УДК 581.1:577.214

РОЛЬ ЭНДОГЕННОЙ АБК В ИНДУЦИРУЕМОЙ ХОЛОДОМ ЭКСПРЕССИИ TADHN ГЕНА ДЕГИДРИНА В ПРОРОСТКАХ ПШЕНИЦЫ

© 2009 г. Ф. М. Шакирова, Ч. Р. Аллагулова, М. В. Безрукова, А. М. Авальбаев, Ф. Р. Гималов

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа

Поступила в редакцию 18.04.2008 г.

Исследовали влияние флуридона, эффективного ингибитора синтеза АБК, на уровень экспрессии TADHN гена дегидрина в 4-дневных проростках пшеницы (Triticum aestivum L.), подвергнутых воздействию низкой температуры (6оС). Выявлено, что полное ингибирование быстрого индуцируемого холодом временного новообразования АБК в проростках приводит к существенному снижению, но не предотвращению вызванного низкотемпературным стрессом усиления транскрипционной активности гена дегидрина. Эти результаты свидетельствуют в пользу важной роли эндогенной АБК в индукции экспрессии TADHN гена дегидрина в проростках пшеницы в условиях низкой температуры. Следовательно, экспрессия гена TADHN дегидрина пшеницы при гипотермии находится под контролем и эндогенной АБК, и холода.

 

Ключевые слова: Triticum aestivum – дегидрин – TADHN ген – экспрессия – АБК – низкотемпературный стресс.

Адрес для корреспонденции: Шакирова Фарида Миннихановна. 450054 Уфа, пр. Октября, 71. Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН. Факс: 007 (347) 235-61-00, электронная почта: shakirova@anrb.ru

ВВЕДЕНИЕ

Экстремальные температуры относятся к числу наиболее часто встречающихся в природе стрессовых факторов, вызывающих нарушение водного режима, ограничивающих рост и продуктивность растений. В процессе эволюции у растений выработался и закрепился целый комплекс защитных механизмов в ответ на эти стрессы, включающих экспрессию генов многих защитных белков. Особого внимания в связи с формированием устойчивости растений к обезвоживанию заслуживают дегидрины  водорастворимые белки, объединенные в II группу или D 11 семейство большого класса LEA (Late Embryogenesis Abundant) белков, присущих всем таксономическим группам царства растений [15]. Действительно, значительное накопление дегидринов наблюдают в зародышах семян в период их обезвоживания; однако резкое усиление экспрессии генов дегидринов и накопление их белковых продуктов регистрируют в тканях вегетирующих растений, подвергнутых обезвоживанию [3, 6]. Индукция экспрессии генов дегидринов и накопление их белковых продуктов происходит в растениях и в нормальных условиях при обработке АБК [2, 6, 7]. К числу универсальных реакций растений в ответ на стрессовые условия, особенно вызывающих изменение водного режима, можно отнести увеличение концентрации АБК, и это служит эффективным сигналом для запуска (усиления) экспрессии многих генов защитных белков [8]. В пшенице обнаружено немало белков дегидринов, участвующих в формировании устойчивости растений к низкотемпературному стрессу, к которым, в частности, относятся дегидрины семейства WCOR (Wheat Cold Responsive) [2]. Чувствительным к холоду является и TADHN ген пшеницы, кодирующий дегидриноподобный белок [9]. Проведенный ранее анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена дегидрина TADHN размером 390 п.н. и дегидринов злаков выявил более, чем 90% гомологию его с геном dhn8 дегидрина ячменя и последовательностями мРНК Wcor410, Wcor410b, Wcor410с дегидринов пшеницы [10]. Причем, ген dhn8 ячменя, гены семейства wcor и TADHN ген пшеницы характеризуются высокой чувствительностью не только к холоду, но и к АБК [2, 9, 11]. Более того, выявлено, что индуцируемой гипотермией экспрессии TADHN гена дегидрина пшеницы предшествует быстрое временное накопление АБК в растениях, что предполагает важную роль эндогенной АБК в активации транскрипции данного гена в этих условиях [9]. Вместе с тем, в литературе имеются сведения о независимой от АБК экспрессии генов некоторых дегидринов в ответ на гипотермию или ее незначительной роли в этом процессе [5]. В связи с этим встает вопрос о значении эндогенной АБК в индукции экспрессии TADHN гена в растениях пшеницы при холодовом стрессе. Цель настоящей работы заключалась в исследовании уровня транскрипционной активности TADHN гена дегидрина в проростках пшеницы, подвергнутых воздействию низкой положительной температуры в условиях ингибирования синтеза АБК.

МЕТОДИКА

Работу проводили на 4-дневных проростках пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Жница. Семена после стерилизации 96% этанолом проращивали на светоплощадке в течение 3 дней в кюветах на фильтровальной бумаге, смоченной водопроводной водой, при 2123оС, 16-часовом световом дне и освещенности 15 клк. После отделения эндосперма 3-дневные проростки корнями помещали в стаканы с раствором 2% сахарозы в смеси с 5 мг/л флуридона на сутки. Затем 4-дневные проростки переносили на свежую смесь 2% сахарозы и 5 мг/л флуридона; часть проростков помещали в термостатированную камеру на 6оС, а другие оставляли при комнатной температуре. В ходе опыта проростки фиксировали в жидком азоте по 15 шт. в каждой навеске для экстракции АБК и выделения РНК. Контролем служили проростки, инкубированные на растворе 2% сахарозы при комнатной температуре. Концентрацию АБК определяли методом иммуноферментного анализа с использованием специфичных к АБК кроличьих антител и антикроличьих антител, меченных пероксидазой. Процедура экстракции и иммуноанализа АБК были описаны ранее [9]. Опыты повторяли трижды. На рисунке приведены средние арифметические из трех независимых опытов, каждый из которых проведен в трех биологических повторностях, и их стандартные ошибки. Тотальную РНК выделяли с использованием гуанидинтиоцианатного буфера, рН 8.0. Уровень экспрессии гена TADHN оценивали методом ОТ-ПЦР. кДНК получали реакцией обратной транскрипции в 30 мкл реакционной смеси, содержавшей 1 мкг растительной РНК, 0.5 мкг праймера oligo(dT)1218, 40 ед. активности обратной транскриптазы М-MuLV ("MBI Fermentas", США), 250 мМ TрисHCl, рН 8.3, 250 мM KCl, 20 мM MgCl2, 50 мM ДTT, по 10 мM каждого дНTФ и 20 ед. РНКзина. Смесь инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Затем проводили амплификацию с использованием Taq-полимеразы и праймеров, гомологичных к консервативным участкам TADHN гена дегидрина пшеницы [10]. Полученные амплификаты фракционировали в 1.2% агарозном геле и после их окрашивания бромистым этидием проводили оценку содержания кДНК в отдельных полосках геля на Gel Camera System ("UVP", США). Опыты проводили в 6 повторностях.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В предыдущих исследованиях было выявлено, что обработка проростков пшеницы АБК вызывала в них обратимое увеличение транскрипционной активности TADHN гена дегидрина; причем скорость этого процесса возрастала с увеличением концентрации гормона [9, 10]. Нами было обнаружено, что в ходе экспозиции проростков пшеницы при 6оС сначала наблюдали быстрое временное повышение содержания АБК, а затем постепенное усиление экспрессии гена TADHN, так что к 9 ч транскрипционная активность гена дегидрина в опытных растениях была втрое выше по сравнению с контрольными [9]. Эти результаты позволили высказать предположение о важной роли индуцируемого холодом накопления эндогенной АБК в активации транскрипции исследуемого гена дегидрина в условиях гипотермии. Для проверки этого предположения были проведены опыты с использованием эффективного ингибитора синтеза АБК флуридона с целью предотвращения вызываемого низкотемпературным воздействием накопления АБК. Первоначально необходимо было выбрать действующую концентрацию флуридона для ингибирования индуцируемого холодом накопления АБК в растениях пшеницы. Использование флуридона в концентрации 1 мг/л не позволило полностью предотвратить вызываемое гипотермией повышение содержания АБК; ингибитор в концентрациях 5 и 10 мг/л был одинаково эффективным, однако предобработка проростков 10 мг/л флуридоном приводила к существенному торможению роста растений. Поэтому в дальнейших опытах использовали ингибитор синтеза АБК в концентрации 5 мг/л. Из данных, приведенных на рис. 1, видно, что экспонирование проростков при температуре 6оС уже через 1 ч привело к двукратному повышению концентрации АБК, после чего наблюдали постепенное уменьшение содержания гормона, так что через 6 ч опытные и контрольные растения мало различались по уровню АБК. В предобработанных же флуридоном и подвергнутых гипотермии проростках пшеницы накопления АБК не происходило (рис. 1). Представленные результаты демонстрируют полное предотвращение вызываемого холодовым стрессом новообразования АБК в растениях. Далее был проведен сравнительный анализ экспрессии гена TADHN дегидрина пшеницы в предобработанных и необработанных флуридоном растениях при воздействии низкой положительной температуры. Из рис. 2 видно, что выдерживание проростков при температуре 6оС приводило к постепенному усилению экспрессии гена дегидрина, так что через 6 ч опыта этот показатель превышал контрольное значение более чем в два раза. Предобработка проростков флуридоном существенно тормозила вызываемую гипотермией активацию транскрипции TADHN гена (рис. 2). Полученные результаты свидетельствуют в пользу важной роли индуцируемого холодом повышения уровня эндогенной АБК в экспрессии TADHN гена, особенно сильно проявляющейся в начальный период стресса. Заметное повышение уровня экспрессии гена дегидрина обнаруживали в обработанных флуридоном проростках лишь через 6 ч воздействия низкой температуры. Следовательно, использование в работе эффективного ингибитора синтеза АБК позволило выявить вклад вызываемого гипотермией накопления АБК в регуляцию индуцируемой холодом экспрессии TADHN гена дегидрина в растениях пшеницы.

ОБСУЖДЕНИЕ

Чувствительность генов дегидринов к АБК определяется наличием в их промоторах ABRE (ABA-responsive)-цис-элементов, включающих консервативную ACGT последовательность, с которыми взаимодействуют активируемые АБК факторы транскрипции семейства bZIP (basic leucine zipper) AREB/ABFs (ABA-responsive element-binding/ABA-binding factors) [5, 14]. В промоторных областях генов дегидринов выявлены также и другие цис-регуляторные элементы, например, содержащие коровый мотив CCGAC, CRT (C-repeat)- или DRE (dehydration-responsive)-элементы, определяющие их чувствительность к засухе, сильному засолению и холоду, которые транс-активируются факторами CBFs/DREB [12, 13, 15, 16]. Так, например, в разных видах пшеницы идентифицировано до 25 различных CBF генов, конститутивный и индуцируемый в условиях холодового стресса, уровень экспрессии которых может определять способность озимых сортов к формированию устойчивости к низким температурам [17]. Таким образом, различные взаимодействующие друг с другом комбинации цис-регуляторных элементов в промоторах генов дегидринов и разнообразие транс-активирующих факторов обусловливает их чувствительность к разным стрессовым факторам, а также к АБК [3, 4, 12, 14, 18]. В течение последних десяти лет в литературе активно дискутируется роль АБК в регуляции экспрессии генов белков, чувствительных к холодовому стрессу [5, 12–14, 18]. С одной стороны, считается, что, несмотря на обратимый подъем уровня эндогенной АБК в растениях при воздействии низкой температуры, он недостаточен для активации CRT/DRE цис-элементов чувствительных к холоду генов, и, следовательно, экспрессия индуцируемых холодом генов CBF/DREB факторов запускается в условиях низкой температуры независимым от АБК путем [14, 18]. С другой стороны, получены результаты, указывающие на усиление экспрессии генов чувствительных к холоду CBF транс-факторов и повышение уровня CBF белков в нормальных условиях под влиянием АБК, которые могут активировать CRT/DRE элементы промоторов генов белков, участвующих в ответе растений арабидопсиса на низкую положительную температуру [13]. Правда, нужно отметить, что в ответ на воздействие гипотермии уровень генной экспрессии CBFs и накопления CBF-факторов значительно превышал таковой при обработке АБК в нормальных условиях. Однако приведенные данные демонстрируют способность АБК участвовать в регуляции экспрессии генов белков, вовлеченных в формирование устойчивости растений к низкой температуре. Недавно получены сведения об активации промотора чувствительного к холоду гена XERO2 дегидрина арабидопсиса в нормальных условиях под влиянием обработки АБК [12]. Более того, манипуляции с ABRE- и CRT/DRE-цис-регуляторными элементами промотора XERO2 гена указывают на кооперативную регуляцию АБК и холодом транскрипции гена этого дегидрина [12]. Обсуждая полученные нами результаты (рис. 1 и 2), следует отметить, что в первые часы действия охлаждения на проростки пшеницы заметная роль в индукции экспрессии гена TADHN принадлежит эндогенной АБК, поскольку в условиях подавления индуцируемого холодом синтеза АБК флуридоном транскрипционная активность TADHN гена дегидрина существенно тормозится. Однако данные о значительном возрастании уровня экспрессии гена дегидрина пшеницы в обработанных флуридоном растениях в последующий период воздействия гипотермии демонстрируют факт существования независимой от эндогенной АБК регуляции этого процесса. Таким образом, можно заключить, что транскрипционная активность TADHN гена дегидрина в проростках пшеницы, подвергнутых холодовому стрессу, находится под контролем как индуцируемого холодом накопления АБК, так и низкой положительной температуры. Работа частично поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (№ 08-04-01563а) и Президента Российской Федерации (МК–4081.2008.4, НШ–915.2008.4 и НШ–649.2008.4).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Close T.J. Dehydrins: A Commonalty in the Response of Plants to Dehydration and Low Temperature // Physiol. Plant. 1997. V. 100. P. 291-296.

2. Danyluk J., Perron A., Houde M., Limin A., Fowler B., Benhamou N., Sarhan F. Accumulation of an Acidic Dehydrin in the Vicinity of the Plasma Membrane during Cold Acclimation of Wheat // Plant Cell. 1998. V. 10. P. 623-638.

3. Аллагулова Ч.Р., Гималов Ф.Р., Шакирова Ф.М., Вахитов В.А. Дегидрины растений: их структура и предполагаемые функции // Биохимия. 2003. Т. 68. С. 1157-1165.

4. Puhakainen T., Hess M.W., Makela P., Svensson J., Heino P., Palva E.T. Overexpression of Multiple Dehydrin Genes Enhances Tolerance to Freezing Stress in Arabidopsis // Plant Mol. Biol. 2004. V. 54. P. 743-753.

5. Beck E.H., Fettig S., Knake C., Hartig K., Bhattarai T. Specific and Unspecific Responses of Plants to Cold and Drought Stress // J. BioSci. 2007. V. 32. P. 501-510.

6. Rodriguez E.M., Svensson J.T., Malatrasi M., Choi D.W., Close T.J. Barley Dhn13 Encodes a KS-Type Dehydrin with Constitutive and Stress Responsive Expression // Theor. Appl. Genet. 2005. V. 110. P. 852-858.

7. Nylander M., Svensson J., Palva E.T., Welin B.V. Stress-Induced Accumulation and Tissue-Specific Localization of Dehydrins in Arabidopsis thaliana // Plant Mol. Biol. 2001. V. 45. P. 263-279.

8. Rock C.D. Pathways to Abscisic Acid-Regulated Gene Expression // New Phytol. 2000. V. 148. P. 357-396.

9. Шакирова Ф.М., Аллагулова Ч.Р., Безрукова М.В., Гималов Ф.Р. Индукция экспрессии гена дегидрина TADHN и накопление абсцизовой кислоты в растениях пшеницы при гипотермии // Докл. РАН. 2005. Т. 400. С. 550-552.

10. Аллагулова Ч.Р., Гималов Ф.Р., Авальбаев А.М., Сахабутдинова А.Р., Юлдашев Р.А., Шакирова Ф.М. Структура дегидрин-подобного гена TADHN пшеницы и активация его экспрессии АБК и 24-эпибрассинолидом // Физиология растений. 2007. Т. 54. С. 131-136.

11. Choi D.-W., Zhu B., Close T.J. The Barley (Hordeum vulgare L.) Dehydrin Multigene Family: Sequence, Allele Types, Chromosome Assignment, and Expression Characteristics of 11 Dhn Genes of cv. Dicktoo // Theor. Appl. Genet. 1999. V. 98. P. 1234-1247.

12. Chung S., Parish R.W. Combination Interactions of Multiple Cis-Elements Regulating the Induction of the Arabidopsis XERO2 Dehydrin Gene by Abscisic Acid and Cold // Plant J. 2008. V. 54. P. 15-29.

13. Knight H., Zarka D.G., Okamoto H., Thomashow M.E., Knight M.R. Abscisic Acid Induces CBF Gene Transcription and Subsequent Induction of Cold-Regulated Genes via the CRT Promoter Element // Plant Physiol. 2004. V. 135. P. 1710-1717.

14. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. Gene Networks Involved in Drought Stress Response and Tolerance //J. Exp. Bot. 2007. V. 58. P. 221-227.

15. Champ K., Febres V.J., Moore G.A. The Role of CBF Transcriptional Activators in Two Citrus Species (Poncirus and Citrus) with Contrasting Level of Freezing Tolerance // Physiol. Plant. 2007. V. 129. P. 529-541.

16. Suzuki M., Ketterling M.G., McCarty D.R. Quantitative Statistical Analysis of Cis-Regulatory Sequences in ABA/VP1- and CBF/DREB1-Regulated Genes of Arabidopsis // Plant Physiol. 2005. V. 139. P. 437-447.

17. Badawi M., Danyluk J., Boucho B., Houde M., Sarhan F. The CBF Gene Family in Hexaploid Wheat and Its Relationship to the Phylogenetic Complexity of Cereal CBFs // Mol. Genet. Genomics. 2007. V. 277. P. 533-554.

18. Narusaka Y., Nakashima K., Shinwari Z.K., Sakuma Y., Furihata T., Abe H., Narusaka M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. Interaction between Two Cis-Acting Elements, ABRE and DRE, in ABA-Dependent Expression of Arabidopsis rd29A Gene in Response to Dehydration and High Salinity Stresses // Plant J. 2003. V. 34. P. 137-148.

Подписи к рисункам

Рис. 1. Динамика содержания АБК в обработанных и необработанных 5 мг/л флуридона 4-дневных проростках пшеницы в ходе воздействия низкой температуры (6оС). 1 – контроль; 2 – действие низкой температуры; 3 – действие флуридона и низкой температуры.

Рис. 2. Относительный уровень экспрессии TADHN гена дегидрина в 4-дневных проростках пшеницы, необработанных (1) и обработанных (2) флуридоном, в условиях низкотемпературного стресса, о котором судили по результатам полуколичественной ОТ-ПЦР. Выравнивание количества РНК в образцах, взятых в реакцию, проводили путем сравнения в них экспрессии гена 18S рРНК.