УДК 581.1
ПОВЫШЕННАЯ ЭКСПРЕССИЯ ДЕСАТУРАЗЫ СТЕАРИЛ-АЦИЛ ПЕРЕНОСЯЩЕГО БЕЛКА В ЧИСТЫХ ЛИНИЯХ КУКУРУЗЫ С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ МАСЛА В ЗЕРНЕ
© 2009 г. Ч. Ц. Лиу*, С. Х. Янь**, Я. Фу**
* Исследовательский центр высоких технологий, Академия сельскохозяйственных наук провинции Шаньдун, Цзинань, КНР
** Национальный центр селекции кукурузы, Китайский сельскохозяйственный университет, Пекин, КНР
Поступила в редакцию 24.01.2008 г.
В последнее время исследователи проявляют повышенный интерес к кукурузе (Zea mays L.) с высоким содержанием масла в зернах (более 6%). До настоящего времени мало известно об экспрессии генов, участвующих в метаболизме ЖК такой кукурузы. SAD -десатураза стеарил-ацил переносящего белка (от stearoyl-acyl carrier protein desaturase) -фермент, превращающий стеариновую кислоту в олеиновую. В нашем исследовании с помощью двухмерного гель-электрофореза, газовой хроматографии и ПЦР в реальном времени мы изучили экспрессию белка SAD на различных стадиях развития семян в линиях кукурузы с высоким и обычным содержанием масла в зернах. SAD экспрессировалась значительно сильнее в линиях с высоким содержанием масла, чем в обычной кукурузе, не только на уровне белка и мРНК, но и на уровне продукта катализируемой реакции. Полученные результаты позволяют предположить, что усиленная экспрессия белка SAD в значительной степени объясняет повышенное содержание масла в зернах кукурузы.
________________________
Сокращения: ACP - ацил-переносящий белок (от acyl carrier protein); SAD - десатураза стеарил-ацил переносящего белка (от stearoyl-acyl carrier protein desaturase); QTL - локус количественного признака (от quality trait locus).
Адрес для корреспонденции: Zh. J. Liu. High-Tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences; Jinan 250100, China. Fax: 86-531-83-17-81-56; e-mail: liuzhanji@yahoo.com.cn

Ключевые слова: Zea mays - SAD - двумерный электрофорез - газовая хроматография - ПЦР в реальном времени.

ВВЕДЕНИЕ

Зерна некоторых сортов кукурузы содержат более 6% масла [1]. По сравнению с обычной кукурузой, в которой содержание масла не превышает 4%, она имеет меньший эндосперм и больший зародыш, в котором и находится до 85% масла [2]. Повышенное содержание масла в кукурузе улучшает ее переваривание животными и снижает необходимость вводить в их рацион дополнительные жиры; калорийность такой кукурузы выше, а качество ее белков лучше [3, 4].
До недавнего времени линии кукурузы с повышенным содержанием масла в зернах получали путем длительной селекции. Так, в 1896 г. Hopkins (Иллинойс, США) впервые начал долговременный эксперимент по селекции кукурузы сорта Буррская белая, направленный на повышение качества белков и содержание масла в ее зернах [5]. Через 100 поколений удалось получить сорт Illinois High-oil с содержанием масла 20.37% [5]. В Китае, начиная с 1980-х гг., ряд сортов кукурузы с высоким содержанием масла получил Song с соавт. [6], в том числе и сорт Beijing High Oil (BHO). Данный сорт был получен из элитных сортов обычной кукурузы, выращиваемой в Китае, содержание масла в которых за 15 циклов селекции было повышено с 4.7 до 13.9%. На основе этого сорта были получены китайские элитные и гибридные линии кукурузы с высоким содержанием масла в зернах [4].
Белок SAD (от stearoyl-acyl carrier protein desaturase) - десатураза стеарил-ацил переносящего белка, больше известный как Δ9-десатураза, катализирует образование первой двойной связи в стеароил-ацил-переносящий белок (стеарил-ACP от acyl carrier protein) между 9-м и 10-м атомами углерода, и при этом образуется олеил-ACP (превращение стеариновой кислоты в олеиновую) [7]. Регуляция экспрессии белка SAD интенсивно изучается [8, 9]. Fofana с соавт. [10] обнаружили, что белок SAD наиболее сильно экспрессируется в завязях льна (Linum usitatissimum), и его экспрессия регулируется по мере развития семян. Knutzon с соавт. [11] показали, что снижение активности белка SAD в семенах трансгенного рапса приводит к снижению содержания масла в них, а также к снижению процента прорастания семян [11]. Насколько нам известно, экспрессия белка SAD в линиях кукурузы, различающихся по содержанию масла в зернах, до настоящего времени не изучена.
В настоящей работе мы изучили экспрессию белка SAD в кукурузе с обычным и повышенным содержанием масла и увидели, что его экспрессия идет гораздо интенсивнее в кукурузе с высоким содержанием масла на уровне не только белка и мРНК, но и на уровне продукта реакции.

МЕТОДИКА

Растительный материал. В качестве растительного материала для протеомного и липидного анализа использовали две чистые линии кукурузы: By804 и B73. By804 - инбредная линия с высоким содержанием масла (11.78%) из коллекции линий Beijing High Oil (BHO), а B73 - обычная чистая линия с содержанием масла в семенах 3.45% на стадии созревания. Растения выращивали на агроферме Китайского сельскохозяйственного университета (Пекин). Зерновки самоопыляющихся початков собирали на 15-, 25- и 35-й день после опыления. Из единичных зерновок извлекали зародыши и немедленно замораживали их в жидком азоте. Образцы хранили при температуре -80ºC до проведения опытов. Еще две линии - By815 и Mo17 - использовали для анализа экспрессии мРНК. By815 - кукуруза с содержанием масла до 11.58%, а Mo17 - обычная кукуруза с содержанием масла в зернах 3.67%.
Анализ липидов. Для определения содержания ЖК из более чем 20 зародышей выделяли липиды и анализировали их при помощи газового хроматографа HP-6890 ("Agilent Technologies", США) с полиэтиленгликольной капиллярной колонкой HP-INNOWAX (30 м × 320 мкм × 0.5 мкм, "Agilent Technologies") по модифицированному одноэтапному методу [12].
Выделение белков. Белки выделяли по методу Damerval с соавт. [13] с небольшими изменениями. Замороженные в жидком азоте зародыши растирали в ступке в мелкий порошок, инкубировали при -20°C в ацетоне с добавлением 10% TCA и 0.07% 2-меркаптоэтанола в течение 1 ч, после чего центрифугировали в течение 30 мин при 30 000 g. Осажденные белки дважды промывали в ацетоне, охлажденном до -20°C и содержащем 0.07% 2-меркаптоэтанола, для удаления липидов. Полученные белки высушивали под вакуумом, ресуспендировали в лизирующем буфере, содержавшем 7 M мочевину, 2 M тиомочевину, 4% CHAPS, 60 мМ ДТТ, 1% Pharmalyte и краситель. Нерастворимые компоненты зародышевых тканей удаляли центрифугированием в течение 30 мин при 30 000 g. Концентрацию белков определяли при помощи набора 2-D Quant Kit ("Amersham Biosciences", Швеция).
Двухмерный гель-электрофорез. Изоэлектрическую фокусировку (ИЭФ) 600 мкг белка в восстанавливающем буфере, содержавшем 8 M мочевину, 2% CHAPS, 0.5% буфер IPG 3-10, 20 мМ ДТТ и 0.01% бромфенолового синего, проводили на полосках длиной 24 см с иммобилизированным градиентом pH от 3 до 10 с помощью прибора IPGphor ("Amersham Biosciences") в течение 6 ч при 30 В, 6 ч при 60 В, 1 ч при 200 В, 1 ч при 500 В, 30 мин при 1000 В, после чего плавно повышали напряжение до 8000 В и выдерживали при 8000 В до достижения суммарной нагрузки не менее 63 000 В/ч. После фокусировки полоски обрабатывали в течение 15 мин в буфере для уравновешивания (50 мМ Трис-HCl, pH 8.8, 6 М мочевина, 30% глицерин, 2% ДДС и 0.01% бромфеноловый синий), содержавшем 10 мг/мл ДТТ, после чего обрабатывали в течение 20 мин в буфере для уравновешивания, содержавшем 40 мг/мл йодоацетамида. ДДС-ПААГ-электрофорез во втором измерении (гель 12.5%, пластины 26 × 24 см, "Amersham Biosciences") проводили на аппарате Pharmacia Ettan DALTsix Large Vertical System в соответствии с инструкциями производителя. После электрофореза пятна белков окрашивали Кумасси ярко синим G-250. По каждому образцу опыт повторяли не менее трех раз. Гели сканировали, и полученные картины анализировали при помощи программы Imagemaster 5.0 ("Amersham Biosciences"). Количество белка в каждом пятне оценивали в объемных процентах. Достоверными считали двукратные отличия в содержании белка между линиями кукурузы (t-тест Стьюдента, p > 0.05).
Обработка белка и масс-спектрометрический анализ. Пятна белка вырезали из окрашенных гелевых пластин, переносили в пробирки для микроцентрифуги и промывали 50% ацетонитрилом, содержавшем 20 мМ бикарбонат аммония для удаления красителя, связанного с белком. После этого их сушили под вакуумом и инкубировали в течение 16 ч при 37°C с 10 мкл 10 мкг/мл трипсина (модифицированный трипсин свиньи, "Sigma", США) в 20 мМ бикарбонате аммония (pH 8.5). Обработанные таким образом фрагменты элюировали методом диффузии в 50% ацетонитриле с добавлением 0.5% трифторуксусной кислоты. Масс-спектры получали с помощью масс-спектрометра Bruker REFLEX III MALDI-TOF ("Bruker-Franzen", Германия) в режиме рефлектора положительных ионов, как описано Jin с соавт. [14]. Спектры калибровали относительно автолизированного трипсина, который использовали в качестве внутреннего стандарта. Белки определяли методом массового картирования пептидов и поиска по информационной базе данных Национального Биотехнологического центра (NCBInr) с использованием поисковой программы MASCOT (http://www.matrixscience.com). Для поиска в базе данных использовали следующие параметры относительно массы пептидов: база данных - NCBInr, таксономия - прочие зеленые растения; постоянные изменения - карбамидометил цистеин; переменные изменения - окисленный метионин; допуск по массе пептида - 0.3 Д; заряд пептида - 1 H+; число пропущенных сайтов разрезания - до 1. Определение считалось достоверным при выполнении следующих критериев: значительное число пунктов по MASCOT; совпадение не менее четырех пептидов; покрытие последовательности не менее 25%.
Количественная ПЦР в режиме реального времени. Для обнаружения разности в экспрессии мРНК SAD в образцах кукурузы с высоким (By804 и By815) и обычным (B73 и Mo17) содержанием масла проводили количественную ПЦР в режиме реального времени. Из зародышей выделяли суммарную РНК методом фенольной экстракции и осаждения в этаноле с последующей обработкой ДНКазой I ("Promega", США) в соответствии с рекомендуемой методикой. Отсутствие загрязнения образцов геномной ДНК подтверждали ПЦР-анализом с последующей реакцией обратной транскрипции, но без обратной транскриптазы (как отрицательный контроль). Реакции синтеза кДНК проводили с помощью обратной транскриптазы M-MLV ("Promega") в соответствии с инструкциями производителя. ПЦР в режиме реального времени проводили на аппарате Opticon2 ("MJ Research") в присутствии зеленого красителя SYBR Green I. Реакцию проводили в следующем режиме: 94°C в течение 3 мин; затем 40 циклов: 94°C в течение 30 с, 55°C в течение 30 с, 72°C в течение 30 с; инкубация при 81°C в течение 1 с для считывания; затем выдержка при 72°C в течение 10 мин. Получение кривой плавления проводили в диапазоне 62-95°C со считыванием интенсивности флуоресценции каждые 0.2°C. Для каждого образца проводили по три реакции ПЦР в реальном времени, а в качестве внутреннего контроля использовали убиквитин. Использовали следующие праймеры: для убиквитина: прямой - 5'-GTC AGT AAG TCA TGG GTC GT-3', обратный - 5'-ACA TAA TGA GCA CAG GCT TT-3'; для SAD: прямой - 5'-GGA TTT CCT CCC TGA CCC A-3', обратный - 5'-GTC CAT GCC CTC GTC CAA A-3'. Относительное количественное определение экспрессии РНК в линиях кукурузы проводили с помощью сравнительного Ct-метода [15].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Сравнение количества белков SAD в линиях кукурузы, различающихся по содержанию масла в зернах
Исходя из кривых экспрессии белков в линиях обогащенной аслом и обычной кукурузы (данные не опубликованы), обнаружили пятно белка, экспрессия которого была заметно активирована в обогащенной маслом линии кукурузы By804 (рис. 1). Количество содержащегося в нем белка (в %об.) в образцах линий By804 и B73 на 15-, 25- и 35-й день после опыления составило 0.47, 0.22, 0.09 и 0.21, 0.09, 0.05 соответственно. Разница в 2.23, 2.56, 1.8 раза была достоверной (p < 0.05). Обработка и идентификация белка в пятне методом анализа массы пептидов (PMF, от peptide mass fingerprint) и поиску по базе данных NCBInr показала, что он действительно является белком SAD (количество пунктов 96, т.е. > 64, p < 0.05) (рис. 2). Как видно из рис. 3, белок SAD в обогащенной маслом линии By804 экспрессируется в значительно большем количестве, чем в обычной линии B73, хотя количество белка SAD по мере развития зародыша уменьшалось в обеих линиях.

Сравнение содержания продуктов реакций, катализируемых SAD, в двух линиях кукурузы

Так как SAD является основным ферментом, катализирующим превращение стеариновой кислоты в олеиновую путем образования первой двойной связи в стеароил-ACP между 9-м и 10-м атомами углерода [7], мы провели дальнейший анализ продукта катализируемой им реакции, т.е. олеиновой кислоты. Результаты газовой хроматографии показали, что концентрация масел (в процентах от сухого веса) в зародышах кукурузы By804 было значительно выше, чем в зародышах B73, и не было разницы в составе ЖК в зародышах By804 и B73 (таблица). Концентрация олеиновой кислоты в зародышах By804 и B73 на 15-, 25- и 35-й день после опыления составляла 11.80, 21.53, 22.22% и 3.83, 7.45, 6.99% соответственно (рис. 4). Превышение составило 3.08, 2.89 и 3.18 раза соответственно, т.е. было достоверным (p < 0.05). Таким образом, анализ содержания продукта реакции также подтверждает, что в кукурузе с повышенным содержанием масла в зернах повышено содержание SAD.

Сравнение уровней мРНК SAD в линиях обогащенной маслом и обычной кукурузы

Был проведен анализ экспрессии мРНК SAD методом количественной ПЦР в реальном времени. Экспрессия транскриптов SAD в богатой маслом кукурузе By804 была в 2.23 (p < 0.01), 2.08 (p < 0.01) и 1.50 (p < 0.05) раз выше, чем в обычной B73 (рис. 5). Данные результаты согласуются с результатами дифференциального анализа накопления белков методом двухмерного электрофореза. Для дальнейшего подтверждения различного уровня экспрессии данного белка в зависимости от генетического фона, мы определили также его экспрессию в сортах By815 (обогащенный маслом) и Mo17 (обычный). Экспрессия белка SAD на 15- и 25-й день после опыления в By815 была в 1.94 (p < 0.01) и 2.27 (p < 0.01) раз выше, чем в Mo17, соответственно, а достоверной разницы в экспрессии между линиями B73 и Mo17 (обычные), как и между линиями By804 и By815 (обогащенные маслом), не было. Данные результаты подтверждают, что мРНК белка SAD в кукурузе с повышенным содержанием масла в зернах присутствует в большем количестве, чем в обычной.

ОБСУЖДЕНИЕ

SAD является основным ферментом, катализирующим превращение стеариновой кислоты в олеиновую путем образования первой двойной связи в стеароил-ACP между 9-м и 10-м атомами углерода [7]. Мы проверили, что его экспрессия в кукурузе By804 (с повышенным содержанием масла в зернах) происходила более активно, чем в обычной кукурузе B73 не только на уровне мРНК и белка, но и на уровне продукта реакции. SAD катализирует только первую стадию десатурации; а что можно сказать о содержании C16:1 в сортах кукурузы с высоким содержанием масла в зернах? На основании анализа содержания ЖК в образцах By804 и B73 (таблица), можно сказать, что различий в содержании C16:1 между данными линиями нет. Высокий уровень экспрессии белка SAD отражается только на содержании олеиновой кислоты.
Линия By804 была отобрана среди популяции BHO на 13-м цикле селекции. Изначально пекинские линии кукурузы с обогащенными маслом зернами были выведены из обычных линий, включая линию Mo17. Для того, чтобы частично исключить фоновый эффект Mo17, мы сравнили экспрессию SAD на уровне мРНК между четырьмя чистыми линиями и нашли, что экспрессия SAD в обогащенной маслом кукурузе By815 была также достоверно выше, чем в обычной кукурузе Mo17, и не было существенной разницы в экспрессии между обычными линиями B73 и Mo17, а также между линиями с повышенным содержанием масла By804 и By815. Данные результаты свидетельствуют, что усиленная экспрессия SAD, возможно, объясняет повышенное содержание масла в обогащенных маслом сортах кукурузы. Особенно следует отметить, что кДНК гена SAD была картирована на хромосоме 3 рекомбинантной линии кукурузы, полученной в нашей лаборатории путем единичного скрещивания между линией By804 и обычной линией B73, а один из важных локусов количественного признака (QTL от quality trait locus) стеариновой кислоты был обнаружен в том же участке хромосомы (данные не приведены). Мы показали, что содержание масла является количественным показателем, и на него влияют около 50 QTL, эффект каждого из которых в отдельности незначителен [16]. Повышенная экспрессия одного гена может являться движущим фактором общего повышения содержания масла в кукурузе.
Кукуруза с высоким содержанием масла была получена человеком в результате длительной селекции. В результате селекционной работы значительно меняется экспрессия многих генов. Одним из видов селекционных изменений является изменение генных и белковых последовательностей. Так, например, пшеница с геном Q не требует обмолота. По сравнению с фенотипом q, аллель Q транскрибируется активнее, а различие между аллелями q и Q состоит в единственном аминокислотном остатке в положении 329 [17]. Подобно этому замена единственной аминокислоты в ДНК-связывающем домене, кодируемом геном sh4, главным образом, помогла устранить разрушение зерна культурного риса [18]. Вторым видом селекционных изменений является изменение регуляторных генов или регуляторных последовательностей генов. Так, например, аллель tb1 в кукурузе экспрессируется вдвое сильнее, чем в теосинте, хотя в аминокислотных последовательностях белков TB1 обоих растений различий нет. Причиной повышенной экспрессии мРНК tb1 в кукурузе является различие в транскрипционных факторах [19(21]. Полиморфизм в 5'-регуляторной области qSH1 участвует в формировании зоны раскрытия как важнейшего QTL, устраняющего разрушение зерна в культурном рисе, так как при этом не формируется зона опадания [22]. Подобным образом изменения в отдаленных регулирующих cis-областях гена Vgt1 как основного QTL кукурузы, работающего во время цветения, отражаются на времени сбрасывания пыльцы и образовании междоузлий [23]. Дальнейший структурный и функциональный анализ белка SAD позволит лучше понять молекулярные основы накопления масла в сортах кукурузы в частности, изменения, происходящие в зерновых культурах при селекции в целом.
Данное исследование выполнялось при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук (проект № 30571165) и Министерства сельского хозяйства Китая (проект № 2004-Z25).


СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Lambert R.J. High-Oil Corn Hybrids // Specialty Corns / Ed. Hallauer A.R. Boca Raton (Florida): CRC Press, 2001. P. 131-154.
2.Curtis P.E., Leng E.R., Hageman R.H. Development Changes in Oil and Fatty Acid Content of Maize Strains Varying in Oil Content // Crop Sci. 1968. V. 8. P. 689-693.
3.Goldman I., Rocheford T.R., Dudley J.W. Molecular Markers Associated with Maize Kernel Oil Concentration in an Illinois High Protein × Illinois Low Protein Cross // Crop Sci. 1994. V. 34. P. 908-915.
4.Song X.F., Song T.M., Dai J.R., Rocheford T.R., Li J.S. QTL Mapping of Kernel Oil Concentration with High Oil Maize by SSR Markers // Maydica. 2004. V. 49. P. 41-48.
5.Dudley J.W., Lambert R.J. 100 Generations of Selection for Oil and Protein in Corn // Plant Breed. Rev. 2004. V. 24. P. 79-110.
6.Song T.M., Kong F., Li C.J., Song G.H. Eleven Cycles of Single Kernel Phenotypic Recurrent Selection for Percent Oil in Zhongzong no. 2 Maize Synthetic // J. Genet. Breed. 1999. V. 53. P. 31-35.
7.Asamizu E., Sato S., Kaneko T., Nakamura Y., Kotani H., Miyajima N., Tabata S. Structural Analysis of Arabidopsis thaliana Chromosome 5 Sequence Features of the Regions of 1,081,958 bp Covered by Seventeen Physically Assigned P1 and TAC Clones // DNA Res. 1998. V. 5. P. 379-391.
8.Fawcett T., Simon W.J., Swinhoe R., Shanklin J., Nishida I., Christie W.W., Slabas A.R. Expression of mRNA and Steady-State Levels of Protein Isoforms of Enoyl-ACP Reductase from Brassica napus // Plant Mol. Biol. 1994. V. 26. P. 155-163.
9.Slocombe S.P., Piffanelli P., Fairbairn D., Bowra S., Hatzopoulos P., Tsiantis M., Murphy D.J. Temporal and Tissue-Specific Regulation of a Brassica napus Stearoyl-Acyl Carrier Protein Desaturase Gene // Plant Physiol. 1994. V. 104. P. 1167-1176.
10.Fofana B., Cloutier S., Duguid S., Ching J., Rampitsch C. Gene Expression of Stearoyl-ACP Desaturase and Delta 12 Fatty Acid Desaturase 2 Is Modulated during Seed Development of flax (Linum usitatissimum) // Lipids. 2006. V. 41. P. 705-712.
11.Knutzon D.S., Thompson G.A., Radke S.E., Johnson W.B., Knauf V.C., Kridl J.C. Modification of Brassica Seed Oil by Antisense Expression of a Stearoyl-Acyl Carrier Protein Desaturase Gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 2624-2628.
12.Sukhija P.S., Palmquist D.L. Rapid Method for Determination of Total Fatty Acid Content and Composition of Feedstuffs and Feces // J. Agric. Food Chem. 1988. V. 36. P. 1202-1206.
13.Damerval C., DeVienne D., Zivy M., Thiellement H. Technical Improvements in Two-Dimensional Electrophoresis Increase the Level of Genetic Variation Detected in Wheat-Seedling Proteins // Electrophoresis. 1986. V. 7. P. 52-54.
14.Jin B.F., He K., Wang H.X., Wang J., Zhou T., Lan Y., Hu M.R., Wei K.H., Yang S.C., Shen B.F., Zhang X.M. Proteomic Analysis of Ubiquitin-Proteasome Effects: Insight into the Function of Eukaryotic Initiation Factor 5A // Oncogene. 2003. V. 22. P. 4819-4830.
15.Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method // Methods. 2001. V. 25. P. 402-408.
16.Laurie C.C., Chasalow S.D., LeDeaux J.R., McCarroll R., Bush D., Hauge B., Lai C., Clark D., Rocheford T.R., Dudley J.W. The Genetic Architecture of Response to Long-Term Artificial Selection for Oil Concentration in the Maize Kernel // Genetics. 2004. V. 168. P. 2141-2155.
17.Simons K.J., Fellers J.P., Trick H.N., Zhang Z., Tai Y., Gill B.S., Faris J.D. Molecular Characterization of the Major Wheat Domestication Gene Q // Genetics. 2006. V. 172. P. 547-555.
18.Li C., Zhou A., Sang T. Rice Domestication by Reducing Shattering // Science. 2006. V. 311. P. 1936-1939.
19.Wang R.L., Stec A., Hey J., Lukens L., Doebley J. The Limits of Selection during Maize Domestication // Nature. 1999. V. 398. P. 236-239.
20.Clark R.M., Linton E., Messing J., Doebley J.F. Pattern of Diversity in the Genomic Region near the Maize Domestication Gene tb1 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 700-707.
21.Clark R.M., Wagler T.N., Quijada P., Doebley J.F. A Distant Upstream Enhancer at the Maize Domestication Gene tb1 Has Pleiotropic Effects on Plant and Inflorescent Architecture // Nat. Genetics. 2006. V. 38. P. 594-597.
22.Konishi S., Izawa T., Lin S.Y., Ebana K., Fukuta Y., Sasaki T., Masahiro Y. An SNP Caused Loss of Seed Shattering during Rice Domestication // Science. 2006. V. 312. P. 1392-1396.
23.Salvi S., Sponza G., Morgante M., Tomes D., Niu X., Fengler K.A., Meeley R., Ananiev E.V., Svitashev S., Bruggemann E. Conserved Noncoding Genomic Sequences Associated with a Flowering-Time Quantitative Trait Locus in Maize // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 11 376-11 381.


ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

Рис. 1. Изменения в содержании белка SAD в зародышах чистых линий кукурузы, различающихся содержанием масла в зерне, с течением времени.
Выделяли суммарные белки зародышей и разделяли их при помощи двухмерного гель-электрофореза. 600 мкг белка наносили на полоски для изофокусировки длиной 24 см и линейным градиентом pH от 3 до 10. Пятна проявляли окрашиванием Кумасси ярко голубой. Белки SAD обведены кружками.

Рис. 2. Анализ пятен белков SAD методом определения массы пептидов.
Белки вырезали из геля и обрабатывали трипсином. Полученные пептиды анализировали на масс-спектрометре Bruker REFLEX III MALDI-TOF в положительном режиме при ускоряющем напряжении 20 кВ с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты. Для каждого пика указано соотношение m/z (масса/заряд пептида).

Рис. 3. Сравнение количества экспрессируемого белка SAD в зародышах B73 (1) и By804 (2) на трех стадиях развития.
Количество экспрессируемого белка SAD выражали в процентах от суммарного объема пятен.

Рис. 4. Сравнение концентрации олеиновой кислоты в зародышах B73 (1) и By804 (2) на трех стадиях развития.
Из более 20 зародышей выделяли липиды модифицированным одноэтапным методом. Анализ содержания ЖК повторяли три раза.

Рис. 5. Анализ экспрессии SAD на уровне мРНК в четырех чистых линиях кукурузы метом количественной ПЦР в реальном времени.
Извлекали суммарную РНК из зародышей By804 (1), By815 (2), B73 (3) и Mo17 (4) на трех стадиях развития. ПЦР-анализ в реальном времени повторяли три раза.
1 - мРНК SAD, относительных единиц; 2 - дней после опыленияжирная кислота