УДК 581.1

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГОЛУБОГО НАТИВНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ПЛАЗМАЛЕММЫ, СОДЕРЖАЩИХ PIP-АКВАПОРИНЫ

© 2013 г. Т. А. Шевырева, М. С. Пиотровский, Б. В. Белугин, И. М. Жесткова, 

М. С. Трофимова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки 

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва

Поступила в редакцию 21.11.2012 г.

В настоящее время голубой нативный электрофорез (BN-PAGE) рассмотрен в качестве одного из эффективных методов идентификации белковых комплексов, содержащих аквапорины PIP-семейства. Предполагается, что способ солюбилизации плазмалеммы и соотношение детергент/белок имеют принципиальное значение для выявления белковых комплексов при помощи BN-PAGE. Наши эксперименты показали, что в плазмалемме этиолированных проростков гороха (Pisum sativum L.) сорта Аксайский сходные наборы белковых комплексов солюбилизируются при помощи неионных детергентов дигитонина, додецилмальтозида и Тритона Х-100. Независимо от типа детергента PIP-аквапорины всегда выявлялись в 440-кД белковом комплексе. По мере роста соотношения додецимальтозид/белков PIP-аквапорины обнаруживались также в 232-кД комплексе.

 

Ключевые слова: Pisum sativum – плазмалемма − неионные детергенты – BN-PAGE − мультибелковые комплексы − PIP-аквапорины

 

---------------------------------

 

Сокращение: BN-PAGE – голубой нативный электрофорез в полиакриламидном геле.

Адрес для корреспонденции: Шевырева Таисия Александровна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронная почта: shevyreva@yandex.ru

 

 ВВЕДЕНИЕ

 

Многообразие типов и уникальность функций биологических мембран возможны благодаря большому разнообразию белков и липидов, являющихся их основным материалом. Фактором, детерминирующим объединение белков и липидов в мембрану, является сродство друг к другу индивидуальных молекул или их ассоциатов, в основе которого лежат гидрофобные взаимодействия. Понимание того, как эти молекулы формируют такую эффективную структуру как мембрану, выполняющую барьерную, матриксную и регуляторную функции, до сих пор остается одной из основных проблем мембранологии [1]. Результатом исследований в этой области стали новые представления о доменной организации биологических мембран, которые изменили представления 70-х годов об их жидкостно-кристаллической природе и равномерном распределении компонентов [2−4]. Доменами называют области мембран, отличающиеся по составу от соседних участков вследствие ограничений в диффузионном обмене их компонентов. Примерами таких доменов в мембранах могут служить обогащенные стеринами и сфинголипидами “рафты” [5, 6], а также мультибелковые комплексы энергосопрягающих мембран прокариот, митохондрий и хлоропластов [7].

Одним из экспериментальных приемов для исследования мембранных доменов является их солюбилизация детергентами для нарушения липидлипидных, липидбелковых или белокбелковых контактов, которые лежат в основе структурно-функциональной организации мембран. Принципиальное значение имеет проблема подбора оптимального детергента для солюбилизации интегральных мембранных белков, которая чаще всего решается эмпирически. Оптимальным считается детергент, который хорошо смешивается с мембранными липидами и при концентрации, превышающей критическую концентрацию мицеллообразования, превращает бислой в смесь глобулярных смешанных мицелл. Вместе с тем, отдельные белки могут быть устойчивы к солюбилизации определенными детергентами, что имеет не только методическое значение для их выделения, но и позволяет получить информацию об их специфическом липидном окружении [8−10]. Для анализа доменной организации особое значение придается разработке методик разделения фрагментов, полученных после солюбилизации мембран неионными детергентами.

Одним из видов такого анализа является голубой нативный электрофорез в полиакриламидном геле (BN-PAGE), который впервые был применен для разделения комплексов ЭТЦ внутренней мембраны митохондрий [11], а позднее − для анализа мультимолекулярных комплексов других мембран, в том числе плазмалеммы клеток шпината, арабидопсиса и зеленой водоросли Dunalliella [12, 13]. Метод основан на нековалентном и нестехиометрическом связывании красителя Кумасси G-250 поверхностью гидрофобных мембранных белков, что придает им отрицательный заряд и позволяет перемещаться в сторону анода при электрофорезе. Исследования, проведенные на митохондриальных и тилакоидных мембранах, позволили отобрать три неионных детергента, оптимальных для проведения BN-PAGE: дигитонин, додецилмальтозид и Тритон Х-100 [7, 10].

PIP-аквапорины – белки одного из семейств клеток растений, формирующие каналы для транспорта воды и низкомолекулярных неэлектролитов, локализованные в плазматических мембранах [14]. С помощью рентгеноструктурного анализа аквапорина шпината было установлено, что этот белок кристаллизуются в форме тетрамера, каждый мономер которого формирует индивидуальную пору для молекул воды [15]. Результаты работ по совместной экспрессии PIP1- и PIP2-изоформ аквапоринов показали, что эти белки способны к формированию гетеротетрамеров в мембране, что сопровождается повышением ее осмотической водной проницаемости [16] или ведет к изменению селективности каналов в отношении транспортируемых субстратов [17]. Распределение PIP-аквапоринов в плоскости плазматической мембраны, скорее всего, гетерогенно. Это подтверждается их обнаружением в детергент-устойчивых фракциях плазмалеммы, обогащенных стеринами и сфинголипидами [18, 19], а также ко-локализацией как с клатрином, так и с флотилином-1 – маркерными белками разных участков плазмалеммы, которым свойственны альтернативные пути эндоцитоза [20]. Также нельзя исключить, что PIP-аквапорины могут образовывать комплексы с другими белками в плазматической мембране. Результаты, подтверждающие такую возможность, представлены в единственной работе [12], где показано, что PIP-аквапорины совместно с ERD8 и P-АТФазой образуют комплекс, функция и свойства которого пока не установлены. Мы предполагаем, что в плазматической мембране может существовать ряд аквапорин-содержащих комплексов с другим составом и свойствами. Поэтому целью настоящей работы стала идентификация с помощью BN-PAGE белковых комплексов плазмалеммы клеток побегов этиолированных проростков гороха, содержащих PIP-аквапорины, а также исследована их устойчивость к неионным детергентам, различающимся по способности солюбилизировать стерины.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение плазматических мембран. Для получения микросомальных мембран побеги 5-дневных этиолированных проростков гороха (Pisum sativum L.) сорта Аксайский гомогенизировали в среде, содержащей 300 мМ сахарозу, 100 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 10 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотрейтол, 5 мМ метабисульфит калия, 1 мМ фенилметилсульфонил фторид и 0.6% поливинилпирролидон. Гомогенат подвергали дифференциальному центрифугированию (10 000 g, 15 мин), отбрасывая осадок, и выделяли микросомальную фракцию мембран (100 000 g, 30 мин). Ее ресуспендировали в среде, содержащей 300 мМ сахарозу, 3 мМ KCl, 5 мМ калийфосфатный буфер (pH 7.8), и разделяли в двухфазной полимерной системе на плазмалемму и внутриклеточные мембраны, согласно рекомендациям [21]. Плазмалемму осаждали центрифугированием (100 000 g, 30 мин) из верхней фазы и суспендировали в среде, содержащей 300 мМ сахарозу, 5 мМ дитиотрейтол, 0.5 мМ ЭДТА, 5 мМ бис-трис-пропан-Mes (pH 7.2) и смесь ингибиторов протеаз (10 мкМ бестатин, 1 мкМ пепстатин, 0.3 мкМ аминоэтилбензенсульфонил фторид, 1 мкМ лейпептин), замораживали и хранили при −70ºС. Содержание белка определяли с помощью бицинхониновой кислоты (“Sigma”, США) с БСА в качестве стандарта. Чистоту фракции плазмалеммы оценивали по активности маркерных ферментов, как в работе [19].

Солюбилизация плазмалеммы для BN-PAGE. Плазмалемму переосаждали (30 мин при 100 000 g) и ресуспендировали в солюбилизационном буфере (500 мМ аминокапроновая кислота, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ Bis-Tris-HCl, рН 7.0) и в этот объем вносили дигитонин, додецилмальтозид или Tритон Х-100 в конечной концентрации 1%, варьируя отношение детергент/белок. Мембранные препараты инкубировали в течение 30 мин при 4С, а затем центрифугировали 30 мин при 20 000 g. Супернатанты замораживали и хранили при −70С до использования.

Двумерный BN/SDS-PAGE проводили, согласно Wittig с соавт. [22] при 4С в 5–20% геле в камере Mini Protean III (“Bio Rad”, США): при 80 В в течение 1 ч и последующие 17 ч при 200 В, используя катодный (50 мМ Tricine, 15 мМ Bis-Tris-HCl, рН 7.0, 0.02% Кумасси G-250) и анодный (50 мМ Bis-Tris-HCl, рН 7.0) буферы. Во втором направлении белковые комплексы, полученные после нативного электрофореза, разделяли на отдельные белки в денатурирующих условиях. Для этого нативный гель разрезали на отдельные дорожки, которые инкубировали в денатурирующем буфере по Laemmli [23] – в течение 45 мин при комнатной температуре. Затем проводили электрофорез в 12.5% геле (200 В, 1 ч) в буфере, содержащем 0.1% ДДС, 0.1 М TrisTricine, рН 8.3.

Гели окрашивали Кумасси R-250 или SyproRuby (“Invitrogen”, США), согласно стандартным протоколам, и сканировали на Epson Perfection V700 Photo или Typhoon Trio Plus (“GE Healthcare”, США).

Вестерн-блот анализ. После денатурирующего электрофореза белки переносили полусухим способом на нитроцеллюлозную мембрану Hybond C Super (“GE Healthcare”) при 1 мА/см2 в течение 2 ч на Trans blot SD (“Bio Rad”). После переноса белков нитроцеллюлозную мембрану отмывали в среде PBST (10 мМ фосфатный буфер, рН 7.4, 2.7 мМ KCl, 137 мМ NaCl, 0.05% Tween-20) и блокировали в той же среде с добавлением 2% сухого обезжиренного молока при комнатной температуре. Затем инкубировали в течение ночи при 4°С с первичными кроличьими антителами в разведении 1 : 100. Антитела были получены против конъюгата БСА с пептидом, в котором состав и последовательность аминокислот соответствовали консервативной области в аквапоринах PIP1- и PIP2-семейства растений (-DYKEPPPAPLFEPGELSSWS-) [19]. Полосы, соответствующие аквапоринам, визуализировали с вторичными козьими FITC-мечеными антителами (“Медгамал”, Россия).

Перенос белковых комплексов после BN-PAGE осуществляли влажным способом. Для этого гели инкубировали в буфере Laemmli [23] без бромфенола дважды по 15 мин, затем – в буфере для переноса (10% метанол, 10 мМ Сaps, рН 11.0) при комнатной температуре в течение 15 мин. Комплексы переносили на мембрану Immobilon-P (“Millipore”, США), используя Mini Trans Blot Electrophoretic Transfer Cell (“BioRad”), на 4 ч при 35 V, 4С и постоянном перемешивании. После этого мембрану отмывали метанолом до обесцвечивания. Блокирование, иммунодетекция и сканирование блотов проводились так же, как описано выше.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Устойчивость PIP-аквапоринов к солюбилизации плазмалеммы 

неионными детергентами

 

Интегральные мембранные белки различаются по степени устойчивости к действию различных неионных детергентов [9]. Проведенный нами анализ эффективности солюбилизации плазмалеммы подтвердил это положение. Как видно на рис. 1а, в одинаковых условиях (30 мин при 4○С) додецилмальтозид солюбилизировал примерно 80% мембранного белка, в то время как для Тритона Х-100 или дигитонина эта величина не превышала 60−70%.

Представленные результаты подтверждают эффективность солюбилизации мембран выбранными детергентами, но не означают, что среди солюбилизированных белков присутствуют PIP-аквапорины. Для проверки этого полученные солюбилизаты и осадки были переведены в раствор ионного детергента и подвергнуты денатурирующему электрофорезу (рис. 1б) с последующей иммунодетекцией аквапоринов.

Как видно на рис. 1в, PIP-аквапорины независимо от типа детергента выявлялись как в солюбилизированной (дорожки 1–3), так и в детергент-устойчивой (дорожки 4–6) фракциях плазмалеммы в виде мономеров и димеров. При этом интенсивность иммуноокрашивания в случае додецилмальтозида была практически одинаковой в обеих фракциях (дорожки 1 и 4). Иная картина наблюдалась при использовании двух других детергентов: содержание этих белков в солюбилизате преобладало над их содержанием в осадке в случае дигитонина (дорожки 3 и 6), а для тритона – распределение было противоположным (дорожки 2 и 5).

Ранее нами было показано, что PIP-аквапорины, равно как и стерины, при обработке плазмалеммы этиолированных проростков гороха Тритоном Х-100 сосредотачиваются в детергент-устойчивой фракции мембран [19]. Дигитонин же, связывая стерины, ослабляет их взаимодействие с аквапоринами, тем самым увеличивая содержание этих белков в солюбилизированной фракции.

Факт обнаружения аквапоринов, как в солюбилизированных, так и в детергент-устойчивых мембранах, говорит, в первую очередь, о том, что аквапорины локализуются не только в стерин-обогащенных доменах, но и в доменах плазмалеммы с другим составом липидов [24].

Применение денатурирующего электрофореза позволяет судить об общем содержании PIP-аквапоринов во фракциях плазмалеммы. Вместе с тем, этот подход не дает информацию о взаимодействии этих белков с другими компонентами мембраны – образование белокбелковых и белоклипидных контактов. Такая задача может быть решена методом BN-электрофореза.

 

Выявление белковых комплексов, содержащих аквапорины PIP-типа, 

методом BN-PAGE

При солюбилизации образцов для нативного электрофореза отношение детергент/белок является определяющим для качественного разделения белковых комплексов. Отношение должно быть достаточным для эффективной солюбилизации белков, но не избыточным, так как в этом случае будут преобладать мицеллы детергента, не содержащие молекул белка. Это ухудшает качество разделения и увеличивает распад белковых комплексов до индивидуальных белков [10]. Эксперименты, результаты которых представлены на рис. 2, были проведены при отношении детергент/белок 1 : 1, 5 : 1 и 10 : 1. Как видно из рис. 2а, профили миграции белковых комплексов, полученных после солюбилизации плазмалеммы каждым из трех детергентов в указанных соотношениях, содержали до десяти различающихся по интенсивности прокрашивания Кумасси G-250 полос.

Последующий вестерн-блот анализ (рис. 2б) позволил детектировать белковые комплексы, содержащие PIP-аквапорины. После солюбилизации мембран додецилмальтозидом или дигитонином были обнаружены низкомолекулярные ( 440 кД) аквапорин-содержащие комплексы, которые отсутствовали в Тритон-солюбилизируемой фракции. Кроме того, независимо от вида детергента и величины отношения детергент/белок, на блоте постоянно присутствовал аквапорин-содержащий комплекс с мол. м. между 440 и 669 кД. Поскольку величина создаваемого Кумасси G-250 отрицательного заряда на поверхности белковых комплексов не пропорциональна их размеру и молекулярной массе, то электрофоретическая подвижность разделяемых белковых комплексов в нативном геле в значительной мере определяется их пространственной организацией. Поэтому определение молекулярных масс белковых комплексов по сравнению с маркерными белками, как это широко применяется при денатурирующем электрофорезе, является приблизительным, что не может считаться корректным. Чтобы показать идентичность белковых комплексов, располагающихся в BN-геле на одном уровне, необходимо провести их разделение на полипептиды во втором денатурирующем направлении и сравнить их состав.

 

Иммунодетекция PIP-аквапоринов после разделения белковых комплексов 

в денатурирующих условиях

При разделении белковых комплексов плазмалеммы двумерным электрофорезом для солюбилизации брали отношение детергент/белок 5 : 1, которое было установлено эмпирически. Такое соотношение оказалось оптимальным для выявления большинства белковых комплексов.

Независимо от того, какой детергент был использован, после двумерного BN/SDS-электрофореза и иммунодетекции, PIP-аквапорины выявлялись в комплексе с кажущейся массой между 440 и 669 кД (рис. 3). Белковый профиль этого комплекса был практически одинаковым для всех трех детергентов. Кроме того, дигитонин и додецилмальтозид, но не Тритон Х-100, солюбилизировали PIP-аквапорин-содержащие комплексы как с более высокой (≥ 669 кД), так и с более низкой (≤ 440 кД) кажущейся молекулярной массой. Выявление других аквапорин-содержащих комплексов согласуется с данными рис. 2, где представлены результаты иммунодетекции PIP-аквапоринов в комплексе с сохраненными белокбелковыми связями. В принципе, такого совпадения после нативного и денатурирующего электрофорезов может и не наблюдаться, поскольку условия их проведения различны, а доступность антител к аквапоринам в составе комплекса по сравнению с денатурированной молекулой существенно ниже.

 

Влияние отношения додецилмальтозид/белок 

на стабильность аквапорин-содержащих комплексов в растворе детергента

Как было обнаружено (рис. 2), при солюбилизации плазмалеммы додецилмальтозидом существует вероятность диссоциации крупных комплексов на более мелкие с увеличением отношения детергент/белок. Кроме того, увеличение отношения может приводить к появлению низмолекулярных белковых комплексов, содержащих PIP-аквапорины. Поэтому подбор оптимального отношения детергент/белок для солюбилизации индивидуальных белков или их комплексов имеет критическое значение. В следующей серии экспериментов для солюбилизации при проведении BN/SDS-электрофореза отношение детергент/белок было увеличено до величины 20 : 1. По интенсивности иммуноокрашивания можно видеть, что при таком высоком отношении появляется комплекс с мол. м. меньше 232 кД (рис. 4а). Поскольку кажущаяся молекулярная масса наименьшего обнаруженного аквапорин-содержащего комплекса, определенная на основании иммунодетекции, близка к массе их тетрамера, можно было бы полагать, что этот комплекс и есть продукт олигомеризации PIP-аквапоринов. Однако, согласно данным денатурирующего электрофореза, этот комплекс, кроме аквапоринов, включает еще, по крайней мере, два неидентифицированных белка (рис. 4б). Судя по всему, именно этот комплекс, обнаруженный впервые Kjell с соавт. [12], и является стабильным и наименьшим PIP-аквапорин-содержащим комплексом плазмалеммы.

В результате проведенного исследования с использованием разных неионных детергентов в плазматической мембране проростков гороха обнаружено несколько PIP-содержащих комплексов с разной молекулярной массой и способностью к диссоциации. Наиболее стабильным оказался комплекс с мол. м. выше 440 кД, который обнаруживался после солюбилизации всеми использованными детергентами, в том числе, Тритоном Х-100. Мембранные домены, обогащенные стеринами, как было сказано выше, устойчивы к солюбилизации этим детергентом. Поэтому можно полагать, что этот комплекс локализуется в участках мембраны с низким содержанием стеринов, а какова причина его повышенной стабильности к действию детергентов, пока не ясно.

Максимальное количество аквапорин-содержащих комплексов плазмалеммы выявлялось при солюбилизации додецилмальтозидом. Отношение додецилмальтозид/белок было определяющим фактором для выявления комплексов разного размера (молекулярной массы) – при отношении 5 : 1 выявлялись преимущественно высокомолекулярные (≥ 440 кД), а соответственно при 20 : 1 – низкомолекулярные (≤ 232 кД) комплексы. Такая зависимость может быть использована как характеристика стабильности аквапорин-содержащих комплексов.

Наименее изученным в настоящее время является вопрос о функциональной роли образования аквапорин-содержащих белковых комплексов. Известно, что молекулы одной из двух изоформ AQP4 млекопитающих являются основой для формирования специфических супрамолекулярных мембранных комплексов в клетках нейроглии и мышцах, получивших название OAP (от orthogonal arrays of particles). Считается, что образование OAP повышает трансмембранную водную проницаемость мембран [25]. Кроме того, снижение содержания AQP4 в OAP коррелирует с развитием некоторых видов мышечных дистрофий, а происходит из-за нарушения связи аквапоринов с дистрофином [26].

Какова физиологическая роль образования комплексов, содержащих PIP-аквапорины, в настоящее время не известно. Можно лишь предполагать, что аквапорины PIP-типа образуют комплексы с белками для регуляции их канальной активности; стабилизации олигомерной структуры в мембране, а также для везикулярного транспорта этих белков. В пользу последнего предположения говорят полученные недавно данные о необходимости гетероолигомеризации PIP-аквапоринов для их доставки в плазмалемму [27].

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 11-04-01225 и № 12-04-31643).

 

 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Lee A.G. Lipid-Protein Interactions // Biochem. Soc. Trans. 2011. V. 39. P. 761−766.

2. Singer S.J., Nicolson G.L. The Fluid Mosaic Model of the Structure of Cell Membranes // Science. 1972. V. 175. P. 720−731.

3. Lindner R., Naim H.Y. Domains in Biological Membranes // Exp. Cell Res. 2009. V. 315. P. 2871−2878.

4. Lajoie P., Goetz J.G., Dennis J.W., Nabi I.R. Lattices, Rafts, and Scaffolds: Domain Regulation of Receptor Signaling at the Plasma Membrane // J. Cell Biol. 2009. V. 185. P. 381385.

5. Kusumi A., Suzuki K. Toward Understanding the Dynamics of Membrane-Raft-Based Molecular Interactions // Biochim. Biophys. Acta. 2005. V. 1746. P. 234−251.

6. Simons K., Mathias J.G. Revitalizing Membrane Rafts: New Tools and Insights // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010. V. 11. P. 688–699.

7. Krause F. Detection and Analysis of ProteinProtein Interactions in Organellar and Prokaryotic Proteomes by Native Gel Electrophoresis: (Membrane) Protein Complexes and Supercomplexes // Electrophoresis. 2006. V. 27. P. 2759−2781.

8. Le Maire M., Champeil P., Moller J.V. Interaction of Membrane Proteins and Lipids with Solubilizing Detergents // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1508. P. 86−111.

9. Schuck S., Honsho M., Ekroos K., Shevchenko A., Simons K. Resistance of Cell Membranes to Different Detergents // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 5795−5800.

10. Reisinger V., Eichacker L.A. Solubilization of Membrane Protein Complexes for Blue Native PAGE // J. Proteom. 2008. V. 71. P. 277−283.

11. Schägger H., von Jagow G. Blue Native Electrophoresis for Isolation of Membrane Protein Complexes in Enzymatically Active Form // Anal. Biochem. 1991. V. 199. P. 223–231.

12. Kjell J., Rasmusson A.G., Larsson G., Widell S. Protein Complexes of the Plant Plasma Membrane Resolved by Blue Native PAGE // Physiol. Plant. 2004. V. 121. P. 546−555.

13. Katz A., Waridel P., Shevchenko A., Pick U. Salt-Induced Changes in the Plasma Membrane Proteome of the Halotolerant Alga Dunaliella salina as Revealed by Blue Native Gel Electrophoresis and Nano-LC-MS/MS Analysis // Mol Cell Proteom. 2007. V. 6. P. 1459−1472.

14. Maurel C., Verdoucq L., Luu D.T., Santoni V. Plant Aquaporins: Membrane Channels with Multiple Integrated Functions // Annu. Rev. Plant Biol. 2008. V. 59. P. 595−624.

15. Törnroth-Horsefield S., Wang Y., Hedfalk K., Johanson U., Karlsson M., Tajkhorshid E., Neutze R., Kjellbom P. Structural Mechanism of Plant Aquaporin Gating // Nature. 2006. V. 439. P. 688−694.

16. Zelazny E., Borst J.W., Muylaert M., Batoko H., Hemminga M.A., Chaumont F. FRET Imaging in Living Maize Cells Reveals that Plasma Membrane Aquaporins Interact to Regulate Their Subcellular Localization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 12 359−12 364.

17. Otto B., Uehlein N., Sdorra S., Fischer M., Ayaz M., Belastegui-Macadam X., Heckwolf M., Lachnit M., Pede N., Priem N., Reinhard A., Siegfart S., Urban M., Kaldenhoff R. Aquaporin Tetramer Composition Modifies the Function of Tobacco Aquaporins // J. Biol. Chem. 2010. V. 285. P. 31 253−31 260.

18.  Minami A., Fujiwara M., Furuto A., Fukao Y., Yamashita T., Kamo M., Kawamura Y., Uemura M. Alterations in Detergent-Resistant Plasma Membrane Microdomains in Arabidopsis thaliana during Cold Acclimation // Plant Cell Physiol. 2009. V. 50. P. 341−359.

19. Белугин Б.В., Жесткова И.М., Трофимова М.С. Сродство PIP-аквапоринов к стерин-обогащенным доменам плазмалеммы клеток этиолированных проростков гороха // Биол. мембраны. 2010. Т. 27. С. 394−403.

20. Luu D.T., Martinière A., Sorieul M., Runions J., Maurel C. Fluorescence Recovery after Photobleaching Reveals High Cycling Dynamics of Plasma Membrane Aquaporins in Arabidopsis Roots under Salt Stress // Plant J. 2012. V. 69. P. 894−905.

21. Larsson C., Sommarin M., Widell S. Isolation of Highly Purified Plasma Membranes and the Separation of Inside-Out and Right-Side-Out Vesicles // Methods Enzymol. 1994. V. 228. P. 451–469.

22. Wittig I., Braun H.P., Schägger H. Blue Native PAGE // Nat. Protoc. 2006. V. 1. P. 418−428.

23. Laemmli U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. P. 680−685.

24. Santoni V., Vinh J., Pflieger D., Sommerer N., Maurel C. A Proteomic Study Reveals Novel Insights into the Diversity of Aquaporin Forms Expressed in the Plasma Membrane of Plant Roots // Biochem. J. 2003. V. 373. P. 289−296.

25. Silberstein C., Bouley R., Huang Y., Fang P., Pastor-Soler N., Brown D., van Hoek A.N. Membrane Organization and Function of M1 and M23 Isoforms of Aquaporin-4 in Epithelial Cells // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2004. V. 287. P. F501−F511.

26. Nicchia G.P., Cogotzi L., Rossi A., Basco D., Brancaccio A., Svelto M., Frigeri A. Expression of Multiple AQP4 Pools in the Plasma Membrane and Their Association with the Dystrophin Complex // J. Neurochem. 2008. V. 105. P. 2156−2165.

27. Zelazny E., Miecielica U., Borst J.W., Hemminga M.A., Chaumont F. An N-Terminal Diacidic Motif Is Required for the Trafficking of Maize Aquaporins ZmPIP2;4 and ZmPIP2;5 to the Plasma Membrane // Plant J. 2009. V. 57. P. 346−355.

 ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

 

Рис. 1. Cолюбилизация плазмалеммы додецилмальтозидом (ДМ), Tритоном Х-100 (Х-100) и дигитонином (ДГ). 

а  cодержание белка в солюбилизируемых (13) и несолюбилизируемых (46) фракциях; б  электрофоретическое разделение белков указанных фракций в денатурирующих условиях; в  иммунодетекция в них PIP-аквапоринов. Плазмалемму (500 мкг) солюбилизировали при отношении детергент/белок 5 : 1 и конечной концентрации детергентов 1%, далее переосаждали центрифугированием (100 000 g, 30 мин) и считали супернатант – солюбилизируемой, а осадок – несолюбилизируемой фракциями. За 100% принимали содержание мембранного белка до солюбилизации. На дорожки геля наносили по 4 мкг белка. Гель окрашивали Sypro Ruby. Аквапорины визуализировали с вторичными флуоресцентно-меченными антителами.

 

Рис. 2. Влияние отношения детергент/белок на разделение белковых комплексов плазмалеммы методом BN-PAGE (а) и анализ содержания в этих комплексах PIP-аквапоринов (б).

Плазмалемму солюбилизировали в присутствии додецилмальтозида (ДМ), Тритона Х-100 (Х-100) или дигитонина (ДГ) в конечной концентрации 1% и отношении детергент/белок 1 : 1, 5 : 1 или 10 : 1 (указано сверху). На дорожки наносили равные объемы фракций, содержащих в среднем от 20 до 50 мкг солюбилизированного белка. Гель окрашивали Кумасси R-250.

 

Рис. 3. Идентификация белковых комплексов, содержащих PIP-аквапорины, методом двумерного BN/SDS-PAGE после солюбилизации плазмалеммы додецилмальтозидом (а), дигитонином (б) и Тритоном Х-100 (в).

Плазмалемму солюбилизировали в присутствии указанных детергентов в конечной концентрации 1% и отношении детергент/белок 5 : 1. В первом направлении на дорожку наносили по 50 мкг белка. Во всех вариантах сверху показаны двумерные гели, окрашенные Sypro Ruby, внизу – вестерн-блоты. Стрелками указаны комплексы, содержащие PIP-аквапорины.

 

Рис. 4. Влияние отношения додецилмальтозид/белок на кажущуюся молекулярную массу PIP-аквапорин-содержащих комплексов плазмалеммы после BN- (а) и BN/SDS-PAGE (б).

Плазмалемму солюбилизировали додецилмальтозидом в конечной концентрации 1% в отношении 5 : 1 или 20 : 1. Аквапорины иммунодетектировали после нативного (а) или после двумерного BN-PAGE (б), и визуализировали флуоресцентно-меченными вторичными антителами. На дорожки геля в первом направлении наносили по 50 мкг белка. Гели окрашивали Кумасси R-250. Справа сверху вниз представлены BN-, двумерный BN/SDS-PAGE и вестерн-блот.