АКТИВАЦИЯ “КИСЛОГО” РОСТА В ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЕНАХ КОНСКОГО КАШТАНА © 2013 г. Н. В. Обручева, И. А. Синькевич, С. В. Литягина, Г. В. Новикова Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва Поступила в редакцию 11.10.2012 г. Изучено, насколько гипотеза “кислого” роста подтверждается в случае инициации роста клеток растяжением в прорастающих семенах конского каштана (Aesculus hippocastanum L.), которые известны тем, что на начальных этапах прорастания зародышевая ось удлиняется только путем растяжения клеток. При набухании семян выделение Н+-ионов сначала происходило слабо, перед проклевыванием возрастало в несколько раз и поддерживалось на высоком уровне в период инициации и во время растяжения клеток. Подкисление клеточных стенок и проклевывание усиливались в присутствии 0.02 мМ фузикокцина, что указывает на участие Н+-АТФазы плазмалеммы в осуществлении “кислого” роста. Иммунохимически показано наличие этого фермента, а также присутствие активатора фермента (14-3-3 белка) в микросомальных фракциях, полученных из корешка и гипокотиля зародышевой оси до, во время и после инициации растяжения клеток. Предполагается, что инициация растяжения клеток при прорастании происходит по типу “кислого” роста в результате активации плазмалеммной Н+-АТФазы, что приводит к подкислению оболочек клеток и повышению их растяжимости. Ключевые слова: Aesculus hippocastanum – прорастание семян – “кислый” рост – растяжение клеток – плазмалеммная H+-AТФаза – 14-3-3 белок – фузикокцин -------------------------------- Адрес для корреспонденции: Обручева Наталья Владимировна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: obroucheva@ippras.ru ВВЕДЕНИЕ Начало прорастания семян происходит за счет растяжения клеток в зародышевой оси [1], что позволяет проросшему семени оперативно быстро войти в контакт с почвенной влагой. Инициация растяжения клеток была изучена на колеоптилях злаков, гипокотилях и эпикотилях двудольных растений in vitro и описана как “кислый” рост [2, 3]. Сущность его заключается в том, что в кислой среде протоны, проникая в оболочки клеток, вызывают их подкисление, что приводит к активации ряда ферментов и разрыхлению структуры оболочек клеток. В результате функционирования механизма “кислого” роста клеточные стенки приобретают способность растягиваться под напором поступающей в клетки воды. Так начинается растяжение клеток. В системе in vivo, вероятнее всего, протоны поступают из цитоплазмы в оболочки клеток с помощью плазмалеммной Н+-АТФазы. Изучение “кислого” роста при прорастании семян до сих пор не проводилось, хотя в отдельных случаях была отмечена стимуляция прорастания в кислой среде. Целью данной работы было изучить, функционирует ли и как осуществляется “кислый” рост при инициации растяжения клеток в прорастающих семенах. Для этой цели были выбраны семена конского каштана, у которых рост зародышевой оси происходит только за счет растяжения клеток, а деление клеток начинается в меристеме корня лишь тогда, когда зародышевая ось достигает длины 3.03.5 см [4]. Тем самым, прорастающие семена конского каштана представляют собой очень удобный объект для изучения “кислого” роста. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Семена конского каштана (Aesculus hippocastanum L.) были собраны на территории Главного ботанического сада РАН (Москва) в 20092011 гг. и стратифицированы во влажном песке при 4°С в течение 4 месяцев. Опыты проводили с вышедшими из покоя семенами, которые прорастали при 27°С за 12 суток при помещении в воду. Влажность осевых органов возрастала от 6263% (в расчете на сырой вес) у стратифицированных семян до 7374% у наклюнувшихся. Инициацию растяжения клеток оценивали, измеряя под микроскопом длину клеток в третьем слое коры вдоль зародышевой оси на продольных срезах, окрашенных алциановым синим (0.1% раствор в 1% ледяной уксусной кислоте). Для оценки подкисления апопласта измеряли рН раствора, в котором инкубировали извлеченные из семян зародышевые оси. Навеску (500 мг) помещали в 0.01 мМ СаСl2 для стабилизации мембран, затем переносили на 10 мин в 1 мМ КСl для насыщения ионами К+ и помещали в ячейку рН-метра в раствор свежеприготовленного 1 мМ КСl при рН 6.2. Снижение рН регистрировали в течение 40 мин. Подкисление среды обусловлено поступлением Н+-ионов из апопласта осевых органов в раствор. Влияние фузикокцина и индолилуксусной кислоты (ИУК) на прорастание семян каштана оценивали по увеличению сырого веса зародышевых осей, помещенных в растворы. О присутствии в осевых органах белков  Н+-АТФазы и 14-3-3  судили при помощи иммунохимического анализа. Из непокоящихся семян, имевших влажность 6263%, а также из набухших до влажности 68%, проклюнувшихся и проросших до длины 12 см, извлекали зародышевые оси и выделяли фракции микросом [5]. Суспензию микросом замораживали в жидком азоте и хранили при 70°С. Для вестерн-блот-анализа разделенные при помощи электрофореза в денатурирующих условиях белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (“Sigma”, США) полусухим способом [6] c добавлением 0.1% Na-ДДС в буфер для переноса. Мембрану инкубировали с 2% желатиной в фосфатно-солевом буфере, содержавшем 0.05% Твин 20, затем в течение ночи (при 4°С) с антителами против Н+-АТФазы плазмалеммы (“Agrisera”, Швеция) или антителами против 14-3-3 белков (К-19) (“Santa Cruz Biotechnology”, США). Полосы на мембране, соответствующие Н+-АТФазе плазмалеммы и 14-3-3 белкам, выявляли при помощи антикроличьих антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (“Promega”, США), активность которой определяли с 4-хлорнафтолом и Н2О2. РЕЗУЛЬТАТЫ На рис. 1а отражена зависимость подкисления наружного раствора от влажности выделенных из семян зародышевых осей. В зародышевых осях исходных семян рН практически не сдвигался (кривая 1); в семенах, набухших до влажности 67%, подкисление (ΔрН) составляло 0.30 ± 0.05 ед.; при влажности 69% это значение было равно 0.51 ± 0.08, а после проклевывания (77% влажности) – 0.63 ± 0.10. На рис. 1б показано изменение длины клеток в верхней части гипокотиля, т.е. клеток, которые первыми в зародышевой оси начинают растягиваться при прорастании. При сопоставлении этих кривых видно, что активное выделение Н+-ионов предшествует началу растяжения клеток и что само начало роста растяжением после проклевывания характеризуется усилением выделения Н+-ионов. Усиление выделения Н+-ионов зародышевыми осями при прорастании обнаружено впервые. Динамика выделения Н+-ионов при прорастании показана на рис. 1в. Аналогичная зависимость была обнаружена нами в осевых органах других семян, а именно, кормовых бобов и пшеницы [7]. Для плазмалеммной Н+-АТФазы характерна активация грибным токсином фузикокцином. Поэтому была измерена скорость подкисления раствора зародышевыми осями из семян каштана в присутствии 0.02 мМ фузикокцина А в среде измерения (рис. 1а, кривая 2). Под действием фузикокцина резко усиливалось подкисление среды зародышевыми осями из семян каштана до начала растяжения клеток. Кроме того, инкубация зародышевых осей в 0.001 мМ растворе фузикокцина А (рис. 2) ускоряла инициацию роста и сам рост растяжением в зародышевой оси. Если в контроле к 24 ч только начиналось проклевывание, то в присутствии фузикокцина осевые органы уже интенсивно росли. Усиление подкисления и роста клеток растяжением в присутствии фузикокцина подтверждает представление о том, что фузикокцин действует по принципу “кислого” роста [8], и указывает на то, что в основе подкисления оболочек лежит выделение протонов Н+-АТФазой плазмалеммы, так как фузикокцин является специфическим активатором этого фермента [9]. Поэтому интенсивность подкисления можно считать показателем активности тех изоформ Н+-АТФазы плазмалеммы, которые осуществляют выделение протонов из цитоплазмы наружу, в клеточную стенку, используя энергию гидролиза АТФ. Выделение Н+-ионов из клетки происходит в обмен на поступление ионов К+ внутрь клетки по ионным каналам. Участие Н+-АТФазы плазмалеммы в процессах “кислого” роста описано и у других объектов, например, у прорастающей пыльцы лилии [10]. Как следует из рис. 3, белок Н+-АТФазы плазмалеммы присутствует в осевых органах семян после стратификации, во время набухания, при наклевывании, т.е. при инициации роста растяжением, а также во время дальнейшего роста клеток растяжением, причем его доля в белке микросом практически не меняется. Однако этих данных недостаточно, чтобы объяснить резкое усиление активности фермента перед инициацией и во время роста растяжением. Поскольку возрастание активности фермента, проявляющееся в усилении выделения Н+-ионов (рис. 1а), происходило интенсивно, тогда как изменения количества белка фермента не наблюдалось (рис. 3а), можно допустить, что активность Н+-АТФазы плазмалеммы могли регулировать, например, 14-3-3 белки, которые у других растительных объектов активируют С-концевой домен молекулы Н+-АТФазы, взаимодействуя с остатком треонина, что обеспечивает фосфорилирование и активацию фермента [11]. Как показано иммунохимически, белки 14-3-3 присутствовали в тех же препаратах микросомальных белков, что и Н+-АТФазы, а именно: в набухающих, начинающих расти и растущих зародышевых осях каштана (рис. 3б). ОБСУЖДЕНИЕ Таким образом, впервые показано, что при прорастании инициация роста растяжением может происходить с помощью механизма “кислого” роста, который включает в себя активацию Н+-АТФазы для доставки Н+-ионов в апопласт. Можно предположить, что в зрелых семенах до начала набухания плазмалеммная Н+-АТФаза находится в самоингибированном состоянии [11] и мало активна. Во время набухания при подготовке прорастания может происходить активация имеющихся молекул фермента 14-3-3 белками. Одновременно может происходить и синтез другого активатора Н+-АТФазы – эндогенного фузикокцина, о чем говорят полуколичественные данные о накоплении фузикокцин-подобных лигандов в осевых органах семян конского каштана перед прорастанием [12]. Возрастающая до инициации роста активность Н+-АТФазы плазмалеммы приводит к усиленному выделению Н+-ионов в апопласт. Такое подкисление вызывает, во-первых, повышение активности экспансинов – белков клеточных стенок, повышающих способность цепочек полимеров смещаться относительно друг друга в результате расщепления водородных связей [13]. Во-вторых, в кислой среде максимальна активность ксилоглюкан-эндотрансгликозилазы/гидролазы, обеспечивающей частичный распад ксилоглюканов [14], а также пектинметилэстеразы [15]. Эти события обеспечивают повышение растяжимости клеточных стенок и инициацию растяжения клеток в прорастающих семенах каштана по механизму “кислого” роста. Тем не менее, вопрос об эндогенных активаторах Н+-АТФазы пока остается открытым. Гипотеза “кислого” роста была предложена исходно для объяснения стимулирующего действия ИУК на рост колеоптилей [2] и описывала действие ИУК как слабой кислоты, вызывающей подкисление и размягчение клеточных стенок. Возможность использовать для этой цели кислый буфер поставила под сомнение особую роль ИУК, тем более, что действие ИУК и кислого буфера синергично [3], т.е. ИУК оказывает также иное действие, например, вызывая стимуляцию Н+-АТФазы плазмалеммы через активацию К+-каналов в плазмалемме [16]. В случае прорастающих семян конского каштана участие ауксина в механизме “кислого” роста вызывает большое сомнение, так как в наших опытах 0.01 мМ раствор ИУК не стимулировал инициацию растяжения клеток (рис. 2) и не усиливал подкисление наружного раствора. По-видимому, в семенах конского каштана эндогенными регуляторами “кислого” роста являются 14-3-3 белки и фузикокцин, причем 14-3-3 белки могут активировать Н+-АТФазу плазмалеммы либо самостоятельно, либо вместе с фузикокцином [17]. Работа выполнена при поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований № 11-04-01139 и Программы по клеточной и молекулярной биологии Президиума Российской академии наук. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1.Obroucheva N.V. Seed Germination: A Guide to the Early Stages. Leiden: Buckhuys, 1999. 156 p. 2.Rayle D.L., Cleland R.E. The Acid Growth Theory of Auxin-Induced Cell Elongation Is Alive and Well // Plant Physiol. 1992. V. 99. P. 1271–1274. 3.Hager A. Role of Plasma Membrane H+-ATPase in Auxin-Induced Elongation Growth: Historical and New Aspects // J. Plant Res. 2003. V. 116. P. 483–505. 4.Obroucheva N.V., Antipova O.V. Germination of Horse Chestnut Seeds  Cell Growth and Hormonal Regulation // Seed Technol. 2003. V. 25. P. 128–139. 5.Божко К.Н., Жесткова И.М., Трофимова М.С., Холодова В.П., Кузнецов Вл.В. Изменение содержания аквапоринов в клеточных мембранах Mesembrianthemum cristallinum при переходе от С3-типа фотосинтеза на САМ // Физиология растений. 2004. Т. 51. С. 887–895. 6.Towbin H., Staechelin T., Gordon J. Electrophoretic Transfer of Protein from Polyacrylamide Gel to Nitrocellulose Sheets: Procedure and Some Applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 77. P. 428–432. 7.Обручева Н.В. Переход от гормональной к негормональной регуляции на примере выхода семян из покоя и запуска прорастания // Физиология растений. 2012. Т. 59. С. 591–600. 8.Kutschera U., Schopfer P. Evidence for the Acid Growth Theory of Fusicoccin Action // Planta. 1985. V. 163. P. 494–499. 9.De Michelis M.I., Rasi-Caldogno F., Pugliarello M.C., Olivari C. Fusicoccin Binding to Its Plasma Membrane Receptor and the Activation of the Plasma Membrane H+-ATPase // Plant Physiol.1996. V. 110. P. 957–964. 10.Perti H., Himly M., Gehwolf R., Kriechbaumer R., Strasser D., Michalke W., Richter K., Ferreira F., Obermeyer G. Molecular and Physiological Characterization of a 14-3-3 Protein from Lily Pollen Grains Regulating the Activity of the Plasma Membrane H+-ATPase during Pollen Grain Germination and Tube Growth // Planta. 2001. V. 213. P. 132–141. 11.Malerba M., Bianchetti R. 14-3-3 Protein Activated and Autoinhibited Forms of Plasma Membrane H+-ATPase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V. 288. P. 984–990. 12.Antipova O.V., Bartova L.M., Kalashnikova T.S., Obroucheva N.V., Voblikova V.D., Muromtsev G.S. Fusicoccin-Induced Cell Elongation and Endogenous Fusicoccin-Like Ligands in Germinating Seeds // Plant Physiol. Biochem. 2003. V. 41. P. 157–164. 13.Takahashi K., Hirata S., Kido N., Katou K. Wall-Yielding Properties of Cell Walls from Elongating Cucumber Hypocotyls in Relation to the Action of Expansin // Plant Cell Physiol. 2006. V. 47. P. 1520–1529. 14.Maris A., Suslov D., Fry S.C., Verbelen J.-P., Vissenberg K. Enzymic Characterization of Two Recombinant Xyloglucan Endotransglucosylase/Hydrolase (XTH) Proteins of Arabidopsis and Their Effect on Root Growth and Cell Wall Extension // J. Exp. Bot. 2009. V. 60. P. 3959–3972. 15.Micheli F. Pectin Methylesterases: Cell Wall Enzymes with Important Roles in Plant Physiology // Trends Plant Sci. 2001. V. 6. P. 414–419. 16.Медведев С.С., Шарова Е.И. Биология развития растений. Начала биологии развития растений. Фитогормоны. Т. 1. Санкт-Петербург: изд-во СПбГУ, 2011. 232 с. 17.Borch J., Bych K., Roepstorff P., Palmgren M.G., Fugisang A.T. Phosphorylation-Independent Interaction between 14-3-3 Protein and the Plant Plasma Membrane H+-ATPase // Biochem. Soc. Trans. Biochemistry. 2002. V. 30. P. 411–415. ПОДПИСИ К РИСУНКАМ Рис. 1. Изменение рН под действием зародышевых осей из прорастающих семян конского каштана и динамика инициации роста в зависимости от увеличения их влажности при набухании. а  подкисление наружного раствора как тест на активность плазмалеммной Н+-АТФазы: 1 – контроль, 2 – 0.02 мМ фузикокцин А. Длительность измерений 40 мин; б  длина клеток гипокотиля. Стрелкой обозначена инициация растяжения клеток при проклевывании семян; в  динамика подкисления раствора зародышевыми осями, изолированными из проклюнувшихся семян. Рис. 2. Рост осевых органов из прорастающих семян каштана в присутствии фузикокцина (1 мкМ) и ИУК (1 мкМ). Сырой вес осевых органов при инициации роста во время проклевывания составлял в среднем 100 мг/ось. Рис. 3. Иммунохимическая идентификация плазмалеммной Н+-АТФазы (а) и 14-3-3 белка (б) в осевых органах из семян конского каштана. На каждом вестерн-блоте представлено по 3 повторности. М  маркеры; 1 – непроклюнувшиеся семена (63% влажности); 2 – набухающие семена (68% влажности); 3 – проклюнувшиеся семена (74% влажности); 4 – проросшие семена (7980% влажности).