УДК 581.1

ВЛИЯНИЕ ЭНДОФИТНЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis 

НА ЧИСЛО КЛЕТОК ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ В МОНОКУЛЬТУРЕ

© 2013 г. З. М. Курамшина*, Р. М. Хайруллин**

* Стерлитамакский филиал Башкирского государственного университета, Стерлитамак

** Федеральное государственное бюджетное учреждение науки 

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа

Поступила в редакцию 29.10.2012 г.

Исследовали влияние разных эндофитных штаммов бактерий Bacillus subtilis на рост водорослей Scenedesmus quadricauda и Chlorella vulgaris. Внесение штаммов бацилл в культуральную среду к водорослям снижало численность последних. Чувствительность C. vulgaris ко всем штаммам эндофитов была одинаковой. Число клеток S. quadricaudas заметнее снижалось к седьмым суткам опыта в присутствии штаммов B. subtilis 11В и 11ВМ, чем со штаммом B. subtilis 26Д, который является основой коммерческого биофунгицида Фитоспорина-М. Промытые и инактивированные автоклавированием клетки бактерий не вызывали снижения числа клеток водорослей C. vulgaris. Клетки, автоклавированные вместе с культуральной жидкостью, а также сама автоклавированная жидкость оказывали такой же ингибирующий эффект, что и живые клетки. Сделан вывод, что снижение числа клеток водорослей под воздействием эндофитных штаммов бацилл связано с синтезом секретируемых ими определенных термостабильных биологически активных веществ.

 

Ключевые слова: Bacillus subtilis  Scenedesmus quadricauda  Chlorella vulgaris  монокультура  биологически активные вещества  число клеток водорослей

 

-------------------------------------------

Адрес для корреспонденции: Курамшина Зиля Мухтаровна. 453103, Республика Башкортостан, Стерлитамак, пр. Ленина, 49. Стерлитамакский филиал Башкирского государственного университета. Электронная почта: kuramshina_zilya@mail.ru

 ВВЕДЕНИЕ

Водоросли в составе экосистем могут взаимодействовать с другими организмами посредством множественных связей. Водоросли способны оказывать влияние на другие микроорганизмы, например, задерживать или стимулировать рост и размножение бактерий или грибов, обитающих по соседству. В то же время, клетки водорослей и сами могут испытывать прямые и косвенные воздействия окружающих микроорганизмов 1, в том числе, появляющихся в экосистемах вследствие применения микробиологических средств защиты сельскохозяйственных культур.

Препараты, созданные на основе различных микроорганизмов, все чаще применяются в сельском хозяйстве в качестве альтернативы химическим препаратам. Так, различные штаммы бактерий рода Bacillus составляют основу средств защиты растений для борьбы с вредителями 2, 3 или фитопатогенами 4, 5, благодаря их способности продуцировать токсины, убивающие насекомых, или антибиотики, подавляющие развитие грибов. Кроме этого, представители аэробных спорообразующих бактерий способны синтезировать и другие вещества, в том числе фитогормоны, стимулирующие рост растений и, как следствие, повышающие урожайность сельскохозяйственных культур и их устойчивость к заболеваниям 69.

Сведения о влиянии подобных бактерий-антагонистов на рост водорослей весьма малочисленны. В литературе практически нет публикаций, посвященных исследованиям взаимоотношений эндофитных представителей различных видов микробов, обитающих внутри растительных тканей без нанесения вреда растению-хозяину, с водорослями. В данной работе мы исследовали влияние эндофитных штаммов B. subtilis на рост водорослей Scenedesmus quadricauda и Chlorella vulgaris.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили альгологически чистые культуры водорослей Scenedesmus quadricauda и Chlorella vulgaris. Культуры были предоставлены Стерлитамакским подразделением Государственного учреждения Управления государственного аналитического контроля Министерства экологии и природных ресурсов Республики Башкортостан. 

Водоросли выращивали в колбах объемом 1 л на жидкой минеральной среде Prat [10] при температуре 25оС и освещенности 3 клк 11. Перед началом эксперимента исходные культуры водорослей сгущали до образования суспензии путем центрифугирования (5 мин при 3000 g) и определяли исходное число клеток в камере Горяева. Затем методом разведений в 50 мл среды число клеток доводили до одинаковой (2325 тыс./см3) в контрольных и экспериментальных сосудах (стерилизованные стеклянные банки объемом 100 мл) и вносили туда клетки бактерий. Банки накрывали акриловой тканью. Совместную культуру выращивали при температуре 25оС на свету, аккуратно перемешивая по 1 мин дважды в течение суток. Подсчет клеток водорослей проводили через 24, 48, 72 и 168 ч после начала эксперимента. 

Каждый вариант опыта закладывали в трех сосудах. Из них брали по две пробы, каждую из которых делили на три образца. Затем образцы помещали в камеры Горяева (для каждой пробы своя камера) и считали число клеток. Из полученных шести результатов выводили среднее значение одного повтора варианта. В таблицах приведены средние значения трех повторений вариантов с указанием стандартного отклонения.

В экспериментах использовали суспензии клеток суточных культур B. subtilis штаммов 26Д, 11ВМ, 11В, полученные при выращивании на качалках в жидкой полусинтетической среде [12]. Культуры разбавляли стерильным 0.9% раствором NaCl до конечной концентрации 103, 104 или 105 кл./см3. Штаммы B. subtilis 26Д (ВНИИСХМ № 128) и 11ВМ (ВНИИСХМ № 519) были предоставлены сотрудниками Башкирского государственного аграрного университета (Уфа), штамм B. subtilis 11В (коллекция ИБФМ РАН, № ВКМ В-2218Д)  сотрудниками ООО НПП “БИОФОРТ”. Инактивирование клеток бацилл вместе с культуральной жидкостью проводили в автоклаве при температуре 120ºС и давлении 1.1 атм в течение 60 мин.

Перед автоклавированием суспензию клеток B. subtilis центрифугировали (5 мин, 12 000 g) и отделяли супернатант от осадка. Клетки промывали 0.05% раствором KCl с последующим цетрифугированием при тех же условиях и супернатанты объединяли. Промытые клетки заливали 0.05% раствором KCl до объема, равного первоначальному объему супернатанта. Суспензию клеток, а также объединенный супернатант автоклавировали. После этого в сосуды с C. vulgaris добавляли клетки бактерий до конечной концентрации 105 или 106 кл./см3. В другом варианте эксперимента в сосуды с водорослями добавляли такие же объемы автоклавированной культуральной жидкости.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Введение эндофитных штаммов бактерий B. subtilis в монокультуры двух видов водорослей S. quadricauda и C. vulgaris приводило к снижению числа клеток водорослей (табл. 1, 2). Действие бацилл было заметно уже через 24 ч, однако сила бактериального ингибирования роста микроводорослей наиболее четко проявлялась к седьмым суткам эксперимента (168 ч). Так, если к этому времени число клеток S. quadricauda и C. vulgaris в контрольных вариантах увеличилось, соответственно, в 6.4 и 7.2 раза от первоначального, то при культивировании с эндофитами B. subtilis наблюдали только их 2-кратное увеличение.

К седьмым суткам опыта стало заметно, что клетки S. quadricauda менее чувствительны к воздействию клеток штамма B. subtilis 26Д в сравнении с двумя другими штаммами (табл. 1). Такая же закономерность отмечалась у вида C. vulgaris, но только к 72 ч эксперимента (табл. 2). В присутствии штамма B. subtilis 26Д число клеток Chlorella составляло 67.2 тыс./см3, в присутствии штамма 11ВМ – 54.0 тыс./см3, а штамма 11В – 53.5 тыс./см3. Таким образом, наибольшее ингибирующее рост воздействие оказывал штамм 11В.

Этот эффект наблюдался в широком диапазоне плотности клеток B. subtilis, введенных в среду для культивирования водорослей. Ни в одном из случаев введения бактерий в культуру водорослей не удалось проследить четко выраженного на протяжении всего опыта “дозозависимого” снижения числа клеток водорослей при увеличении первоначальной концентрации клеток бактерий.

После автоклавирования бактерий вместе с культуральной средой ингибирующее действие на рост водорослей полностью сохранялось (рисунок), причем при использованных минимальных концентрациях (103 кл./см3). Независимое от количества внесенных бактериальных клеток снижение числа клеток водорослей, а также ингибирующий эффект инактивированных автоклавированием клеток бактерий в минимальной концентрации позволяют предположить, что ингибиторами роста водорослей в данном случае могли выступать некие термостабильные метаболиты бактерий, секретирующиеся в среду культивирования. В связи с этим, был проведен эксперимент, в котором в среду к C. vulgaris вносили суспензии отмытых автоклавированных клеток бактерий или такие же объемы автоклавированной культуральной жидкости. Выявлено, что сами убитые нагреванием клетки не влияли на рост водорослей, тогда как культуральная жидкость при разведении в 100 и 1000 раз вызывала четкое снижение числа клеток водорослей (табл. 3).

Известно, что индивидуальные физиологические особенности клеток и межклеточные связи значительно изменяются при сосуществовании нескольких видов микроорганизмов [13, 14. Конкуренция может происходить за жизненное пространство, источники питания и другие факторы. У бактерий “оружием” конкуренции могут быть антибиотики. Известно, что одним из характерных этапов действия антибиотиков B. subtilis на клетки разных организмов является их взаимодействие с клеточными мембранами. Антибиотик может изменять их проницаемость и/или проникать в цитоплазму клетки, не вызывая разрушения мембраны [15]. Накапливаясь внутри клетки, антибиотики способны ингибировать синтез нуклеиновых кислот, белков, нарушать синтез клеточной стенки и клеточное деление [1618]. При этом показано, что некоторые антибиотики (субтилин, эрицин, мерсацидин, субланцин, субтилозин) устойчивы к окислению, низким значениям рН, а также малочувствительны к воздействию высоких температур [19, 20]. 

Снижение числа клеток C. vulgaris под влиянием автоклавированной культуральной жидкости штаммов Bacillus позволяет утверждать, что именно секретируемые бактериями метаболиты являются причиной описанного нами явления. Результаты наших экспериментов не позволяют ответить на вопрос: происходит ли это вследствие угнетения их деления и/или роста, деструкции части поделившихся клеток, преждевременным старением и гибелью? Выявлению механизмов обнаруженного явления, описанного в данной работе, будут посвящены наши дальнейшие исследования.

 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Балашова Н.Б., Никитина В.Н. Водоросли. Лунинград: Лениздат, 1989. С. 79–92.

2. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии – продуценты биологически активных веществ. Киев: Наук. думка, 1982. 278 с.

3. Powell K.A., Jutsum A.R. Technical and Commercial Aspects of Biological Control Products // Pesticide Sci. 1993. V. 37. P. 315–321.

4. Bais H.P., Fall R., Vivanco J.M. Biocontrol of Bacillus subtilis against Infection of Arabidopsis Roots by Pseudomonas syringae Is Facilitated by Biofilm Formation and Surfactin Production // Plant Physiol. 2004. V. 134. P. 307–319.

5. Shoda M. Bacterial Control of Plant Diseases // J. BioSci. Bioeng. 2000. V. 89. P. 515–521.

6. Yan Z., Reddy M.S., Yyu C.-M., McInroy J.A., Wilson M., Kloepper J.W. Induced Systemic Protection against Tomato Late Blight Elicited by Plant Growth-Promoting Rhizobacteria // J. Phytopathol. 2002. V. 92. P. 1329–1333.

7. Stein T. Bacillus subtilis Antibiotics: Structures, Syntheses and Specific Functions // Mol. Microbiol. 2005. V. 56. P. 845–857.

8. Rodriguez H., Fraga R., Gonzalez T., Bashan Y. Genetic of Phosphate Solubilization and Its Potential Applications for Improving Plant Growth-Promoting Bacteria // Plant Soil. 2006. V. 287. P. 15–21.

9. Мелентьев А.И. Аэробные спорообразующие бактерии Bacillus Cohn в агроэкосистемах. Москва: Наука, 2007. 147 с.

10. Prat S. Algarum, Hepaticarum, Muscorumque in Culturis Collectio // Plantarum Physiologiae Institutum Universitatis Carolinae. Preslia. 1948. V. 22–23. P. 1–12.

11. Жмур Н.С., Орлова Т.Л. Методика определения токсичности вод, водных вытяжек из почв, осадочных сточных вод и отходов по изменению уровня флуоресценции хлорофилла и численности клеток водорослей. Москва: АКВАРОС, 2007. С. 25–40.

12. Недорезков В.Д. Биологическая защита пшеницы от болезней в условиях Южного Урала. Москва: МСХА, 2002. 173 с.

13. Hogan D.A., Kolter R. Pseudomonas-Candida Interactions: An Ecological Role of Virulence Factors // Science. 2002. V. 296. P. 2229–2232.

14. Hogan D.A., Vik A., Kolter R. Pseudomonas aeruginosa Quorum-Sensing Molecule Influence Candida albicans Morphology // Mol. Microbiol. 2004. V. 54. P. 1212–1223.

15. Hancock R.E., Diamond G. The Role of Cationic Antimicrobial Peptides in Innate Host Defenses // Trends Microbiol. 2000. V. 8. P. 402–410.

16. Lampen J.O,. Arnow P. Inhibition of Algae by Nystatin // J. Bacteriol. 1961. V. 82. P. 247–251.

17. Verschuere L., Rombaut G., Sorgeloos P., Verstraete W. Probiotic Bacteria as Biological Control Agents in Aquaculture // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. V. 64. P. 655–671.

18. Brogden K.A. Antimicrobial Peptides: Pore Formers or Metabolic Inhibitors in Bacteria? // Nat. Rev. Microbiol. 2005. V. 3. P. 238–250.

19. Nakano M.M., Zuber P. Molecular Biology of Antibiotic Production in Bacillus // Crit. Rev. Biotechnol. 1990. V. 10. P. 223−240.

20. Jenssen H., Hammil P., Hancock R.E. Peptide Antimicrobial Agents // Clin. Microbiol. Rev. 2006. V. 19. P. 491–511.

 

 

ПОДПИСЬ К РИСУНКУ

 

Число клеток Scenedesmus quadricaudа при культивировании с клетками бактерий.

а  B. subtilis 26Д; б  B. subtilis 11ВМ; в  B. subtilis 11В. 1 – контроль; 2 – живые клетки бактерий; 3 – клетки бактерий после автоклавирования.