ВЛИЯНИЕ СТРЕССОВ НА СОДЕРЖАНИЕ ПИГМЕНТОВ И ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ В КЛЕТКАХ МИКРОВОДОРОСЛИ Desmodesmus sp. ИЗ БЕЛОМОРСКОГО ГИДРОИДА  2013 г. А. Е. Соловченко*,**, О. Б. Чивкунова*, Л. Р. Семенова*, И. О. Селях*, П. Н. Щербаков*, Е. А. Карпова*, Е. С. Лобакова* * Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва ** Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва Поступила в редакцию 17.09.2012 г. Исследовали влияние интенсивности освещения, наличия азота в среде культивирования и плотности инокулюма на рост, динамику содержания жирных кислот (ЖК) в составе ацилсодержащих липидов, а также каротиноидов (Кар) и хлорофиллов (Хл) у беломорской одноклеточной зеленой водоросли Desmodesmus sp. 3Dp86E-1, выделенной из гидроида Dynamena pumila L. На полной среде BG-11 скорость роста не лимитировалась освещенностью до 480 мкE/(м2 с) ФАР, а определялась плотностью инокулюма при засеве; в отсутствие азота свет высокой интенсивности снижал скорость роста, этот эффект был менее выражен при высокой плотности инокулюма. Максимальное содержание ЖК липидов клеток регистрировали при азотном голодании и высокой освещенности (30% сухого веса на 3 сутки); максимальное содержание ЖК в культуре (0.25 г/л) отмечено при культивировании микроводоросли на полной среде при 480 мкE/(м2 с). Характерной реакцией на стресс у Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 было повышение относительного содержания в ее липидах олеиновой кислоты на фоне снижения доли линоленовой. У этой микроводоросли не выявлено существенного повышения содержания Кар при стрессе. Дефицит азота вызывал резкое снижение содержания Хл при сравнительно постоянном содержании Кар, тогда как на полной среде свет высокой интенсивности не вызывал адаптивных реакций пигментного аппарата. Изменения спектров поглощения суспензии клеток Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 отражали повышение вклада Кар по отношению к вкладу Хл в поглощение света культурой и характеризовались высокой корреляцией с накоплением ацилсодержащих липидов. Обсуждаются механизмы адаптации Desmodesmus sp. 3Dp86E-1к сильному свету, дефициту азота и комбинированному стрессу в связи с ее возможным применением в биотехнологии. -------------------------------------------- Сокращения: Кар  каротиноид(ы); ЛГ – липидные глобулы; ТАГ  триацилглицерины; Хл  хлорофилл(ы). Адрес для корреспонденции: Соловченко Алексей Евгеньевич. 119234 Москва, ГСП-1, Воробьевы горы, д. 1, корп. 12. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, каф. биоинженерии. Факс: 007 (495) 939-38-07; электронная почта: solovchenko@mail.bio.msu.ru Ключевые слова: Desmodesmus sp. – дефицит азота – жирные кислоты – каротиноиды – хлорофиллы – сильный свет – фотоадаптация ВВЕДЕНИЕ В природе фотосинтезирующие микроорганизмы часто сталкиваются с резкими перепадами температуры, освещенности и дефицитом элементов минерального питания, в особенности азота [1, 2]. В этих условиях определенное преимущество фотоавтотрофам может давать существование в составе ассоциаций с гетеротрофными и азотфиксирующими микроорганизмами, а также с животными [3]. Вместе с тем, подобный образ жизни может оказывать существенное влияние на толерантность микроводорослей к экстремальным значениям интенсивности света и дефициту связанного азота, а также на отклики их пигментного аппарата и липидного метаболизма на эти факторы [4]. Известно, что при действии стрессоров различной природы у многих свободноживущих представителей Chlorophyta наблюдается координированный синтез немембранных липидов  триацилглицеринов (ТАГ), откладывающихся в цитоплазме клеток водорослей в виде липидных глобул (ЛГ), число и размеры которых значительно увеличиваются при дефиците азота и интенсивном освещении [2]. Предполагается, что ТАГ выполняют функции депо для фотоассимилятов, которые не могут быть утилизированы в неблагоприятных условиях. Наличие стока для фотоассимилятов сокращает время, в течение которого компоненты электрон-транспортной цепи хлоропластов находятся в восстановленном состоянии. Это ведет к снижению стационарной концентрации активных форм кислорода, что, в свою очередь, снижает риск окислительного повреждения клеток микроводорослей [2, 5]. Вероятно, водоросли, живущие в составе ассоциаций и симбиозов, в меньшей степени подвергаются стрессам из-за недостатка азота и чрезмерной освещенности, поскольку организм-хозяин способен, по крайней мере, частично, обеспечивать фотосимбионта связанным азотом и защищать от интенсивного излучения [6, 7]. Не исключено, что это может приводить к снижению стресс-толерантности микроводорослей, длительное время сосуществовавших с организмами-партнерами. В этой связи представляется важным изучение реакции на свет и дефицит азота у свободноживущих и симбиотических микроводорослей с потенциально высокой способностью к синтезу запасных липидов, к которым относятся и недавно выделенные водоросли из беспозвоночных животных Белого моря [8]. Следует отметить, что выяснение этого вопроса существенно и для определения пригодности этих микроорганизмов для выращивания в условиях интенсивной культуры. Дополнительный интерес к этим микроорганизмам обусловлен их высоким потенциалом для использования в биотехнологии с целью получения полиненасыщенных ЖК и биоизъятия углекислоты из выбросов промышленных предприятий. В настоящей работе объектом исследования служила одноклеточная микроводоросль 3Dp86E-1, выделенная из гидроида Dynamena pumila L. (1758) и идентифицированная как Desmodesmus sp. (GenBank accession # JQ313132) [8, 9]. В ходе предварительных исследований установлено, что даже в отсутствие дефицита азота эта микроводоросль способна накапливать много ЖК в составе ацилсодержащих липидов  более 50% сухого веса на поздней стационарной стадии (25 и более суток культивирования). Основной целью работы явилось исследование влияния интенсивности освещения и наличия азота в среде на рост, динамику содержания ЖК липидов, хлорофиллов (Хл) и каротиноидов (Кар). Особое внимание уделялось связи динамики вышеперечисленных параметров с изменениями оптических свойств суспензий Desmodesmus sp. при выращивании в различных условиях. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Условия культивирования. Водоросль Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 (далее для краткости называемая Desmodesmus) выращивали так же, как в работе [10], на полной среде BG-11 и безазотной среде BG-110 [11], в стеклянных цилиндрах диаметром 6.6 см и емкостью 1.5 л, при постоянном освещении светодиодными лампами белого света средней (110 мкE/(м2 с) ФАР) или высокой (480 мкE/(м2 с) ФАР) интенсивности. Интенсивность освещения измеряли квантометром LiCor 850 (“LiCor”, США). Культуру непрерывно барботировали воздухом и поддерживали температуру 27°С. В различных опытах использовали инокулюм с содержанием хлорофиллов 5 либо 25 мг/л. Для создания дефицита азота клетки, осажденные центрифугированием, трижды отмывали стерильной дистиллированной водой и ресуспендировали в среде BG-110, после чего культуру выращивали в описанных выше условиях. Экстракция и анализ пигментов. К осажденным центрифугированием (3000 g, 15 мин) клеткам добавляли смесь хлороформа c метанолом (2 : 1), гомогенизировали в гомогенизаторе “стеклотефлон”, инкубировали в течение 1 ч при 4°С, затем к гомогенату добавляли воду (1/5 часть от объема гомогената), перемешивали и центрифугировали для быстрого разделения фаз (3000 g, 15 мин). Экстракцию повторяли до обесцвечивания осадка. Хлороформные фазы экстрактов объединяли, при необходимости упаривали на роторном испарителе Laborota (“Heidolf”, Германия) и использовали для дальнейшего анализа. Общие Хл и Кар определяли спектрофотометрически по формулам Wellburn [12]. В отдельных экспериментах проводили ВЭЖХ-анализ пигментов по методу [13]. Анализ ЖК ацилсодержащих липидов. Хлороформную фазу экстрактов, приготовленных по вышеописанному методу, упаривали досуха, подвергали переметилированию путем инкубации с 2% раствором H2SO4 в метаноле в течение 1.5 ч при 80ºС, и состав полученных метиловых эфиров ЖК анализировали методом ГЖХ согласно Cohen с соавт. [14]. В качестве внутреннего стандарта к образцам добавляли гептадекановую (маргариновую) кислоту. Идентификацию метиловых эфиров ЖК проводили путем ко-хроматографии с чистыми веществами (“Sigma”, США) и по эквивалентной длине углеродной цепи [15]. Спектральные измерения. Спектры поглощения экстрактов пигментов и суспензий клеток регистрировали на спектрофотометре Hitachi 150-20 (Япония), снабженном 150-миллиметровой интегрирующей сферой; измеренные спектры компенсировали на рассеяние по методу, разработанному Мерзляком с соавт. [16]. Эксперименты проводили в трехкратной повторности. Если не указано иное, на рисунках представлены средние значения и их стандартные ошибки. РЕЗУЛЬТАТЫ Рост культуры При засеве среды BG-11 инокулюмом низкой плотности (5 мг/л Хл) скорость роста культуры Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 не зависела от интенсивности освещения и составляла приблизительно 0.15 г/(л сутки). Накопление биомассы к 14 суткам роста  1.75 г/л (рис. 1а, кривые 1, 2). При засеве среды BG-11 инокулюмом высокой плотности (25 мг/л Хл) скорость роста была выше (0.30 г/(л сутки); рис. 1а, кривая 3); накопление биомассы к 14 суткам роста составило около 3 г/л. Скорость роста на свету средней интенсивности при высокой начальной плотности культуры (данные не приводятся) была идентична таковой при низкой начальной плотности (рис. 1, кривые 1). При выращивании на среде BG-110 темпы роста на свету средней интенсивности (110 мкЕ/(м2 с) ФАР) не отличались от таковых на полной среде (рис. 1а, 1б; кривые 1). В то же время, на свету высокой интенсивности (480 мкЕ/(м2 с) ФАР) скорость роста была ниже (кривые 2, 3 на рис. 1а, 1б). Данный эффект был более выражен в случае культуры с низкой стартовой плотностью (5 мг/л Хл) по сравнению с культурой, засеянной с 25 мг/л Хл. Содержание жирных кислот в составе ацилсодержащих липидов Как видно на рис. 2а, на полной среде BG-11 массовая доля ЖК ацилсодержащих липидов в клетках Desmodesmus к 4 суткам роста увеличивалась примерно в три раза по сравнению с инокулюмом, после чего оставалась постоянной и равной приблизительно 10% сухого веса клеток независимо от интенсивности освещения и плотности инокулюма. В отличие от роста на полной среде, при культивировании на среде BG-110 динамика содержания ЖК липидов в клетках Desmodesmus зависела от освещенности и начальной плотности культуры. В ходе роста культуры с начальной плотностью инокулюма 5 мг/л Хл на свету средней интенсивности наблюдали незначительное повышение содержания этерифицированных ЖК (примерно до 15% сухого веса к 14 суткам; рис. 2б, кривая 1). У культуры с начальной плотностью инокулюма 5 мг/л Хл при росте на интенсивном свету содержание ЖК в липидах клеток достигало 30% уже к третьим суткам культивирования, затем снижалось до 25%, после чего практически не изменялось (рис. 2б, кривая 2). При высокой освещенности и начальной плотности инокулюма 25 мг/л Хл содержание ацилсодержащих липидов увеличивалось медленнее и выходило на плато к 7–8 суткам культивирования, составляя около 20% сухого веса (рис. 2б, кривая 3). Содержание ЖК липидов в культуре (рис. 2в, 2г), было максимальным (250 мг/л) при выращивании на полной среде культуры с высокой начальной плотностью при высокой интенсивности света (рис. 2в, кривая 3). В остальных изученных вариантах динамика и максимальные значения содержания ЖК в составе липидов были сходными и достигали 180 мг/л (рис. 2в, кривые 1, 2 и рис. 2г). Следует отметить, что при культивировании на среде BG-110 повышение содержания ЖК липидов в культуре прекращалось к 10 суткам культивирования (рис. 2г), в то же время, на полной среде накопление ацилсодержащих липидов продолжалось и после 12 суток роста (рис. 2в). Хроматографический анализ не выявил изменений качественного состава ЖК ацилсодержащих липидов (подробнее см. [8]) клеток Desmodesmus в изученных условиях культивирования, однако отмечены характерные изменения количественного состава ЖК липидов при стрессе, вызванном дефицитом азота (рис. 3, светлые символы), выражавшиеся в трехкратном снижении содержания α-линоленовой кислоты (18:3) с 30.1 до 10.0% от суммы ЖК липидов на фоне повышения содержания олеиновой кислоты (18:1) с 9.7 до 30.8%. Как следствие, соотношение 18:1/18:3 в ацилсодержащих липидах за первые семь суток культивирования увеличивалось на порядок (с 0.3 до 3.0) и в дальнейшем оставалось приблизительно на одном уровне. При культивировании на полной среде данный эффект не наблюдался (рис. 3, темные символы). Изменение пропорций остальных ЖК в составе ацилсодержащих липидов было незначительным (данные не приводятся). Содержание хлорофиллов и каротиноидов Динамика содержания Хл и Кар в суспензии клеток Desmodesmus, а также соотношения между этими пигментами представлена на рис. 4. На полной среде во всех изученных вариантах наблюдалось увеличение содержания суммы Хл, пропорциональное увеличению биомассы культуры, замедлявшееся лишь после 12 суток культивирования (рис. 1 и 4а). На среде, не содержавшей азота, во всех случаях наблюдали к 14 суткам значительное снижение содержания Хл по сравнению с инокулюмом (рис. 4б). Согласно данным ВЭЖХ, среди Кар микроводоросли Desmodesmus преобладали лютеин и β-каротин, кроме того, обнаружены ксантофиллы виолаксантинового цикла (виолаксантин, антераксантин и зеаксантин), а также неоксантин, что типично для Chlorophyta [17]. В наших экспериментальных условиях изменения качественного состава Кар не наблюдалось. Содержание Кар при росте на среде BG-11 при средней интенсивности освещения изменялось синхронно с содержанием Хл (рис. 4а и 4в, кривая 1). Как следствие, соотношение Кар/Хл практически не изменялось по сравнению с инокулюмом (рис. 4д, кривая 1). При высокой интенсивности освещения на среде BG-11 увеличение содержания Кар опережало увеличение содержания Хл (рис. 4д, кривые 2, 3). В культуре, выращенной из инокулюма низкой плотности, рост соотношения Кар/Хл прекращался на 10 сутки культивирования (рис. 4д, кривая 2), в то время как в культуре из инокулюма высокой плотности, выращиваемой на свету высокой интенсивности, это соотношение продолжало увеличиваться за счет дальнейшего снижения содержания Хл (рис. 4д, кривая 3). На среде BG-110 содержание Кар изменялось пропорционально изменениям содержания Хл, однако амплитуда изменений была существенно меньше (ср. рис. 4б и 4г). Как следствие, при дефиците азота наблюдали значительное (в 5 раз) увеличение соотношения Кар/Хл, несмотря на снижение абсолютного содержания Кар. При этом максимальное соотношение Кар/Хл отмечали у культур из инокулюма низкой плотности, растущих на свету высокой интенсивности (рис. 4е, кривая 2), а минимальное  у культур из инокулюма высокой плотности, выращиваемых при той же освещенности (рис. 4е, кривая 3). Связь динамики содержания пигментов, ЖК липидов и изменения оптических свойств клеток Компенсированные на светорассеяние спектры поглощения клеточных суспензий Desmodesmus (рис. 5) в красной области содержали полосу поглощения Хл a с максимумом около 678 нм и плечо при 650 нм, обусловленное поглощением Хл b. Поглощение суспензии в сине-фиолетовой части спектра определялось совместным поглощением Хл a (основной максимум около 440 нм) и Кар (максимум около 485 нм). Повышение амплитуды в сине-зеленой области спектров поглощения, нормированных по длинноволновому максимуму Хл, определялось повышением вклада фотозащитных Кар [13, 17] в поглощение света клетками. Таким образом, анализ нормированных спектров дает информацию об адаптивных реакциях фотосинтетического аппарата микроводорослей на действие стрессоров. Сравнительный анализ компенсированных на светорассеяние спектров поглощения суспензий клеток Desmodesmus, нормированных по длинноволновому максимуму поглощения Хл, показал, что при росте на среде BG-11, сопровождающимся синхронным увеличением содержания Хл и Кар (рис. 4), происходят лишь незначительные изменения формы спектров независимо от интенсивности освещения (тонкие линии на рис. 5а–5в). Сходная картина наблюдалась у культур из инокулюма низкой плотности, выращиваемых на свету высокой интенсивности (рис. 5а, толстые линии). В то же время, на свету высокой интенсивности отмечено значительное повышение амплитуды нормированных спектров поглощения в синей области (рис. 5б и 5в, толстые линии). Этот эффект был более выражен у культуры из инокулюма низкой плотности по сравнению с культурой из инокулюма высокой плотности (ср. толстые линии на рис. 5б и 5в). Соответственно, вариация в синей области спектра у данных культур была значительно выше, чем у культур, выращиваемых на полной среде. Согласно данным анализа стандартного отклонения, максимумы вариации спектров поглощения располагались при 425, 450 и 480 нм (рис. 5). Сопоставление нормированных спектров поглощения суспензий с динамикой содержания ЖК ацилсодержащих липидов выявило связь между изменением этих параметров в культурах, испытывавших дефицит азота; на полной среде подобная связь не выявлена. На рис. 6 представлены графики изменения нормированного поглощения на 480 нм (в полосе максимума поглощения Кар, рис. 5) в зависимости от содержания ЖК липидов. Так, на свету средней интенсивности рост содержания липидов в биомассе сопровождался линейным (r2 = 0.82) увеличением отношения OD480/OD678 (рис. 6а, кривая 1′), тогда как на свету высокой интенсивности эта связь приобретала экспоненциальный характер (рис. 6а, кривые 2′, 3′). Величина OD480/OD678 у культур, выращенных на свету средней интенсивности, также была линейно связана с содержанием ЖК липидов клеток, рассчитанным на единицу объема культуры (рис. 6б, кривая 1′). При росте на свету высокой интенсивности эта связь также становилась экспоненциальной, однако ее параметры существенно различались в зависимости от начальной плотности культуры (ср. кривые 2′ и 3′ на рис. 5б). При культивировании на полной среде величина OD480/OD678 варьировала незначительно и не зависела от содержания ЖК ацилсодержащих липидов (рис. 6, темные символы). ОБСУЖДЕНИЕ Исследование кривых роста показало, что темпы роста в интенсивной культуре зеленой микроводоросли Desmodesmus, изолированной из ассоциации с беломорским гидроидным полипом Dynamena pumila, в значительной степени зависит от наличия связанного азота в среде культивирования. Недостаток азота замедлял рост культуры и ускорял наступление стационарной стадии; напротив, в присутствии азота стационарная стадия не была достигнута за 14 суток культивирования (рис. 1). Эта зависимость проявлялась при росте на свету высокой интенсивности, тогда как на свету средней интенсивности она была выражена слабо (ср. кривые 1 и 2, 3 на рис. 1а и 1б). В естественной среде обитания микроводоросль Desmodesmus входит в состав ассоциированного с гидроидным полипом поликомпонентного микробного сообщества вместе с другими фототрофами, а также с гетеротрофными и азотфиксирующими бактериями [3, 9, 18]. Вероятно, это обстоятельство является одной из причин низкой толерантности Desmodesmus к дефициту азота в среде. Как и у многих свободноживущих видов, азотное голодание приводит к увеличению содержания ацилсодержащих липидов в клетках. Повышение этого параметра в наших условиях положительно коррелировало с интенсивностью освещения (рис. 2а; см. также [2, 5]). Следует отметить, что при росте на среде BG-11 и высокой интенсивности освещения, несмотря на низкую массовую долю ЖК липидов в клетках Desmodesmus, при расчете на единицу объема культуры содержание этих соединений было высоким (рис. 3в) за счет более высокой плотности клеток (рис. 1а). Изменения содержания пигментов, а также ацилсодержащих липидов клеток, обнаруженные в настоящей работе у микроводоросли Desmodesmus, выделенной из ассоциации с беломорским гидроидом, сходны со стрессовыми реакциями, вызванными дефицитом азота у свободноживущих Chlorophyta (Parietochloris incisa [19, 20], Chlorella sp. [21] и др.). В частности, в данных условиях наблюдается ингибирование синтеза мембранных галактолипидов на фоне индукции синтеза запасных липидов, преимущественно ТАГ [1], откладывающихся в виде цитоплазматических ЛГ. Формирование ЛГ у исследованной в данной работе микроводоросли в изученных условиях стресса было показано также электронно-микроскопически [22]. Считается, что активация биосинтеза ТАГ обеспечивает сток для избыточных фотоассимилятов, которые не могут быть утилизированы для роста и деления клетки в условиях дефицита азота и вызванного им подавления синтеза белков. Это предохраняет клетку от повреждения АФК, уровень которых повышается из-за чрезмерной восстановленности переносчиков электрон-транспортной цепи хлоропластов, весьма вероятной в отсутствие стока для фотоассимилятов [5]. В пользу предположения об индукции синтеза ТАГ у изученной нами микроводоросли свидетельствует стимулирование накопления ЖК в составе ацилсодержащих липидов светом высокой интенсивности и характерные изменения их ЖК-состава (снижение общей ненасыщенности и многократное повышение соотношения 18:1/18:3, рис. 3). Подобные изменения липидного метаболизма являются характерным откликом на действие стрессоров различной природы, таких как свет высокой интенсивности, дефицит азота, повышенная концентрация солей в среде, а также комбинации этих факторов. Причиной наблюдаемых изменений состава ЖК липидов может быть редукция гранально-ламеллярной системы хлоропластов и демонтаж фотосинтетических мембран (α-линоленовая кислота входит преимущественно в состав гликолипидов мембран хлоропластов, тогда как олеиновая кислота преобладает в составе нейтральных липидов (ТАГ), доминирующих среди липидов клеток многих видов микроводорослей при стрессах [2, 20]). Дополнительным свидетельством в пользу предположения о перестройке мембранного аппарата является существенное снижение содержания Хл при дефиците азота (рис. 4б). Анализ динамики пигментного состава Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 не выявил повышения содержания Кар при действии исследованных стрессовых факторов. По всей видимости, адаптация к действию света высокой интенсивности при дефиците азота в среде у этого организма осуществляется, главным образом, путем снижения содержания Хл, способного в условиях стресса, лимитирующих фотохимическую утилизацию поглощенной световой энергии, проявлять фотодинамический эффект. Судя по данным о пигментном составе Desmodesmus, именно этот процесс является причиной роста соотношения Кар/Хл при стрессе, а не каротиногенез (рис. 4д, 4е; 6), имеющий место у свободноживущих Chlorophyta Haematococcus pluvialis [23] или Dunaliella salina [24]. Важно, что в отсутствие дефицита азота высокая (480 мкЕ/(м2 с) ФАР) интенсивность освещения не вызывает адаптивной реакции фотосинтетического аппарата Desmodesmus sp. 3Dp86E-1, как и дефицит азота при культивировании на свету средней интенсивности 110 мкЕ/(м2 с). Лишь комбинация стрессоров (свет высокой интенсивности и дефицит азота) индуцирует биосинтез запасных липидов (накопление этерифицированных ЖК, рис. 2) и резкое снижение содержания Хл (рис. 4а, 4б). Судя по спектрам поглощения суспензий клеток (рис. 5), фотодеструкции пигментов и накопления продуктов деградации Хл при этом не наблюдается. Вероятно, вышеупомянутые адаптивные механизмы активируются одновременно и функционируют синергически, на что указывает высокая корреляция между накоплением ЖК в составе ацилсодержащих липидов, величиной Кар/Хл (данные не приводятся) и поглощением света суспензиями в сине-зеленой области спектра (последнее сильно коррелирует с Кар/Хл, r2 > 0.95). Особо отметим, что характер этих корреляций зависел от интенсивности действия стрессоров: при слабом стрессе (свет средней интенсивности, рис. 6, кривая 1′) она была линейной, а при усилении стрессового фактора она становилась экспоненциальной (сильный свет; рис. 6, кривые 2′ и 3′). Суммируя полученные результаты, можно заключить, что выращивание Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 в условиях интенсивной культуры возможно (даже при высокой интенсивности освещения у нее не выявлено признаков фотоповреждения), но осложняется низкой устойчивостью данной микроводоросли к комбинированным стрессорам (недостаток азота на свету высокой интенсивности сильно угнетает рост культуры). При этом не исключено, что в силу происхождения Desmodesmus минеральная среда и атмосферная концентрация CO2 не являются оптимальными для ее роста и не позволяют полностью раскрыть ее адаптивный и биосинтетический потенциал. В пользу данного предположения свидетельствует толерантность к сверхвысоким концентрациям CO2, выявленная у Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 в предварительных экспериментах. Для выяснения этого вопроса необходимы дополнительные исследования, которые позволят выявить особенности акклимации к стрессорам микроводорослей, обитающих в составе ассоциаций, а также оценить потенциал данного микроорганизма в получении возобновляемого сырья для биодизеля, а также для биоизъятия CO2 из промышленных бросовых газов и органических загрязнителей из сточных вод [25]. Работа выполнена при частичной финансовой поддержке фонда “Сколково” (проект “Фотобиологические микробные топливные элементы”) и Министерства образования и науки РФ (Госконтракт № 16.513.12.3028). СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1.Whitelam G., Codd G. Damaging Effects of Light on Microorganisms // Microbes in Extreme Environments / Eds. Herbert R., Codd G. London: Academic, 1986. P. 129–169. 2.Guschina I.A., Harwood J.L. Algal Lipids and Effect of the Environment on Their Biochemistry // Lipids in Aquatic Ecosystems / Eds. Kainz M., Brett M., Arts M. Dordrecht, Heidelberg, London, New York: Springer-Verlag, 2009. P. 1–24. 3.Горелова О.А., Косевич И.А., Баулина О.И., Федоренко Т.А., Торшхоева А.З., Лобакова Е.С. Ассоциации беспозвоночных животных Белого моря и оксигенных фототрофных микроорганизмов // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16. Биол. 2009. № 1. С. 18–25. 4.Dove S., Lovell C., Fine M., Deckenback J., Hoegh-Guldberg O., Iglesias-Prieto R., Anthony K. Host Pigments: Potential Facilitators of Photosynthesis in Coral Symbioses // Plant Cell Environ. 2008. V. 31. P. 1523–1533. 5.Соловченко А.Е. Физиологическая роль накопления нейтральных липидов эукариотическими микроводорослями при стрессах // Физиология растений. 2012. Т. 59. С. 192–202. 6.Ambarsari I., Brown B., Barlow R., Britton G., Cummings D. Fluctuations in Algal Chlorophyll and Carotenoid Pigments during Solar Bleaching in the Coral Goniastrea Aspera at Phuket, Thailand // Mar. Ecol. Prog. Ser. 1997. V. 159. P. 303–307. 7.Salih A., Larkum A., Cox G., Kühl M., Hoegh-Guldberg O. Fluorescent Pigments in Corals Are Photoprotective // Nature. 2000. V. 408. P. 850–853. 8.Горелова О.А., Баулина О.И., Соловченко А.Е., Федоренко Т.А., Кравцова Т.Р., Чивкунова O.Б., Кокшарова О.А., Лобакова Е.С. Зеленые микроводоросли, изолированные из ассоциаций с беспозвоночными Белого моря // Микробиология. 2012. Т. 81. С. 546–548. 9.Gorelova O., Baulina O., Solovchenko A., Chivkunova O., Fedorenko T., Lobakova E. Green Microalgae from Associations with White Sea Invertebrates // J. Mar. Biol. Assoc. UK. 2012. 10.Соловченко А.Е., Хозина-Голдберг И., Диди-Коэн Ш., Коэн Ц., Мерзляк М.Н. Влияние света и азотного голодания на содержание и состав каротиноидов зеленой водоросли Parietochloris incisa // Физиология растений. 2008. Т. 55. С. 507–515. 11.Rippka R., Deruelles J., Waterbury J.B., Herdman M., Stanier R.Y. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria // J. Gen. Microbiol. 1979. V. 111. P. 1–61. 12.Wellburn A. The Spectral Determination of Chlorophyll a and Chlorophyll b, as Well as Total Carotenoids, Using Various Solvents with Spectrophotometers of Different Resolution // J. Plant Physiol. 1994. V. 144. P. 307–313. 13.Соловченко А.Е., Чивкунова O.Б., Маслова И.П. Пигментный состав, оптические свойства и устойчивость к фотодеструкции микроводоросли Haematococcus pluvialis, культивируемой при высокой освещенности // Физиология растений. 2011. Т. 58. С. 12–20. 14.Cohen Z., Didi S., Heimer Y.M. Overproduction of γ-Linolenic and Eicosapentaenoic Acids by Algae // Plant Physiol. 1992. V. 98. P. 569–572. 15.Ackman R. Gas-Liquid Chromatography of Fatty Acids and Esters // Methods Enzymology. V. 14 / Ed. Lowenstein J. New York: Academic, 1969. P. 329–381. 16.Мерзляк М.Н., Чивкунова О.Б., Маслова И.П., Накви Р.К., Соловченко А.Е., Клячко-Гурвич Г.Л. Спектры поглощения и рассеяния света клеточными суспензиями некоторых цианобактерий и микроводорослей // Физиология растений. 2008. Т. 55. С. 464–470. 17.Lichtenthaler H.K. Chlorophyll and Carotenoids: Pigments of Photosynthetic Biomembranes // Methods Enzymol. 1987. V. 148. P. 331–382. 18.Gorelova O., Baulina O., Kosevich I., Lobakova E. Associations between the White Sea Colonial Hydroid Dynamena pumila and Microorganisms // J. Mar. Biol. Assoc. UK. 2012. doi 10.1017/S002531541100172X 19.Solovchenko A., Merzlyak M., Khozin-Goldberg I., Cohen Z., Boussiba S. Coordinated Carotenoid and Lipid Syntheses Induced in Parietochloris incisa (Chlorophyta, Trebouxiophyceae) Mutant Deficient in Δ5 Desaturase by Nitrogen Starvation and High Light // J. Phycol. 2010. V. 46. P. 763–772. 20.Bigogno C., Khozin-Goldberg I., Cohen Z. Accumulation of Arachidonic Acid-Rich Triacylglycerols in the Microalga Parietochloris incisa (Trebuxiophyceae, Chlorophyta) // Phytochemitry. 2002. V. 60. P. 135–143. 21.Guckert J.B., Cooksey K.E. Triglyceride Accumulation and Fatty Acid Profile Changes in Chlorella (Chlorophyta) during High pH Induced Cell Cycle Inhibition // J. Phycol. 1990. V. 26. P. 72–79. 22.Solovchenko A., Chivkunova O., Selyakh I., Semenova L., Baulina O., Gorelova O., Scherbakov P., Karpova E., Burakova O., Lobakova E. Irradiance and Nitrogen Starvation Effects on the Optical Properties, Pigment and Fatty Acid Accumulation in the White Sea Chlorophyte from the Genus Desmodesmus // Abst. Int. Conf. “Physiology and Biotechnology of Microalgae” Devoted to the 80th Anniversary of V.E. Semenenko. Moscow, 2012. P. 39. 23.Lemoine Y., Schoefs B. Secondary Ketocarotenoid Astaxanthin Biosynthesis in Algae: A Multifunctional Response to Stress // Photosynth. Res. 2010. V. 106. P. 155–177. 24.Ye Z.-W., Jiang J.-G., Wu G.-H. Biosynthesis and Regulation of Carotenoids in Dunaliella: Progresses and Prospects // Biotechnol. Adv. 2009. V. 26. P. 352–360. 25.Pittman J.K., Dean A.P., Osundeko O. The Potential of Sustainable Algal Biofuel Production Using Wastewater Resources // Biores. Technol. 2011. V. 102. P. 17–25. ПОДПИСИ К РИСУНКАМ Рис. 1.Рост культур Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 на полной среде (а) и в отсутствие азота (б) при различной интенсивности освещения и плотности инокулюма. 1  110 мкЕ/(м2 с), инокулюм: 5 мг/л хлорофилла; 2  480 мкЕ/(м2 с), инокулюм: 5 мг/л хлорофилла; 3  480 мкЕ/(м2 с), инокулюм: 25 мг/л хлорофилла. Рис. 2.Накопление жирных кислот в составе ацилсодержащих липидов культурами Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 на полной среде (а, в) и в отсутствие азота (б, г) при различной интенсивности освещения и плотности инокулюма. Обозначения кривых см. на рис. 1. Рис. 3.Изменение соотношения олеиновой (18:1) и α-линоленовой (18:3) кислот в биомассе Desmodesmus при культивировании на свету высокой интенсивности на полной среде и в отсутствие азота (содержание хлорофилла в инокулюме  25 мг/л). Темные символы  полная среда, светлые символы  дефицит азота. Рис. 4.Динамика суммарного содержания хлорофиллов (а, б), каротиноидов (в, г) и их соотношения (д, е) в клетках Desmodesmus sp. 3Dp86E-1, выращенных на полной среде (а, в, д) и в отсутствие азота (б, г, е). Обозначения кривых см. на рис. 1. Рис. 5.Нормированные по длинноволновому максимуму хлорофилла спектры поглощения суспензий клеток Desmodesmus sp. 3Dp86E-1, выращенных на полной среде (тонкие линии) и в отсутствие азота (толстые линии)/ а  инокулюм 5 мг/л хлорофилла, 110 мкЕ/(м2 с) ФАР; б  инокулюм 25 мг/л хлорофилла, 480 мкЕ/(м2 с) ФАР); в  инокулюм 25 мг/л хлорофилла, 480 мкЕ/(м2 с) ФАР). Рядом с кривыми указаны сутки культивирования. STD  спектр стандартного отклонения оптической плотности. Рис. 6. Корреляция между накоплением жирных кислот в составе липидов клеток Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 в расчете на сухой вес (а) и на единицу объема культуры (б) с изменениями нормированной по максимуму хлорофилла оптической плотностью на 480 нм (в полосе совместного поглощения каротиноидов и хлорофиллов) при культивировании на полной (темные символы) и безазотной (светлые символы) среде. ■, □  110 мкЕ/(м2 с), инокулюм: 5 мг/л хлорофилла; ●, ○  480 мкЕ/(м2 с), инокулюм: 5 мг/л хлорофилла; ▲, ∆  480 мкЕ/(м2 с), инокулюм: 25 мг/л хлорофилла.