УДК 581.1
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА кДНК, КОДИРУЮЩЕЙ ДИСУЛЬФИДИЗОМЕРАЗУ, ИЗ РАЗВИВАЮЩИХСЯ ЗЕРНОВОК ЯЧМЕНЯ
© 2008 г. Дж. Ю. Ким*, М. С. Ли*, С. З. Янг*, Ч. Ю. Хе**, К. Г. Парк**, Ч. С. Ким**, М. С. Канг**, С. Дж. Ким**, Дж. Г. Ким***, Д. Ю. Хьюн**, Ю. В. Зео*
* Отдел биотехнологии Колледжа естественных наук и биотехнологии Корейского университета, Республика Корея
** Министерство развития села, Республика Корея
*** Агрономический институт, Республика Корея
Поступила в редакцию 17.03.2007 г.
Для изучения молекулярных механизмов развития зерновок ячменя через 14 дней после оплодотворения (ДПО) проводили дифференциальную гибридизацию с использованием двух разных тканей: кДНК из зерновки как тестер (tester) и перикарпа как драйвер (driver). Секвенированы гены, которые в преобладающем количестве экспрессировались в зерновках, они разделены на 9 категорий по их предполагаемым функциям. Транскрипты белка дисульфидизомеразы из Hordeum vulgare L. (HvPDI), кодирующие этот белок кДНК, в большом количестве определялись в зерновках, но слабо экспрессировались в перикарпах, стеблях и листьях. Экспрессия гена HvPDI в зерновках через 5 ДПО была высокой, но постепенно снижалась к 20-му дню. Гибридизация in situ показала, что на поздней стадии развития зерна (14- и 20-й дни после оплодотворения) транскрипты HvPDI определялись преимущественно в крахмалистом эндосперме, локализуясь вблизи алейронового слоя. Обработка некоторыми растительными гормонами (АБК, ГК3, БАП, метилжасмоновой кислотой) стимулировала экспрессию гена HvPDI. Полученные данные способствуют пониманию молекулярных механизмов развития зерновки и накопления в них запасных белков.

Сокращения: ДГ – дифференциальная гибридизация; ДПО – дни после оплодотворения; ДСИ – дисульфидизомераза; МеЖК – метилжасмоновая кислота; ЭР – эндоплазматический ретикулум; SSC – Na-цитратный буфер, состоящий из 0.15 М NaCl, 0.015 M цитрата Na, pH 7.0.
Адрес для корреспонденции: Y. W. Seo. Division of Biotechnology, College of Life Sciences and Biotechnology, Korea Нiversity, Anam-Dong, Seongbuk-Gu, Seoul, 136-713, Republic of Korea. Fax: +82 2 3290 3501; e-mail: seoag@korea.ac.kr
Ключевые слова: Hordeum vulgare – дифференциальная экспрессия генов – развитие зерновок – дисульфидизомераза

ВВЕДЕНИЕ

Развивающиеся зерновки злаков состоят из нескольких первичных тканей, включая диплоидный зародыш, триплоидный эндосперм и материнский перикарп. Все эти ткани дифференцируются после двойного оплодотворения. На ранней стадии развития зерновки перикарп функционирует как временный запасающий орган, а эндосперм и зародыш – как слабые акцепторы запасных веществ. Во время развития зерна запасные вещества по проводящим тканям перикарпа переносятся к развивающимся зародышу и эндосперму.
В большинстве зерновых основная часть резерва эндосперма состоит из запасных белков, что характеризует эндосперм как эффективный акцептор ассимилятов. В ячмене мажорными запасными белками являются гордеины [1]. Гордеины делят на четыре группы (B, C, D и γ-гордеины); их гены в основном локализованы на коротком плече хромосомы 5 (1H) [2]. Биохимические свойства и аминокислотный состав разных групп гордеинов заметно различаются; эти различия отражаются в образовании и стабильности их полимеров и дисульфидных связей [1]. Гордеины синтезируются полисомами, прикрепленными к поверхности шероховатого эндоплазматического ретикулума (ЭР), и переносятся в полость ЭР, где на последних стадиях налива зерна они подвергаются сворачиванию (фолдингу) и сборке [3, 4].
Быстрое накопление запасных белков семени требует их эффективного фолдинга в ЭР. Такой фолдинг осуществляется при помощи ферментов фолдинга, таких как дисульфидизомераза (ДСИ) [5]. ДСИ может катализировать реакции тиол–дисульфидного обмена. Известно также, что в качестве субъединицы многих сложных ферментных систем она осуществляет многообразные функции. Например, ДСИ функционирует как β-субъединица пролил-4-гидроксилазы, которая катализирует гидроксилирование ряда секреторных белков [6], и как компонент триглицерид-транспортирующего белкового комплекса, участвующего в транспорте липидов в клетку [7]. Quan с соавт. [8] предположили, что ДСИ может действовать также как молекулярный шаперон при свертывании белков. В настоящее время охарактеризованы ДСИ из многих видов растений, включая ячмень [9], мягкую пшеницу [10], твердую пшеницу [11], кукурузу [12] и морковь [13]. Несмотря на то, что появились сообщения о двух последовательностях ДСИ ячменя и есть данные о локализации ДСИ в ячмене, молекулярная характеристика ДСИ ячменя осуществлена не полностью [9].
Развитие зерновки включает сложную серию физиологических и молекулярных процессов. В предыдущих работах с помощью супрессорной субтрактивной гибридизации и дифференциальной гибридизации (ДГ) мы изучали влияние стадии развития зерновки и тканевую специфичность генов характерных для зерновок: HvCaBP1, HvSec61α и HvIDs [14, 15]. В данной работе приведены данные о генах, преобладающих в зерновках на 14-й день после оплодотворения ячменя (сорт Karl). Данные получены с помощью ДГ с использованием кДНК из зерновок в качестве тестера, а из перикарпов – в качестве драйверов. Кроме того, статья включает данные о кодируемом кДНК ортологе растительной ДСИ, идентифицированном с использованием нозерн-анализа и in situ гибридизации. Полученные результаты могут быть полезными для понимания молекулярных механизмов развития зерновки ячменя. В совокупности с предыдущими данными они могут быть использованы при селекции высококачественного солодового ячменя.

МЕТОДИКА

Растительный материал. Ячмень (Hordeum vulgare L., сорт Karl, Clho 15487) был получен из National Small Grain Collection (Абердин, США) и подвергнут самоопылению для повышения числа зерен. Растения выращивали на опытном поле Корейского университета. На каждый колос помещали ярлык после появления колоса из обкладки листа (1 ДПО). Растительные образцы отбирали на 5-, 8-, 11-, 14-, 17- и 20-й ДПО, сразу замораживали в жидком азоте и хранили при –80ºС до использования. Кроме того, на 14-й ДПО собирали зерновки, перикарпы, листья и стебли.
Листья трехнедельных растений опрыскивали растворами, содержавшими 0.05% Твин-20 и по 100 мкМ АБК, ГК3, БАП и метилжасмоновой кислоты (МеЖК). Растения, обработанные МеЖК, покрывали прозрачным пластиковым мешком для сохранения газового состава. Необработанные растения также покрывали на 48 ч пластиковыми мешками. После обработок растения росли в вегетационной камере при 25/18ºС (день/ночь) и 16-часовом фотопериоде в течение 48 ч. Образцы отбирали через 3, 6, 12, 24 и 48 ч после обработок, замораживали в жидком азоте и хранили при –80ºС.
Дифференциальная гибридизация. На 14-й ДПО из зерновок растений экстрагировали суммарную РНК, используя Trizol ("Invitrogen"), и поли(A)+РНК, используя систему polyATRact мРНК ("Promega", США), согласно рекомендациям производителя. С помощью вектора Нi-ZAP XR ("Stratagene") создали библиотеку кДНК по методу Jang с соавт. [15].
Плазмидные ДНК экстрагировали из примерно 600 случайно выбранных колоний, применяя QIAprep Miniprep kit ("Qiagen"), денатурировали 0.4 M NaOH и 10 мM ЭДТА и кипятили 10 мин. Затем равные количества (400 нг) каждой плазмидной ДНК наносили на две нейлоновые мембраны (MSI) и проводили гибридизацию с помощью аппарата для дот-блот-анализа (96 лунок). После гибридизации мембраны промывали 2X SSC (SSC – Na-цитратный буфер, состоящий из 0.15 М NaCl, 0.015 M цитрата Na, pH 7.0) дважды по 2 мин, высушивали и фиксировали в ультрафиолетовом свете.
В этом опыте в качестве тестера и драйвера использовали кДНК зерновок и перикарпа соответственно. 20 мкг суммарной РНК каждого образца инкубировали в течение 10 мин при 70ºС и охлаждали на льду в течение 5 мин. Денатурированную РНК затем вносили в реакционную среду, содержавшую 10 мM Трис (pH 8.3), 50 мM KCl, 5 мM MgCl2, смесь дигоксигенина и трифосфатов нуклеотидов Dig-дНТФ (0.1 мM дATФ, 0.1 мM дЦТФ, 0.1 мM дГТФ, 0.065 мM дТТФ и 0.035 мM DIG-11-дУТФ), 1.6 мкг праймеров олиго(dT)15, 50 ед. ингибитора РНКазы и 50 ед. обратной транскриптазы AMV-RT ("Roche," Швейцария). Конечный объем среды составлял 20 мкл. В этой среде проводили первую стадию реакции синтеза кДНК: 10 мин при 25ºС, 60 мин при 42ºС и 5 мин при 95ºС. Содержание кДНК-зондов измеряли с помощью DIG-меченной контрольной ДНК ("Roche"), согласно инструкции производителя. Предварительную гибридизацию мембран проводили в течение 2 ч при 68ºС в растворе, содержавшем 5X SSC, 0.1% лаурилсаркозин натрия, 0.02% ДДС и 1% блокирующий реагент ("Roche"). Затем проводили гибридизацию с DIG-меченным зондом в свежем буфере такого же состава при 68ºС в течение 16 ч. Сигналы регистрировали с помощью Dig Luminescent Detection kit ("Roche") в соответствии с инструкцией производителя. Интересующие гены амплифицировали, используя cycle sequencing Ready Reaction Kit для BigDye@TM Terminator ("Applied Biosystems").
Клонирование и секвенирование кДНК. На 14-й ДПО из зерновок растений экстрагировали суммарную РНК, используя Тризол ("Invitrogen"),. Затем синтезировали кДНК с помощью cDNA Synthesis Kit ("Roche"). Для выделения полноразмерного гена ДСИ проводили гнездовой ПЦР, используя два типа ген-специфичных праймеров. В качестве первичных праймеров использовали HvPDISense1 (5´-CACCGCTCCCCCAGTTCCGC-3´) и HvPDIAntisense1 (5´-CTGGCGTTGGAATCTGCCTT-3´), в качестве вторичных праймеров − HvPDISense2 (5´-GCTCCCCCAGTTCCGCCATG-3´) и HvPDIAntisense2 (5´-CCTCTACCTGTCTGCTGCTA-3´).
Амплифицированные фрагменты клонировали с помощью pGEM easy vector ("Promega") и секвенировали, используя ABI PRISM 310 анализатор генов ("Perkin Elmer"). Гомологию аминокислотных последовательностей определяли с использованием программы BLASTХ [16]. Сравнение аминокислотных последовательностей ДСИ с последовательностями известных растительных ДСИ проводили с использованием программы CLUSTAL W [17].
Нозерн-блот-анализ. Суммарные РНК каждого образца (10 мкг) разделяли в 1% агарозном геле, содержавшем 2.2 М формальдегид, и затем переносили на положительно заряженную нейлоновую мембрану (MSI). кДНК стандартно метили с использованием биотин-дЦТФ и ПЦР. ПЦР проводили по Jang с соавт. [15]. Меченная биотином смесь дНТФ состояла из дАТФ, дТТФ и дГТФ (по 0.5 мМ каждого), 0.25 мМ дЦТФ и 0.25 мМ биотин-дЦТФ ("Invitrogen"). В качестве матрицы для ПЦР кДНК лигировали в pBluescript вектор, он амплифицирован с применением Т3 (прямой) и Т7 (обратный) универсальных праймеров.
Мембраны уравновешивали в 250 мМ Na-фосфатном буфере, предгибридизировали 1 ч при 65ºС в буфере для гибридизации, содержавшем 0.1 мМ ЭДТА, 7% ДДС, 250 мМ натрий-фосфатный буфер (рН 7.2) и 5% декстран сульфат. Гибридизацию проводили с применением меченного биотином зонда в свежем буфере для гибридизации в течение 16 ч при 65ºС. Мембраны дважды промывали 2X SSC и 1% ДДС 5 мин при комнатной температуре, затем дважды 0.1Х SSC и 1% SDS 15 мин при 65ºС и, наконец, еще два раза 1Х SSC 5 мин при комнатной температуре. Измерение сигнала проводили с помощью Southern-Light и Southern-stat систем согласно инструкции производителя ("Applied Biosystems"). Процесс гибридизации и измерения сигнала повторяли трижды.
In situ гибридизация. In situ гибридизацию проводили по Jang с соавт. [14]. Вкратце, образцы ткани фиксировали при комнатной температуре в 1Х PBS буфере (8 мM натрий-фосфат, 1.5 мM калий-дигидрофосфат, 135 мM NaCl и 3 мM KCl), содержащем 4% параформальдегид и 1 мл Тритона X-100 ("Roche") путем вакуумной инфильтрации в течение 1 ч и последующего встряхивания в течение 18 ч при комнатной температуре. Затем конструировали смысловые и антисмысловые РНК зонды с DIG-RNA labeling Kit ("Roche") по инструкции производителя. Образцы ткани гибридизировали с полученными РНК-зондами в течение 18 ч при 42ºС в буфере для гибридизации, содержавшем 50% формамид, 4X SSC, 150 мкг/мл тРНК и 0.5% блокирующий буфер ("Roche"). После гибридизации срезы дважды споласкивали при 42ºС 50% формамидом и 4X SSC и дважды промывали 4X SSC при 42ºС. Определение проводили с использованием Dig Luminescent Detection kit ("Roche") по инструкции производителя. Процедуры гибридизации и измерения сигнала повторяли дважды.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Выделение генов специфичных для зерновок ячменя через 14 ДПО

Чтобы выделить специфично экспрессирующиеся в зерновках гены, провели дифференциальную гибридизацию (ДГ), используя две разные ткани ячменя через 14 ДПО. Зерновки использовали как tester, а перикарп − как driver. Мы протестировали 600 клонов из библиотеки кДНК, созданной для зерновок ячменя (14 ДПО), и обнаружили, что 54 индивидуальных клона кДНК (№ доступа в Генбанке. DR421007−DR421060) активно экспрессировались в зерновке, но не в перикарпе. 54 специфичных для зерновок ячменя (14 ДПО) клона секвенировали и сравнили с NCBI банком данных, используя программу BLASTX (таблица). В результате обнаружили, что 41 клон обладали значительной гомологией с другими растительными белками. Эти клоны в дальнейшем разделили на 9 категорий по их предполагаемым функциям: структура хроматина (2.4%), защита (22.0%), экспрессия генов и метаболизм РНК (7.3%), первичный метаболизм (35.7%), синтез и процессинг белков (14.6%), проведение сигналов (2.4%), запасные белки семян (4.9%), транспортеры (4.9%) и клоны с неизвестной функцией (4.7%). Среди генов активно экспрессирующихся в зерновках один клон кодировал белок ДСИ, который связан с накоплением запасных белков в развивающейся зерновке.

Выделение кДНК клона дисульфидизомеразы, содержавшего полную открытую рамку считывания

Клоны, полученные методом дифференциальной гибридизации, были неполные: в них отсутствовала 5´ область, которая кодирует N-конец белка. Чтобы выделить полноразмерную кДНК ДСИ, мы модифицировали метод ПЦР, используя два типа ген-специфичных праймеров. Полученные клоны кДНК имели длину в 1573 п.н., включая открытую рамку считывания из 1524 п.н. Поэтому белок HvPDI должен состоять из 507 аминокислотных остатков и иметь мол. м. 58.8 кД и pI 5.04. Предсказанная аминокислотная последовательность содержит две копии доменов, идентичных активным сайтам ДСИ позвоночных, APWCGHCK [9]. Более того, белок содержал на N-конце сигнальную последовательность из 23 аминокислотных остатков [18] и на C-конце KDEL, сигнал удерживания в ЭР [19].

Сравнение предсказанной аминокислотной последовательности HvPDI
с последовательностями других растительных дисульфидизомераз

Присутствие в ДСИ активного сайта, N-терминального сигнального пептида и сигнала удерживания в ЭР предполагало, что белок относится к семейству ДСИ. Поиск в банке данных (http://ncbi.nlm.nih.gov) показал, что определенная в данной работе аминокислотная последовательность обладает гомологией с другими известными последовательностями растительных ДСИ. Сравнение аминокислотной последовательности HvPDI с другими ДСИ растений показано на рис. 1. Гомология между HvPDI и ДСИ других растений, включая ячмень, пшеницу, рис, кукурузу, арабидопсис и горчицу, была равна 98.4, 95.3, 83.7, 80.8, 58.4 и 57.1% соответственно. Филогенетическое родство с другими растительными ДСИ показало, что ген HvPDI подобен генам ДСИ других однодольных, таких как ячмень [9], пшеница [11, 20] и рис [21] (рис. 2).

Зависимая от стадии развития и тканеспецифичная экспрессия гена HvPDI

Чтобы изучить тканеспецифичность экспрессии HvPDI, использовали четыре разные ткани растения (14 ДПО): зерновка, перикарп, стебель и лист. Транскриптов гена HvPDI было много в зерновках, но мало в перикарпе, стеблях и листьях (рис. 3). Влияние стадии развития зерна на экспрессию HvPDI анализировали с использованием нозерн-метода на 5-, 8-, 11-, 14-, 17- и 20-й ДПО. Экспрессия гена HvPDI была высокой, начиная с 5 ДПО, а затем постепенно снижалась к 20 ДПО (рис. 4).

Пространственное распределение экспрессии гена HvPDI при развитии зерна

Чтобы изучить пространственное распределение экспрессии гена HvPDI в развивающихся зернах, провели in situ гибридизацию с использованием смыслового и антисмыслового зондов HvPDI из тканей зерна на 5-, 14- и 20-й ДПО (рис. 5). Ген HvPDI экспрессировался в проводящей ткани лодикулы на 5-й ДПО (pис. 5а). Необходимо отметить, что на поздних стадиях развития зерна (например, на 14- и 20-й ДПО) транскрипты гена HvPDI выявлялись, главным образом, в крахмалистом эндосперме вблизи алейронового слоя (рис. 5б, 5в). Однако этот феномен не наблюдали в случае использования смыслового зонда (рис. 5г, 5д).

Реакция на обработку растительными гормонами

Действие разных гормональных регуляторов роста – АБК, ГК3, БАП и МеЖК – на экспрессию гена HvPDI изучали на листьях трехнедельных растений. Обнаружили, что обработка растений всеми использованными гормональными препаратами стимулировала экспрессию гена HvPDI (рис. 6). Через 3 ч после обработки ГК3 содержание транскриптов повышалось, достигая максимального значения к 6 ч, и затем экспрессия продолжалась с такой же скоростью до 48 ч. В растениях, обработанных АБК, транскрипты гена HvPDI на 3- и 6-й ч образовывались так же, как при обработке ГК3, однако между 12 и 48 ч наблюдали некоторое снижение экспрессии. Обработка БАП не индуцировала экспрессию гена HvPDI до 12 ч, но затем экспрессия увеличивалась к 24 ч, несколько снижаясь к 48 ч. В результате обработки МеЖК содержание транскриптов гена HvPDI увеличивалось от 6 к 24 ч, снижаясь затем к 48 ч. Слабое повышение экспрессии гена HvPDI наблюдали также в растениях, подвергнутых контрольной (mock) обработке, которое было похоже на результаты, полученные через 48 ч после начала всех обработок. Это предполагает, что ген HvPDI может реагировать на слабый абиотический стресс, такой как накрывание пластиковым мешком.

ОБСУЖДЕНИЕ

Во время развития зерновок большинства злаков эндосперм функционирует как основное место отложения веществ; он служит резервуаром питательных веществ, включая запасные белки и полисахариды. Это предполагает, что многие гены, связанные с накоплением питательных веществ, должны экспрессироваться в зерновках. Сорт Karl, известный как низкобелковый сорт ячменя, оказался хорошим материалом для селекции улучшенного солодового ячменя [22, 23]. Изучение специфичных для зерновок генов в таком низкобелковом сорте ячменя может стать благодатной почвой в отношении молекулярной селекции превосходного солодового ячменя, так же как в понимании молекулярных механизмов, работающих во время развития зерна.
В предыдущей работе мы изолировали и охарактеризовали гены зерновок, специфичные для средней стадии развития зерна (14 ДПО по сравнению с 5 ДПО). В результате были выделены три гена, кодирующие гордеин, хордотионин и ингибитор α-амилазы [15]. В настоящей работе, используя метод ДГ (перикарп против зерновок на 14-й ДПО), мы изолировали гены, активные в зерновках. Sreenivasulu с соавт. [24] показали, что два гена преимущественно экспрессируются или в перикарпе, или в эмбриональном мешке зерновок, которые были собраны через 1−7 ДПО. Согласно нашим данным, два гена, α-хордотионина и ингибитора α-амилазы, связанные с защитными механизмами, дифференциально экспрессируются в зерновках, а также являются частью общего генного пула. Это предполагает, что защитные механизмы в зерновках необходимы для защиты растений от вредителей, по крайней мере, до средней стадии развития зерна.
Chen и Hayes [9] изолировали из трехдневной оплодотворенной завязи ячменя две кДНК, кодирующие ДСИ, и обнаружили пик экспрессии на 8-й ДПО. Подобным образом ген HvPDI был выделен из библиотеки кДНК, полученной из зерновок ячменя на 14-й ДПО.
Xu с соавт. [13] сообщили, что семейство растительных ДСИ состоит из четырех подсемейств. Кроме того, Houston с соавт. [21] показали, что семейство ДСИ состоит из 10 классов. Филогенетический анализ ДСИ-подобных генов Arabidopsis, риса и кукурузы показал, что семейство растительных ДСИ может включать, по крайней мере, восемь подсемейств [25]. Так как HvPDI содержит KDEL-сигнал удерживания в ЭР и два тиоредоксин-подобных активных домена, ген HvPDI классифицировали как принадлежащий к подсемейству 1. Есть данные о том, что самую высокую экспрессию растительных ДСИ подсемейства 1 наблюдали в распустившихся цветках, в то время как в листьях определяли только незначительный сигнал [13, 26]. Однако показано, что распределение экспрессии гена PDI1 по тканям и/или по стадиям развития в растениях топинамбура отличается от распределения экспрессии других растительных PDI генов подсемейства 1 [27]. В нашей работе транскрипт гена HvPDI в значительных количествах накапливался в тканях зерновки, но не в перикарпе, стеблях и листьях (рис. 3). Это согласуется с данными, полученными для типичных растительных PDI генов подсемейства 1 (рис. 2). Экспрессия гена HvPDI была максимальной на ранних стадиях развития зерна (5 ДПО) и по мере роста зерна постепенно снижалась, что совпадает с данными по другим растительным ортологам ДСИ.
Ранее было показано, что в пшенице и кукурузе пик в содержании мРНК ДСИ обнаруживался примерно на 14-й ДПО [12, 28]. Møgelsvang и Simpson [29] нашли, что содержание белка ДСИ слабо повышалось от 11-го к 29-му ДПО, а затем снижалось по мере созревания семян. В данном исследовании с помощью нозерн-анализа мы показали, что транскрипты HvPDI активно экспрессировались в зерновках, но слабо – в других тканях, включая перикарп, зрелые листья и стебли. Эти данные можно объяснить функциями ДСИ, которая может быть вовлечена в образование дисульфидных мостиков во время накопления в зерновках запасных белков семян. Постоянное присутствие гена HvPDI в крахмалистом эндосперме вблизи алейронового слоя на поздних стадиях развития зерна (17−20 ДПО) было подтверждено гибридизацией in situ. Однако требуются дальнейшие исследования, чтобы определить связь эффективного фолдинга и сборки запасных белков семян с пространственным распределением экспрессии гена HvPDI и с его изменением при развитии.
Экспрессия генов растений может активироваться или ингибироваться в ответ на воздействие различных гормональных регуляторов роста, например, АБК и цитокинина [30]. Известно, что АБК, которая регулирует многие процессы, включая созревание, приобретение устойчивости к высыханию, предотвращение преждевременного прорастания, является также первичным регулятором развития зерна. Исследования, оценивающие природу экспрессии HvPDI, обнаружили возможность индукции гена в процессе обработки АБК. Экспрессия гена HvPDI протекает интенсивно в зерновках на ранней фазе развития зерна, хотя есть тенденция к снижению его экспрессии при завершении созревания семян. Обработка цитокинином (БАП) также активирует экспрессию HvPDI. Этот стимулирующий эффект может быть связан с функциями цитокининов, которые индуцируют клеточные деления в процессе развития растения. Интересно, что ген HvPDI нечувствителен к обработке ГК3; это согласуется с известным фактом, что ГК3 является антагонистом АБК и выводит семена из состояния покоя. Однако в предыдущем сообщении было замечено, что экспрессия гена HvPDI при развитии зерна стимулируется обработкой и АБК, и ГК3 [15]. Эти данные позволяют предполагать, что ген HvPDI может регулироваться различными путями, в том числе включающими ГК3 (например, в зрелых листьях).
МеЖК связан с защитными реакциями против механического повреждения или атак насекомых. Например, ингибитор протеиназы, индуцируемый жасмоновой кислотой, в томатах и картофеле накапливался в результате индуцируемых насекомыми и физических повреждений [31]. Обработка МеЖК явно индуцирует ген HvPDI, хотя слабое повышение его экспрессии наблюдается также в результате mock-обработки. Активация экспрессии может быть связана с другой функцией ДСИ, а именно, при фолдинге белка ДСИ функционирует как шаперон [8]. Если так, то это показывает, что ген HvPDI может участвовать в фолдинге и сборке белков, ненормальное образование которых тндуцируется стрессом.
Изучение генов, активных в зерновках, было проведено нами с целью выяснения молекулярных механизмов, работающих во время развития зерна в солодовом ячмене. В сообщении приведены специфические характеристики гена HvPDI, который индуцируется в развивающихся зернах и активируется рядом растительных гормонов. В частности, регуляция транскрипта гена HvPDI может представлять потенциально полезный инструмент молекулярной селекции, направленной на улучшение качества солодового ячменя. Однако требуется более специфичное и тонкое функциональное изучение свойств гена HvPDI для выявления роли HvPDI в фолдинге запасных белков семян при развитии зерен ячменя.
Работа поддержана Муниципальным кооперативным сельскохозяйственным исследовательским проектом (№ 20070501080006) Республики Корея, грантом программы Биогрин 21 (№ 20070301034016007) Администрации развития села республики Корея, а также Биоэнергетической программой (грант № 20070201036023).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Shewry P.R. Barley Seed Protein // Barley: Chemistry and Technology / Eds Alexander W.M., Rattan, S.B. Minnesota: American Association of Cereal Chemists, 1993. P. 131-197.
2. Abbo S., DНford R.P., Miller T.E., Reader S.M., King I.P. Primer-Mediated In Situ Detection of the B-Hordein Gene Cluster on Barley Chromosome 1H // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 11 821-11 824.
3. Bewley J.D., Black M. Seed Development and Maturation // Seeds: Physiology of Development and Germination / Eds Bewley J.D., Pleum M.B. New York, London, 1994. P. 68-82.
4. Müntz K. Deposition of Storage Proteins // Plant Mol. Biol. 1998. V. 38. P. 77-99.
5. Novia R., Lennarz W.J. Protein Disulfide Isomerase. A Multifunctional Protein Resident in the Lumen of the Endoplasmic Reticulum // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 3553-3556.
6. Pihlajaniemi T., Helaakoski T., Tasanen K., Myllyla R., Huhtala M.L., Koivu J., Kivirikko K.I. Molecular-Cloning of the Beta-Subunit of Human Prolyl 4-Hydrozylase: This Subunit and Protein Disulfide Isomerase Are Products of the Same Gene // EMBO J. 1987. V. 6. P. 643-649.
7. Wetterau J.R., Combs K.A., Spinner S.N., Joiner B.J. Protein Disulfide Isomerase Is a Component of the Microsomal Triglyceride Transfer Protein Complex // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 9800-9807.
8. Quan H., Fan G., Wang C.C. Independence of the Chaperone Activity of Protein Disulfide Isomerase from Its Thioredoxin-Like Active Site // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 17 078-17 080.
9. Chen F., Hayes P.M. Nucleotide Sequence and Developmental Expression of Duplicated Genes Encoding Protein Disulfide Isomerase in Barley (Hordeum vulgare L.) // Plant Physiol. 1994. V. 106. P. 1705-1706.
10. Shimoni Y., Zhu X.Z., Levanony H., Segal G., Galili G. Purification, Characterization, and Intracellular-Location of Glycosylated Protein Disulfide-Isomerase from Wheat Grains // Plant Physiol. 1995. V. 108. P. 327-335.
11. Ciaffi M., Paolacci A.R., Dominici L., Tanzarella O.A., Porceddu E. Molecular Characterization of Gene Sequences Coding for Protein Disulfide Isomerase (PDI) in Durum Wheat (Triticum turgidum ЗБС. durum) // Gene. 2001. V. 265. P. 147-156.
12. Li C.P., Larkins B.A. Expression of Protein Disulfide Isomerase Is Elevated in the Endosperm of the Maize floury-2 Mutant // Plant Mol. Biol. 1996. V. 30. P. 873-882.
13. Xu Z.J., Ueda K., Masuda K., Ono M., Inoue M. Molecular Characterization of a Novel Protein Disulfide Isomerase in Carrot // Gene. 2002. V. 284. P. 225-231.
14. Jang C.S., Kim D.S., Bu S.Y., Kim J.B., Lee S.S., Kim J.Y., Johnson J.W., Seo Y.W. Isolation and Characterization of Lipid Transfer Protein (LTP) Genes from a Wheat-Rye Translocation Line // Plant Cell Rep. 2002. V. 20. P. 961-966.
15. Jang C.S., Lee M.S., Kim J.Y., Kim D.S., Seo Y.W. Molecular Characterization of a cDNA Encoding Putative Calcium Binding Protein, HvCaBP1, Induced during Kernel Development in Barley (Hordeum vulgare L.) // Plant Cell Rep. 2003. V. 22. P. 64-70.
16. Altschul S.F., Madden T.L., Schäffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 3389-3402.
17. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 4673-4680.
18. Von Heijne G. A New Method for Predicting Signal Sequence Cleavage Sites // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P. 4683-4690.
19. Denecke J., Rycke R.D., Botterman J. Plant and Mammalian Sorting Signals for Protein Retention in the Endoplasmic Reticulum Contain a Conserved Epitope // EMBO J. 1992. V. 11. P. 2345-2355.
20. Ciaffi M., Paolacci A.R., D’Aloisio E, Tanzarella O.A., Porceddu E. Cloning and Characterization of Wheat PDI (Protein Disulfide Isomerase) Homeologous Genes and Promoter Sequences // Gene. 2006. V. 366. P. 209-218.
21. Houston N.L., Fan C., Xiang Q.Y., Schulze J.M., JНg R., Boston R.S. Phylogenic Analyses Identify 10 Classes of the Protein Disulfide Isomerase Family in Plants, Including Single-Domain Protein Disulfide Isomerase-Related Proteins // Plant Physiol. 2005. V. 137. P. 762-778.
22. Dailey J.E., Peterson D.M., Osborn T.C. Hordein Gene Expression in a Low Protein Barley Cultivar // Plant Physiol. 1998. V. 188. P. 450-453.
23. Goblirsch C.A., Horsley R.D., Schwarz P.B. A Strategy to Breed Low-Protein Barley with Acceptable Kernel Color and Diastatic Power // Crop Sci. 1996. V. 36. P. 41-44.
24. Sreenivasulu N., Altschmied L., Panitz R., Hähnel U., Michalek W., Weschke W., Wobus U. Identification of Genes Specifically Expressed in Maternal and Filial Tissues of Barley Caryopses: A cDNA Array Analysis // Mol. Genet. Genomics. 2002. V. 266. P. 758-767.
25. Ciaffi M., Tanzarella O.A., Porceddu E. The Wheat Protein Disulfide Isomerase (PDI) Genes // Frontiers of Wheat Bioscience / Ed. TsНewaki K. Yokohama: Wheat Inform. Serv., 2005. P. 61-64.
26. Shorrosh B.S., Dixon R.A. Molecular Cloning of a Putative Plant Endomembrane Protein Resembling Vertebrate Protein Disulfide-Isomerase and a Phosphatidylinositol-Specific Phospholipase C // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 10 941-10 945.
27. Huang D.-J., Chen H.-J., Lin Y.-H. Isolation and Expression of Protein Disulfide Isomerase cDNA from Sweet Potato (Ipomoea batatas [L.] Lam ‘Yainong 57’) Storage Roots // Plant Sci. 2005. V. 169. P. 776-784.
28. Grimwade B., Tatham A.S., Freedman R.B., Shewry P.R., Napier J.A. Comparison of the Expression Patterns of Genes Encoding for Wheat Gluten Proteins and Proteins Involved in the Secretory Pathway in Developing Caryopses of Wheat // Plant Mol. Biol. 1996. V. 30. P. 1067-1073.
29. Møgelsvang S., Simpson D.J. Change in the Levels of Seven Proteins Involved in Polypeptide Folding and Transport during Endosperm Development of Two Barley Genotypes Differing in Storage Protein Localization // Plant Mol. Biol. 1988. V. 36. P. 541-552.
30. Kende H., Zeevaart J.A.D. The Five “Classical” Plant Hormones // Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1197-1210.
31. Farmer E.E., Ryan C.A. Interplant Communication − Airborne Methyl Jasmonate Induces Synthesis of Proteinase-Inhibitors in Plant Leaves // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 7713-7716.
Дифференциально экспрессирующиеся гены зерновок ячменя на 14-й день после оплодотворения
Клоны
Гены
Функции
Виды
Значения E*
BA30
OSJNBa0064H22.15
Н
O. sativa
4e-17
BA34
транспортер гексоз
Т
Z. mays
2e-50
BA39
гордоиндолин-b
ЗБС
H. vulgare
3e-42
BA46
BTI-СМe1
З
H. vulgare
5e-72
BA49
цитозольная глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа GAPC3
ПМ
T. monococcum
5e-55
BA57
малая субъединица АДФГ-пирофосфорилазы
ПМ
H. vulgare
2e-71
BA64
цитоплазматическая малатдегидрогеназа
ПМ
T. aestivum
9e-63
BA65
40S рибосомальный белок
СПБ
A. thaliana
1e-46
BA67
цитоплазматический S15a-подобный рибосомальный белок
СПБ
A. thaliana
4e-58
BA72
α-гордотионин
З
H. vulgare
1e-74
BC01
протеиндисульфидизомераза
СПБ
H. vulgare
6e-74
BC03
предшественник ингибитора α-амилаза/субтилизина
З
H. vulgare
3e-41
BC04
предшественник СМd цепи ингибитора α-амилазы, тетрамер
З
H. vulgare
3e-41
BC15
белок BTI-СМe3.1
З
H. vulgare
1e-82
BC12
глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа GAPC3
ПМ
T. monococcum
3e-56
BC19
сплайсинг-фактор RSZp22
ЭГМР
A. thaliana
8e-09
BC20
H0423H10.3
Н
O. sativa
5e-44
BC25
глютатион-зависимая формальдегиддегидрогеназа
З
Z. mays
9e-56
BC28
D-гордеин
ЗБС
H. vulgare
6e-23
BC33
цитозольная глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
ПМ
T. monococcum
3e-52
BC41
сахарозосинтаза
ПМ
H. vulgare
2e-44
BD18
предшественник α-гордотионина
З
H. vulgare
3e-70
BD28
СМe предшественник трипсинового ингибитора
З
H. vulgare
1e-53
BE06
белок 5a2
ПМ
T. aestivum
6e-18
BE18
глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
ПМ
H. vulgare
2e-35
BE30
фактор транскрипции EREBP1
ЭГМР
O. sativa
2e-27
BE33
β-фосфатаза фосфатидной кислоты
ПС
O. sativa
3e-67
BE48
цитоплазматическая малатдегидрогеназа
ПМ
Z. mays
2e-65
BE53
энолаза
ПМ
O. sativa
7e-53
BE61
β-субъединица пирофосфат-зависимой фосфофруктокиназы
ПМ
O. sativa
2e-32
BE63
белок теплового шока
СПБ
S. cereale
2e-37
BE66
изоформа 2 α-субъединицы Sec 61
Т
O. sativa
9e-42
BH02
РНК-связывающий, обогащенный глицином белок
ЭГМР
H. vulgare
1e-17
BH49
60S рибосомальный белок L3
СПБ
T. aestivum
8e-30
BH55
компонент тетрамерного ингибитора α-амилазы
З
H. vulgare
5e-54
BH71
низкомолекулярный белок теплового шока
СПБ
O. sativa
8e-26
BG25
гидроксилаза ЖК
ПМ
O. sativa
3e-17
BG36
α-субъединица пирофосфат-зависимой фосфофруктокиназы
ПМ
O. sativa
4e-24
BG45
предшественник редуктоизомеразы кетокислот
ПМ
O. sativa
3e-30
BG48
белок ядрышка
СХ
O. sativa
8e-27
BG60
BSL2 гомолог серин/треонин-протеинфосфатазы
ПМ
O. sativa
2e-67

Примечание. СХ − структура хроматина; З − защита; ЭГМР − экспрессия генов и метаболизм РНК; ПМ − первичный метаболизм; СПБ − синтез и процессинг белков; ПС − передача сигналов; ЗБС − запасные белки семян; Т − транспортеры; Н − функции неизвестны.
* E отражает сходство, ожидаемое на основании программы BLASTX.

ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

Рис. 1. Сравнение аминокислотных последовательностей с ДСИ из разных источников.
Определенную в работе аминокислотную последовательность сравнивали с последовательностями ДСИ из ячменя (P80284), пшеницы (AAK49424), риса (AAX85991), кукурузы (AAX09961), арабидопсиса (NP_173594) и горчицы (ABB17025). Цифры справа от каждой линии означают число аминокислотных последовательностей в линии. Тиоредоксин-активный сайт и ЭР-специфичный мотив отмечены, соответственно, звездочками и подчеркиванием. Черным выделены одинаковые аминокислоты на всем протяжении аминокислотной цепи; серым – консервативные аминокислотные остатки, присутствующие, по крайней мере, в пяти из семи последовательностей; пунктиром – пробелы в аминокислотных последовательностях.

Рис. 2. Фенограмма связей между HvPDI и другими растительными ДСИ.
Анализ проведен с использованием ClustalW-метода для сравнения последовательностей. Номера доступа аминокислотных последовательностей получены из NCBI. Масштабная линейка – 0.1 ед.

Рис. 3. Нозерн-блот-гибридизация генов HvPDI из разных тканей.
На 14-й день после оплодотворения ячменя (сорт Karl) выделены образцы четырех тканей: З – зерновки; П – перикарп; С – стебли; Л – листья.

Рис. 4. Нозерн-блот-гибридизация гена HvPDI из зерен ячменя на разных стадиях развития.
Зерновки отбирали на 5-, 8-, 11-, 14-, 17- или 20-й ДПО.

Рис. 5. In situ гибридизация гена HvPDI во время развития зерна ячменя.
Поперечные срезы зерен на 5-й ДПО (a, г), на 14-й ДПО (б, д) и на 17-й ДПО (в, е). a–в – гибридизация с антисмысловым РНК зондом гена HvPD; г–е – гибридизация со смысловым РНК зондом гена HvPD. Л – лодикула; ФЛ – филамент лодикулы; КЭ – крахмалистый эндосперм; АС – алейроновый слой.

Рис. 6. Нозерн-блот-гибридизация гена HvPDI из трехнедельных листьев ячменя, обработанных 100 мкМ растворами АБК, ГК3, БАП или МеЖК.
Образцы обработанных листьев собирали через 3, 6, 12 или 24 ч после обработки. К – необработанные образцы, М – mock-обработка (48 ч).