МЕТОД КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА ИУК В DR5::GUS ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ АРАБИДОПСИСА © 2013 г. Г. А. Пожванов*,**, А. Л. Шаварда*,**, С. С. Медведев* * Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования “Санкт-Петербургский государственный университет”, Санкт-Петербург ** Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН, Санкт-Петербург Поступила в редакцию 09.06.2012 г. При изучении транспорта ауксина широко применяют трансгенные конструкции для визуализации локализации фитогормона, в том числе DR5::GUS. Ранее нами был предложен метод количественной оценки содержания ИУК по гистохимическому окрашиванию на активность глюкуронидазы. В настоящей работе этот метод дополнен количественными данными о содержании ИУК в растении, полученными методом газовой хроматографиимасс-спектрометрии (ГХ/МС), что позволило более точно охарактеризовать латеральный градиент ИУК, возникающий при гравистимуляции корня Arabidopsis thaliana (L.) Heynh (экотип Columbia 0). Примененный нами метод анализа ИУК, сочетающий ГХ/МС и гистохимию, может быть использован для количественного анализа распределения других фитогормонов в трансгенных растениях с GUS-репортером. ------------------------------------ Сокращения: GUS – репортерный фермент β-D-глюкуронидаза из Escherichia coli; RGB – цветовая модель, в которой комбинация красного, зеленого и синего цвета (R, G, B) формирует итоговый цвет пикселя растрового изображения; ГХ/МС – аналитический метод газовой хроматографии с масс-селективным детектированием; ТМС – триметилсилильный фрагмент Si(CH3)3. Адрес для корреспонденции: Пожванов Григорий Александрович. 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9. Кафедра физиологии и биохимии растений, Санкт-Петербургский государственный университет. Факс: +7 (812) 328-97-03; электронная почта: gregory@pozhvanov.com Ключевые слова: Arabidopsis thaliana – гравитропизм – перераспределение ИУК – GUS-репортер – газовая хроматография – масс-спектрометрия – анализ цифровых изображений ВВЕДЕНИЕ Из всех фитогормонов только для ИУК характерно ярко выраженное полярное передвижение по тканям растительного организма. Полярный, т.е. векторный, транспорт ауксина лежит в основе регуляции практически всех процессов морфогенеза. Полярные потоки ауксина контролируют эмбриогенез и апикальное доминирование, формирование почек и побегов, филлотаксис и опадение листьев, формирование сосудистой системы и боковых корней, цветение и тропизмы [1]. Поэтому разработка методов, позволяющих одновременно регистрировать и локализацию, и концентрацию ИУК в тканях растений, является актуальной задачей. Ауксин играет определяющую роль в регуляции гравитропизма – ростового ответа растения на изменение положения относительно вектора силы тяжести. В ходе развития гравитропического ответа корня ИУК перераспределяется в латеральном направлении благодаря активности переносчиков семейства PIN [2] при участии цитоскелета [3, 4] и ингибирует рост клеток растяжением в нижней части корня. Локализацию ИУК в растительных тканях стало возможным изучать благодаря созданию трансгенных конструкций, позволявших визуально наблюдать распределение ауксина в растении. В современных работах наиболее распространена генетическая конструкция DR5::GUS, в которой экспрессия бактериальной β-D-глюкуронидазы (GUS, репортерный фермент β-D-глюкуронидаза из Escherichia coli) находится под контролем синтетического ауксин-чувствительного промотора DR5 [5]. Для визуализации активности GUS проводят гистохимическую реакцию in situ с реактивом X-Gluc, в результате которой появляется синее окрашивание за счет образования индиго. Интенсивность окрашивания коррелирует с локальной концентрацией ИУК в ткани. Вслед за конструкцией DR5::GUS были созданы DR5::GFP трансгенные растения [6], позволяющие определять уровень ИУК прижизненно при помощи конфокальной микроскопии; а в работе Lewis и Muday [7] усовершенствован метод определения транспорта ИУК при помощи радиоизотопного метода и анализа экспрессии генов. Для определения точного количества ИУК в органе или целом растении используется аналитический метод газовой хроматографии с масс-селективным детектированием (ГХ/МС) [8, 9]. Ранее нами был предложен метод количественного определения ИУК с помощью анализа цифровых микрофотографий [10], который делал возможным оценку относительных концентраций ауксина, выраженных в процентах от среднего. В настоящей работе мы предлагаем дополнить данные, полученные этим методом, результатами измерения внутриклеточного содержания ИУК с помощью метода ГХ/МС. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объект исследования. Объектом исследования служили трансгенные 7-суточные проростки Arabidopsis thaliana (L.) Heynh, экотип Columbia 0, трансформированные конструкцией DR5::GUS [5]. В этих растениях активность репортерного фермента глюкуронидазы зависит от концентрации ауксина в клетках. Условия выращивания. Растения выращивали в стерильных условиях на гелеобразной минеральной питательной среде МурасигеСкуга (МС/2), содержащей 1% сахарозы ("Экрос", Россия) и 0.7% агарозы ("НИЦФ", Россия). Семена перед посадкой стерилизовали в 96% этаноле и затем переносили на поверхность питательной среды в квадратных чашках Петри 125  125 мм ("Greiner Bio-One", Германия). Семена стратифицировали при 4°C в течение суток, после чего растения выращивали в вертикально ориентированных чашках Петри при 16-часовом фотопериоде (флуоресцентные лампы FL40SS-W/37, 5 клк) и температуре 20°C в климатической камере MLR-351 ("Sanyo", Япония). Для построения калибровочной кривой, отражающей зависимость активности GUS от концентрации экзогенного ауксина, в питательную среду добавляли ИУК ("Sigma", США) из спиртового 1 мМ раствора до конечной концентрации 106, 107 или 108 М. Визуальное определение активности GUS и анализ цифровых изображений. Активность глюкуронидазы в тканях корня трансгенных растений DR5::GUS визуально определяли с помощью гистохимического окрашивания с 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкопиранозидом (X-Gluc, "Fluka", Германия), как описано ранее [10]. В состав окрашивающего раствора, приготовленного на 50 мМ Na-фосфатном буфере, pH 7.0, входили 1 мМ X-Gluc, 0.5 мМ ферро- и 0.5 мМ феррицианид натрия, 0.5% Тритон X-100 и 2 мМ ЭДТА. Гистохимическую реакцию проводили при 37°С в течение 24 ч. После окрашивания препараты фиксировали в течение 1 мин в 2% глутаральдегиде ("Sigma", Германия), отмывали от фиксатора и заключали в глицерин. Цифровые микрофотографии получали с помощью фотокамеры EOS 40D ("Canon", Япония) с настройками, идентичными для каждой серии опытов (ISO 100, Tv 1/200", формат JPEG sRGB без постобработки), как описано ранее [10]. Измерения и перевод цифровых единиц в физические единицы длины производили по микрофотографиям шкалы объект-микрометра ОМП ГОСТ 7513-75 ("ЛОМО", Россия). Масштаб составил 2.84, 5.51 и 11.33 px/мкм для объективов 10, 20 и 40 соответственно. Цифровые микрофотографии анализировали с помощью программного обеспечения ImageJ (Wayne Rasband, "NIH", США) и Adobe Photoshop ("Adobe Systems Inc.", США). В работе использовали цветовую модель RGB, в которой комбинация красного, зеленого и синего цвета (R, G, B) формирует итоговый цвет пикселя растрового изображения. В Photoshop цветовую информацию получали инструментом "Color Sampler" вручную с усреднением по области 5  5 px, после чего экспортировали в Microsoft Excel. Определение содержания ИУК в корне методом ГХ/МС. В работе использовали модификацию метода анализа на газовом хроматографе–масс-спектрометре в режиме SIM (от single ion monitoring) [11, 12]. Фиксацию материала и экстракцию метаболитов из целых проростков или отрезков корней длиной 1 см от кончика проводили с помощью метанола (х.ч., "Вектон", Россия) из расчета не менее 10 : 1 (объем/вес) в герметически закрытой микропробирке в течение 7 дней при 6°C. Обезвоженные растительные ткани извлекали из микропробирки, а экстракт испаряли досуха в вакуумном ротационном испарителе Eppendorf Concentrator Plus ("Eppendorf", Германия). Сухой остаток растворяли в 10 мкл пиридина (ч.д.а., "Экрос", Россия), содержащего 1.26 нг/мл ванилина (ч.д.а., "Экрос") в качестве внутреннего стандарта. Объемную концентрацию внутреннего стандарта сохраняли строго постоянной во всех экспериментах. Дериватизацию образца для повышения летучести производных метаболитов проводили методом исчерпывающего силилирования пробы с помощью бис-триметилсилилтрифторацетамида, содержащего 1% триметилхлоросилана (BSTFA + TMCS, "Supelco", США) в сухом термоблоке при 100°C в течение 25 мин. Хроматографический анализ содержания ИУК проводили на газовом хроматографе Agilent 6850 GC, оснащенном масс-селективным квадрупольным детектором Agilent 5975B VL MSD ("Agilent Technologies", США) на неполярной капиллярной колонке DB-5HT (5% фенилметилсилоксан, длина 30 м, внутренний диаметр 250 мкм, толщина пленки 0.1 мкм). Анализ проводили с контролем постоянства газового потока (газ-носитель – гелий, 1 мл/мин) при линейном повышении температуры (начальная температура колонки 135°C, скорость нагрева 6°C/мин). Пробу в количестве 5 мкл вводили с помощью программируемого автоматического пробоотборника Agilent G4513A в режиме импульсной инжекции без деления потока (Pulsed splitless); температура испарителя  330°C, давление  85.6 кПа, импульс давления (pulse pressure)  350 кПа в течение 0.8 мин, скорость потока газа-носителя через испаритель  23.8 мл/мин. Ионизацию вещества в камере масс-спектрометра осуществляли посредством электронного удара (70 эВ), температура ионизационной камеры составляла 290°C, квадруполя  180°C. Для количественного измерения уровня ИУК детекцию проводили в режиме мониторинга отдельных ионов (SIM): 194 m/z (триметилсилилванилин, ванилин-ТМС) с 3 по 9 мин анализа, 202 и 319 m/z (ИУК-2ТМС) после 9 мин. Индексы удерживания рассчитывали на основании данных по времени выхода нормальных углеводородов C10÷C35 с помощью программы AMDIS (G. Mallard, "NIH"). Хроматограммы обрабатывали в программном обеспечении Agilent MSD ChemStation E 02.02.1431. Профили выбранных ионов (194, 202 и 319 m/z) интегрировали автоматически при помощи интегратора ChemStation (см. таблицу). Результаты интегрирования переносили в Excel, и значения площадей пиков использовали для расчета количества ИУК, содержавшегося в образце. Для расчета концентрации ИУК использовали калибровку, для которой исследовали отношение площадей пиков ТМС-производных внутреннего стандарта и ауксина в смесях чистых веществ с соотношением, соответственно, 1 : 1, 1 : 2, 1 : 0.1, 1 : 5, 1 : 10, 1 : 20 в трехкратной аналитической повторности. Соотношение площадей пиков производных внутреннего стандарта и ИУК выражали как k = SИУК/Sстд., соотношение концентраций выражали как r = CИУК/Cстд.. Калибровку строили, исходя из предположения о линейной зависимости между отношением площадей и концентраций веществ: r = αk. Концентрацию ИУК в образце рассчитывали в Excel как CИУК = αCстд.SИУК/Sстд.. Расчет концентрации ИУК в тканях корня. Данные об интенсивности GUS-зависимого окрашивания, полученные при анализе цифровых микрофотографий, использовали для расчета оптической плотности, как описано ранее [10]. Плотность окрашивания в красном канале рассчитывали, как DR = –lg(R/R0), ошибку плотности окрашивания  как mDR = DRmR/R, где R и R0 – яркость в красном канале в точке, принадлежащей соответственно ткани корня или фону, mR – стандартная ошибка среднего. Зависимость содержания ИУК от оптической плотности окрашивания вычисляли по формуле: CИУК = aD2R + bDR + c, (1) где a, b, c – параметры квадратичной регрессии. Ошибку определения ИУК вычисляли как mCИУК = CИУКmR/R. При построении калибровочной зависимости использовали микрофотографии корней растений DR5::GUS, выращенных на среде с экзогенным ауксином (образцы фона препарата и паренхимы корня на расстоянии 650–800 мкм от кончика корня), и абсолютное значение содержания ИУК в 1-сантиметровых отрезках корня. Все эксперименты проводили в трехкратной биологической повторности; на рис. 2 приведены типичные кривые. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Главная задача настоящего исследования заключалась в том, чтобы дополнить данные о содержании ауксина в тканях корней DR5::GUS-трансгенных растений, выраженные в относительных величинах, результатами измерения абсолютного содержания ИУК и выразить содержание ИУК в физических единицах концентрации на площадь цифрового изображения. Анализ цифровых микрофотографий корней растений после гистохимического окрашивания дает представление об относительном содержании ИУК и сравнительно точную локализацию. Вариант метода метаболомного анализа триметилсилильных производных позволяет получить точную количественную оценку концентрации ИУК в целом растении или его отдельном органе. Содержание ауксина в ткани мало, что не позволяет обнаруживать его с помощью стандартной методики, регистрируя полный ионный ток (рис. 1а), поэтому было необходимо найти подход, позволяющий повысить чувствительность на несколько порядков. Масс-спектр 2ТМС-производного ИУК (триметилсилил 2-(1-(триметилсилил)-1H-индол-3-ил)ацетата) содержит главные пики 319 и 202 m/z – молекулярный ион и наиболее стабильный фрагмент соответственно (рис. 1б). В режиме мониторинга отдельных ионов (202, 319 m/z) после оптимизации условий ввода пробы (см. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ) стало возможным зарегистрировать производные ИУК в количестве от 1.3 × 1015 г в образце. 7-суточный проросток трансгенного A. thaliana DR5::GUS содержал в среднем 15.9 ± 1.0 пг свободной ИУК на мг сырой массы растения, что согласуется с имеющимися в литературе данными [8]. Для определения содержания ИУК в растении использован вариант метаболомного анализа методом ГХ/МС, при котором получали триметилсилильные производные низкомолекулярных веществ, что предполагает более простой протокол анализа по сравнению с получением метильных производных. С учетом определенного таким образом содержания ИУК в 1-сантиметровых отрезках корня A. thaliana DR5::GUS (калибровка) формула для расчета ИУК по гистохимическому окрашиванию (1) приобрела вид: CИУК = (267.9 D2R + 496.2 DR + 13.7) ×1012 моль/мкм2. (2) С использованием этой схемы расчета были уточнены параметры латерального перераспределения ИУК, которое реализуется при гравистимуляции корней растений арабидопсиса путем поворота на 90° относительно вектора силы тяжести в течение 90 мин. В контрольных растениях содержание ИУК было равномерным и составляло около 0.9 ÷ 1.0 × 10–10 моль/мкм2 (рис. 2). После гравистимуляции содержание ИУК в апикальной меристеме и зоне растяжения корня составляло в верхней части около 1 × 10–10 моль/мкм2 и 0.7 × 10–10 моль/мкм2 соответственно, а в нижней части корня в области апикальной меристемы достигало 3.0 × 10–10 моль/мкм2, в зоне растяжения – 2.2 × 10–10 моль/мкм2. Усовершенствованный нами метод количественной оценки содержания ИУК в ткани растения позволяет описывать перераспределение ауксина в процессе развития и при реализации тропизмов, используя в качестве объекта DR5::GUS-трансгенные растения арабидопсиса. Данный метод также применим для количественного анализа других фитогормонов, для изучения которых доступны GUS-репортерные конструкции. В настоящее время для изучения перераспределения ИУК в процессе развития гравитропической реакции предложены новые репортерные конструкции, которые позволяют изучать транспорт ауксина in vivo: DR5::GFP, DII-VENUS [6]. Конструкция DII-VENUS предоставляет большее временнóе разрешение, поскольку не затрагивает клеточные процессы синтеза белка в ходе своей работы. Однако конструкция DR5::GUS не теряет актуальности, и ее можно применять для изучения сравнительно более медленных процессов с вовлечением транспорта ИУК и для качественного/количественного описания экспрессии генов. Работа выполнена при поддержке грантов Российского фонда фундаментальных исследований (№№ 08-04-00566 и 11-04-00701) и Правительства Санкт-Петербурга (№№ 2.6/22-03/004, 2.6/16-05/219-А). СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1.Медведев С.С. Механизмы формирования и физиологическая роль полярности в растениях // Физиология растений. 2012. Т. 59. С. 543–556. 2.Peer W.A., Blakeslee J.J., Yang H., Murphy A.S. Seven Things We Think We Know about Auxin Transport // Mol. Plant. 2011. V. 4. P. 487–504. 3.Nick P., Han M.-J., An G. Auxin Stimulates Its Own Transport by Shaping Actin Filaments // Plant Physiol. 2009. V. 151. P. 155–167. 4.Пожванов Г., Суслов Д., Медведев С. Реорганизация актинового цитоскелета при гравистимуляции корней растений арабидопсиса // Тр. Томского гос. ун-та. 2010. Т. 275. С. 305–308. 5.Ulmasov T., Murfett J., Hagen G., Guilfoyle T.J. Aux/IAA Proteins Repress Expression of Reporter Genes Containing Natural and Highly Active Synthetic Auxin Response Elements // Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1963–1971. 6.Brunoud G., Wells D.M., Oliva M., Larrieu A., Mirabet V., Burrow A.H., Beeckman T., Kepinski S., Traas J., Bennett M.J., Vernoux T. A Novel Sensor to Map Auxin Response and Distribution at High Spatio-Temporal Resolution // Nature. 2012. V. 482. P. 103–106. 7.Lewis D., Muday G. Measurement of Auxin Transport in Arabidopsis thaliana // Nat. Protocols. 2009. V. 4. P. 437–451. 8.Ribnicky D., Cooke T., Cohen J. A Microtechnique for the Analysis of Free and Conjugated Indole-3-Acetic Acid in Milligram Amounts of Plant Tissue Using a Benchtop Gas Chromatograph-Mass Spectrometer // Planta. 1997. V. 204. P. 1–7. 9.Ljung K., Bhalerao R.P., Sandberg G. Sites and Homeostatic Control of Auxin Biosynthesis in Arabidopsis during Vegetative Growth // Plant J. 2001. V. 28. P. 465–474. 10.Пожванов Г.А., Медведев С.С. Метод количественной оценки содержания ауксина по гистохимическому окрашиванию на активность GUS под контролем ауксин-чувствительного промотора // Физиология растений. 2008. Т. 55. С. 786–792. 11.Kopka J., Schauer N., Krueger S. , Birkemeyer C., Usadel B., Bergmüller E., Dörmann P., Weckwerth W., Gibon Y., Stitt M., Willmitzer L., Fernie A.R., Steinhauser D. GMD@CSB.DB: The Golm Metabolome Database // Bioinformatics. 2005. V. 21. P. 1635–1638. http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/21/8/1635.full 12.Roessner U., Bowne J. What Is Metabolomics All about? // Biotechniques. 2009. V. 46. P. 363–365. Подписи к рисункам Рис. 1. Метаболитный спектр 7-суточного проростка арабидопсиса, масс-спектр ТМС-производного ИУК. а  метаболитный спектр 7-суточного проростка арабидопсиса DR5::GUS (полный ионный ток, TIC). Идентифицированные в AMDIS метаболиты отмечены выборочно. Кружком показано время выхода ТМС-производного ИУК; б  масс-спектр ТМС-производного ИУК. Основные пики: 73.1 m/z – триметилсилильный фрагмент, 202.1 m/z – основной фрагмент, 319.2 m/z – молекулярный ион триметилсилил 2-(1-(триметилсилил)-1H-индол-3-ил)ацетата. Рис. 2. Содержание ИУК в апикальной меристеме и зоне растяжения корня A. thaliana DR5::GUS в норме и при гравистимуляции. а  содержание ИУК в вертикально ориентированном корне (контроль) в зоне растяжения. На врезке схематично показан кончик корня арабидопсиса и положение профиля содержания ИУК (линия А–Б) в зоне растяжения, стрелкой отмечено направление вектора силы тяжести; б  содержание ИУК в гравистимулированном в течение 90 мин корне арабидопсиса. На врезке схематично показан кончик корня арабидопсиса и положение профилей концентрации ИУК в зоне растяжения (линия А–Б) и в апикальной меристеме (линия В–Г).