УДК 581.1
БИОИНФОРМАЦИОННОЕ ПРЕДСКАЗАНИЕ НОВЫХ МИКРО-РНК РАСТЕНИЙ ТОМАТА И ИХ ПОДТВЕРЖДЕНИЕ МЕТОДОМ ПЦР С ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИЕЙ
© 2010 г. Фу-Лэй Луань1, Ю-Шэн Хань1, Хун-Лян Чжу, И Шао, Ань-Цзюнь Чэнь,
Хуэй-Цинь Тянь, Юнь-Бо Ло, Бэнь-Чжун Чжу
Китайский сельскохозяйственный университет, Пекин, Китай
Поступила в редакцию 29.04.2008 г.
Микро-РНК (миРНК) - недавно открытый класс молекул РНК длиной около 21 нуклеотида, не кодирующих белки, а регулирующих пост-транскрипционную экспрессию генов у животных и растений. Исследования показали, что миРНК выполняют целый ряд функций в процессах роста и развития растений. миРНК трудно обнаружить экспериментальными методами из-за низкого уровня их экспрессии и высокой тканевой специфичности; в то же время, хорошим методом предсказания новых миРНК является биоинформатика. В данной работе мы разработали подход, основанный на анализе меток экспрессируемых последовательностей (EST) для предсказания новых миРНК, а также их мишеней в растениях томата (Lycopersicon esculentum Mill.). С помощью программы BLAST сравнили базу данных EST томата с известными миРНК других видов растений - с целью поиска новых миРНК среди данных меток. По ряду критериев отбора, включая структуру ствол-петля, число несовпадений, содержание A + U, индекс минимальной свободной энергии укладки и другие, определили 8 потенциальных миРНК, после чего провели их
________________________
Сокращения: ДМСО - диметилсульфоксид; миРНК - микроРНК; ACS - 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатсинтаза; AGO1 - белок семейства Argonaute; DDBJ - база данных ДНК Японии (от DNA Data Bank of Japan); EST - метка экспрессируемой последовательности (от expressed sequence tag); ERF - фактор связывания с элементом чувствительности к этилену (от ethylene response element-binding factor); MFE - минимальная свободная энергия укладки (от minimal folding free energy); MFEI - коэффициент минимальной свободной энергии укладки (от minimal folding free energy index); NCBI - Национальный центр биотехнологической информации; PTGS - пост-транскрипционное подавление генов (от post-transcriptional gene silencing); RISC - РНК-индуцируемый комплекс подавления транскрипции (от RNA-induced silencing complex); SBP - белки, связывающиеся с промотором Squamosa (от Squamosa-promoter binding proteins); TGS - транскрипционное подавление экспрессии генов (от transcriptional gene silencing).
--------------------------------------
Адрес для корреспонденции: Fu-Lei Luan. Laboratory of Fruit Biology, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing, 100083 China. Fax: +86 (10) 6273-7538; e-mail: cauzbz@yahoo.com.cn

1 Данные авторы внесли равный вклад в работу.

экспериментальное подтверждение методом ОТ-ПЦР. Таким образом, были найдены три ранее неизвестных миРНК томата: LemiR157a, LemiR172i и LemiR399. Далее сравнили вновь обнаруженные последовательности миРНК с базой данных мРНК при помощи программы BLAST, в результате чего определили 42 потенциальные мишени миРНК. На основании аннотаций к мРНК томата, содержащихся на веб-сайте (http://ted.bti.cornell.edu/digital/sRNA), гены-мишени данных миРНК можно разделить на четыре основные группы: факторы-регуляторы роста и развития, пути передачи сигналов, участники процессов метаболизма растений томата и группа с неизвестными функциями.

Ключевые слова: Lycopersicon esculentum - плод - EST - миРНК - мишени

ВВЕДЕНИЕ
МикроРНК (миРНК) представляют собой недавно открытый класс молекул РНК длиной около 21 нуклеотида, не кодирующих белки [1]. МикроРНК химически и функционально схожи с малыми интерферирующими РНК, которые являются посредниками процессов интерференции РНК (RNAi), пост-транскрипционного подавления экспрессии генов (PTGS, от post-transcriptional gene silencing) и транскрипционного подавления экспрессии генов (TGS, от transcriptional gene silencing) [2]. На сегодняшний день показано, что миРНК играют важную роль в регуляции экспрессии генов на пост-транскрипционном уровне [1, 3]. Компьютерные предсказания и последующие экспериментальные подтверждения показали, что большинство генов-мишеней миРНК являются транскрипционными факторами [4]. В частности, гены-мишени миРНК управляют процессами метаболизма во время роста и развития растений, такими как морфогенез корней, стеблей, листьев и цветков, клеточная дифференциация и рост тканей [4, 5]. Кроме того, образование миРНК может регулироваться внешними стрессовыми факторами, такими как патогенез, засуха, соль, тепло и холод [5, 6].
Первичные миРНК - длинные, кэпированные и полиаденилированные, их транскрипция происходит на генах миРНК в ядрышке [7]. В отличие от животных, у растений нет гомолога Drosha, в то же время, есть гомолог Dicer, известный как DCL1, катализирующий превращение первичных миРНК в пре-миРНК, что требует также участия белка dsRBD (HYL1) [1, 7, 8]. Затем дуплексы миРНК-миРНК* с помощью белка HASTY переносятся в цитоплазму [7, 8]. В растениях дуплексы миРНК-миРНК* метилируются при помощи фермента HEN1, которого нет у животных [9-11]. Хеликаза катализирует превращение дуплекса миРНК-миРНК* в спираль, после чего зрелые миРНК соединяются с белком Argonaute и образуют РНК-индуцируемый, подавляющий транскрипцию комплекс (RISC, от RNA-induced silencing complex) [12-14]. миРНК растений более точно комплементарны своим мишеням, чем у животных, и, по большому счету, управляют процессом разрезания комплементарных мРНК; поэтому функции миРНК в растениях более сходны с функциями малых интерферирующих РНК (siRNA) (15 TGS [18]).
В последнее время достигнуты большие успехи в исследованиях миРНК растений [1]. Так, многие миРНК были обнаружены в таких модельных растениях, как Arabidopsis, Populus и Oryza, а в растениях томата, который является модельным растением для изучения процессов созревания и развития плода, количество разных миРНК невелико [19, 20]. Существует два основных способа обнаружения миРНК: первый - прямое клонирование, второй - биоинформационный. Первый способ затруднен тем, что требует длительного эксперимента, и с его помощью очень трудно клонировать миРНК, присутствующие в малых количествах и обладающие высокой тканевой специфичностью. Поэтому методом прямого клонирования и глубокого секвенирования было обнаружено крайне мало миРНК [21, 22]. Так, например, Rachel с соавт. [23] клонировали 4018 малых РНК из тканей зеленых плодов томата, и получили только девять известных миРНК и три потенциально новых миРНК. Биоинформационный путь позволяет значительно сократить затраты труда и времени [24]. Общеизвестным биоинформационным методом является анализ меток экспрессируемых последовательностей EST (от expressed sequence tag) [25]. EST - частично экспрессируемые генетические последовательности, которые можно превратить в кДНК, поэтому метод EST-анализа является достаточно быстрым, экономичным и достоверным, особенно для видов, для которых пока не получено последовательности генома [25, 26].
EST-анализ оказался очень эффективным методом для поиска консервативных миРНК растений. миРНК в растениях действительно очень консервативны; поэтому известные миРНК одних растений могут быть использованы для поиска новых миРНК в других, менее изученных видах растений [24]. Сообщается, что на сегодняшний день методом EST-анализа выявлено 481 миРНК 71 вида растений, которые можно разделить на 37 семейств миРНК [24]. Поэтому EST-анализ действительно можно считать лучшим методом обнаружения миРНК, особенно содержащихся в тканях растений в малом количестве, что затрудняет их поиск методом прямого клонирования [24].
Томат - промышленно возделываемая культура во многих странах мира. Более того, он является модельным растением для исследования развития и созревания плодов и овощей. Большинство работ направлено именно на изучение миРНК в модельных растениях и промышленных культурах [19]. На сегодняшний день известно очень мало миРНК томата. Поэтому в данной работе мы поставили цель обнаружить большее количество миРНК томата методом EST, а также проанализировать их гены-мишени. Знание большего количества миРНК и их генов-мишеней позволило бы больше узнать о процессах регуляции генов, связанных с физиологическими процессами томата, управляемых малыми РНК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Последовательности миРНК, EST и мРНК. Для поиска потенциальных миРНК томата загрузили последовательности всех известных 838 миРНК и их предшественников из базы данных миРНК (сайт http://microrna.sanger.ac.uk, выпуск 10.0, август 2007 г.). Данные последовательности принадлежат нескольким видам растений: Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Populus trichocarpa, Glycine max, Medicago truncatula, Physcomitrella patens, Saccharum officinarum, Sorghum bicolor и Zea mays. Для поиска отправных точек для последующего определения миРНК томата устранили из данного набора последовательностей миРНК повторы. Оставшиеся последовательности как отправные подвергли анализу BLAST на совпадение с последовательностями EST томата.
Последовательности EST томата получили из версии 2.2.15 базы данных ДНК Японии (DDBJ, от DNA Data Bank of Japan; сайт http://blast.ddbj.nig.ac.jp), а последовательности mRNA томата - с сайта http://ted.bti.cornell.edu/digital/sRNA.
Прикладные программы для анализа последовательностей. Анализ BLAST (версия 2.2.15) производили на интернет-сайте DDBJ http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-e.html, а анализ вторичной структуры РНК - на сайте http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/rna-form1.cgi с помощью программы mFold (версия 3.2), составленной Zuker и Turner. Для анализа потенциальных генов-мишеней миРНК использовали программы, содержащиеся на веб-сайте http://ted.bti.cornell.edu/digital/sRNA.
Предсказание миРНК томата. Процесс предсказания миРНК томата по методу Zhang [24], который мы использовали с небольшими изменениями, схематически представлен на рис. 1. Для начала получили все известные последовательности миРНК растений из базы данных миРНК и удалили повторяющиеся последовательности. Оставшиеся последовательности миРНК сравнили с последовательностями EST томата, полученными из базы данных DDBJ при помощи BLAST-анализа. При этом интересовались подходящими последовательностями EST томата, достаточно точно совпадающими с проверяемыми последовательностями миРНК, т.е. имеющие 0, 1 или 2 несовпадения. После этого проверили их по базе данных белков NCBI (Национальный центр биотехнологической информации) при помощи анализа BLASTX, чтобы исключить последовательности EST, кодирующие белки. Затем при помощи интернет-программы mFold проанализировали вторичную структуру оставшихся РНК, так как известно, что пре-миРНК автоматически сворачиваются в специфическую структуру, напоминающую шпильку для волос. И, наконец, оставшиеся EST, имеющие такую форму вторичной структуры, считали потенциальными генами, кодирующими миРНК томата. Однако полученный таким образом результат можно считать лишь очень грубым, и гарантировать, что все полученные последовательности являются миРНК, никак нельзя, поскольку и многие другие типы РНК (мРНК, тРНК, малая РНК) также имеют вторичную структуру в виде шпильки [27]. Для того, чтобы оставить из них только миРНК и исключить все прочие, установили следующие строгие правила отбора: (1) допускается только 0, 1 или 2 несовпадения предсказуемых миРНК с известными миРНК; (2) предшественники миРНК могут сворачиваются во вторичную структуру в виде шпильки таким образом, что зрелая миРНК имеет длину около 21 нуклеотида и представляет собой одно плечо шпильки предшественника; (3) вторичная структура предшественников миРНК имеет более высокое значение минимальной отрицательной свободной энергии, чем другие виды РНК. Дело в том, что сама миРНК не всегда имеет более высокое значение минимальной свободной энергии, чем другие виды РНК. Для того, чтобы отличить миРНК от других видов кодирующих или некодирующих РНК, вводится коэффициент минимальной свободной энергии ее предшественника MFEI (от minimal folding free energy index). Известно, что у большинства предшественников миРНК он превышает 0.85 (что и является общепринятым критерием отбора), у тРНК он составляет 0.64, у рРНК - 0.59 и у мРНК - от 0.62 до 0.66; (4) 30-70% оснований миРНК должны составлять A + U; (5) между последовательностями миРНК и противоположной миРНК* во вторичной структуре не должно быть более 6 несовпадений; и, наконец, (6) не допускаются петли и разрывы в комплементарных последовательностях миРНК* [27, 28].
Предсказание мишеней миРНК. В проведенных до сегодняшнего дня исследованиях было отмечено, что большинство известных миРНК растений полностью или практически полностью комплементарны своим мРНК, и разрушают свои мРНК-мишени способом, подобным РНК интерференции [29]. При этом число несовпадений между миРНК и потенциальными мишенями мРНК должно быть не более четырех, и в комплементарных сайтах миРНК и мРНК не должно быть разрывов [29].
Поэтому в процессе предсказания новых миРНК томата мы сравнили их с базой мРНК томата при помощи программы BLAST. Допускали менее 4 несовпадений между миРНК и мРНК томата, после чего отбросили повторяющиеся последовательности РНК. Таким образом, были получены потенциальные функциональные мишени миРНК, которые и подвергали последующему анализу (рис. 2).
Плоды томата и их обработка. Плоды томата (Lycopersicon esculentum Mill.) собирали на пяти стадиях созревания: незрелые, зрелые зеленые, в начале пожелтения, розовые и красные. Плоды зеленой спелости подвергали следующим видам обработки: холод (4°C в течение 48 ч), зáморозки (-2°C в течение 10 ч), нагревание (50°C в течение 10 ч), обработка этиленом и инфильтрация патогена. Обработка этиленом заключалась в погружении плодов в раствор этилена с концентрацией 150 мкл/л на 10 ч при комнатной температуре. Обработку патогеном проводили путем прокалывания эпидермиса зеленых плодов, внесении в каждое отверстие 10 мкл суспензии Rhizopus nigricans Ehrenb. с концентрацией бактерий 2 × 105 КОЕ/мл и последующей инкубации в течение 48 ч при комнатной температуре. После обработки соответствующие ткани плодов немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C до проведения анализа.
Выделение и очистка миРНК. Из тканей плодов пяти стадий созревания и при пяти видах обработки выделяли суммарную РНК с помощью реагента Trizol, содержавшего 0.8 М гуанидин тиоцианат, 0.4 М аммоний тиоцианат, 0.1 М натрий ацетат (pH 5.0), 5% глицерин и 38% водный раствор фенола. Фракции РНК с высоким молекулярным весом осаждали 40% раствором изопропанола, и затем низкомолекулярные фракции РНК - 50% раствором изопропанола. Выделение миРНК проводили в 15% денатурирующем ПААГ-электрофорезе. При этом жидкий гелевый раствор тщательно перемешивали и немедленно заливали в форму, после чего выдерживали при 37°C не менее 2 ч. Исследуемые образцы, содержавшие 5-10 мг суммарной РНК, растворяли в 50 мкл без-РНКазной воды. Электрофорез проводили при 4°C под напряжением 350 В в течение 5 ч, затем при 200 В в течение 2 ч. Гель окрашивали путем погружения в 100 мл 0.5( буфера TBE, содержавшего 0.25 мкг/мл бромистого этидия, на 10 мин. Из геля вырезали полосу, содержавшую короткие фракции РНК длиной от 18 до 28 нуклеотидов (их положение определяли с помощью маркера олигоДНК с шагом 10 нуклеотидов). И, наконец, элюцию миРНК из геля проводили погружением в раствор 0.3 М NaCl при температуре 4°C на ночь.
Подтверждение экспрессии предсказанных миРНК с помощью контрольного ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). 3′-конец миРНК сшивали с 3′-адаптором (5′-rUrUrUCTATCCATGGACTGidT-3′, где A, C, G, T - основания ДНК; rA, rU - основания РНК;  - 5′-фосфат; idT - 3′-инвертированный дезокситимидин) при 37°C в течение 90 мин в 10 мкл реакционной смеси, состоявшей из 6 мкл раствора миРНК, приготовленного, как описано выше, 1 мкл 100 мкМ раствора 3′-адаптора, 1 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), 1 мкл 10( РНК-лигазного буфера T4, 0.5 мкл ингибитора РНКаз ("Takara", Япония) и 0.5 мкл РНК-лигазы T4 RNA ("New England Biolabs", США).
кДНК синтезировали с использованием специфичного праймера для обратной транскрипции и миРНК, связанной с 3′-адаптором, в качестве матрицы при 42°C в течение 60 мин. Реакционная смесь объемом 10 мкл содержала 5 мкл раствора миРНК, связанной с 3′-адаптором, 1 мкл 10 мкМ раствора 3′-праймера (5′-TACAGTCCATGGATAGAAA-3′), 1 мкл 10 мМ раствора смеси дНТФ, 2 мкл 5( буфера для синтеза первой цепи и 1 мкл обратной транскриптазы M-MLV ("Promega", США).
ПЦР проводили, используя в качестве матрицы кДНК, синтезированную, как описано выше. Реакционная смесь общим объемом 50 мкл содержала 5 мкл 10( буфера для ПЦР, 1 мкл 10 мМ раствора смеси дНТФ, 1 мкл 10 мкМ раствора обратного праймера, 1 мкл 10 мкМ раствора прямого праймера (соответствующих последовательности миРНК), 1 мкл кДНК, 1 мкл (2 ед.) ДНК-полимеразы Taq ("Takara"), 40 мкл дважды дистиллированной воды. ПЦР проводили по следующей схеме: денатурация при 94°C в течение 30 с, температура отжига постепенно уменьшалась на 1°C с 68( до 60°C каждые 2 цикла, а затем с 59° до 46°C на 1°C каждый цикл; затем 10 циклов при 45°C; длительность отжига при этом всегда составляла 30 с; окончательное удлинение при 72°C в течение 10 мин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Поиск миРНК томата

Хотя и обнаружено некоторое количество неконсервативных миРНК, большинство зрелых миРНК в ходе эволюции остались довольно консервативными у различных видов царства растений. Данный факт позволяет успешно искать новые миРНК на основании уже известных миРНК других видов растений [30].
Из базы данных DDBJ получили 357 365 последовательностей EST растений томата. С помощью анализа BLAST провели поиск потенциальных миРНК, установив значение e, равное 10. После первого этапа сравнения известных миРНК растений с полученной базой EST томата, и второго этапа анализа, на котором удалили повторяющиеся и кодирующие белки последовательности, получили 8 потенциальных миРНК (табл. 1): LemiR157a/b, LemiR159, LemiR167, LemiR168, LemiR172a/i и LemiR399. Для проверки, являются ли они миРНК, рассчитали содержание в них остатков A + U. Кроме последовательности miR168, в которой A + U составляло 33.3%, во всех остальных зрелых миРНК содержание A + U составило от 47.6 до 61.9%, что соответствует требованиям, согласно которым в предшественниках миРНК, а также в зрелых миРНК, содержание A + U должно быть выше, чем содержание G + C [27] (рис. 3). Чтобы проверить, не являются ли на самом деле потенциальные миРНК другими видами молекул РНК, ввели строгие критерии отбора. Одним из важнейших критериев является минимальная отрицательная свободная энергия свертывания (MFE, от minimal folding free energy). Как правило, миРНК имеют более высокое значение MFE, чем другие виды кодирующих и некодирующих молекул РНК. Однако такое наблюдается не всегда, и поэтому мы ввели коэффициент MFEI - коэффициент минимальной свободной энергии укладки пре-миРНК, который, как нам кажется, является более достоверным критерием отбора. Дело в том, что известное большинство предшественников миРНК действительно имеет значение MFEI выше, чем 0.85, которое и считается общепринятым значением для отличия миРНК от других видов молекул РНК. Так, например, тРНК имеют значение MFEI 0.64, рРНК - 0.59, а у мРНК оно варьирует в пределах от 0.62 до 0.66. Что касается определенных нами восьми последовательностей как потенциальных миРНК томата, то значение MFEI их предшественников было достаточно высоким - от 1.39 до 4.28, в среднем 2.46 (табл. 1), что достоверно выше, чем 0.85 [27, 28, 31].
Две группы исследователей для поиска миРНК томата использовали метод прямого клонирования. Так, Rachel с соавт. [23] из 4018 малых РНК плодов томата зеленой спелости выделили 12 миРНК, а Biao Ding с соавт. [32] сообщали о 1210 малых РНК цветочных почек, молодых и зрелых плодов, а также листьев, среди которых есть и миРНК, причем большинство определенных ими малых РНК являются неконсервативными и обладают высокой тканевой специфичностью. Что касается биоинформационного метода, то путем анализа последовательностей EST Zhang с соавт. [24] обнаружили в общей сложности 481 миРНК, принадлежащие 71 виду растений, в том числе 9 миРНК томата.

Разнообразие и множественность миРНК растений томата

Восемь полученных миРНК томата входят в шесть семейств: в miRNA157 и miRNA172 - по два члена, а в остальные - по одному. Предшественники миРНК имеют различную структуру и размер. Их длина варьирует от 45 до 178 нуклеотидов. Вторичная структура оказалась очень разной. Различные структура и размеры миРНК разных семейств позволяют предположить, что различные миРНК имеют разные функции при регулировании экспрессии генов. Полученные нами миРНК характеризовались также различным расположением в последовательностях своих предшественниках. Так, например, miRNA159, miRNA172a и miRNA399 расположены на 3′-концах своих предшественников, в то время как остальные расположены на 5′-концах (рис. 3). EST предшественников определенных нами миРНК, как указано в аннотациях, получены из разных тканей. Так, например, метка EST BM536323 предшественника miR157b, а также метка EST BE461111 предшественника miR168 были клонированы из ткани плодов. EST предшественников miR157a, miR167, miR172a и miR399 клонированы из листьев. EST предшественников miR159 и miR172i клонированы из корней и цветков соответственно (http://getentry.ddbj.nig.ac.jp). Получение меток из различных тканей указывает на то, что зрелые миРНК имеют, вероятно, тканеспецифичный характер экспрессии и различные функции в регуляции процессов роста и развития растений.

Экспериментальное подтверждение результатов предсказания полученных миРНК

Методом анализа EST мы предсказали восемь миРНК томата, метки предшественников двух из которых - miR157b и miR168, согласно аннотациям, клонированы из плодов, а метки предшественников остальных - из других тканей. Для подтверждения результатов предсказания и тканевой специфичности провели анализ методом контрольного ОТ-ПЦР по специально разработанной схеме.
Выделяли суммарную РНК из тканей плодов пяти различных стадий спелости и при пяти различных видах обработки. Процесс выделения миРНК описан в разделе "МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ". Так как миРНК участвуют в регуляции процессов роста и развития плодов, а также реагируют на внешние стрессовые факторы [24], для повышения чувствительности анализа смешивали вместе образцы миРНК, полученные из тканей различных стадий спелости и после различных видов обработки.
В качестве матриц для амплификации служили кДНК, синтезированные с помощью обратной транскриптазы из полученных миРНК, связанных с 3′-адапторами. Так как к 3′-концам миРНК были пришиты 3′-адапторы, то обратные праймеры имели последовательность, комплементарную последовательности адаптора, в то время как последовательность прямого праймера была строго комплементарна последовательности миРНК. Поэтому продукты амплификации должны иметь длину около 40 п.н., что подтверждало бы гипотезу о существовании миРНК с данной последовательностью.
Метод ОТ-ПЦР использовал Zhi-min Yang [31] для проверки существования предсказанных миРНК растения Brassica napus, и он зарекомендовал себя как достаточно надежный метод экспериментального подтверждения предсказанных миРНК. В данной работе мы несколько улучшили этот метод для повышения его чувствительности и специфичности.
Все предсказанные миРНК действительно обнаруживались в тканях плодов различных стадий спелости и при различных условиях обработки по результатам обратной транскрипции и амплификации (рис. 4). Анализ показал также, что miR172a редко обнаруживается в плодах на всех стадиях спелости и при всех условиях обработки, поэтому можно предположить, что miR172a играет меньшую роль в процессах развития плода и реакции на стрессовые условия, чем остальные миРНК. Из восьми миРНК, предсказанных в ходе данной работы, только в отношении EST предшественников miR157b и miR168 сообщалось, что они клонированы из тканей плодов (http://getentry.ddbj.nig.ac.jp). Существование шести остальных миРНК, а именно, miR157a, miR159, miR167, miR172a, miR172i и miR399), EST предшественников которых клонированы из других тканей (http://getentry.ddbj.nig.ac.jp), подтверждает наш анализ ОТ-ПЦР. Такое явление может означать, что EST предшественников данных миРНК также могут экспрессироваться в нормальных или обработанных плодах, но из тканей плодов они до настоящего времени не были клонированы исследователями, или же данные миРНК имеют другие предшественники, экспрессируемые в тканях плодов, в дополнение к предшественникам, EST которых использовались нами для предсказания.

Предсказание мишеней миРНК и комплементарных сайтов мРНК

Недавно Biao Ding с соавт. создали интернет-сайт (http://ted.bti.cornell.edu/digital/sRNA), содержащий базу данных РНК томата (Tomato Expression Database), а также программу для анализа последовательностей малых РНК. Данный ресурс позволяет определить мишени вновь установленных нами миРНК томата методами биоинформационного анализа. Допускали не более трех расхождений между известными миРНК и восемью новыми, установленными нами [17]. Разрывы и неканонические пары, кроме G : U, также считали несовпадениями, и такие миРНК отбрасывали [17] (например, miR172i в табл. 2). После отсечения последовательностей, не удовлетворяющих данным критериям, а также повторяющихся последовательностей, получили 42 мишени, которые распределили в четыре группы по функциям (табл. 3). Первая и сама большая группа содержит мишени, предсказанные как кодирующие факторы транскрипции. Вторую группу составляют мишени, кодирующие ряд ферментов, предположительно играющих важную роль в метаболизме растений. В третью группу входит мРНК протеинкиназы, макромолекул, участвующих в передаче сигналов. И, наконец, о некоторых мишенях информации нет, т.е. их функции на данный момент неизвестны. Мы объединили такие мРНК в четвертую группу.
Сообщалось, что основную часть предсказанных мишеней миРНК составляют факторы транскрипции, предположительно играющие важную роль в дифференциации клеток, развитии тканей и росте растений [1, 2]. Как правило, миРНК растений полностью или почти полностью комплементарны своим мишеням - мРНК; поэтому поиск мишеней у растений осуществлять гораздо легче, чем у животных [17]. В большинстве случаев миРНК комплементарны более чем одной мишени [17]. Иногда мишени даже могут быть сгруппированы в несколько семейств генов. Так, например, мишени miR172a разделяются на три группы: фактор транскрипции, протеинкиназа и белок с неизвестными функциями. Одно и то же семейство миРНК может иметь те же или похожие мишени, что и другое семейство [17]. Данные результаты указывают на то, что миРНК участвуют в экспрессии и регуляции множественных функциональных генов растений.
По результатам нашего анализа, мишенью miRNA157a/b являются SBP-подобные белки (от Squamosa-promoter Binding Proteins), которые, как сообщалось, регулируют экспрессию гена Squamosa - гена-маркера флоральной меристемы Antirrhinum. Экспрессия данного гена, вероятно, регулируется и miRNA157a/b в растениях томата [33].
Предсказанными мишенями miRNA172a/i является ген-гомолог белка HD-ZIP III. В геноме Arabidopsis имеется пять генов HD-ZIP III: REVOLUTA (REV), PHABULOSA (PHB), PHAVOLUTA (PHV), ATHB8 и ATHB15 [34]. Также, по результатам предсказания, мишенью miR172a/i является ген фактора, связывающегося с элементом чувствительности к этилену (ERF, от ethylene response element-binding factor). Подтверждено, что ERF являются основными регуляторами пути передачи сигнала этилена, и в целом рассматриваются как важные элементы системы сигналов защитной реакции растений [35]. Сообщалось, что ряд членов семейства ERF специфично связывается с GCC-блоком (AGCCGCC) этилен-регулируемых генов через консервативный участок ERF, инициирующий транскрипцию передаваемых сигналов при реакции на этилен [36].
Мишенью miR168, как предсказывается, является белок Argonaute (AGO1). Семейство белков Argonaute - основной компонент комплекса подавления транскрипции, индуцируемого РНК (RISC, от RNA-induced silencing complex). Известно, что из 10 белков Argonaute арабидопсиса только белок AGO1 необходим для функционирования миРНК в этом растении. Так, из-за того, что белок AGO1 арабидопсиса связывается с миРНК и катализирует расщепление мРНК-мишени, данное расщепление подавлено в мутантах с дефектами гена ago1, и количество мишеней миРНК в таких мутантах in vivo повышено [37]. Этот факт позволяет предположить, что miR168 участвует также в регуляции работы других миРНК томата.
В качестве одной из мишеней miR159 предсказан ген 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатсинтазы 8 томата (LeACS8), кодирующий основной элемент биосинтеза этилена. Он является цитозольным ферментом, катализирующим стадию, лимитирующую скорость биосинтеза этилена в высших растениях [38]. EST предшественником miR159 является CN385843, которая, согласно аннотации, экспрессируется в тканях корней томата, т.е. miR159, вероятно, регулирует рост и развитие корней путем управления экспрессией гена LeACS8 в растениях томата.
Данное исследование финансировалось Фондом естественных наук Китая (проекты 30430490 и 30600421) в рамках Национальной программы развития ключевых технологий 11-го 5-летнего плана (проект 2006BAD22B01).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.Jones-Rhoades M.W., Bartel D.P., Bartel B. MicroRNAs and Their Regulatory R[A1]oles in Plants // Annu. Rev. Plant Biol. 2006. V. 57. P. 19-53.
2.Verdel A., Jia S., Gerber S., Sugiyama T., Gygi S., Greval S.I.S., Moazed D. RNAi-Mediated Targeting of Heterochromatin by the RITS Complex // Science. 2004. V. 303. P. 672-676.
3.Boutet S., Vazquez F.J., Beclin C., Fagard M., Gratias A., Morel J., Crete P., Chen X., Vaucheret H. Arabidopsis HEN1: A Genetic Link between Endogenous miRNA Controlling Development and siRNA Controlling Transgene Silencing and Virus Resistance // Curr. Biol. 2003. V. 13. P. 843-848.
4.Jones-Rhoades M.W., Bartel D.P. Computational Identification of Plant MicroRNAs and Their Targets, Including a Stress-Induced miRNA // Mol. Cell. 2004. V. 14. P. 787-799.
5.Rhoades M.W., Reinhart B.J., Lim L.P., Burge C.B., Bartel B., Bartel D.P. Prediction of Plant microRNA Targets // Cell. 2002. V. 110. P. 513-520.
6.Wang X.J., Reyes J.L., Chua N.H., Gaasterland T. Prediction and Identification of Arabidopsis thaliana microRNAs and Their mRNA Targets // Genome Biol. 2004. V. 5. P. R65.
7.Dugas D.V., Bartel B. MicroRNA Regulation of Gene Expression in Plants // Curr. Biol. 2004. V. 7. P. 512-520.
8.Bollman K.M., Aukerman M.J., Park M.Y., Hunter C., Berardini T.Z., Poethig R.S. HASTY, the Arabidopsis Ortholog of Exportin 5/MSN5, Regulates Phase Change and Morphogenesis // Development. 2003. V. 130. P. 1493-1504.
9.Li J., Yang Z., Yu B., Liu J., Chen X. Methylation Protects miRNAs and siRNAs from a 3′-end Uridylation Activity in Arabidopsis // Curr. Biol. 2005. V. 15. P. 1501-1507.
10.Park W., Li J., Song R., Messing J., Chen X. CARPEL FACTORY, a Dicer Homolog, and HEN1, a Novel Protein, Act in microRNA Metabolism in Arabidopsis thaliana // Curr. Biol. 2002. V. 12. P. 1484-1495.
11.Xie Z., Kasschau K.D., Carrington J.C. Negative Feedback Regulation of Dicer-Like1 in Arabidopsis by microRNA-Guided mRNA Degradation // Curr. Biol. 2003. V. 13. P. 784-789.
12.Hammond S.M., Bernstein E., Beach D., Hannon G.J. An RNA-Directed Nuclease Mediates Post-Transcriptional Gene Silencing in Drosophila Cells // Nature. 2000. V. 404. P. 293-296.
13.Llave C., Xie Z., Kasschau K.D., Carrington J.C. Cleavage of Scarecrow-like mRNA Targets Directed by a Class of Arabidopsis miRNA // Science. 2002. V. 297. P. 2053-2056.
14.Tang G., Reinhart B.J., Bartel D.P., Zamore P.D. A Biochemical Framework for RNA Silencing in Plants // Genes Dev. 2003. V. 17. P. 49-63.
15.Xie X., Lu J., Kulbokas E.J., Golub T.R., Mootha V., Lindblad-Toh K., Lander E.S., Kellis M. Systematic Discovery of Regulatory Motifs in Human Promoters and 3′ UTRs by Comparison of Several Mammals // Nature. 2005. V. 434. P. 338-345.
16.Brennecke J., Stark A., Russell R.B., Cohen S.M. Principles of microRNA-Target Recognition // PLoS. Biol. 2005. V. 3. P. e85.
17.Krek A., Grun D., Poy M.N., Wolf R., Rosenberg L., Epstein E.J., MacMenamin P., da Piedade I., Gunsalus K.C., Stoffel M., Rajewsky N. Combinatorial microRNA Target Predictions // Nat. Genet. 2005. V. 37. P. 495-500.
18.Lewis B.P., Shih I.H., Jones-Rhoades M.W., Bartel D.P., Burge C.B. Prediction of Mammalian microRNA Targets // Cell. 2003. V. 115. P. 787-798.
19.Bonnet E., Wuyts J., Rouze P., van de Peer Y. Detection of 91 Potential in Plant Conserved Plant microRNAs in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa Identifies Important Target Genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 115-116.
20.Ramanjulu S., Thomas G., Pradeep K.J., Zhu J.K. Cloning and Characterization of microRNAs from Rice // Plant Cell. 2005. V. 17. P. 1397-1411.
21.Berezikov E., Cuppen E., Plasterk R.H. Approaches to microRNA Discovery // Nat. Genet. 2006. V. 38. P. S2-S7.
22.Lu C., Tej S.S., Luo S., Haudenschild C.D., Meyers B.C., Green P.J. Elucidation of the Small RNA Component of the Transcriptome // Science. 2005. V. 309. P. 1567-1569.
23.Pilcher R.L., Moxon S., Pakseresht N., Moulton V., Manning K., Seymour G., Dalmay T. Identification of Novel Small RNAs in Tomato (Solanum lycopersicum) // Planta. 2007. V. 226. P. 709-717.
24.Zhang B.H., Pan X.P., Wang Q.L., Cobb G.P., Anderson T.A. Identification and Characterization of New Plant microRNAs Using EST Analysis // Cell Res. 2005. V. 15. P. 336-360.
25.Adams M.D., Kelley J.M., Gocayne J.D., Dubnick M., Polymeropoulos M.H., Xiao H., Merril C.R., Wu A., Olde B., Moreno R.F., Kerlavage A.R., McCombie W.R., Venter J.C. Complementary DNA Sequencing: Expressed Sequence Tags and Human Genome Project // Science. 1991. V. 252. P. 1651-1656.
26.Matukumalli L.K., Grefenstette J.J., Sonstegard T.S., van Tassell C.P. EST-PAGE - managing and analyzing EST data // Bioinformatics. 2004. V. 20. P. 286-288.
27.Zhang B.H., Pan X.P., Cox B., Coob G.P., Anderson T.A. Evidence That miRNAs Are Different from Other RNAs // Cell Mol. Life Sci. 2006. V. 63. P. 246-254.
28.Ambros V., Bartel B., Bartel D.P., Burge C.B., Carrington J.C., Chen X., Dreyfuss G., Eddy S.R., Griffiths-Jones S., Marshall M., Matzke M., Ruvkun G., Tuschl T. A Uniform System for microRNA Annotation // RNA. 2003. V. 9. P. 277-279.
29.Wang X.J., Reyes J.L., Chua N.H., Gaasterland T. Prediction and Identification of Arabidopsis thaliana microRNAs and Their mRNA Targets // Genome Biol. 2004. V. 5. P. R65.
30.Zhang B.H., Pan X., Cannon C.H., Cobb G.P., Anderson T.A. Conservation and Divergence of Plant microRNA Genes // Plant J. 2006. V. 46. P. 243-259.
31.Xie F.L., Huang S.Q., Guo K., Xiang A.L., Zhu Y.Y., Nie L., Yang Z.M. Computational Identification of Novel microRNAs and Targets in Brassica napus // FEBS Lett. 2007. V. 581. P. 1464-1474.
32.Klein J., Saedler H., Huijser P. A New Family of DNA Binding Proteins Includes Putative Transcriptional Regulators of the Antirrhinum majus Floral Meristem Identity Gene SQUAMOSA // Mol. Gen. Genet. 1996. V. 250. P. 7-16.
33.Vaucheret H., Vazquez F., Crete P., Bartel D.P. The Action of ARGONAUTE1 in the miRNA Pathway and Its Regulation by the miRNA Pathway Are Crucial for Plant Development // Genes Dev. 2004. V. 18. P. 1187-1197.
34.Emery J.F., Floyd S.K., Alvarez J., Eshed Y., Hawker N.P., Izhaki A. Radial Patterning of Arabidopsis Shoots by Class III HD-ZIP and KANADI Genes // Curr. Biol. 2003. V. 13. P. 1768-1774.
35.Thara V.K., Tang X., Gu Y.Q., Martin G.B., Zhou J.M. Pseudomonas syringae pv. tomato Induces the Expression of Tomato EREBP-Like Genes Pti4 and Pti5 Independent of Ethylene, Salicylate and Jasmonate // Plant J. 1999. V. 20. P. 475-483.
36.Solano R., Stepanova A., Chao Q.M., Ecker J.R. Nuclear Events in Ethylene Signaling: A Transcriptional Cascade Mediated by ETHYLENE-INSENSITIVE 3 and ETHYLENE-RESPONSE FACTOR 1 // Genes Dev. 1998. V. 12. P. 3703-3714.



ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

Рис. 1. Схема поиска миРНК томата на основе известных миРНК растений и последовательностей EST томата.

Рис. 2. Схема поиска мишеней вновь обнаруженных миРНК томата.

Рис. 3. Последовательности и предсказанная вторичная структура вновь обнаруженных миРНК томата и их предшественников.
Последовательности показаны от 5' до 3'; последовательности зрелых миРНК помечены линией. Реальный размер предшественников может быть несколько короче, чем показано (miR159).

Рис. 4. Подтверждение экспрессии вновь обнаруженных миРНК томата в тканях плодов методом ПЦР с обратной транскрипцией.
NC - отрицательный контроль; DL - маркер ДНК с шагом 10 п.н. ("Takara"). Маркировка отрицательного контроля соответствует образцам миРНК при ПЦР-анализе, за исключением синтезированной матрицы кДНК.