УДК 581.1
ОТДЕЛЕННЫЕ ОТ РАСТЕНИЙ ЛИСТЬЯ ЯЧМЕНЯ КАК ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РЕГУЛЯЦИИ ЦИТОКИНИНОМ ТРАНСКРИПЦИИ ПЛАСТИДНЫХ ГЕНОВ
© 2009 г. Я. О. Зубо, М. В. Ямбуренко, А. К. Кравцов, О. Н. Кулаева, В. В. Кузнецов
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 23.09.2008 г.
Предложена схема эксперимента, которая позволяет изучать на отделенных от растений первых листьях дифференциальную регуляцию транскрипции хлоропластных генов экзогенным цитокинином, что представляется чрезвычайно важным для раскрытия молекулярного механизма гормональной регуляции биогенеза хлоропластов. Показано, что регуляция цитокинином транскрипции пластидного генома зависит от возраста растений, от которых отделен лист, от локализации хлоропластов на листовой пластине, от интенсивности и продолжительности освещения листьев. Регуляцию транскрипции наблюдали на первых листьях ячменя (Hordeum vulgare L.), отделенных от 9-дневных растений, выращенных в почве. Листья предынкубировали на воде в течение 24 ч на свету (270 мкмоль/(м2 с)) и затем переносили на 3 ч на воду или раствор цитокинина (БАП, 2.2 ( 10-5 М) при тех же условиях освещения. Из наиболее чувствительной к цитокинину апикальной части листа выделяли хлоропласты и использовали их для run-on транскрипции. Из 26 изученных генов цитокинин активировал скорость транскрипции 19 генов (от 2 до 9 раз в сравнении с контролем) и не влиял на транскрипцию 7 генов. Регулируемые цитокинином гены кодируют как белки фотосинтеза, так и компоненты экспрессии пластидного генома. Полученные результаты позволяют перейти к изучению более тонких механизмов гормональной регуляции транскрипции хлоропластного генома.
Адрес для корреспонденции: Кузнецов Виктор Васильевич. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронная почта: vkusnetsov2001@rambler.ru

Ключевые слова: Hordeum vulgare - цитокинины - пластом - транскрипция - run-on - свет.

ВВЕДЕНИЕ
Цитокинины - важнейшие эндогенные регуляторы роста и развития растений. Одним из наиболее ярких проявлений их функциональной активности является регуляция биогенеза хлоропластов. В настоящее время установлен очень сложный эффект цитокининов на развитие хлоропластов. Цитокинины влияют на накопление пигментов, ультраструктуру хлоропластов и этиопластов, активность фотосинтетических ферментов, накопление белков тилакоидных мембран хлоропластов и фотосинтетическую активность [1-5]. Такое многогранное влияние цитокининов может быть результатом регуляции ими экспрессии ядерных и хлоропластных генов, имеющих отношение к биогенезу хлоропластов. До последнего времени все полученные результаты подтверждали важнейшую, практически исключительную роль посттранскрипционного уровня регуляции экспрессии пластидных генов цитокининами [4, 6]. Однако результаты последнего десятилетия заставили по-новому взглянуть на возможные механизмы гормональной регуляции экспрессии пластидных генов. Во-первых, было установлено, что пластиды являются важнейшим звеном гормональной регуляции растительной клетки. Показано, что они не только содержат большой набор природных цитокининов, включая свободные основания, рибозиды, риботиды и N-глюкозиды, но и участвуют в синтезе цитокининов [7-9], о чем говорит обнаружение в пластидах четырех изопентенилтрансфераз (AtIPT1, AtIPT3, AtIPT5 and AtIPT8) [9]. Во-вторых, принципиально новые результаты получены при изучении организации транскрипционной системы хлоропластов. В настоящее время не вызывает сомнения существование двух РНК-полимераз, кодируемых хлоропластным (PEP - от plastid-encoded plastid RNA polymerase) и ядерным (NEP - от nuclear-encoded plastid RNA polymerase) геномами [10, 11]. У некоторых видов растений идентифицированы семейства ядерных генов, которые кодируют σ-подобные факторы, определяющие специфичность транскрипции пластидных генов PEP [10, 12]. Показано, что PEP и NEP узнают разные промоторы. Выделены белки, которые участвуют в регуляции транскрипции хлоропластных генов [10, 13, 14]. Из хлоропластов листьев ячменя выделен цитокинин-связывающий белок, который гормон-зависимым способом регулировал тотальную транскрипцию в хлоропластных лизатах [15]. Активность этого белка зависела от возраста растений ячменя, из которых он был выделен [16].
Таким образом, наличие в хлоропластах активных цитокининов и выделение из них цитокинин-регулируемых транскрипционно-активных белков, позволяло предполагать возможность участия цитокинина в регуляции транскрипции индивидуальных хлоропластных генов.
Для доказательства регуляции цитокининами транскрипции пластидных генов необходимо было выполнить два условия. Во-первых, выбрать метод анализа, который однозначно говорил бы об участии или неучастии цитокининов в регуляции транскрипции. Во-вторых, разработать такую постановку эксперимента на выбранном биологическом материале, которая дала бы возможность обнаружить воспроизводимый эффект экзогенного цитокинина на транскрипцию индивидуальных хлоропластных генов. В этом и заключалась основная задача данной работы.

МЕТОДИКА
Растительный материал. Растения ячменя (Hordeum vulgare L., сорт Луч) выращивали в почве (в отдельных опытах - в перлите) при продолжительности светового периода 16 ч, при интенсивности освещения, если не оговорено специально, 270 мкмоль/(м2 с) (Lamp Master HPI-T Plus 400W E40, "Philips") и температуре 22-23ºC. Первый настоящий лист ячменя (далее по тексту - первый лист) отделяли от 4- или 9-дневных растений и инкубировали в течение 3 ч на воде или растворе синтетического аналога природного цитокинина - БАП (2.2 ( 10-5М). В ряде опытов перед инкубацией листьев на воде или растворе цитокинина проводили предынкубацию на увлажненной фильтровальной бумаге в течение 24 ч при постоянном освещении. Оптимальная концентрация БАП была определена в предварительных экспериментах (данные не приводятся). Возраст растений считали с момента появления всходов (через 2.5-3.0 дня после высева семян в почву), а не с момента замачивания семян.
Выделение хлоропластов. Листья или фрагменты листьев (10 г) гомогенизировали в 80 мл буфера А (0.33 М сорбит, 50 мМ трицин, pH 8.0, 2 мМ ЭДТА, 5 мМ β-меркаптоэтанол). Гомогенат фильтровали через Miracloth ("Calbiochem-Behring Corp.", США) и центрифугировали при 2700 g в течение 6 мин. Осадок органелл ресуспендировали в 1.5 мл буфера А, фракционировали в 40-70% ступенчатом градиенте перкола, центрифугируя 30 мин при 4000 g, и затем отбирали интактные хлоропласты, находящиеся на границе 40(70% перкола. Органеллы промывали буфером А и ресуспендировали в 0.5-1 мл буфера Б (50 мМ Трис-HCl, рН 7.0, 10 мМ MgCl2, 10 мМ KCl, 4 мМ β-меркаптоэтанол). Все этапы выделения хлоропластов проводили при 4ºС. Количество хлоропластов определяли с помощью камеры Фукса-Розенталя [17].
Run-un транскрипция. Для определения скорости транскрипции хлоропластных генов использовали метод run-on транскрипции в лизатах хлоропластов, который был разработан ранее [18] и подробно проанализирован в недавно опубликованной статье [19].
Транскрипцию in vitro проводили в лизате 5·( 107 хлоропластов в объеме 100 мкл. Транскрипция проходила в течение 15 мин при 25ºС в буфере следующего состава: 50 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 10 мМ MgCl2, по 0.2 мМ ЦTФ, ГТФ, АТФ, 0.01 мМ УТФ, 2 МБк α-32P-УТФ (110 ТБк/ммоль, "Amersham", Англия), 20 ед. активности РНКазина ("Fermentas", Латвия), 10 мМ β-меркаптоэтанол. Реакцию остановливали добавлением равного объема стоп-буфера (50 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 25 мМ ЭДТА, 5% саркозил). 32P-РНК, синтезированная в ходе реакции транскрипции, была выделена, как описано Guadino и Pikaard [20].
Приготовление мембран с ген-специфическими зондами. Фрагменты 26 индивидуальных пластидных генов получены с помощью ПЦР на тотальной хлоропластной ДНК ячменя с применением ген-специфических праймеров. Все фрагменты были проклонированы в pUC57 A/T вектор ("Fermentas"). Фрагменты генов готовили для нанесения на нейлоновую мембрану, как было описано ранее Guadino и Pikaard [20]. По 1 мкг каждого из фрагментов наносили на нейлоновую мембрану Hybond-N+ ("Amersham Pharmacia Biothech", Англия) и гибридизовали с 32P-РНК, полученными в ходе транскрипции in vitro, в буфере следующего состава: 250 мМ Na2HPO4, 7% ДДС и 2.5 мМ ЭДТА. Радиоактивные сигналы были сканированы, используя Molecular Imager FX и Quantity One software ("Bio-Rad", США). Эффект цитокинина считали достоверным, если его сигнал отличался от водного контроля не менее, чем в два раза.
Доказательство специфичности 32Р-РНК/ДНК гибридизации. Получение достаточного количества фрагментов хлоропластных генов для нанесения на нейлоновую мембрану проводили с помощью ПЦР с M13 sequence/M13 reverse sequence праймерами, используя в качестве матрицы pUC57 A/T рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагменты пластидных генов. При этом каждый амплифицированный фрагмент содержал кроме части индивидуального хлоропластного гена последовательность полилинкера с одной стороны размером 52 п.н., с другой - 76 п.н. В связи с этим можно было ожидать неспецифичную гибридизацию 32Р-РНК с фрагментами генов, нанесенными на мембрану, что могло привести к искажению полученных результатов. Чтобы проверить такую возможность, были рестриктированы шесть плазмид с фрагментами различных пластидных генов. Рестрикция была проведена XbaI и BamHI; при этом практически весь полилинкер оставался в составе вектора. После электрофореза в 1% агарозном геле (рис. 1а) ДНК переносили на нейлоновую мембрану и гибридизовали с 32Р-меченными транскриптами пластидных генов. Результаты показали, что меченые транскрипты гибридизовались только с фрагментами хлоропластных генов, но не с вектором, содержащим полилинкер (рис. 1б). Это доказывает, что при использованных нами условиях гибридизации отсутствует неспецифичная гибридизация последовательности полилинкера с транскриптами хлоропластных генов.
Традиционные молекулярно-биологические методы. Все молекулярно-биологические процедуры, такие как выделение растительной и плазмидной ДНК, рестрикция, лигирование, трансформация бактерий, элюция фрагментов ДНК из гелей и другие проводили, как описано Maniatis с соавт. [21]. Большинство рисунков представляют типичные результаты одного из 3-4 опытов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
До настоящего времени все исследователи, пытавшиеся изучать гормональную регуляцию транскрипции хлоропластных генов, применяли методы нозерн-анализа, дот-гибридизации или технику микрочипов, результаты которых не могли привести к однозначному выводу об участии цитокининов в регуляции процесса транскрипции, поскольку уровень мРНК, определяемый этими методами, зависит как от синтеза, так и от распада транскриптов. Метод run-on транскрипции в лизатах хлоропластов, учитывающий только вновь синтезированные за короткий период времени (5-15 мин) транскрипты, сводит к минимуму влияние на конечный результат процессов распада РНК и может дать однозначный ответ об участии цитокининов в регуляции транскрипции пластидных генов. Этот метод был разработан еще в 1987 г. и успешно применен для изучения световой регуляции транскрипции пластидных генов [18]; однако он не был использован для изучения гормональной регуляции транскрипции. Мы выбрали метод run-on транскрипции для изучения регуляции цитокинином экспрессии хлоропластных генов. Он подробно описан в недавно опубликованной нами статье [19]. Кроме выбора метода анализа процесса транскрипции, необходимо было выбрать объект и разработать экспериментальную модель для изучения действия цитокинина на транскрипцию хлоропластных генов. Решение этой задачи осложнялось присутствием в клетках эндогенных цитокининов, которые маскируют эффект экзогенного цитокинина.
Поскольку основная масса эндогенных цитокининов синтезируется в корнях и поступает в надземные органы растений в составе пасоки [1], в большинстве исследований механизма действия цитокинина использовали отделенные от растения семядоли, листья, проростки с отделенными корнями и т.д. [1, 4, 16]. Исключение составляют работы, выполненные на целых растениях Arabidopsis thaliana [20, 22-24]. Основываясь на ранее полученных данных, для изучения регуляции транскрипции пластидных генов цитокинином мы выбрали отделенные от растения листья ячменя, которые характеризуются высокой чувствительностью к цитокинину [15].
Сначала в опытах использовали молодые, растущие первые листья, отделенные от 4-дневных растений ячменя. В клетках таких листьев происходило активное развитие хлоропластов, и можно было ожидать высокую активность транскрипции хлоропластных генов, которая дала бы возможность изучить регуляцию их экспрессии цитокинином независимо от силы их промоторов. Мы изучили влияние цитокинина одновременно на транскрипцию 26 хлоропластных генов (рис. 2а). Срезанные листья инкубировали в течение 3 ч на растворе БАП или воде (контроль). Трехчасовая инкубация листьев обеспечила достаточно высокий уровень транскрипции (рис. 2б и 2в) и, вместе с тем, позволила избежать опосредованных эффектов гормона на транскрипцию через его влияние на уровень фотосинтетических пигментов, ультраструктуру хлоропластов и т.д.
После 3 ч инкубации листьев на растворе БАП или воде из них выделяли хлоропласты, проводили транскрипцию в хлоропластных лизатах и выделяли 32P-меченные транскрипты, которые гибридизовали с фрагментами хлоропластных генов, нанесенными на нейлоновую мембрану согласно схеме, показанной на рис. 2а. Полученные при гибридизации сигналы (рис. 2б) сканировали и представили в виде гистограммы (рис. 2в). Критерием, по которому оценивали наличие или отсутствие регуляции, было превышение или уменьшение сигналов опытного варианта более, чем в 2 раза по сравнению с контрольным. Как видно из полученных результатов, ни для одного гена показатель отношения интенсивности транскрипции БAП/H2O не был выше 2.0 или ниже 0.5. Таким образом, регуляция экспрессии хлоропластных генов на уровне транскрипции под действием цитокинина в листьях 4-дневных растений ячменя не была обнаружена. Это могло быть связано с высоким эндогенным содержанием цитокининов в молодых листьях [25], поскольку действие экзогенного гормона всегда зависит от концентрации эндогенного цитокинина.
Для снижения уровня эндогенных цитокининов в ткани листа можно было: 1) вырастить ячмень в условиях низкого содержания элементов минерального питания; 2) изучить влияние цитокинина на транскрипцию на закончивших рост листьях ячменя, в которых содержание цитокинина резко снижено [25]; 3) ввести предынкубацию листьев ячменя на воде до перенесения их на раствор цитокинина для их истощения по данному фитогормону.
Из литературных данных известно, что обеднение почвы элементами минерального питания, особенно азотом и фосфором, приводит к снижению содержания цитокининов в растениях [26, 27]. Поэтому в качестве субстрата максимально обедненного по элементам минерального питания был выбран перлит. Предварительные результаты показали, что растения, выращенные в перлите, увлажненном необходимым количеством дистиллированной воды, значительно отставали по росту от растений, выращенных в почве. Они имели первый лист такой же длины, как и контрольные растения, однако его ширина была в 2-3 раза меньше. У 7-8-дневных растений ячменя, выросших на перлите, появлялись ярко выраженные признаки старения. Эксперимент был проведен на листьях, отделенных от 4-дневных растений. Листья инкубировали на воде или на растворе цитокинина в течение 3 ч на свету; затем из них выделяли хлоропласты и определяли скорость транскрипции. Как видно из результатов, представленных на рис. 3, выращивание ячменя на перлите приводило к значительному снижению скорости транскрипции хлоропластных генов, кодирующих как белки фотосинтетического аппарата (рис 3а, psbB, psbE, petB, petLG, ndhA, ndhF), так и компоненты системы экспрессии пластидного генома (рис. 3б, rps4, rps14, rps16, 3'rps12, rpl16, rpl23-2, rpoB, clpP). Однако и при значительном истощении растений цитокинин не активировал скорость транскрипции пластидных генов, что, вероятно, было вызвано общим истощением клеток по всем метаболитам, необходимым для активации транскрипции в хлоропластах.
Для многих растений, в том числе и для ячменя, показано, что цитокинин замедляет старение целого растения, отдельных органов, тканей и даже клеточных органелл [1]. При старении растения содержание эндогенных цитокининов значительно падает. Как было показано ранее, в первом листе 9-10-дневных растений ячменя наблюдалось значительного снижения уровня цитокинина [25]. Именно из первого листа растений ячменя этого возраста были выделены наиболее активные цитозольные, ядерные и хлоропластные цитокинин-связывающие белки, которые в присутствии транс-зеатина в условиях in vitro активировали тотальную транскрипцию в ядерных и хлоропластных лизатах [15]. В первом листе 9-дневных растений ячменя показана регуляция цитокинином транскрипции ядерного гена, кодирующего 18S рРНК [28]. В связи с этими данными представлялось вполне логичным изучить влияние цитокинина на транскрипцию пластидных генов на первом листе 9-дневных растений ячменя. Для этого отделенные от растения первые листья инкубировали в течение 3 ч на свету на воде или растворе цитокинина, выделяли хлоропласты и проводили run-on транскрипцию, как описано в разделе "МЕТОДИКА". Результаты, представленные на рис. 4, показывают отсутствие влияния цитокинина на транскрипцию хлоропластных генов в первом листе 9-дневных растений. Таким образом, в условиях эксперимента, в которых цитокинин активировал скорость транскрипции ядерного rrn18 гена, он никак не влиял на скорость транскрипции хлоропластных генов. Эти данные не вызывают удивления, поскольку известно, что экспрессия ядерных генов обычно более чувствительна к воздействию различных факторов, чем экспрессия пластидных генов [4].
Можно было предположить, что первый лист более старых растений ячменя будет более чувствительным к цитокинину, поскольку цитокинины способны не только задерживать распад фотосинтетических пигментов, снижать активность ферментов, влиять на структуру хлоропластов, но и обращать вспять процесс старения листьев [1]. Однако использование листьев более старых растений ячменя имеет, по крайней мере, два очевидных недостатка. Во-первых, с возрастом обычно падает активность экспрессии пластидных генов, что создает дополнительные трудности при изучении регуляции значительного количества слабо экспрессирующихся генов. Во-вторых, влияние цитокинина на транскрипцию в листьях старых растений может быть опосредовано общей активацией процессов, происходящих при замедлении старения тканей в присутствии цитокинина.
В связи с этим в следующих экспериментах были взяты закончившие рост первые листья 9-дневных растений ячменя, выращенных в почве, и была проведена дополнительная инкубация отделенных листьев в течение 24 ч на воде на свету (270 мкмоль/(м2 с)), которая предшествовала 3-часовой инкубации листьев на воде или растворе БАП при тех же условиях освещения. Мы ожидали, что предынкубация на воде ускорит истощение листьев по цитокининам и/или изменится баланс эндогенных фитогормонов и других регуляторов, что создаст условия для проявления регуляции экзогенным цитокинином транскрипции пластидных генов.
В данной постановке опыта из 26 проанализированных генов была обнаружена регуляция транскрипции цитокинином 14 генов, а для 12 генов достоверной регуляции транскрипции не было показано (рис. 5). Как видно по отношению скорости транскрипции БАП/Н2О, для большинства регулируемых генов активация составляла от 2.0 до 3.5 раз. Регуляции были подвержены как гены, кодирующие белки фотосинтетических комплексов, так и гены "домашнего хозяйства".
Таким образом, нами были разработаны условия постановки эксперимента (рис. 6), которые позволили обнаружить дифференциальную регуляцию транскрипции хлоропластных генов экзогенным цитокинином.
Все описанные выше опыты были проведены на целых первых листьях ячменя. Листья злаков, как известно, обладают возрастным градиентом клеток по длине листа, что не может не сказываться на функциональном состоянии пластид в разных зонах листа и на воспроизводимости гормональной регуляции транскрипции пластидных генов. Лист злаков растет базальной частью, поэтому именно там находятся самые молодые клетки. Они имеют мелкие пластиды, отличающиеся низкой транскрипционной активностью. Максимальная транскрипционная активность хлоропластов наблюдается в зоне 1-3 см от основания листа. В верхней части листа активность транскрипции падает [29]. Учитывая это, мы изучили гормональную регуляцию транскрипции пластидных генов цитокинином в трех зонах листа. Для этого после обработки гормоном первого листа, отделенного от 9-дневных растений ячменя в соответствии со схемой, показанной на рис. 6, для выделения хлоропластов были взяты 2-сантиметровые зоны базальной, средней и апикальной частей листа.
Результаты run-on транскрипции показали, что наиболее стабильным и сильным ответом на цитокинин характеризуется апикальная часть листа (рис. 7). Наиболее регулируемыми цитокинином в апикальной зоне листа оказались atpB, petD и rrn16 гены, которые активировались в 6.9, 7.7 и 9.0 раз соответственно. Цитокинин не регулировал ни один из изученных генов в пластидах базальной части, и только rrn16 ген достоверно активировался в средней части листа. Эти данные показывают, что ответ на цитокинин зависит от локализации хлоропластов на листе ячменя, что было учтено при всех последующих экспериментах.
Исключительной сложностью отличается взаимодействие света и цитокинина в регуляции физиологических процессов у растений. Активно исследуемый в течение длительного времени вопрос о влиянии света на содержание эндогенных цитокининов и других фитогормонов до настоящего времени не дал однозначного ответа. Свет и цитокинин могут взаимодействовать на самых разных уровнях, включая влияние на процесс трансляции, воздействие на одни и те же транс-факторы и компоненты сигнальных систем [1, 22, 23]. Причем это взаимодействие может зависеть от качества и интенсивности света. Наиболее корректным представляется предположение о том, что как свет, так и цитокинин необходимы для регуляции многих физиологических процессов у растений.
При оптимизации описываемой в данной статье постановки эксперимента использование длительного интенсивного освещения листьев имело решающее значение для получения эффекта экзогенного цитокинина на транскрипцию пластидных генов. Выбранная в начале работы интенсивность освещения 270 мкмоль/(м2 с), использованная при выращивании растений, предынкубации листьев на воде в течение 24 ч и инкубации на воде или растворе цитокинина в течение 3 ч, оказалась достаточной для получения эффекта экзогенного цитокинина на транскрипцию пластидных генов. Проведение предынкубации листьев в течение 24 ч и инкубации 3 ч в темноте или при меньшей интенсивности освещения (30 и 130 мкмоль/(м2 с)) не приводило к активации транскрипции пластидных генов цитокинином (данные не приводятся). Согласно полученным ранее результатам [30], для эффекта цитокинина на транскрипцию пластидных генов свет является абсолютно необходимым в ходе предынкубации листьев в течение 24 ч на воде.
Таким образом, результатом проведенных исследований является разработка экспериментальной системы, позволившей установить участие цитокининов в дифференциальной регуляции транскрипции индивидуальных хлоропластных генов у ячменя. Схема разработанной постановки эксперимента показана на рис. 6. Для ее создания была исследована зависимость действия цитокинина от возраста растений, от которых отделяли первый лист. Показана различная чувствительность к цитокинину базальной, средней и апикальной частей листа, и была выбрана для изучения влияния цитокинина на транскрипцию хлоропластных генов апикальная часть. Были применены различные подходы (включая голодание по минеральным элементам) для оптимизации условий ответа экспериментальной системы на цитокинин и было установлено, что таким условием является выдерживание срезанных листьев до воздействия цитокинина на воде и на свету в течение 24 ч. Гормональная регуляции транскрипции пластидного генома отличается исключительной сложностью и определяется многими как экзогенными, так и эндогенными факторами. Становится понятным, почему до настоящего времени участие цитокинина в регуляции транскрипции пластидных генов никем не было показано.
Благодаря взаимодействию многих факторов, таких как возраст растения, состояние пластид, температура, интенсивность и продолжительность освещенности, было обеспечено такое состояние клеток листа, при котором проявлялась активация цитокинином транскрипции хлоропластных генов.
Работа частично поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований (№ 07-04-01398), а также грантом Президента Российской Федерации по поддержке ведущих научных школ (НШ-915.2008.4).


СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функция. М.: Наука, 1973, 263 с.
2.Хохлова В.А. Действие цитокинина на формирование пластид на свету и в темноте в изолированных семядолях тыквы // Физиология растений. 1977. Т. 24. С. 1189-1193.
3.Partier B. The Role of Phytohormones (Cytokinins) in Chloroplast Development // Biochem. Physiol. Pflanz. 1979. V. 174. P. 173-214.
4.Kusnetsov V.V., Oelmüller R., Sarwat M.I., Porfirova S.A., Cherepneva G.N., Herrmann R.G., Kulaeva O.N. Cytokinins, Abscisic Acid and Light Affect on Accumulation of Chloroplast Proteins in Lupinus luteus Cotyledons without Notable Effect on Steady State m-RNA Levels // Planta. 1994. V. 194. P. 318-327.
5.Макеев А.В., Кузнецов В.В. Интенсивный и экстенсивный эффекты фитогормонов в развитии фотохимической активности хлоропластов // Докл. АН. 1996. Т. 346. С. 116-118.
6.Deng X.W., Grüissem W. Control of Plastid Gene Expression during Development: The Limited Role of Transcriptional Regulation // Cell. 1987. V. 49. P. 379-387.
7.Benkova E., Witters E., van Donger W., Kolar J., Motyka V., Brzobohaty B., van Onckelen H.A., Macháčková I. Cytokinins in Tobacco and Wheat Chloroplasts, Occurrence and Changes due to Light/Dark Treatment // Plant Physiol. 1999. V. 121. P. 245-251.
8.Rohmer M. Mevalonate-Independent Methylerythritol Phosphate Pathway for Isoprenoid Biosynthesis. Elucidation and Distribution // Pure Appl. Chem. 2003. V. 75. P. 375-387.
9.Kasahara H., Takei K., Ueda N., Hishiyama S., Yamaya T., Kamiya Y., Yamaguchi S., Sakakibara H. Distinct Isoprenoid Origins of cis- and trans-Zeatin Biosyntheses in Arabidopsis // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 14 040-14 054.
10.Hess W.R., Boerner T. Organellar RNA Polymerases of Higher Plants // Int. Rev. Cyt. 1999. V. 190. P. 1-59.
11.Лысенко Е.А., Кузнецов В.В. РНК-полимеразы пластид // Молекуляр. биология. 2005. Т. 39. С. 762-775.
12.Lysenko E.A. Plant Sigma Factors and Their Role in Plastid Transcription // Plant Cell Rep. 2007. V. 26. P. 845-859.
13.Kim M., Mullet J.E. Identification of a Sequence-Specific DNA Binding Factor Required for Transcription of the Barley Chloroplast Blue Light-Responsive psbD-psbC Promoter // Plant Cell. 1995. V. 7. P. 1445-1457.
14.Baba K., Nakano T., Yamagishi K., Yoshida S. Involvement of a Nuclear-Encoded Basic Helix-Loop-Helix Protein in Transcription of the Light-Responsive Promoter of psbD // Plant Physiol. 2001. V. 125. P. 595-603.
15.Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Kusnetsov V.V., Zemlyachenko Ya.V., Cherepneva G.N., Maslova G.G., Lukevich T.V., Smith A.R., Hall M.A. Nuclear and Chloroplast Cytokinin-Binding Proteins from Barley Leaves Participating in Transcription Regulation // Plant Growth Regul. 2000. V. 32. P. 329-335.
16.Люкевич Т.В., Кузнецов В.В., Каравайко Н.Н., Кулаева О.Н., Селиванкина С.Ю. Участие хлоропластного зеатин-связывающего белка в гормон-зависимой регуляции транскрипции хлоропластного генома // Физиология растений. 2002. Т. 49. С. 105-112.
17.Brown R., Rickless P. A New Method for Study Cell Division and Cell Extension with Some Preliminary Effect of Temperature and Nutrient // Proc. R. Soc. London (B). 1949. V. 136. P. 110-125.
18.Mullet J.E., Klein R.R. Transcription and RNA Stability Are Important Determinants of Higher Plant Chloroplast RNA Levels // EMBO J. 1987. V. 6. P. 1571-1579.
19.Зубо Я.О., Кузнецов В.В. Применение метода run-on транскрипции для изучения регуляции экспрессии пластидного генома // Физиология растений. 2008. Т. 55. С. 114-122.
20.Guadino R.G., Pikaard C.S. Cytokinin Induction of RNA Polymerase I Transcription in Arabidopsis thaliana // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 6799-6804.
21.Maniatis T., Frisch E.F., Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Lab., 1982. 545 p.
22.Kusnetsov V., Landsberger M., Meuer J., Oelmüller R. The Assembly of the CAAT-Box Binding Complex at the AtpC Promoter Is Regulated by Light, Cytokinin and the Stage of the Plastids // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 36 009-36 014.
23.D'Agostino I.B., Deruere J., Kieber J.J. Characterization of the Response of the Arabidopsis Response Regulator Gene Family to Cytokinin // Plant Physiol. 2000. V. 124. P. 1706-1717.
24.Romanov G.A., Kieber J.J., Schmülling Th. A Rapid Cytokinin Response Assay in Arabidopsis Indicates a Role for Phospholipase D in Cytokinin Signaling // FEBS Lett. 2002. V. 515. P. 39-43.
25.Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Moshkov I.E., Novikova G.V., Zemlyachenko Ya.V., Shipilova S.V., Orudgev E.M. Cytokinin Signaling System from a Whole Plant to the Molecular Level // Plant Growth Regul. 1996. V. 18. P. 29-37.
26.Lilly J.W., Maul J.E., Stern D.B. The Chlamydomonas reinhardtii Organellar Genomes Respond Transcriptionally and Post-Transcriptionally to Abiotic Stimuli // Plant Cell. 2002. V. 14. P. 2681-2706.
27.Kandlbinder A., Finkemeier I., Wormuth D., Hanitzsch M., Dietz K.-J. The Antioxidant Status of Photosynthesizing Leaves under Nutrient Deficiency: Redox Regulation, Gene Expression and Antioxidant Activity in Arabidopsis thaliana // Physiol. Plant. 2004. V. 120. P. 63-73.
28.Селиванкина С.Ю., Зубо Я.О., Зубкова Н.К., Кудрякова Н.В., Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Транскрипционная регуляция генов рибосомальных РНК цитокинином в стареющих листьях ячменя // Докл. АН. 2004. Т. 397. C. 832-834.
29.Baumgartner B.J., Rapp J.C., Mullet J.E. Plastid Transcription Activity and DNA Copy Number Increase Early in Barley Chloroplast Development // Plant Physiol. 1989. V. 89. P. 1011-1018.
30.Zubo Y.O., Yamburenko M.V., Selivankina S.Yu., Shakirova F.M., Avalbaev A.M., Kudryakova N.V., Zubkova N.K., Liere K., Kulaeva O.N., Kusnetsov V.V., Börner Th. Cytokinins Stimulate Chloroplast Transcription in Detached Barley Leaves // Plant Physiol. 2008. V. 148. P. 1082-1093.

 

ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

Рис. 1. Доказательство специфичности гибридизации меченой РНК, полученной в ходе run-on транскрипции, с фрагментами пластидных генов.
a - рекомбинантные плазмиды pUC57 A/T, содержащие фрагменты шести различных хлоропластных генов (1-6), были рестриктированы ферментами XbaI и BamHI. Чтобы отделить фрагменты от вектора, ДНК фракционировали в 1% агарозном геле и окрашивали бромистым этидием; б - после переноса ДНК на нейлоновую мембрану ее гибридизовали в стандартных условиях с 32Р-РНК, полученными в ходе run-on транскрипции в лизированных хлоропластах. Представлены результаты радиоавтографии. В качестве маркера (М) использовали ДНК фага λ, рестриктированную ферментами EcoRI и HindIII.

Рис. 2. Влияние цитокинина на транскрипцию хлоропластных генов в первых листьях, отделенных от 4-дневных растений ячменя.
Отделенные от растения первые листья ячменя инкубировали на воде или растворе цитокинина на свету в течение 3 ч. Фрагменты пластидных генов получали методом ПЦР и наносили на нейлоновую мембрану в 2-кратной повторности. а - схема эксперимента; цифры и буквы обозначают ряды образцов ДНК на мембране; б - радиоавтограмма результатов гибридизации фрагментов хлоропластных генов с меченой РНК, полученной в ходе run-on транскрипции в лизированных хлоропластах, которые были выделены из листьев ячменя. Обозначения, как на (а); в - результаты сканирования радиоавтограммы, полученные с использованием 1D Scan (Microsoft). 1 - вода, 2 - БАП, 2.2 ( 10-5 М.

Рис. 3. Влияние цитокинина на транскрипцию хлоропластных генов в первых листьях, отделенных от 4-дневных растений ячменя.
Отделенные листья инкубировали на воде или растворе БАП в течение 3 ч на свету. а - гены фотосинтетических белков; б - гены "домашнего хозяйства". 1, 2 - растения выращены в почве, 3, 4 - растения выращены в перлите; 1, 3 - вода, 2, 4 - БАП, 2.2 ( 10-5 М.

Рис. 4. Влияние цитокинина на скорость транскрипции хлоропластных генов в листьях ячменя, отделенных от 9-дневных растений.
Отделенные от растений первые листья ячменя инкубировали на свету на воде (1) или растворе цитокинина (2) в течение 3 ч. Представлены типичные результаты одного из трех биологических опытов.

Рис. 5. Влияние предынкубации отделенных от растения листьев ячменя в течение 24 ч на воде на свету на регуляцию скорости транскрипции пластидных генов цитокинином.
Первые листья ячменя, отделенные от 9-дневных растений, предынкубировали в течение 24 ч на воде на свету (270 мкмоль/(м2 с)) и затем переносили на 3 ч при тех же условиях освещения на воду или раствор БАП. Достоверной является активация транскрипции цитокинином более, чем в два раза, в сравнении с транскрипцией в контрольном варианте (темные столбики). Представлены типичные результаты одного из трех биологических опытов.

Рис. 6. Схема постановки эксперимента, при которой цитокинин регулирует транскрипцию пластидных генов.
Первые листья ячменя отделяли от 9-дневных растений и предынкубировали на увлажненной фильтровальной бумаге в течение 24 ч при освещении (270 мкмоль/(м2 с)). После этого листья инкубировали на воде или растворе БАП (2.2 (·10-5 M) в течение 3 ч при тех же условиях освещения.

Рис. 7. Регуляция цитокинином скорости транскрипции пластидных генов в различных частях первого листа ячменя.
Первый лист ячменя отделяли от 9-дневных растений, предынкубировали на воде на свету в течение 24 ч, затем переносили на воду или раствор БАП на 3 ч при тех же условиях освещения. Хлоропласты выделяли из 2-сантиметровых верхней (1), средней (2) и базальной (3) частей листа. 32P-меченные РНК выделяли после транскрипции in vitro и гибридизовали с фрагментами пластидных генов, нанесенными на нейлоновую мембрану. Интенсивность радиоактивных сигналов оценивали, как описано в разделе "МЕТОДИКА". Представлены типичные результаты одного из трех биологических опытов.