиотическим стрессам // Успехи соврем. биологии. 2003. Т. 123. С. 487–494.
6.Кочетов А.В., Титов С.Е., Колодяжная Я.С., Трифонов Е.А., Романова А.В., Комарова М.Л., Коваль М.Л., Шумный В.К. Повышение содержания пролина и осмотического давления клеточного сока у трансформантов табака, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы // Генетика. 2004. Т. 40. С. 282–285.
7.Nanjo T., Kobayashi M., Yoshiba Y., Kakubari Y., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. Antisense Suppression of Proline Degradation Improves Tolerance to Freezing and Salinity in Arabidopsis thaliana // FEBS Lett. 1999. V. 461. P. 205–210.
8.Мохаммед А.М., Ралдугина Г.Н., Холодова В.П., Кузнецов Вл.В. Аккумуляция осмолитов растениями различных генотипов рапса при хлоридном засолении // Физиология растений. 2006. Т. 53. С. 732–738.
9.Чумаков М.И., Рожок Н.А., Великов В.А., Тырнов В.С., Волохина И.В. Трансформация кукурузы путем инокуляции агробактериями пестичных нитей in planta // Генетика. 2006. Т. 42. С. 1083–1088.
10.Мамонтова Е.М., Великов В.А., Волохина И.В., Чумаков М.И. Высокоэффективная встройка Т-ДНК в геном гаплоидных и диплоидных растений кукурузы, трансформированных in planta // Генетика. 2009. Т. 46. С. 578–582.
11.Sawada H., Ieki H., Matsuda I. PCR Detection of Ti- and Ri-Plasmids from Phytopathogenic Agrobacterium Strains // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. P. 828–831.
12.Bates L.E., Waldren R.P., Teare I.D. Rapid Determination of Free Proline for Water Stress Studies // Plant Soil. 1973. V. 39. P. 205–207.
ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

Рис. 1. ПЦР-анализ тотальной ДНК, выделенной из листьев кукурузы, на наличие антисмысловой последовательности фрагмента гена пролиндегидрогеназы (АПГП).
1, 3, 5 – растения кукурузы, содержащие АПГП; 2 – растение кукурузы, не содержащее АПГП; 4 – растение кукурузы, не подвергавшееся трансформации (отрицательный контроль); 6 – плазмидная ДНК из штамма A. tumefaciens LBA4404, содержащего бинарный вектор pBiE2 (положительный контроль); 7 – маркер молекулярного веса с шагом 0.1 т.п.н. (“Fermentas”, Литва).

Рис. 2. ПЦР-анализ тотальной ДНК, выделенной из листьев кукурузы, на участки генов virC1 и virC2.
1–5 – ДНК из проростков кукурузы, содержащая вставку Т-ДНК с АПГП; 6 – тотальная ДНК из клеток A. tumefaciens (штамм LBA4404); 7 – маркер молекулярного веса с шагом 0.1 т.п.н.

Рис. 3. Содержание свободного пролина в листьях кукурузы на стадии цветения.
1–3 – контрольные растения кукурузы (гибриды линий АТ-3 и ЗМСП), не содержащие АПГП; 4–8 – ПЦР-положительные на АПГП растения кукурузы (гибриды линий АТ-3 и ЗМСП). Различия между опытными и контрольными образцами достоверны при P < 0.05.