УДК 581.1

ФИТОХРОМ-ЗАВИСИМАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФУМАРАТГИДРАТАЗЫ 

В ЗЕЛЕНЫХ ЛИСТЬЯХ КУКУРУЗЫ

© 2015 г. А. Т. Епринцев, Д. Н. Федорин, О. В. Сазонова

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования “Воронежский государственный университет”, Воронеж

Поступила в редакцию 10.11.2014 г.

Выявлена зависимость активности фумаратгидратазы в зеленых листьях кукурузы (Zea mays L.) от светового режима. Установлено участие фитохромной системы в светорегуляции фумаразной активности, причем красный свет тормозил скорость функционирования фумаразы. Исследование уровня экспрессии генов fum1 и fum2 в зеленых листьях показало, что активно экспрессируется только ген fum1, тогда как экспрессия гена fum2 выключается. Полученные данные свидетельствуют, что в листьях кукурузы ионы кальция могут выступать в качестве вторичного мессенджера в трансдукции светового сигнала, при этом активная форма фитохрома, образующаяся при действии красного света, вызывала накопление ионов кальция, выступающих в качестве регулятора функционирования цикла Кребса. Применение ингибитора кальциевых каналов (рутения красного) и комплексона (ЭГТА) позволило обнаружить, что изменение содержания свободного кальция в ядрах клеток листьев кукурузы связано с его перераспределением между компартментами клетки. Активная форма фитохрома вызывала увеличение скорости транскрипции гена pif3, при этом наблюдали ингибирование функционирования гена fum1. Предполагается, что посредником в трансдукции фитохромного сигнала в ядре может выступать транскрипционный фактор PIF3.

-----------------------------

Сокращения: КС − красный свет; ДКС − дальний красный свет; СДГ – сукцинатдегидрогеназа; ФГ – фумаратгидратаза.

Адрес для корреспонденции: Епринцев Александр Трофимович. 394006 Воронеж, Университетская пл., 1. Воронежский государственный университет, кафедра биохимии и физиологии клетки. Электронная почта: bc366@bio.vsu.ru

Ключевые слова: Zea mays – фумаратгидратаза − ферментативная активность − экспрессия гена − фитохромная система – сигнализация – катионы кальция – транскрипционный фактор PIF3

 

ВВЕДЕНИЕ

Фумараза (фумаратгидратаза, КФ 4.2.1.2) катализирует обратимое превращение малата и фумарата. Для большинства организмов роль фумаратгидратазы (ФГ) сводилась к ее участию в работе цикла трикарбоновых кислот в митохондриях [1]. Однако в растениях Arabidopsis было выявлено наличие цитозольной формы; в них были обнаружены гены, кодирующие и митохондриальную (At2g47510), и цитозольную фумаразу (At5g50950) [2]. Кроме того, обнаружили нескольких метаболических функций этого фермента [3]. В частности, сообщается о важной роли цитозольной формы фумаразы в метаболизме азота [2]. ФГ может использовать фумарат, образующийся в реакции, катализируемой аргининсукцинат-лиазой, находящейся в цитозоле [4] или пластидах [5]. Фумараза была также обнаружена во внеклеточной среде культуральных клеток моркови [6], где она принимает участие в утилизации малата. Двойная локализация и двойная функция ФГ были подтверждены сначала в клетках животных, позже подобная информация стала появляться и для растений [7, 8].

В настоящее время известно, что цикл Кребса в листьях растений ингибируется на свету. Об этом сообщалось в наших работах на примере маркерного фермента этого пути – сукцинатдегидрогеназы (СДГ) [9]. Неоднозначна роль других ферментных систем в световой регуляции ЦТК. Экспрессия многих генов, кодирующих различные ферменты, участвующие в фотосинтетическом и дыхательном метаболизме, регулируется светом. Данный факт установлен для таких ферментов, как ротенон-нечувствительные НАД·H- и НАД(Ф)·H-дегидрогеназы и альтернативная оксидаза, которые стимулируются светом, а также сукцинатдегидрогеназа, пируватдегидрогеназа, цитохромоксидаза и фумаратгидратаза, у которых активность на свету снижается [10–12]. Следовательно, свет ингибирует цикл трикарбоновых кислот и митохондриальную ЭТЦ, в то время как несопряженные пути активируются [12]. 

Имеются сообщения о существовании фоторегуляции фумаратгидратазной активности в листьях растений, однако неизвестен механизм трансдукции светового сигнала. Важную роль в этих процессах может играть фитохромная система, оказывающая свое влияние на функционирование ферментов через различные вторичные мессенджеры, такие как ионы Са, G-белки и цАМФ [13]. Ранее было установлено, что фитохромная система участвует в регуляции некоторых дыхательных ферментов на уровне экспрессии их генов [14–16]. Кроме того, важная роль в регуляции экспрессии генов, кодирующих светозависимые ферменты, по мнению некоторых авторов, принадлежит транскрипционным факторам семейства PIF (PIF1–PIF5) [17, 18]. 

Поэтому заслуживающей внимания проблемой представляется исследование роли фитохромной системы растений в работе ферментов цикла трикарбоновых кислот, в частности, фумаратгидратазы. Данные об активности ФГ позволяют судить о скорости функционирования цикла Кребса, причем характеризовать функционирование этого фермента можно не только по энзиматической активности, но и по экспрессии гена, кодирующего его белковую молекулу. В связи с этим целью настоящего исследования было выяснение роли фитохромной системы в трансдукции светового сигнала, обуславливающего фоторегуляцию фумаратгидратазной активности в зеленых листьях кукурузы.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследования использовали зеленые листья 14-дневных растений кукурузы (Zea mays L.) сорта Воронежская 76, выращенных гидропонным способом при 10-часовом световом дне, температуре 25ºС и интенсивности света 25 Вт/м2.

Для создания различного светового режима растения помещали в темную камеру на 24 ч (вариант “темнота”) и облучали красным (вариант КС) и/или дальним красным (варианты КС+ДКС или ДКС) светом в течение 15 мин. Для этого использовали светодиоды с областью испускания 640–680 нм (КИПД40М40-К-П6, Россия) и 710–750 нм (3Л127А-5, Россия). Пробы для дальнейшего анализа отбирали через 3 ч с момента облучения.

Активность ФГ измеряли спектрофотометрически по снижению оптической плотности при длине волны 240 нм при 25ºС. Состав среды: 50 мМ Tris–HCl (pH 8.0), 50 мМ малат, 3 мМ MgSO4. За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, образующего 1 мкмоль продукта за 1 мин при 25ºС в расчете на 1 г сырой массы.

Общее количество белка определяли по методу Lowry с соавт. [19].

Фракции ядер из растительного материала выделяли по методике, предложенной Lee и Lin [20].

Количества свободного кальция определяли спектрофотометрическим методом по цветной реакции с мурексидом в присутствии глицерина. Мурексид образует с кальцием окрашенный комплекс, устойчивость которого повышается путем добавления в раствор глицерина [21]. Расчет концентрации кальция проводили по калибровочному графику.

Перекрестное загрязнение определяли по активности цитоплазматических маркерных ферментов. Активность алкогольдегидрогеназы определяли спектрофотометрически по скорости восстановления НАД+ при 340 нм в присутствии 150 мМ этанола [22]. Активность лактатдегидрогеназы измеряли при помощи оптического теста Варбурга [23], используя в качестве субстрата 1 мМ пируват натрия.

При изучении действия ингибитора кальциевых каналов (рутения красного) и комплексона (ЭГТА) растения кукурузы перед началом эксперимента выдерживали в 25 мМ растворе рутения красного или 5 мМ растворе ЭГТА в течение 2 ч [24].

Для выделения суммарной клеточной РНК использовали набор Magna RNA Prep 100 (“Амплисенс”, Россия), согласно рекомендация производителя. 

Обратную транскрипцию РНК осуществляли с использованием обратной транскриптазы вируса Moloney лейкоза мышей M-MULVRT (“Fermentas”, Литва) для синтеза первой цепи кДНК. 

ПЦР в реальном времени проводили на приборе Bio-Rad DNA Engine Thermal Cycler Chromo 4 (“Bio-Rad”, США), используя в качестве красителя SYBR Green. В качестве праймеров, подобранных с помощью программного обеспечения Primer3, использовали нуклеотидные последовательности к гену fum 1: прямой 5′-gattacttcgatcattgaggt-3′ и обратный 5′-accagaactcgcggatgtggc-3′, и к гену fum 2: прямой 5′-acaaacttgccattcgtcacc-3′ и обратный 5′-tggttcattctcaggcagaga-3′.

Параметры амплификации: предварительная денатурация – 95ºС, 5 мин; цикл – 95ºС, 30 с, 60ºС, 30 с, 72ºС, 30 с (детекция); финальная элонгация – 72ºС, 10 мин. Количество матрицы контролировали с помощью параллельной амплификации фактора элонгации ef-1α с ген-специфичными праймерами [25]. В качестве отрицательного контроля использовали суммарную РНК без проведения обратной транскрипции.

Определение относительного уровня экспрессии исследуемых генов проводили с применением 2–ΔΔCt-метода с использованием программного обеспечения Opticon MonitorTM Software (“Bio-Rad”).

Полученные данные обрабатывали с использованием статистического критерия Стьюдента. Обсуждаются статистически достоверные различия при P < 0.05 [26].

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

Изучение динамики активности ФГ в зеленых листьях кукурузы при помещении растений в темноту показало, что в первые 0.5 ч происходило резкое возрастание активности фермента (в 4.6 раза) по сравнению с контролем (свет) (рис. 1). При дальнейшей экспозиции активность фумаразы уменьшалась относительно предыдущей точки, но оставаясь выше контрольных значений. 

Полученные ранее методом ОТ-ПЦР данные свидетельствуют о том, что в геноме кукурузы присутствуют два гена: fum1 и fum2, кодирующие митохондриальную и цитоплазматическую формы фумаразы соответственно [27]. 

Исследование экспрессии генов ФГ в зеленых листьях кукурузы выявило их дифференциальную экспрессию в фотосинтезирующих тканях. Расчетные значения для транскриптов генов fum1 и fum2 в разных образцах кДНК показали (рис. 2), что в листьях наблюдается определенный уровень экспрессии гена fum1, в то время как экспрессия гена fum2 практически не обнаруживается. Эти результаты указывают на светозависимый способ регуляции дифференциации генов ФГ.

Важным механизмом световой регуляции может выступать фитохромная система, обеспечивающая регуляцию фотозависимых ферментов, в частности, СДГ, альтернативных НАД(Ф)·H-дегидрогеназ, альтернативной оксидазы, пируватдегидрогеназы, цитохромоксидазы и ФГ [12].

Проведенный анализ образцов кДНК кукурузы с праймерами к гену fum1 в условиях разного освещения позволил установить, что в растениях на свету и после облучения КС с длиной волны 660 нм относительная концентрация мРНК исследуемого гена значительно меньше, чем в растениях, находящихся в темноте или после облучения ДКС (рис. 3). Интенсивность транскрипции гена fum1 на свету была гораздо ниже, чем в темноте. Так, уровень относительной транскрипции для вариантов опыта “темнота” и “ДКС” или “КС+ДКС” в 5.5–5.8 раза выше этого показателя в вариантах “свет” и “КС”.

Известно, что эффект фитохрома может проявляться либо путем прямого взаимодействия с молекулой фермента, либо через изменение структуры мембранных белков, либо влияя на работу генетического аппарата клетки [13, 28]. Показано проникновение активной формы фитохромов А и В в ядро, приводящее к трансформации структуры хроматина и как следствие к изменению экспрессии генетического аппарата клетки с участием различных мессенджеров [29].

Для выяснения роли двухвалентных ионов кальция в трансдукции внутриклеточного сигнала фитохромной системы в регуляции экспрессии гена fum1 мы проанализировали их влияние на уровень транскрипции в условиях разного светового режима и в присутствии специфического ингибитора Са-каналов и комплексона. Было установлено, что интенсивность транскрипции гена fum1 ФГ имеет определенную зависимость как от состояния фитохромной системы, так и от природы действующих веществ.

При исследовании механизмов реализации фитохромного сигнала в растительной клетке мы оценили изменения в содержании свободных катионов Са2+ в ядрах клеток и получили четкую корреляцию между содержанием кальция в ядрах и состоянием фитохромной системы (рис. 4). После экспонирования растений в темноте, а также при их облучении ДКС и последовательном облучении КС и ДКС было выявлено уменьшение содержания кальция в ядрах листьев кукурузы. После облучения КС уровень кальция в ядрах возрастал в 1.4 раза по сравнению с темновым вариантом (рис. 4).

Известно, что катионы кальция являются наиболее распространенными внутриклеточными мессенджерами фитохромного сигнала [13]. Для выяснения механизма трансдукции фитохромного сигнала в клетках зеленых листьев кукурузы нами проведено исследование скорости транскрипции гена fum1 в условиях различного светового режима в присутствии ингибитора кальциевых каналов (рутения красного) и комплексона ЭГТА. После обработки растений рутением красным и ЭГТА интенсивность экспрессии гена fum1 во всех вариантах светового режима оставалась на уровне темнового варианта (рис. 5). Полученные данные показали, что активная форма фитохрома, образующаяся при действии КС, приводила к накоплению Са2+ в ядрах листьев кукурузы (рис. 4). В присутствии специфического ингибитора Са-каналов (рутения красного) было выявлено, что под действием света разной длины волны в ядрах клеток исследованных растений не происходило изменений в содержании кальция путем его перераспределения между компартментами клетки.

Известно, что фитохром и фитохром-индуцирующие факторы (семейство PIF) расположены в ядре [13]. Было показано, что PIF могут функционировать как факторы транскрипции, регулируя экспрессию ряда генов, при этом наблюдается как положительная, так и отрицательная регуляция [30].

Для выяснения роли фактора PIF3 в регуляции скорости экспрессии гена fum1 мы провели количественную ПЦР в реальном времени и обнаружили, что интенсивность транскрипции гена pif3 зависела от состояния фитохромной системы. При действии КС наблюдали высокую скорость экспрессии pif3, так же как и в растениях, экспонируемых на свету. Однако при облучении зеленых листьев кукурузы ДКС и при последовательном облучении КС и ДКС скорость транскрипции исследуемого гена снижалась на 30–35% (рис. 6).

Анализ уровня экспрессии гена pif1 в зеленых листьях кукурузы показал, что колебания в количестве его продукта при изменении светового режима хотя и наблюдались, но были незначительными и находились в пределах статистической ошибки (рис. 7). 

ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение динамики активности ФГ в зеленых листьях при изменении светового режима показало значительное увеличение активности фермента после помещения растений в темноту, что связано с перестройками в системе энергообеспечения клетки. В отсутствие света фотосинтез не функционирует, поэтому роль главного поставщика энергии берет на себя ЦТК. Со временем интенсивность работы цикла Кребса снижается и выходит на постоянный уровень, превышающий контрольный. Возможно, такое снижение активности ЦТК в темноте связано с постепенным истощением пула фотоассимилятов после прекращения функционирования фотосинтеза [9]. 

Поскольку геном ряда организмов содержит 2 гена ФГ (fum1 и fum2) [2], мы исследовали уровень их экспрессии. В зеленых листьях 14-дневных растений кукурузы транскрипции гена fum2 обнаружено не было, что свидетельствует о его выключении в фотосинтезирующих тканях растений, но в них присутствовало некоторое количество гена fum1. Из анализа литературных данных и наших результатов можно заключить, что в процессе развития растений кукурузы происходит дифференциальная экспрессия этих двух генов ФГ [8]. Это может быть обусловлено потребностями клетки, когда при автотрофном типе питания основные биосинтетические субстраты образуются при фотосинтезе, а экспрессия гена fum1 обеспечивает образование митохондриальной формы ФГ, необходимой для нормального функционирования ЦТК.

Световая регуляция ФГ осуществляется фитохромной системой. Анализ влияния светового режима на уровень транскрипции гена fum1 ФГ в листьях кукурузы показал, что под действием КС происходили изменения в работе генетического аппарата клетки, приводящие к уменьшению количества мРНК fum1. Противоположный эффект вызывало действие ДКС и последовательное действие КС и ДКС. Ранее на растениях арабидопсиса мы выявили сходный механизм участия фитохромной системы в фоторегуляции активности другого фермента – СДГ [9, 16].

Посредником в реализации внутриклеточной сигнализации фитохромного сигнала могут быть катионы кальция [13]. Полученные нами данные указывают на то, что в листьях кукурузы ионы Са2+ могут выступать в качестве вторичного мессенджера в трансдукции светового сигнала, при этом активная форма фитохрома, образующаяся при действии КС, вызывает накопление Са2+. Обратный эффект наблюдали в растениях после их облучения ДКС. 

Анализ перекрестного загрязнения ядерной фракции с помощью маркерных ферментов цитоплазмы – алкогольдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы – позволил установить, что степень загрязнения составила 6.4 и 6.1%, соответственно, что учитывалось при определении содержания Са в ядрах растений при разных условиях опыта.

При изменении светового режима и рутений красный (ингибитор), и ЭГТА (комплексон) вызывали изменения в содержании Са2+ в ядре, влияя на перераспределение катионов между компартментами клетки. Увеличение количества кальция в ядре, обусловленное его перемещением из цитоплазмы, приводило к снижению уровня транскрипции гена fum1 в зеленых листьях кукурузы в условиях различного освещения (рис. 5). При этом независимо от варианта освещения и ингибитор, и комплексон оказывали на экспрессию fum1 одинаковое действие, что свидетельствует о важной роли ионов кальция в трансдукции фитохромного сигнала в ядре растительной клетки. Следовательно, перераспределение внутриклеточного кальция, обусловленное состоянием фитохромной системы, можно рассматривать как механизм регуляции экспрессии генов красным светом. Ранее в листьях кукурузы был установлен сходный механизм фитохром-зависимой регуляции экспрессии для гена sdh1-2 СДГ [15].

Функция Ca2+ в регуляции транскрипции генов связана с его субклеточным перераспределением между цитоплазмой и ядром, приводящим к активации или подавлению активности Ca2+-зависимых белков (например, протеинкиназы и фосфатазы), регулирующих скорость присоединения транскрипционных факторов, обеспечивающих регуляцию экспрессии генов-мишеней [13, 16]. 

Ранее мы показали, что между содержанием свободного кальция в ядрах листьев кукурузы и уровнем экспрессии гена sdh2-3 СДГ существует тесная связь, что может указывать на возможный механизм регуляции скорости транскрипции этого гена [15]. Таким образом, экспрессия гена субъединицы В СДГ, вероятно, находится под контролем фитохромной системы, и один из механизмов внутриклеточной трансдукции светового сигнала в ядро клетки связан с участием кальция. Перераспределение внутриклеточного кальция фитохромной системой можно рассматривать как механизм тонкой регуляции скорости функционирования СДГ [16]. При этом такой механизм контроля может осуществляться прямо или опосредованно через кальмодулин и транскрипционные факторы [30].

Можно предположить, что транскрипционный фактор PIF3 является посредником при передаче фитохромного сигнала в ядре растительной клетки. Известно, что транскрипционный фактор PIF3 участвует в световой регуляции синтеза суъединицы А СДГ в листьях арабидопсиса [16]. В ходе нашего исследования выяснилось, что активная форма фитохрома (вариант “свет”) вызывала увеличение концентрации Са2+ в ядре и скорости транскрипции гена pif3 (рис. 4 и 6), что в свою очередь отрицательно коррелировало с экспрессией гена fum1 и выражалось в снижении данного показателя (рис. 3).

В настоящее время также известно, что PIF1 обладает наибольшим физическим сродством к фитохромам, поэтому было важно исследовать его роль в трансдукции фитохромного сигнала в зеленых клетках кукурузы. Кроме того, известно, что фитохром А играет доминирующую роль в регуляции деградации PIF1 на свету, в то время как фитохромы В и D, так же влияя на разрушение PIF1, проявляют свое действие в условиях более длительного периода освещения [30]. 

В отличие от PIF3 транскрипционный фактор PIF1 не взаимодействует непосредственно с фитохромами А и В, однако имеет важное значение в регуляции клеточного метаболизма в темноте. Следовательно, регуляция световых процессов в клетках растений может осуществляться путем удаления негативных регуляторов (например, PIF) путем светозависимого протеолиза [31].

Таким образом, результаты исследования показали, что активность фумаратгидратазы и скорость экспрессии гена fum1 находятся под контролем фитохромной системы. Активная форма фитохрома А проявляет опосредованное ингибирующее действие на транскрипцию гена fum1 путем вовлечения в этот процесс вторичного мессенджера – двухвалентных катионов кальция. В механизме трансдукции фитохромного сигнала в ядро принимают участие катионы Са2+ в качестве вторичного мессенджера и транскрипционный фактор PIF3, регулирующие активность фумаразы и экспрессию ее гена (fum1) в зеленых листьях кукурузы. Увеличение содержания катионов кальция в ядерной фракции в условиях освещения красным светом (660 нм) четко соотносится с изменением скорости транскрипции гена фактора PIF3. Возможно, концентрация Са2+ в ядре служит модулирующим фактором, обеспечивающим регуляцию экспрессии гена pif3.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант 14-14-00721) и Министерства образования и науки РФ в рамках государственного задания вузам в сфере научной деятельности на 2014–2016 гг. (проект № 959).

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Behal R.H., Oliver D.J. Biochemical and molecular characterization of fumarase from plants: purification and characterization of the enzyme – cloning, sequencing, and expression of the gene // Arch. Biochem. Biophys. 1997. V. 348. P. 65–74.

2.Pracharoenwattana I., Zhou W.X., Keech O., Francisco P.B., Udomchalothorn T., Tschoep H., Stitt M., Gibon Y., Smith S.M. Arabidopsis has a cytosolic fumarase required for the massive allocation of photosynthate into fumaric acid and for rapid plant growth on high nitrogen // Plant J. 2010. V. 62. P. 785–795.

3.Araujo W.L., Nunes-Nesi A., Fernie A.R. Fumarate: multiple functions of a simple metabolite // Phytochemistry. 2011. V. 72. P. 838–843.

4.Taylor A.A., Stewart G.R. Tissue and subcellular localization of enzymes of arginine metabolism in Pisum sativum // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981. V. 101. P. 1281–1289.

5.Slocum R.D. Genes, enzymes and regulation of arginine biosynthesis in plants // Plant Physiol. Biochem. 2005. V. 43. P. 729–745.

6.Kim S.H., Lee W.S. Participation of extracellular fumarase in the utilization of malate in cultured carrot cells // Plant Cell Rep. 2002. V. 20. P. 1087–1092.

7.Tolley E., Craig I. Presence of two forms of fumarase (fumarate hydratase, EC 4.2.1.2) in mammalian-cells – immunological characterization and genetic analysis in somatic cell hybrids – confirmation of assignment of a gene necessary for enzyme expression to human chromosome-1 // Biochem. Genet. 1975. V. 13. P. 867–883.

8.Yogev O., Naamati A., Pines O. Fumarase: a paradigm of dual targeting and dual localized functions // FEBS J. 2011. V. 278. P. 4230–4242.

9.Попов В.Н., Епринцев А.Т., Федорин Д.Н. Световая регуляция экспрессии сукцинатдегидрогеназы в листьях Arabidopsis thaliana // Физиология растений. 2007. Т. 54. С. 409–415.

10.Escobar M.A., Franklin K.A., Svensson A.S., Salter M.G., Whitelam G.C., Rasmusson A.G. Light regulation of the Arabidopsis respiratory chain. Multiple discrete photoreceptor responses contribute to induction of type II NAD(P)H dehydrogenase genes // Plant Physiol. 2004. V. 136. P. 2710–2721.

11.Popov V.N., Eprintsev A.T., Fedorin D.N., Igamberdiev A.U. Succinate dehydrogenase in Arabidopsis thaliana is regulated by light via phytochrome A // FEBS Lett. 2010. V. 584. P. 199–202.

12.Igamberdiev A.U., Eprintsev A.T., Fedorin D.N., Popov V.N. Phytochrome-mediated regulation of plant respiration and photorespiration // Plant Cell Environ. 2014. V. 37. P. 290–299.

13.Kreslavski V.D., Fomina I.R., Los D.A., Carpentier R., Kuznetsov Vl.V. Red and near infra-red signaling: hypothesis and perspectives // J. Photochem. Photobiol. C: Photochem. Rev. 2012. V. 13. P. 190–203.

14.Matthew A.E., Keara A.F., Svensson A.S., Salter M.G., Whitelam G.C., Rasmusson A.G. Light regulation of the Arabidopsis respiratory chain. multiple discrete photoreceptor responses contribute to induction of type II NAD(P)H dehydrogenase genes // Plant Physiol. 2004. V. 136. P. 2710–2721.

15.Епринцев А.Т., Селиванова Н.В., Федорин Д.Н., Башкин С.С., Селезнева Е.А., Дадакина И.В., Махмуд Али С. Роль катионов кальция в механизме фитохром-зависимой регуляции экспрессии гена sdh1-2 и активности сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы // Биол. мембраны. 2012. Т. 29. № 3. С. 165–168.

16.Eprintsev A.T., Fedorin D.N., Igamberdiev A.U. Ca2+ is involved in phytochrome A-dependent regulation of the succinate dehydrogenase gene sdh1-2 in Arabidopsis // J. Plant Physiol. 2013. V. 170. P. 1349–1352.

17.Moon J., Zhu L., Shen H., Huq E. PIF1 directly and indirectly regulates chlorophyll biosynthesis to optimize the greening process in Arabidopsis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. 9433–9438.

18.Toledo-Ortiz G., Huq E., Rodríguez-Concepción M. Direct regulation of phytoene synthase gene expression and carotenoid biosynthesis by phytochrome-interacting factors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. V. 107. P. 11 626–11 631.

19.Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265–275.

20.Lee H.C., Lin T.Y. Isolation of plant nuclei suitable for flow cytometry from recalcitrant tissue by use of a filtration column // Plant Mol. Biol. Rep. 2005. V. 23. P. 53–58.

21.Scarpa A. Spectrophotometric measurement of calcium by murexide // Methods Enzymol. 1972. V. 24. P. 343–351.

22.Pathuri I.P., Reitberger I.E., Hückelhoven R., Proels R.K. Alcohol dehydrogenase 1 of barley modulates susceptibility to the parasitic fungus Blumeria graminis f. sp. hordei // J. Exp. Bot. 2011. V. 10. P. 3449–3457.

23.Yang X., Liu B., Sang Y., Yuan Y., Pu J., Liu Y., Li Z., Feng J., Xie Y., Tang R., Yuan H., Liao F. Kinetic analysis of the lactate dehydrogenase-coupled reaction process and measurement of alanine transaminase by an integration strategy // Jpn. Soc. Anal. Chem. 2010. V. 26. P. 1193– 1198.

24.Trewavas A.J., Knight M. Mechanical signalling, calcium and plant form // Plant Mol. Biol. 1994. V. 26. P. 1329–1341.

25.Nicot N., Hausman J.F., Hoffmann L., Evers D. Housekeeping gene selection for real-time RT-PCR normalization in potato during biotic and abiotic stress // J. Exp. Bot. 2005. V. 56. P. 2907–2914.

26.Лакин Г.Ф. Биометрия. Москва: Высш. шк., 1990. 351 с.

27.Eprintsev A.T., Fedorin D.N., Starinina E.V., Igamberdiev A.U. Expression and properties of the mitochondrial and cytosolic forms of fumarase in germinating maize seeds // Physiol. Plant. 2014. V. 152. P. 231–241.

28.Любимов В.Ю., Креславский В.Д., Ширшикова Г.Н., Кособрюхов А.А. Регуляция прооксидантно-антиоксидантного потенциала при облучении листьев растений фитохром-активирующим светом // Науч. журн. Изв. КГТУ. 2014. № 34. С. 167–174.

29.Takagi S., Kong S.G., Mineyuki Y., Furuya M. Regulation of actin-dependent cytoplasmic motility by type II phytochrome occurs within seconds in Vallisneria gigantea epidermal cells // Plant Cell. 2003. V. 15. P. 331–345.

30.Castillon A., Shen H., Huq E. Phytochrome interacting factors: central players in phytochrome-mediated light signaling networks // Trends Plant Sci. 2007. V. 12. P. 514–521.

31.Shen H., Zhu L., Castillon A., Majee M., Downie B., Huq E. Light-induced phosphorylation and degradation of the negative regulator PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR1 from Arabidopsis depend upon its direct physical interactions with photoactivated phytochromes // Plant Cell. 2008. V. 20. P. 1586–1602.

ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

 

Рис. 1. Динамика активности фумаратгидратазы в листьях 14-дневных растений кукурузы при изменении светового режима. 

К – растения, экспонируемые на свету с интенсивностью 25 Дж/(м2 с); 0.5, 1, 2, 3, 6, 9 – время инкубации растений в темноте (ч).

 

Рис. 2. Уровень экспрессии генов фумаратгидратазы (fum1 и fum2) в зеленых листьях 14-дневных растений кукурузы. 

Значения экспрессии гена рассчитывали относительно уровня экспрессии гена фактора элонгации ef-1α методом 2–∆∆Сt.

 

Рис. 3. Относительный уровень транскрипции гена fum1 в листьях кукурузы при разных световых режимах. 

Свет – растения, освещенные белым светом; темнота – растения, выдержанные в темноте; КС – растения, освещенные светом с длиной волны 660 нм; КС+ДКС – растения, последовательно освещенные светом с длиной волны 660 и 730 нм.

 

Рис. 4. Зависимость содержания катионов кальция в ядре от воздействия света разной длины волны.

Свет – растения, освещенные белым светом; темнота – растения, выдержанные в темноте; КС – растения, освещенные светом с длиной волны 660 нм; КС+ДКС – растения, последовательно освещенные светом с длиной волны 660 и 730 нм.

 

Рис. 5. Экспрессия гена fum1 в присутствии рутения красного (серые столбцы) и ЭГТА (черные столбцы) в листьях кукурузы при разных световых режимах.

Свет – растения, освещенные белым светом; темнота – растения, выдержанные в темноте; КС – растения, освещенные светом с длиной волны 660 нм; КС+ДКС – растения, последовательно освещенные светом с длиной волны 660 и 730 нм.

 

Рис. 6. Относительный уровень транскрипции фактора pif3 в листьях кукурузы при разных световых режимах.

Свет – растения, освещенные белым светом; темнота – растения, выдержанные в темноте; КС – растения, освещенные светом с длиной волны 660 нм; КС+ДКС – растения, последовательно освещенные светом с длиной волны 660 и 730 нм.

 

Рис. 7. Относительный уровень транскрипции фактора pif1 в листьях кукурузы при разных световых режимах.

Свет – растения, освещенные белым светом; темнота – растения, выдержанные в темноте; КС – растения, освещенные светом с длиной волны 660 нм; КС+ДКС – растения, последовательно освещенные светом с длиной волны 660 и 730 нм.