УДК 581.1
ГЕТЕРОЛОГИЧНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ДВУХ ω-3 ДЕСАТУРАЗ ЖИРНЫХ КИСЛОТ Glycine max В Saccharomyces cerevisiae
© 2009 г. Х. Т. Чжань, И. П. Би, Ж. Ж. Лиу, Л. Шан
Исследовательский центр высоких технологий, Академия сельскохозяйственных наук провинции Шандонь, Главная лаборатория генетической селекции зерновых, животных и птиц, Жинан, Китай
Поступила в редакцию 05.11.2007 г.
α-Линоленовая кислота (АЛК, C18:3Δ9,12,15) обладает многими важными биологическими функциями. ω-3 десатураза ЖК (FAD3), находящаяся в цитозоле и пластидах высших растений, катализирует дегидрогенизацию линолевой кислоты (ЛК), и при этом образуется АЛК. Гены GmFAD3A-2 и GmFAD3C, кодирующие FAD3 сои (Glycine max) сорта Qihuang 29, были клонированы, встроены в вектор p416 и экспрессированы в штамме дрожжей K601 (Saccharomyces cerevisiae). Газовая хроматография показала, что в трансформированных дрожжах действительно образуется АЛК. Уровень накопления АЛК в дрожжах, трансформированных генами GmFAD3A-2 и GmFAD3C, составлял соответственно 0.77 ± 0.1 и 4.13 ± 0.4% от суммарного содержания ЖК, в то время как содержание ЛК уменьшалось с 14.34 ± 0.8% в контроле до 10.93 ± 0 и 7.85 ± 0.1% у соответствующих трансформированных дрожжевых культур, что указывает на бóльшую активность или стабильность продукта гена GmFAD3C по сравнению с GmFAD3A-2.
________________________
Сокращения: АЛК ( α-линоленовая кислота; ЛК ( линолевая кислота; ОРС ( открытая рамка считывания; ПНЖК ( полиненасыщенные ЖК; ССД ( средняя степень десатурации; ЭР ( эндоплазматический ретикулум; FAD3 ( ω-3 десатураза ЖК.
Адрес для корреспонденции: L. Shan. High-Tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences; Key Laboratory for Genetic Improvement of Crop, Animal and Poultry of Shandong Province, Jinan, 250100 China. Fax: 86-531-8317-8156; e-mail: shlei1025@sina.com.cn

Ключевые слова: Glycine max ( Saccharomyces cerevisiae ( ω-3 десатураза ЖК ( α-линоленовая кислота.

ВВЕДЕНИЕ
ω-3 десатураза ЖК (FAD3) катализирует введение третьей двойной связи в ω-3 положение линолевой кислоты (ЛК, C18:2Δ9,12), и при этом образуется α-линоленовая кислота (АЛК, C18:3Δ9,12,15). В организмах позвоночных животные введение двойных связей в положения ω-3 и ω-6 ЖК невозможно; поэтому им приходится получать полиненасыщенные ЖК (ПНЖК) с продуктами питания, в связи с чем эти виды кислот называются незаменимыми ЖК [1]. Триенольная АЛК - один из видов ПНЖК, поступающая в организм из растительных масел. Она является важным питательным веществом для человека как структурный компонент фосфолипидов мембран и предшественник сигнальных эйкозаноидов [2]. В целях улучшения здоровья населения большое значение имеют исследования FAD3, направленные на получение растений с высоким содержанием АЛК, в том числе, используются методы брожения с участием микроорганизмов.
В высших растениях имеются два различных пути биосинтеза ПНЖК, один из которых называется микросомным, а другой пластидным. Микросомный путь важен для создания запасных ПНЖК в развивающихся семенах. Основным ферментом в этом процессе является микросомная ω-3 десатураза ЖК [3]. Для многих растений клонированы гены FAD3 микросомной FAD3, а также гены FAD7 и FAD8 пластидных ω-3 десатураз ЖК [3, 4]. В соевых бобах (Glycine max, сорт Williams 82) были определены три гомологичных гена семейства FAD3: GmFAD3A (AY204710), GmFAD3B (AY204711) и GmFAD3C (AY204712) [5]. В развивающихся семенах уровень транскрипции генов GmFAD3A и GmFAD3C составлял 60 и 0.2% от уровня транскрипции "гена домашнего хозяйства", кодирующего EF1 (фактор элонгации 1α), в то время как уровень экспрессии гена GmFAD3B был ниже минимального уровня обнаружения [5]. В то же время, анализ мутантов показал, что вклады генов GmFAD3A и GmFAD3C в образование ЛК в семенах сои различаются только в три раза, составляя соответственно 46 и 15 г/кг масла [6].
Saccharomyces cerevisiae часто используют как организм-хозяин для получения чужеродных белков, а также для исследования FAD [7, 8]. Дрожжи поглощают и усваивают многие виды ЖК из среды выращивания, а низкий уровень β-окисления в S. cerevisiae в присутствии подходящего источника углерода позволяет им накапливать как предшественники ЖК, так и сами ЖК [9]. На сегодняшний день в дрожжах экспрессированы многие типы генов FAD [7, 9(11]. Reed с соавт. [9] сообщали об успешной экспрессии гена FAD3 Brassica napus в S. cerevisiae, и кроме того, они также изучили субстратную специфичность и региональную селективность такой системы. Белок FAD3 B. napus имеет свойство катализировать дегидрогенизацию субстратов от 16- до 22-членных ЖК в ω-3 положении, предпочитая субстраты с двойной связью в положении ω-6 [9]. Suga с соавт. [11] пытались также экспрессировать FAD3 Chlorella в S. cerevisiae, но не обнаружили АЛК; они нашли в рекомбинантных трансформантах только экзогенную ЛК.
В настоящей работе для изучения разницы между генами GmFAD3A и GmFAD3C, от экспрессии которых зависит содержание ЛК в соевых бобах, мы амплифицировали кДНК GmFAD3A и GmFAD3C развивающихся семян соевых бобов сорта Qihuang 29. кДНК были экспрессированы в штамме K601 S. cerevisiae, после чего было определено содержание АЛК в трансформированных дрожжах.

МЕТОДИКА
Растительный материал. Растения сои (Glycine max, сорт Qihuang 29), любезно предоставленные Исследовательским институтом зерновых Шандоньской Академии сельскохозяйственных наук, выращивали в полевых условиях. Незрелые семена собирали, замораживали в жидком азоте и хранили при температуре (70°C для последующего проведения экспериментов.
Клонирование кДНК и анализ последовательностей. Суммарную РНК выделяли из развивающихся семян сои при помощи набора TRIzol ("Tianweishidai", Китай), согласно инструкции производителя. Используя суммарную РНК как матрицу, олиго-дТ(20) в качестве праймера и обратную транскриптазу RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase ("Sangon", Китай), в соответствии с инструкциями производителя синтезировали одноцепочечную кДНК. Затем, используя в качестве матрицы одноцепочечную кДНК, синтезировали кДНК генов GmFAD3A и GmFAD3C. Условия амплификации были следующими: 94°C в течение 3 мин; затем 5 циклов: 94°C в течение 50 с, 53°C в течение 50 с и 72°C в течение 80 с; затем 30 циклов: 94°C в течение 50 с, 60°C в течение 50 с и 72°C в течение 80 с, после чего следовала окончательная выдержка при 72°C в течение 10 мин. Исходя из последовательностей мРНК GmFAD3A (AY204710) и мРНК GmFAD3C (AY204712), разработали следующие праймеры для их амплификации из Qihuang29: смысловой праймер для амплификации GmFAD3A с сайтом BamHІ 5′ tag gat ccg cca aag cag caa tgg tt 3′, и антисмысловой праймер с сайтом XhoІ 5′ gtc tcg aga ttg aaa ctc agt ctc gg 3′; смысловой праймер для амплификации GmFAD3C ( 5′ aat ggt tca agc aca gcc 3′, и антисмысловой праймер ( 5′ ctt tag ttg gac tgg gtc 3′. Очищенные продукты амплификации кДНК GmFAD3A и GmFAD3C клонировали в векторы pGEM-T Easy ("Promega", США) и pUCm-T ("Sangon"), полученные конструкции назвали соответственно pGEM-FAD3A и pUCm-FAD3C и секвенировали. Последовательности GmFAD3A и GmFAD3C анализировали при помощи программы DNAMAN, а гидрофобность кодируемых ими белков - при помощи программы GPMAW6.
Построение вектора экспрессии в дрожжах. p416 - челночный вектор экспрессии между дрожжами и Escherichia coli, содержащий конститутивный промотор TEF, терминатор CYT1 и репликон CEN6/ARSH4, селективный маркер URA3 экспрессии в дрожжах и селективный маркер устойчивости к ампициллину в E. coli. Рецептором являлся гаплоидный штамм S. cerevisiae K601 (ade2, his3, leu2, trp1, ura3), любезно предоставленный проф. Чень-Чао Жень (Шандоньский сельскохозяйственный университет).
Продукты амплификации GmFAD3A, обработанные ферментами BamHІ и XhoІ, а также рекомбинант pUCm-FAD3C, обработанный ферментами BamHІ и EcoRІ (многоферментный сайт плазмиды pUCm-T содержит сайты BamHІ и EcoRІ), лигировали в вектор p416, в результате чего сконструировали рекомбинантные плазмиды p4GFAD3A и p4GFAD3C. После этого p416, p4GFAD3A и p4GFAD3C трансформировали в штамм K601 S. cerevisiae с помощью LiAc-метода [12]. Селекцию штаммов p416/K601, p4GFAD3A/K601 p4GFAD3C/K601 проводили на минимальной агарозной среде без урацила.
Экспрессия GmFAD3C и GmFAD3A в дрожжах. Штаммы, содержавшие конструкции p416, p4GFAD3A и p4GFAD3C, инокулировали в жидкую среду CM (Ura-) с добавлением 2% глюкозы, 0.5 мМ ЛК и 1% NP-40, но не содержавшую урацила. Десатуразы ЖК проявляют бóльшую активность при пониженных температурах. Так, например, при 20°C синтезируется гораздо больше ненасыщенных ЖК, чем при 30°C. В то же время, 30°C является оптимальной температурой для быстрого роста дрожжей, а при 20°C рост их значительно замедляется. Выращивание дрожжей при низкой температуре не позволяет накопить количество клеток до необходимой плотности. Поэтому когда плотность клеток, выращенных при 30°C, достигала 5 × 106 клеток/мл, температуру снижали до 20°C, культивирование продолжали еще 72 ч, после чего собирали слоевища.
Анализ содержания ЖК в клетках трансформированных дрожжей методом газовой хроматографии. Собранные слоевища промывали деионизованной водой, лиофилизировали и растирали. Затем добавляли 2 мл 0.5 М раствора KOH(CH3OH, смесь инкубировали при 60°C в течение 30 мин в струе газообразного азота и охлаждали до комнатной температуры. Затем добавляли 2 мл 15% раствора BF3(CH3OH и выдерживали смесь на водяной бане при 60°C в течение 2 мин. Затем в смесь добавляли необходимое количество раствора NaCl и 1.0(1.5 мл петролейного эфира, тщательно встряхивали и оставляли для осаждения. Супернатант (петролейный эфир, содержащий метиловые эфиры ЖК) анализировали на газовом хроматографе Agilent 6890N с капиллярной колонкой FFAP и пламенно-ионизационным детектором, как описано в работе [13]. Эфиры ЖК идентифицировали по времени их удерживания путем сравнения со стандартами.
Реактивы и среды. Все рестрикционные эндонуклеазы и маркеры ДНК были приобретены у "TaKaRa"; X-Gal, IPTG, Taq-полимеразу ДНК и ЛК были приобретены у компании "Sangon", ДНК спермы лосося и метил-линоленат приобретали у "Sigma" (США). Среды LB, YPD, 2× YPD, CM (Ura-) использовали такие же, как в публикации [14]. Остальные реагенты были качества "ч.д.а.".

РЕЗУЛЬТАТЫ

Клонирование и анализ последовательностей GmFAD3A и GmFAD3C

Две последовательности кДНК GmFAD3, названные GmFAD3A-2 и GmFAD3C, амплифицировали из незрелых семян сои сорта Qihuang 29, исходя из опубликованных последовательностей GmFAD3A (AY204710) и GmFAD3C (AY204712). Длина их кодирующих участков составляла 1128 и 1140 п.н. соответственно. Предсказанные аминокислотные последовательности были идентичны опубликованным последовательностям GmFAD3A и GmFAD3C на 99 и 100% соответственно. Исследуемые нуклеотидные последовательности GmFAD3A-2 и GmFAD3C отличаются от опубликованных всего на 9 и 1 нуклеотид соответственно.
С помощью программы DNAMAN проанализировали первичную структуру этих двух белков, а также прочих последовательностей FAD3, помещенных в Генбанк: Arabidopsis (AtFAD3, P48623), рапса (BnFAD3, P48624), табака (NtFAD3, P48626), сои (GmFAD3A, AA024263; GmFAD3C, AA024265) и льна (LuFAD3A, ABA02172; LuFAD3B, ABA02173). Обнаружили, что все они содержат три консервативных мотива (рис. 1), богатых гистидином: HxCGH, HxxxxxHRTHH и HHxxxxHVIHH, и необходимых для связывания атомов железа [15, 16].

Анализ активности GmFAD3A и GmFAD3C в дрожжах

Полные кодирующие области GmFAD3A-2 и GmFAD3C встраивали в вектор p416, после чего рекомбинантные плазмиды p4GFAD3A и p4GFAD3C, а также вектор p416 независимо встраивали в штамм дрожжей K601. ЖК, суммарно экспрессирующиеся в трансформированных дрожжах, этерифицировали для анализа методами газовой хроматографии (по времени удерживания) и масс-спектрометрии. Результаты анализа показали, что в хроматограммах экстрактов дрожжей, несущих ген GmFAD3A2 или GmFAD3C, оба из которых обуславливают образование ЛК, появлялся новый пик, вызванный наличием метилового эфира АЛК (установлено путем сравнения со стандартным временем удерживания метилового эфира данной кислоты - данные не приведены). У образцов культуры дрожжей со встроенным контрольным вектором данный пик не обнаруживали. Содержание АЛК в дрожжевых клетках со встроенными GmFAD3A-2 и GmFAD3C составило 0.77 ± 0.10 и 4.13 ± 0.40% суммарного содержания ЖК соответственно (таблица). Содержание ЛК в дрожжах штамма K601, содержавших GmFAD3A-2 и GmFAD3C, снизилось до 10.93 ± 0 и 7.85 ± 0.10% соответственно, по сравнению с 14.34 ± 0.80% у контрольных образцов. Следовательно, и GmFAD3A-2, и GmFAD3C могут экспрессироваться в нашей системе дрожжевых клеток, а кодируемые ими белки могут специфично превращать ЛК в АЛК путем удаления атомов водорода в ω-3 положении (рис. 2). GmFAD3C имеет более высокую активность по сравнению с GmFAD3A-2. Определили также среднюю степень дегидрирования (ССД) системы in vitro как весовой процент продуктов/(весовой процент продуктов + весовой процент субстратов) × 100%. Так, ССД GmFAD3A-2 составляла 6.6%, а у GmFAD3C ( около 34.5%.

ОБСУЖДЕНИЕ

S. cerevisiae является организмом, удобным для изучения ω-3 и ω-6 десатураз, так как в них не могут эндогенно образовываться ПНЖК из-за отсутствия данных ферментов. Известно, что микросомная десатураза в качестве доноров электронов использует цитохром b5 и цитохром b5-оксидоредуктазу, в то время как пластидная десатураза требует наличия ферредоксина и ферредоксин-оксидоредуктазы [16]. В систему переноса электронов S. cerevisiae входят цитохром b5, НАДФ∙H и цитохром b5-оксидоредуктаза; поэтому данный организм может экспрессировать микросомную десатуразу, тогда как пластидная десатураза в нем функционировать не может [18]. Дрожжи, содержащие кодирующие области генов GmFAD3A-2 или GmFAD3C, могут вырабатывать АЛК, что означает, что десатуразы, кодируемые этими генами, являются микросомными. Хотя типичные последовательности для локализации в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) и не были найдены в ферментах GmFAD3A-2 и GmFAD3C, в COOH-концевой области данных ферментов могут существовать какие-то альтернативные, пока не известные мотивы локализации в ЭР.
Установлено, что микросомные FAD3 являются основными катализаторами образования АЛК в семенах растений [3]. В масле, получаемом из семян сои, содержание АЛК достаточно велико и может превышать 6.1% от суммарного содержания ЖК [6, 19]. В развивающихся семенах сои уровень экспрессии гена GmFAD3A гораздо выше, чем генов GmFAD3C и GmFAD3B. Транскрипты гена GmFAD3A составляют 60% в сравнении с транскриптами гена, кодирующего EF1, в то время как транскрипты гена GmFAD3C составляют всего 0.2%. Таким образом, накопление мРНК гена GmFAD3A идет в более, чем 300 раз, быстрее по сравнению с накоплением мРНК гена GmFAD3C. Экспрессия гена GmFAD3B обнаружена не была [5]. Однако анализ вклада генов GmFAD3A и GmFAD3C в содержание АЛК показал, что уровень АЛК вследствие экспрессии гена GmFAD3A составил 46 г/кг масла, что всего лишь в 3 раза выше, чем вклад GmFAD3C (15 г/кг) [6]. Результаты нашей работы показывают, что в той же самой культуре и в тех же самых условиях экспрессии содержание АЛК в клетках дрожжей, несущих ген GmFAD3C, было в 5 раз выше, чем в клетках, несущих ген GmFAD3A-2, хотя белки, экспрессируемые как геном GmFAD3A-2, так и геном GmFAD3C, могут использовать экзогенные субстраты и катализировать включение третьей двойной связи в ЛК, в результате чего образуется АЛК. Поэтому мы сделали заключение, что белок, кодируемый геном GmFAD3C, вероятно, обладает гораздо более высокой ферментативной активностью или более стабилен, чем белок, кодируемый геном GmFAD3A-2, или же этот белок более интенсивно транслируется.
Известно, что на эффективность накопления продуктов в клетках S. cerevisiae влияет множество факторов, в том числе условия выращивания культуры, скорость усвоения экзогенных ЖК-субстратов десатураз, скорость эндогенного биосинтеза ЖК и другие [9]. Reed с соавт. [9] сообщили, что скорость десатурации в культурах не ограничивается уровнем ЛК, если он не превышает 7%. Результаты наших прошлых работ также свидетельствуют, что содержание АЛК в культурах дрожжей, несущих ген GmFAD3C, не менялось, даже когда содержание ЛК достигало 16.2% от суммарного содержания ЖК (данные не приведены). В ходе настоящего исследования мы обнаружили, что для двух исследованных штаммов дрожжей скорость обработки экзогенной ЛК не являлась основным фактором, влиявшим на уровень накопления АЛК при строгом соблюдении условий выращивания. Исходя также из результатов наших прошлых работ [5, 6], можно заключить, что ферментативная активность GmFAD3C примерно в 100 раз выше, чем активность GmFAD3A. Тем не менее, настоящее исследование показало, что разность в активности GmFAD3Cи GmFAD3A-2 гораздо меньше, чем можно было ожидать. Вероятно, есть и другие факторы, влияющие на экспрессию GmFAD3C и GmFAD3A-2 на уровне их трансляции. Полученные нами данные не позволяют определить точное соотношение ферментативных активностей белков, и их следует рассматривать как полуколичественные. Тем не менее, результаты нашего исследования позволяют в какой-то степени оценить их соотношение.
Мы выражаем признательность проф. Чень-Чао Жень Шандонского сельскохозяйственного университета за предоставленные вектор p416 и штамм дрожжей K601.
Данное исследование выполнялось при финансовой поддержке Фонда молодых ученых и Программы индустриализации и разработки новых сортов зерновых Правительства провинции Шандонь.


СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Shahidi F., Wanasundara U.N. Omega-3 Fatty Acid Concentrates: Nutritional Aspects and Production Technologies // Trends Food Sci Technol. 1998. V. 9. P. 230-240.
2.Spector A.A. Essentiality of Fatty Acids // Lipids. 1999. V. 34. P. S1-S3.
3.Yadav N.S., Wierzbicki A., Aegerter M., Caster C.S., Pérez-Grau L., Kinney A.J., Hitz W.D., Booth J.R. Jr., Schweiger B., Stecca K.L. Cloning of Higher Plant Omega-3 Fatty Acid Desaturase // Plant Physiol. 1993. V. 103. P. 467-476.
4.Arondel V., Lemieux B., Hwang I., Gibson S., Goodman H.M., Somerville C.R. Map-Based Cloning of a Gene Controlling Omega-3 Fatty Acid Desaturation in Arabidopsis // Science. 1992. V. 258. P. 1353-1355.
5.Bilyeu K.D., Palavalli L., Sleper D.A., Beuselinck P.R. Three Microsomal Omega-3 Fatty Acid Desaturase Genes Contribute to Soybean Linolenic Acid Levels // Crop Sci. 2003. V. 43. P. 1833-1838.
6.Bilyeu K.D., Palavalli L., Sleper D.A., Beuselinck P.R. Mutations in Soybean Microsomal Omega-3 Fatty Acid Desaturase Genes Reduce Linolenic Acid Concentration in Soybean Seeds // Crop Sci. 2005. V. 45. P. 1830-1836.
7.Watts J.L., Browse J. Isolation and Characterization of a Delta-5 Fatty Acid Desaturase from Caenorhabditis elegans // Arch. Biochem. Biophys. 1999. V. 362. P. 175-182.
8.Kim Y.O., Kim H.W., Lee J.H., Kim K.K., Lee S.J. Molecular Cloning of the Phytase Gene from Citrobacter braakii and Its Expression in Saccharomyces cerevisiae // Biotechnol. Lett. 2006. V. 28. P. 33-38.
9.Reed D.W., Schafer U.A., Covello P.S. Characterization of the Brassica napus Extraplastidal Linoleate Desaturase by Expression in Saccharomyces cerevisiae // Plant Physiol. 2000. V. 122. P. 715-720.
10.Covello P.S., Reed D.W. Functional Expression of the Extraplastidial Arabidopsis thaliana Oleate Desaturase Gene (FAD2) in Saccharomyces cerevisiae // Plant Physiol. 1996. V. 111. P. 223-226.
11.Suga K., Honjoh K., Furuya N., Shimizu H., Nishi K., Shinohara F., Hirabaru Y., Maruyama I., Miyanoto T., Hatano S., Iio M. Two Low-Temperature-Inducible Chlorella Genes for Δ12 and ω-3 Fatty Acid Desaturase (FAD): Isolation of Δ12 and ω-3 FAD cDNA Clones, Expression of Δ12 FAD in Saccharomyces cerevisiae, and Expression of ω-3 FAD in Nicotiana tabacum // BioSci. Biotechnol. Biochem. 2002. V. 66. P. 1314-1327.
12.Frederick M.A., Roger B., Robert E.K. Short Protocols in Molecular Biology. New York: Wiley John & Sons Inc, 1995.
13.Eiji S., Michihiko K., Sakayu S. Δ9-Fatty Acid Desaturase from Arachidonic Acid-Producing Fungus: Unique Gene Sequence and Its Heterologous Expression in a Fungus Aspergillus // Eur. J. Biochem. 1999. V. 260. P. 208-216.
14.Sambrook J., David W.R. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Lab., 2001.
15.Tocher D.R., Leaver M.J., Hodgson P.A. Recent Advances in the Biochemistry and Molecular Biology of Fatty Acid Desaturases // Prog. Lipid Res. 1998. V. 37. P. 73-117.
16.Los D.A., Murata N. Structure and Expression of Fatty Acid Desaturases // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1394. P. 3-15.
17.McCartney A.W., Dyer J.M., Dhanoa P.K., Kim P.K., Andrews D.W., McNew J.A., Mullen, R.T. Membrane-Bound Fatty Acid Desaturases Are Inserted Co-Translationally into the ER and Contain Different ER Retrieval Motifs at Their Carboxy Termini // Plant J. 2004. V. 37. P. 156-173.
18.Domergue F., Spiekermann P., Lerchl J., Beckmann C., Kilian O., Kroth P.G., Boland W., Zähringer U., Heinz E. New Insight into Phaeodactylum tricornutum Fatty Acid Metabolism, Cloning and Functional Characterization of Plastidial and Microsomal Δ12-Fatty Acid Desaturases // Plant Physiol. 2003. V. 131. P. 1648-1660.
19.Anai T., Yamada T., Kinoshita T., Rahman S.M., Takagi Y. Identification of Corresponding Genes for Three Low-(-Linolenic Acid Mutants and Elucidation of Their Contribution to Fatty Acid Biosynthesis in Soybean Seed // Plant Sci. 2005. V. 168. P. 1615-1623.


Содержание ЖК в процентах от суммарного содержания липидов в трансформированных штаммах дрожжей
Конструкцияа


а Штаммы S. cerevisiae выращивали в среде МС, содержавшей глюкозу, с добавлением 0.5 мМ ЛК.
б Прочерк означает, что ЖК обнаружена не была.
в Подчеркивание означает, что ЖК была новообразованной.
г Каждое значение представляет собой среднее из трех измерений.

 

ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

Рис. 1. Анализ выведенных аминокислотных последовательностей белков GmFAD3A и GmFAD3C.
Последовательности, обведенные в рамки, представляют собой мотивы, богатые гистидином, а подчеркнутые ( двухлизиновые мотивы локализации в ЭР ((KXKXX). Все последовательности, включая FAD3 Arabidopsis (AtFAD3, P48623), рапса (BnFAD3, P48624) и табака (NtFAD3, P48626); FAD3A (LuFAD3A, ABA02172), FAD3B (LuFAD3B, ABA02173) льна; FAD3A (GmFAD3A, AA024263) и FAD3C (GmFAD3C, AA024265) сои, а также GmFAD3A-2, исследованную в настоящей работе, сопоставляли с помощью программы DNAMAN.

Рис. 2. Анализ суммарного содержания ЖК в трансформированных штаммах S. cerevisiae методом газовой хроматографии.
Клетки штамма K601, несущие векторы p416 (а), p4GFAD3A (б) или p4GFAD3C (в), выращивали при 20°C в среде MC, содержавшей глюкозу, с добавлением 0.5 мМ ЛК. Метиловые эфиры ЖК определяли путем сравнения времен удерживания со стандартами.
C16:0 - пальмитиновая кислота; C16:1 - пальмитоолеиновая кислота; C18:0 - стеариновая кислота; C18:1 - олеиновая кислота; C18:2 - линолевая кислота; C18:3 ( α-линоленовая кислота.