УДК 581.1

ИНАКТИВАЦИЯ ГЕНА sll0136 У Synechocystis sp. PCC 6803 ПРИВОДИТ К НАРУШЕНИЮ БИОГЕНЕЗА БЕЛКОВ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ КОМПЛЕКСОВ

© 2013 г. Е. С. Пожидаева*, **, C. Малтерер*, А. С. Баик**, А. В. Соколенко*

* Департамент биологии I, Университет Людвига-Максимилиана, Мюнхен, Германия

** Федеральное государственное бюджетное учреждение науки 

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва

Поступила в редакцию 29.10.2012 г.

В геноме цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 содержится ген sll0136 (pepP), предположительно кодирующий гомолог пролиновой аминопептидазы PII (АМРРII) гетеротрофной бактерии Escherichia coli. Известно, что аминопептидаза АМРРII удаляет N-концевую аминокислоту у пептидов или белков в том случае, если в следующем положении находится пролин. Мутант Synechocystis sp. PCC 6803 с инсерционной инактивацией гена pepP характеризуется пониженным содержанием фикобилипротеинов, а также белков ФС II, что может быть связано с пониженным уровнем синтеза/деградации соответствующих белков. Обсуждается возможное участие РерР в биогенезе белков фотосинтетического аппарата.

 

Ключевые слова: Synechocystis sp. PCC 6803  аминопептидаза  синтез белка

 

----------------------------

Сокращения: АМРР – аминопептидаза Р; АФЦ – аллофикоцианин; СО – стандартное освещение; РерР – пролиновая аминопептидаза Р; С-ФЦ – фикоцианин; Synechocystis – Synechocystis sp. PCC 6803. 

Адрес для корреспонденции: Пожидаева Елена Станиславовна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Факс: +7 (499) 977-80-18; электронная почта: alenapoj@mail.ru

 

 ВВЕДЕНИЕ

Многие белки подвергаются протеолизу за счет действия пролиновых пептидаз [13]. Эта группа ферментов осуществляет избирательный протеолиз белков [4], гидролизуя пептидные связи, образованные пролином. Их активность определяется изомерным (цис/транс) состоянием молекулы и положением в ней пролина [5]. Известны пролиновые металлопептидазы (аминопептидаза Р, карбоксипептидаза Р, пролидаза), активность которых зависит от ионов двухвалентных металлов, а также пролиновые пептидазы серинового типа (пролилолигопептидазы, дипептидилпептидазы II и IV и пролилкарбоксипептидаза), каталитический центр которых включает триаду Ser-Asp-His [3, 6, 7].

К настоящему времени хорошо охарактеризована пролиновая аминопептидаза РII гетеротрофной бактерии Escherichia coli (EC 3.4.11.9; AMPPII; proline aminopeptidase PII E. coli) [8]. В базе данных MEROPS AMPPII отнесена к подсемейству пептидаз М24B [9], которые отщепляют аминокислотный остаток от N-конца пептидов и белков только в том случае, если в следующем после него положении находится пролин [10]. Наибольшую активность in vitro AMPPII E. coli проявляла в присутствии ионов Mn2+ [8]. Этот фермент обладает значительным структурным сходством с другими аминопептидазами [10], например, с метиониновыми аминопептидазами, удаляющими N-концевой метионин в процессе трансляции белков [11], а также с Xaa-Pro дипептидазами и пролидазами. Инактивация генов метиониновых аминопептидаз летальна для большинства организмов, что свидетельствует об их жизненно важной функции в клетках.

Протеолиз N-концевых аминокислотных остатков полипептидов характерен для всех живых организмов и хорошо изучен у гетеротрофных прокариот и эукариот, но не у фотосинтетических организмов. Согласно базе данных CyanoBase (http://genome.kazusa.or.jp/cyanobase/Synechocystis), геном одноклеточной цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 (Synechocystis) кодирует 25 аминопептидаз разного типа [12, 13]. Функция пролиновых аминопептидаз у Synechocystis до сих пор не изучена. Ранее с помощью сайт-направленного мутагенеза нами был инактивирован ген sll0136, кодирующий, предположительно, пролиновую аминопептидазу РерР Synechocystis. Мутант ∆рерР был способен к фотоавтотрофному росту, однако рос медленнее, чем штамм дикого типа [13]. Для выяснения роли белка РерР у Synechocystis в данной работе был проведен физиолого-биохимический анализ мутанта ∆рерР, а также исследована кинетика накопления белков основных фотосинтетических комплексов при стандартных условиях роста цианобактерий в сравнении со штаммом дикого типа.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы и условия культивирования. В работе использовали штамм дикого типа Synechocystis из коллекции кафедры генетики МГУ им. М.В. Ломоносова. Инсерционный мутант ∆рерР Synechocystis был получен ранее сайт-направленным мутагенезом [13]. Штаммы выращивали в климатической камере фотоавтотрофно на среде BG11 [14] при температуре 30°С и при постоянной освещенности люминесцентными лампами белого света 50 мкмоль фотонов/(м2 с). Рост мутанта ∆pepP поддерживали на среде BG11, содержавшей канамицин в концентрации 50 мкг/мл. Для экспериментов клеточную культуру штаммов дикого типа и ∆рерР в логарифмической фазе роста предварительно разводили до концентрации хлорофилла 3 мкг/мл и подращивали в течение следующих 48 ч при стандартных условиях роста.

Спектроскопический анализ и анализ пигментов. Спектры поглощения целых клеток в среде BG11 измеряли через 48 ч роста при температуре 30°С и освещении 50 мкмоль фотонов/(м2 с) на спектрофотометре UV2401 UV/VISIBLE (“Shimadzu Biotech.”, Япония). Хлорофилл и каротиноиды экстрагировали из клеток 90% метанолом и определяли их концентрацию по формуле, выведенной Lichtenthaler [15]. Концентрацию фикоцианина в клеточной суспензии определяли по описанному ранее методу [16].

Анализ белков фотосинтетических комплексов. Для анализа содержания белков фотосинтетических комплексов клетки дикого типа и мутанта ∆рерР через 48 ч роста осаждали центрифугированием при 16 000 g и использовали для выделения суммарного белка, как описано в работе [17]. Концентрацию суммарного белка в исследуемых образцах определяли с помощью набора Bio-Rad protein assay (“Bio-Rad Laboratories GmbH”, Германия). Разделение белков проводили в денатурирующем полиакриламидном геле (SDS-PAGE) по методу Laemmli [18]. Для анализа белков в лунку 12.5% SDS-PAGE вносили по 50 мкг суммарного белка исследуемого образца. Иммуноферментный анализ белков, иммобилизованных на мембране проводили по стандартной методике с использованием буфера, содержавшего 7.5 мМ NaCl, 0.3 мМ KCl, 0.45 мМ Na2HPO4, 0.5 мМ KH2PO4, pH 7.5, 0.1% Tween и 5% обезжиренное сухое молоко. При анализе использовали антитела против белков PsaA, PsaD и PsaF (комплекс ФС I), CP47 и D2 (комплекс ФС II), β-субъединицы АТФ-синтазного комплекса, а также α∕-субъединиц фикоцианина фикобилисом (С-ФЦ) [19].

Анализ кинетики накопления полипептидов. Для мечения белков in vivo использовали радиоактивно меченный [35S]-метионин (400 Бк/мл). В суспензию клеток Synechocystis (концентрация хлорофилла при А750 = 0.5 составляла 5 мкг/мл) вносили [35S]-метионин до конечной концентрации 0.04 Бк/мл. Клетки инкубировали при 30°С и постоянном освещении 50 мкмоль фотонов/(м2 с) в течение 8 ч. Реакцию останавливали добавлением в клеточную суспензию хлорамфеникола до конечной концентрации 150 мкг/мл. Для анализа кинетики накопления полипептидов 1 мл клеток каждого образца осаждали центрифугированием при 16 000 g, осадок ресупендировали в буфере, содержавшем 0.0625 М Трис-HCl, 2% SDS, 10% глицерин, 5% -меркаптоэтанол, 0.004% бромфеноловый синий, pH 6.8, клетки денатурировали при 100С в течение 5 мин, затем коротко центрифугировали, и равный объем образцов наносили на гель. Белки разделяли с помощью 12.5% SDS-PAGE [18]. После разделения гель высушивали, и радиоактивный сигнал регистрировали, используя систему анализа изображений Phosphoimaging (“Fuji GmbH”, Германия). Денситометрию пластин проводили с помощью анализатора FLA-3000 Phosphoimage Reader (“Fuji GmbH”). 

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

В геноме Synechocystis содержится ген sll0136 (номер гена в базе данных NCBI NP_441891), обозначенный как рерР, который кодирует белок с мол. м. 48.5 кД. С целью выявления сходных белков был проведен анализ баз данных по белкам NCBI с аминокислотной последовательностью PepP. Результаты показали гомологию РерР с белками семейства М24: аминопептидазами Р, Хаа-Pro дипептидазами и метиониновыми пептидазами. Среди гетеротрофных бактерий наибольшее сходство было найдено с пролиновой аминопептидазой PII E. coli (AMPPII; NP_417384) и аминопептидазой Р Haemophilus influenzae (AMP; NP_438976), степень гомологии составляет 43 и 42% соответственно. Кроме того, РерР показал высокое сходство с Хаа-Pro дипептидазой PepD Homo sapiens (NP_000276) и с метиониновой пептидазой E. coli (NP_285862.1)  28 и 23% соответственно. С помощью программы Pfam у белка PepP были выявлены две консервативные области: N- и С-концевые домены (рис. 1). N-концевой домен состоит из 133 аминокислотных остатков (начинается в позиции аминокислоты V5 и заканчивается N138) и характерен для Xaa-Pro аминопептидаз [8]. С-концевой домен более протяженный и включает 254 а. о. (A182-I436). Эта область содержит аминокислотный мотив, типичный для металлопептидаз [20]. Вероятно, как и в случае белка AMPPII E. coli [8], аминокислоты в позиции D260, D271, H354, E385 и E415 могут участвовать в образовании каталитического центра РерР Synechocystis (рис. 1). 

Клетки мутанта ΔрерР способны к фотоавтотрофному росту [13], однако в условиях стандартного освещения (СО; 50 мкмоль фотонов/(м2 с)) клетки мутанта ∆рерР имели желтоватый оттенок (данные не представлены), что согласуется с количественными различиями в спектрах поглощения целых клеток, снятых через 48 ч роста (рис. 2). Пики поглощения хлорофилла при 440 нм и 678 нм, каротиноидов  при 450 нм и фикобилисом – при 625 нм у мутанта снижены по сравнению с диким типом (рис. 2). В таблице представлены результаты сравнительного анализа скорости роста и содержания пигментов в клетках Synechocystis дикого типа и мутантного штамма ∆рерР через 48 ч роста при СО. Клетки ∆рерР характеризуются более низким уровнем содержания пигментов. У мутанта содержание хлорофилла снижено на 20%, каротиноидов  на 17%, а фикобилипротеинов – на 63% по сравнению с клетками дикого типа (таблица). 

Разница в количестве пигментов, в первую очередь, свидетельствует об изменениях в пигмент-содержащих комплексах: ФС I, ФС II и фикобилисомах. Для оценки состояния пигмент-содержащих комплексов в клетках дикого типа и штамма ∆рерР исследовали содержание белков PsaA, PsaD и PsaF комплекса ФС I, белков D2 и CP47 комплекса ФС II и белка С-фикоцианина фикобилисом. На рис. 3 представлены результаты иммунологического определения содержания белков фотосинтетических комплексов в клетках дикого типа и мутанта через 48 ч роста. В клетках мутанта ∆рерР значительно снижено содержание белков D2 и СР47 комплекса ФС II, а также снижено содержание белка С-фикоцианина фикобилисом по сравнению с культурой дикого типа (ДТ). В то же время, по сравнению с ДТ у мутанта ∆рерР количество белков PsaD и PsaF комплекса ФС I было увеличено. Содержание белка β-субъединицы АТФ-синтазного комплекса у обоих штаммов не имело значительных различий (рис. 3).

Наблюдаемые различия могут быть следствием нарушений в синтезе и (или) стабильности данных белков. Для исследования этого вопроса были проведены эксперименты по кинетике накопления указанных белков в течение 8 ч с использованием [35S]-метионина. Идентификацию полученных на авторадиограмме индивидуальных полос проводили с помощью иммуноферментного анализа с антителами против исследуемых белков. Прижизненное включение [35S]-метионина в de novo синтезируемые клеточные белки показало, что у мутанта ∆рерР снижен синтез или нарушена стабильность С-фикоцианина фикобилисом (рис. 4), а также белка D2 комплекса ФС II. В то же время, содержание [35S]-меченных полипептидов PsaD и PsaF комплекса ФС I в мутантных клетках было несколько выше, чем у ДТ. Не удалось идентифицировать на авторадиограмме полосы, соответствующие меченым полипептидам PsaA (ФС I) и CP47 (ФС II). Как и в случае иммуноферментного анализа, никаких существенных различий в синтезе и стабильности β-субъединицы ATФ-синтазного комплекса у обоих штаммов не выявлено (рис. 4).

 

ОБСУЖДЕНИЕ 

РерР является консервативным белком и представлен в клетках, как прокариот, так и эукариот, о чем свидетельствуют данные сравнительного анализа (BLAST NCBI). Анализ баз данных по белкам показал сходство РерР с белками семейства М24, включая белок АМРРII E. coli, который удаляет N-концевую аминокислоту от пептида или белка, если в следующем после нее положении находится пролин [8]. Известно, что АМРPII E. coli имеет структуру полой сферы, так называемого “pita-bread” типа, для которого характерно наличие консервативного мотива DDEEH [8, 11]. Указанные аминокислоты обеспечивают связывание фермента с ионами двухвалентных металлов, необходимых для активности данной аминопептидазы. Вероятно, что у РерР Synechocystis аминокислотные остатки в позициях D259, D270, H354, E385, указанные для АМРРII E. coli [8] (рис. 1) также могут участвовать в образовании каталитического центра фермента. Данное предположение подтверждается уже опубликованными исследованиями, указывающими на высокую консервативность этих пяти аминокислот не только у пролиновых аминопептидаз, но у пролидаз и метиониновых аминопептидаз [11]. Все изученные к настоящему времени АМРР являются металлопептидазами, чья активность регулируется Mn2+, Co2+ или Zn2+ [8, 11, 20]. Поэтому можно предположить, что белок РерР также является металлопептидазой. В настоящее время изучается протеолитическая активность белка РерР в присутствии различных ионов металлов и роли в этом аминокислотных остатков D260, D271, H354, E385 и E415.

Успешная инактивация гена рерР у Synechocystis [13] свидетельствует о том, что функция соответствующего белка не является жизненно необходимой при стандартных условиях роста (30°С, 50 мкмоль фотонов/(м2 с)) или может быть заменена другой аминопептидазой. Поиск сходных аминокислотных последовательностей Synechocystis в программе BLAST на сервере NCBI с аминокислотной последовательностью РерР выявил гомологию данного белка с метиониновыми аминопептидазами MapA (ген slr0918), MapB (ген slr0786) и MapC (ген sll0555), где процент гомологии составлял 35, 46 и 61% соответственно [13, 21]. Причем наибольшее сходство наблюдается в каталитической С-концевой области белков (рис. 5). Несмотря на то, что большинство бактерий имеют только один ген map, в геномах многих цианобактерий присутствует два, а у Synechocystis даже три гена, кодирующих метиониновые аминопептидазы [12]. Физиологическая роль увеличения числа map-паралогов у цианобактерий остается неясной. Сопоставление каталитических доменов всех четырех метиониновых аминопептидаз Synechocystis показало наличие идентичного аминокислотного мотива (2  D, 2  E и H) в составе β-слоев (рис. 5), образующих каталитический центр фермента. Возможно, что при определенных условиях функциональная активность белка РерР Synechocystis может быть частично заменена активностью белков метиониновых аминопептидаз.

Тем не менее, в ходе нашего исследования установлено, что мутация в гене рерР повлияла на жизнедеятельность клеток Synechocystis, на это указывают данные кривых роста [13], содержания пигментов, спектров поглощения, а также динамики синтеза и количества белков фотосинтетических комплексов. Замедленный рост мутанта по сравнению с ДТ, возможно, связан с нарушениями в его фотосинтетическом аппарате, а более желтая окраска клеточной суспензии, в первую очередь, с пониженным содержанием фикобилипротеинов. Прижизненное мечение синтезируемых полипептидов [S35]-метионином выявило нарушения в синтезе или стабильности α∕-субъединиц фикоцианина, основного белка ССК цианобактерий. Нельзя исключить, что это, в свою очередь, может повлиять на сборку функциональных фикобилисом у мутантного штамма ∆рерР. Пониженное количество светоулавливающих антенн у ∆рерР ведет к дефициту энергии внутри клеток, и как следствие, к более медленному росту по сравнению с ДТ [13]. 

Подобный эффект наблюдали у мутанта, дефектного по гену apсE, который кодирует якорный полипептид LСМ95, отвечающий за контакт фикобилисом с пигментбелковыми комплексами хлорофилла [22]. В связи с этим, можно предположить, что изменения в синтезе или стабильности, а также количестве белков комплекса ФС I и ФС II являются следствием нарушения сборки фикобилисом. Однако известно, что сниженное количество фикобилисом вследствие инактивации гена apcE не влияет на отношение ФС II/ФС I [22], а количество фикобилипротеинов не изменяется при инактивации комплекса ФС I, предполагая, что регуляция синтеза этих трех комплексов (ФС I, ФС II и фикобилисом) осуществляется независимо друг от друга [22]. Также известно, что отсутствие фикобилисом у мутанта PAL вследствие делеции в генах, кодирующих С-фикоцианин, аллофикоцианин и якорный полипептид, приводит к компенсаторным перестройкам в пользу комплекса ФС II, что выражается в 5-кратном возрастании содержания белков реакционного центра [23]. В наших же экспериментах у мутанта ∆рерР количество белков комплекса ФС II было существенно снижено, а не наоборот. Причем эти изменения были связаны с изменением скорости накопления этих белков или их стабильности. Таким образом, пониженный синтез фикобилипротеинов не является причиной выявленных у мутанта нарушений в биогенезе белков фотосинтетических мембран. Возможно, наблюдаемый эффект связан с нарушениями в функционировании РерР-зависимых регуляторных белков, которые, в свою очередь, вовлечены в биогенез белков фотосинтетических комплексов, в том числе фикобилипротеинов, однако для подтверждения данного предположения требуются дальнейшие исследования.

Таким образом, проведенная работа показала, что инактивация гена sll0136 в клетках Synechocystis sp. PCC6803, кодирующего гомолог пролиновой аминопептидазы РерР, значительно повлияла на жизнедеятельность цианобактерий, вызывая нарушения в биогенезе белков фотосинтетических комплексов.

Авторы приносят благодарность проф. Р. Херрманну (Университет Людвига-Максимилиана, Германия) и проф. А. Гроссману (Стендфордский Университет, США) за предоставление антител против белков фотосинтетических комплексов, используемых в данной работе.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 09-04-00410-а и № 12-04-00049-а) и Немецкого фонда фундаментальных исследований (DFG SO448/2).

 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Mentlein R. Proline Residues in the Maturation and Degradation of Peptide Hormones and Neuropeptides // FEBS Lett. 1988. V. 234. P. 251–256.

2. Yaron A., Nader F. Proline-dependent Structural and Biological Properties of Peptides and Proteins // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1993. V. 28. P. 31–81.

3. Vanhoof G., Goossens F., De Meester I., Hendriks D., Scharpé S. Proline Motifs in Peptides and their Biological Processing // FASEB J. 1995. V. 9. P. 736–744.

4. Hershko A. Ubiquitin-mediated Protein Degradation // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 15237–15240.

5. Fischer G., Heins J., Barth A. The Conformation Around the Peptide Bond Between the P1- and P2-positions is Important for Catalytic Activity of Some Proline-Specific Proteases // Biochim. Biophys. Acta. 1983. V. 742. P. 452–462.

6. Walter R., Simmons W.H., Yoshimoto T. Proline Specific Endo- and Exopeptidases // Mol. Cell Biochem. 1980. V. 30. P. 111–127.

7. Maes M.B., Scharpé S., De Meester I. Dipeptidyl Peptidase II (DPPII) // Clin. Chim. Acta. 2007. V. 380. P. 31–49.

8. Wilce M.C., Bond C.S., Dixon N.E., Freeman H.C., Guss J.M., Lilley P.E., Wilce J.A. Structure and Mechanism of a Proline-Specific Aminopeptidase from Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 3472–3477.

9. Rawlings N.D., Barrett A.J. MEROPS: The Peptidase Database // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 325–331.

10. Ben-Bassat A., Bauer K., Chang S.Y., Myambo K., Boosman A., Chang S. Processing of the Initiation Methionine from Proteins: Properties of the Escherichia coli Methionine Aminopeptidase and Its Gene Structure // J. Bacteriol. 1987. V. 169. P. 751–757.

11. Bazan J.F., Weaver L.H., Roderick S.L., Huber R., Matthews B.W. Sequence and Structure Comparison Suggest that Methionine Aminopeptidase, Prolidase, Aminopeptidase P, and Creatinase Share a Common Fold // Biochemistry. 1994. V. 91. P. 2473–2477.

12. Kaneko T., Sato S., Kotani H., Tanaka A., Asamizu E., Nakamura Y., Miyajima N., Hirosawa M., Sugiura M., Sasamoto S., Kimura T., Hosouchi T., Matsuno A., Muraki A., Nakazaki N., Naruo K., Okumura S., Shimpo S., Takeuchi C., Wada T., Watanabe A., Yamada M., Yasuda M., Tabata S. Sequence Analysis of the Genome of the Unicellular Cyanobacterium Synechocystis sp. Strain PCC6803. II. Sequence Determination of the Entire Genome and Assignment of Potential Protein-Coding Regions // DNA Res. 1996. V. 3. P. 109–136.

13. Sokolenko A., Pojidaeva E., Zinchenko V., Panichkin V., Glaser V.M., Herrmann R.G., Shestakov S.V. The Gene Complement for Proteolysis in the Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 and Arabidopsis thaliana Chloroplasts // Curr. Genet. 2002. V. 41. P. 291–310.

14. Rippkа R. Isolation and Purification of Cyanobacteria // Meth. Enzymol. V. 167. P. 3–27.

15. Lichtenthaler H.K. Chlorophylls and Carotenoids: Pigments of Photosynthetic Biomembranes // Meth. Enzymol. 1987. V. 148. P. 350–382.

16. Grossman A.R., Schaefer M.R., Chiang G.G., Collier J.L. The phycobilisome, a Light-Harvesting Complex Responsive to Environmental Conditions // Microbiol. Rev. 1993. V. 57. P. 725–749.

17. Shukla V.K., Stanbekova G.E., Shestakov S.V., Pakrasi H.B. The D1 Protein of the Photosystem II Reaction-Centre Complex Accumulates in the Absence of D2: Analysis of a Mutant of the Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 Lacking Cytochrome b559 // Mol. Microbiol. 1992. V. 6. P. 947–956.

18. Laemmli U.K. Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. P. 680–685.

19. Pojidaeva E., Zinchenko V., Shestakov S.V., Sokolenko A. Involvement of the SppA1 Peptidase in Acclimation to Saturating Light Intensities in Synechocystis sp. Strain PCC 6803 // J. Bacteriol. 2004. V. 186. P. 3991–3999.

20. Lowther W.T., Matthews B.W. Metalloaminopeptidases: Common Functional Themes in Disparate Structural Surroundings // Chem. Rev. 2002. V. 102. P. 4581–4608.

21. Atanassova A., Sugita M., Sugiura M., Pajpanova T., Ivanov I. Molecular Cloning, Expression and Characterization of Three Distinctive Genes Encoding Methionine Aminopeptidases in Cyanobacterium Synechocystis sp. Strain PCC 6803 // Arch. Microbiol. 2003. V. 180. P. 185–193.

22. Shen G., Boussiba S., Vermaas W. F.J. Synechocystis sp. PCC 6803 strains lacking photosystem I and phycobilisome function // Plant Cell. 1993. V. 5. P. 1853–1863.

23. Стадничук И. Н., Лукашев Е. П., Еланская И. В., Бойченко В. А., Бухов Н. Г. Увеличение интенсивности фотосинтетического линейного транспорта электронов у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803, лишенной фикобилисом // Физиология растений. 2009. Т. 56, С. 483–489.

 Параметры скорости роста и содержание пигментов в культурах клеток Synechocystis штаммов дикого типа (ДТ) и мутанта ΔpepP

 

Исследуемые параметры ДТ ΔpepP

Время удвоения 

при 50 мкмоль фотонов/(м2 с), ч 10.3 ± 0.8 12.0 ± 0.3

Содержание хлорофилла,

OD750, мкг/мл 2.20 ± 0.60 1.77 ± 0.19

Содержание фикобилипротеинов, OD750, мкг/ мл 0.46 ± 0.01 0.17 ± 0.09

Содержание каротиноидов, 

OD750, мкг/ мл 0.343 ± 0.030 0.285 ± 0.030

 

Примечание. Пигменты экстрагировали из клеток, выросших фотоавтотрофно при интенсивности света 50 мкмоль фотонов/(м2 с).

 ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

 

Рис. 1. Сравнение аминокислотных последовательностей белков РерР Synechocystis (NP_441891.1), пролиновых аминопептидаз E. coli (AMPII; NP_417384), H. influenzae (AMP; NP_438976) и H. sapiens (PepD; NP_000276.2).

Пунктирной линией обозначены области N-концевого и С-концевого доменов. Жирным шрифтом выделены идентичные аминокислоты. В С-концевом домене стрелкой и курсивом показаны аминокислоты D260, D271, H354, E385 и E415, участвующие в образовании каталитического центра фермента у E. coli. Серым цветом обозначены последовательности, участвующие в связывании лигандов у AMPPII E. coli [11]. Аминокислотные последовательности белков получали в банке данных NCBI. Поиск сходных белков проводили с помощью программы BLAST на сервере NCBI. Выравнивание и сравнение аминокислотных последовательностей белков проводили с помощью программы ClustalW. Доменную организацию белков получали из базы данных Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/).

Рис. 2. Спектры поглощения целых клеток Synechocystis дикого типа (1) и мутанта ∆рерР (2) через 48 ч роста при стандартных условиях (30°С, 50 мкмоль фотонов/(м2 с)).

Рис. 3. Результаты вестерн-блоттинга белков фотосинтетических комплексов Synechocystis дикого типа (ДТ) и ∆pepP Synechocystis, выделенных через 48 ч роста при стандартных условиях (30°С, 50 мкмоль фотонов/(м2 с)).

Рис. 4. Авторадиограмма кинетики накопления индивидуальных полипептидов фотосинтетических комплексов в клетках штамма дикого типа (ДТ) и ∆pepP Synechocystis. Идентификацию полученных на авторадиограмме индивидуальных полос проводили с помощью иммуноферментного анализа. Время инкубации клеток с [35S]-метионином указано в часах.

Рис. 5. Сравнение аминокислотных последовательностей белков РерР (ген sll0136), MapA (ген slr0918), MapB (ген slr0786) и MapC (ген sll0555) Synechocystis. Жирным шрифтом выделены идентичные аминокислоты. Серым цветом отмечена область каталитических доменов в составе β-слоев. Звездочкой отмечены аминокислоты, образующие каталитический центр фермента у белков Мар. Аминокислотные последовательности белков получали в банке данных CyanoBase http://genome.kazusa.or.jp/cyanobase/Synechocystis). Выравнивание и сравнение аминокислотных последовательностей белков проводили с помощью программы ClustalW.