УДК 581.1
ЛЕКАРСТВЕННОЕ РАСТЕНИЕ Rehmannia glutinosa: МЕТАБОЛИТЫ, КУЛЬТУРА ТКАНЕЙ, РОСТ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ГЕНОМИКА
© 2009 г. Х. Лин*, Р. Лю**
* Кафедра биоинженерии Чженчжойского университета, Хэнань, КНР
** Библиотека Чженчжойского университета, Хэнань, КНР
Поступила в редакцию 15.03.2008 г.
Важное лекарственное растение Rehmannia glutinosa Libosch. широко распространено в странах восточной Азии. Его корни содержат множество веществ, обладающих фармакологическим действием и использующихся в китайской традиционной медицине. В последнее время в изучении свойств R. glutinosa был достигнут значительный прогресс. С помощью применения культуры тканей и методов микроразмножения были получены свободные от вирусов растения. Были проведены эксперименты по культивированию тканей in vitro, а также по генетическому трансформированию R. glutinosa. На процессы роста и развития R. glutinosa влияют множество факторов окружающей среды: концентрация СО2, влажность, транспирация, засуха и вирусные заболевания. Основными направлениями исследования R. glutinosa являются клонирование генов, генетическая трансформация и исследование состава метаболитов. Обзор обобщает данные по метаболомике, культурам тканей и воспроизведению растений, росту и его регуляции, функциональной геномике R. glutinosa. Особое внимание уделено вопросам культивирования, переработки, метаболической инженерии и исследованию метаболитов этого растения.
---------------------
Сокращения: БО ( белок оболочки; ВТМ - вирус табачной мозаики; ВРМ - вирус мозаики Rehmannia glutinosa; КК/ГК ( контроль и гарантия качества; ТПФ - темновой период фотосинтеза; ФАЛ ( фенилаланинаммиак-лиаза; PPF - фотосинтетическое излучение; R-Gluc ( 3'-H-резвератрол-3-O-β-D-глюкозид.
Адрес для корреспонденции: Hua Ling. Department of Bioengineering, Zhengzhou University, 100 Kexue Road, Zhengzhou, 450001 Henan, China. Fax: 3716-778-32-35; e-mail: hling_1@hotmail.com


Ключевые слова: Rehmannia glutinosa - лекарственное растение - культура in vitro - рост и его регуляция ( функциональная геномика - метаболомика.

ВВЕДЕНИЕ
Rehmannia glutinosa (Gaertn) Libosch. (2n = 4( = 56, также носит название Dihuang в Китае и Jiwhang в Корее) является многолетником, представителем сем. Scrophulariaceae, широко распространенным в Китае, Японии и Корее [1, 2]. R. glutinosa ( растение высотой 10(30 см, покрытое плотными железистыми и нежелезистыми волосками. Корни растения мясистые, удлиненной формы, длиной около 5.5 см. Именно корни перерабатывают для дальнейшего использования в медицинских целях. Также фрагменты корня традиционно используются для культивирования. Стебли красно-розового цвета; листья овальные или эллиптические, сужающиеся к основанию, края листьев зубчатые; цветки пазушные или в верхушечных кистях, красно-розового цвета; семенная коробочка яйцеобразной формы. Период цветения и плодоношения длится с апреля по июль [3, 4]. R. glutinosa культивируется на протяжение приблизительно 1000 лет, вследствие чего в Китае наличествуют обширные источники материалов для работы.
В корне R. glutinosa было обнаружено около 70 веществ, обладающих фармакологическим действием. Среди них: иридоиды, гликозиды, сахариды, монотерпены, аминокислоты и др. Мажорными компонентами являются иридоиды: каталпол и дигидрокаталпол [4]. В медицинских целях используется свежий корень, высушенный корень (Rehmanniae radix) и корень, приготовленный специальным образом. В медицинской практике корни R. glutinosa (особенно высушенные корни) используются как средства регулирования деятельности иммунной и центральной нервной систем, стимуляции пролиферации остеобластов, уменьшения содержания сахара в крови, понижения кровяного давления. Также они оказывают противоинфекционное и противоопухолевое действие [5(12].
Состав метаболитов R. glutinosa различается в зависимости от сорта растения, условий выращивания, фазы развития и условий хранения и переработки корня. Это затрудняет контроль и гарантию качества (КК/ГК) корня. Важной задачей является стабилизация состава метаболитов и высокой урожайности растения, что зависит от различных молекулярно-биологических, физиологических и метаболических факторов. Недавно в этой области был достигнут значительный прогресс. Для изучения метаболических профилей R. glutinosa [13] наряду с методами интегрального анализа применяли технологии химического анализа (в том числе инфракрасную спектроскопию, ВЭЖХ, ЯМР, ГХ-МС). С целью получения свободных от вирусов и обладающих другими необходимыми свойствами растений были успешно применены методы работы с культурами тканей, технологии регенерации и генетической трансформации [14(19]. Выявлена физиологическая и метаболическая активность, характер которой зависит от факторов окружающей среды (в том числе, от концентрации CO2, уровня влажности, питания, освещения, вирусных инфекций, засухи и температурных стрессов) и от обработки растений такими веществам, как паракват и холинхлорид [20(31]. Также проводили работы по выделению и изучению функций отдельных генов и моделированию индукции биосинтеза вторичных метаболитов [18, 19, 32]. В обзоре обобщаются известные на сегодняшний день сведения о профилях метаболитов, о работе с культурами тканей, а также функциональной геномике R. glutinosa.

СОСТАВ МЕТАБОЛИТОВ

В настоящий момент из R. glutinosa были выделены десятки различных соединений, в основном иридоидов и их гликозидов, включая ремаглютины, каталпол, леонурид, реманниозиды и др. [33(36]. Концентрации различных компонентов могут разниться в зависимости от многочисленных факторов: сорта растения, условий выращивания, фазы развития растения, условий хранения и методов переработки растений. Задачей метаболомики является изучение состава метаболитов, в особенности вторичных, с помощью широкого спектра методов химического анализа в целых тканях в сочетании с методами распознавания. Именно метаболомику R. glutinosa и требуется исследовать.
В настоящее время кроме исследования отдельных активных веществ для изучения влияния условий роста, хранения и переработки R. glutinosa также используют анализ состава метаболитов [13, 19, 31, 37(39]. Методами ВЭЖХ в растениях, испытывавших водный и температурный стресс, было определено содержание вторичных метаболитов, включая резвератрол и фенольные соединения. По результатам этих исследований был сделан вывод о возможности разработки методов культивирования R. glutinosa, содержащей повышенное количество активных веществ, например, резвератрола, даже в случае выращивания в неблагоприятных условиях [31]. Концентрация некоторых активных веществ может разниться в зависимости от способа их выделения. Это выражается в различном фармакологическом действии свежего корня, высушенного корня (Rehmannia Radix - фармакологическое название) и препарата из корня. Поэтому большое внимание уделяется изучению влияния на фармакологические свойства корня условий хранения и методов переработки. На хроматограммах, полученных методами ВЭЖХ на различных этапах переработки корня, были выявлены различия. Согласно ВЭЖХ хроматограммам, в процессе переработки корня происходит дегалактозилирование стахеозы, а при его обработке паром происходит ее дефруктозилирование [38]. Chang с соавт. [13] впервые определили фингерпринты метаболитов R. glutinosa, комбинируя методы ГХ-МС и методы статистического анализа (метод главных компонент и ASCA). Было выявлено, что на разных этапах переработки корня упомянутые метаболиты претерпевают значительные изменения. Bai с соавт. [39] методом инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием исследовали профили дикорастущих растений R. glutinosa и культивируемых форм и обнаружили, что концентрация различных веществ, выделенных из них, разнится. В будущем большую роль в культивировании, биологии и определении КК/ГК R. glutinosa будут играть метаболическое профилирование, технологии химического анализа (в том числе инфракрасная спектроскопия, ВЭЖХ, ЯМР, ГХ-МС), интегрированные с другими аналитическими методами (например, с измерением показателя преломления).

КУЛЬТУРА ТКАНЕЙ И РЕГЕНЕРАЦИЯ

Традиционно для выращивания R. glutinosa используют фрагменты корня, что значительно увеличивает восприимчивость растения к патогенам (особенно к вирусам) в поле и, как следствие, выражается в виде разного рода отклонениях от нормального роста и развития. Для преодоления этой проблемы были использованы культура тканей и микроразмножение, с помощью которых были получены свободные от вирусов растения. Существуют данные о микроразмножении свободных от вирусов растений, используя в качестве эксплантов апексы побегов и фрагменты корней [14, 20, 40]. В настоящее время в качестве эксплантов используют корни, апексы побегов, стебли, листья, черешки и пыльники. Из вышеперечисленных эксплантов для быстрого получения большого количества растений используют фрагменты корня и стебля, а также апексы побегов; экспланты из листьев часто служат материалом для получения каллусов [15(17, 41(44].
Активно ведутся работы по получению трансгенных растений R. glutinosa с помощью агробактерий. Так, по аналогии с трансформацией растений арахиса, у которых с помощью Agrobacterium tumefaciens в клетки молодых листьев были встроены гены GUS и резвератролсинтазы (AhRS3), методом непрямого органогенеза были получены устойчивые к канамицину растения R. glutinosa. Трансгенные растения нормально росли и цвели на протяжении трех месяцев [18, 19]. В Китае листья, стебли и черешки R. glutinosa были использованы как экспланты для заражения A. rhizogenes (штамм 15 834, штамм А4 и штамм LBA 9402 соответственно) [45]. Эти трансгенные растения успешно образовывали "бородатые" корни. Было показано, что при заражении листьев штаммом 15 834 "бородатые" корни образуются у получаемых из них растений наиболее часто по сравнению с другими эксплантами и штаммами. Уже достигнутый успех в регенерации полученных трансгенных R. glutinosa будет полезным для получения новых трансгенных растений.

РОСТ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ

Акклиматизация и условия роста ex vitro растеньиц после пересадки

Несмотря на то, что воспроизведение растений in vitro широко освоено [14, 40, 41, 46], все еще существуют некоторые трудности в связи с тем, что степень акклиматизации достаточно мала и является сложной и дорогостоящей процедурой [21, 47]. Акклиматизация растений, выращенных in vitro, в поле и теплицах происходит с трудом.
На акклиматизацию влияет множество факторов. Paek с соавт. [22] показали, что R. glutinosa после ее микроразмножения растет лучше, чем размноженная стандартными методами. Seon с соавт. [23, 24] показали, что интенсивность транспирации играет ключевую роль в процессах акклиматизации, а создание благоприятных фотоавтотрофных условий способствует росту растений in vitro, а также выживанию R. glutinosa ex vitro. В дальнейшем Cui с соавт. [25] показали, что повышение аэрации сосуда, в котором производится культивирование, понижение концентрации сахарозы, положительная температура темнового периода фотосинтеза (ТПФ) в сочетании с последующим интенсивным освещением являются благоприятными факторами для роста и акклиматизации растеньиц R. glutinosa. Эти данные свидетельствуют о том, что рост и выживаемость растеньиц могут быть повышены следующим образом: (а) оптимальным уровнем транспирации на ранних стадиях роста после пересадки; (б) улучшением аэрации в сосуде культивирования и поддержанием в нем низкой влажности; (в) повышением концентрации CO2; (г) понижением концентрации сахарозы в среде для культивирования in vitro; (д) поддержанием высокого уровня фотосинтеза за счет повышения интенсивности освещения и (е) увеличением разницы между температурой фотопериода и темнового периода. Таким образом, концентрация CO2, влажность, транспирация, концентрация сахарозы, освещение, фотопериод и ТПФ - факторы, влияющие на рост и акклиматизацию растеньиц R. glutinosa.

Вирусные инфекции

Одним из самых "узких мест" в культивировании R. glutinosa являются вирусные заболевания, которые приводят к значительным потерям в качестве и урожае корня. На сегодняшний день описаны следующие вирусные патогены R. glutinosa: вирус дегенерации реманнии, ВТМ (вирус табачной мозаики), ВРМ (вирус мозаики реманнии, относится к тобамовирусам), вирус мозаики огурца, карлавирус и Х-вирус картофеля [20, 48(52]. Только некоторые из этих вирусов были описаны полностью. Свободные от вирусов растения R. glutinosa L. var. purpurea Makino при высадке в поле были реинфицированы ВТМ. Обнаружено, что степень реинфицированности растет (от 27% в первый год до 63% в третий год роста) [20]. Zhang с соавт. [48, 51] сообщили, что ген белка оболочки (БО) штамма RH ВТМ и геном ВРМ имеют высокую идентичность с аналогичным геном штамма U1 ВТМ и другими штаммами ВТМ. Более того, было показано, что ген транспортного белка и ген БО ВРМ придают табаку устойчивость к вирусным заболеваниям [53]. Проводили эксперименты по заражению R. glutinosa одним вирусом и смешанному инфицированию обоими вирусами [20, 41, 49, 50].
Вирусные инфекции, являясь в основном помехой для культивирования R. glutinosa, также являются факторами негативной регуляции роста и развития растений. Вирусные инфекции значительно снижают урожай корня. Matsumoto с соавт. [20] показали, что общий вес корней клонированных растений в первый год роста был приблизительно в три раза больше, чем аналогичный вес инфицированных вирусами родительских растений. Общая масса корней, наряду с ростом реинфицированности, снижалась с каждым последующим годом. Масса корней растений, посаженных 3 года назад, за 2 года уменьшилась в 2 раза.
Потери урожая корня коррелирует с уровнем реинфицированности, из чего следует, что борьба с вирусными заболеваниями положительно скажется на урожайности. Содержание некоторых фармакологически активных веществ в корне снижалось именно из-за вирусных заболеваний. Содержание некоторых гликозидов иридоидов (включая каталпол, реманноизиды B, C и леонурид) в клонально размноженных растениях падало от года к году. В то же время, степень реинфицированности растений ВТМ повышалась [20]. Вирусные заболевания снижали гомогенность вторичных метаболитов, а также ухудшали качество "сырого" материала корня R. glutinosa. Подобное воздействие вирусных инфекций должно быть тесно связано с урожайностью, однако эта связь требует дополнительных исследований.
На сегодняшний день существуют определенные методы борьбы с вирусными заболеваниями R. glutinosa; однако подходящих химических препаратов для этих целей не разработано. Методы борьбы с вирусами заключаются в следующем: селекция устойчивых к вирусам растений, размножение семенами, вегетативное размножение свободных от вирусов растеньиц R. glutinosa. В дополнение к этому необходимо обновлять культивируемые растения на новые, свободные от вирусов, каждые три года [20]. В будущем возможно создание с помощью методов генетической инженерии устойчивых к вирусам растений. Наша исследовательская группа занимается созданием трансгенных растений R. glutinosa, устойчивых к широкому спектру вирусных агентов.

Устойчивость к воздействию параквата

Существовало мнение о том, что R. glutinosa обладает устойчивостью к действию неселективного гербицида параквата (1,1'-диметил-4,4-бипиридиниум) [26]. В действительности, восприимчивых к действию параквата разновидностей R. glutinosa не обнаружено [27, 28].
Механизмы подобной устойчивости раскрывались постепенно. Chun с соавт. [28] исследовали устойчивость R. glutinosa к параквату в сравнении с чувствительными к нему соей и кукурузой. Из результатов исследования следовало, что устойчивость к параквату связана с его метаболизмом вне хлоропластов, а также со связыванием параквата с клеточной стенкой. Но ряд других эффектов (проницаемость кутикулы, концентрирование в вакуолях, ферментативная детоксификация индуцированных паракватом АФК) не коррелировали с устойчивостью к этому препарату, и их нельзя было объяснить с точки зрения проведенного исследования [29]. Впоследствии было показано, что такие АФК как O2- и H2O2 принимают участие в обеспечении устойчивости R. glutinosa к воздействию параквата [32]. Более того, было показано, что как сам водный экстракт, так и выделенный из него актеозид (3,4-дигидрокси-β-фенетил-O-(-рамнопиранозил-(1→3)-4-O-кафефоил-(-D-глюкопиранозид) обладают антиоксидантной активностью и снимают действие параквата [6, 27, 37]. Это прямо свидетельствует о том, что подобного рода инактивация является результатом непосредственного взаимодействия актеозида и параквата. Недавно было высказано предположение о том, что ген фенилаланинаммиак-лиазы (RgPAL1) играет определенную роль в регуляции синтеза актеозида в R. glutinosa [32]. В пользу этого предположения говорит то, что после обработки паракватом происходит повышение ферментативной активности и концентрации мРНК RgPAL1, а также то, что АФК, синтез которых предположительно индуцируется паракватом, индуцируют экспрессию RgPAL1. Дальнейшие исследования изменений концентрации актеозида дадут прямые доказательства его роли в формировании устойчивости к параквату и роли RgPAL1 в биосинтезе актеозида.
Данные приведенных исследований [28, 29, 32, 37] устойчивости R. glutinosa к параквату обобщены на рисунке. Связывание с клеточной стенкой (путь I) и прямая инактивация с помощью актеозида (путь II) уже доказаны, а гипотеза о роли антиоксидантных ферментов в формировании устойчивости к параквату (путь III) нуждается в дополнительных исследованиях. Вероятно, устойчивость R. glutinosa к параквату обеспечивается несколькими различными путями. Однако, каким образом индуцирование экспрессии RgPAL1 влияет на увеличение содержания актеозида? Как актеозид инактивирует паракват: непосредственно связываясь с ним или посредством каких-либо химических модификаций? Существуют ли другие механизмы устойчивости R. glutinosa к параквату? Как именно антиоксидантные ферменты участвуют в защите от действия параквата? На эти вопросы еще предстоит ответить в будущем. Необходимо изучить и другие, помимо RgPAL1A, гены, отвечающие за синтез актеозида.

Влажность и температура

R. glutinosa произрастает в засушливых областях, где растения часто испытывают стресс от засухи, что ограничивает фотосинтез и выражается в низкой урожайности и падении медицинской ценности растений. Zhao с соавт. [30] изучали стресс от засухи и показали, что холинхлорид может значительно способствовать процессам фотосинтеза, облегчая процессы свободнорадикального окисления липидов и способствуя накоплению пролина (таблица). Chung с соавт. [31] показали, что стресс от повышенной температуры (в частности, 25 и 30ºC) отрицательно коррелировал с синтезом вторичных метаболитов (резвератрола, фенольных соединений) и общим количеством свободных аминокислот, в то время как стресс от засухи коррелировал с ним положительно. Необходимы дальнейшие исследования зависимости синтеза вышеперечисленных метаболитов от засухи и в условиях повышенных температур.

Вред от последовательного выращивания культуры на одном месте

Последовательное культивирование R. glutinosa на одном и том же месте наносит значительный вред ее урожайности. С каждым последующим урожаем вместо больших толстых корней вырастают все более тонкие и маленькие корни. Более того, для успешного выращивания растений почва, на которой был однажды произведен сбор урожая R. glutinosa, пригодна к повторному ее культивированию только спустя 8(10 лет. Помимо грибковых заболеваний, вирусные инфекции теснее всего связаны с этой проблемой [54]. Matsumoto с соавт. [20] показали, что заражение растений ВТМ приводит к ежегодному значительному падению урожайности корня. Ведутся интенсивные исследования взаимосвязи между вирусными инфекциями и многолетним культивированием на одном месте. Более того, возможно, что неизвестные вещества, секретируемые корнем R. glutinosa, также в этом случае могут оказывать вредное влияние [55]. Как бы то ни было, до сих пор полной ясности в этом вопросе не существует и необходимы дальнейшие исследования.

ВЫДЕЛЕНИЕ ГЕНОВ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ

По сравнению с другими лекарственными растениями, такими как Panax ginseng и Catharanthus roseus, полностью изученных генов R. glutinosa намного меньше. Помимо девяти расшифрованных последовательностей геномной ДНК (№№ EU266024, DQ856493, AY423124, AY423081, DQ856487, DQ069312, AJ247589, AY950451, AY423106, и AJ247615) в базе Генбанка представлены расшифрованные последовательности кДНК трех генов (ген аскорбатпероксидазы, хитиназы и ген RgPAL1A) [32, 56(58]. Из трех упомянутых генов функционально изучен только один - ген PAL1. Экспрессия RgPAL1 индуцируется паракватом и опосредована стрессовыми гормонами [32]. Синтез мРНК RgPAL1 повышается в результате воздействия параквата, H2O2, УФ-излучения, ранений, дрожжевого экстракта, жасмоновой кислоты и этефона. Предположительно RgPAL1 является участником фенилпропаноидного сигнального пути, который запускается в условиях окислительного стресса. Однако необходимы дальнейшие исследования этого гена посредством его суперэкспрессии в R. glutinosa и других растениях, таких как Arabidopsis thaliana. Едва ли можно сказать, что функциональная геномика R. glutinosa исследована достаточным образом. Необходимо охарактеризовать гены, ответственные за рост, развитие, устойчивость к стрессам и синтез вторичных метаболитов у R. glutinosa.
Существует множество методов генетической трансформации растений. Генетическое трансформирование R. glutinosa является очень перспективным методом дальнейшего изучения функциональной геномики R. glutinosa, а также процессов синтеза вторичных метаболитов. На сегодняшний день проводились работы только по трансформированию R. glutinosa с помощью агробактерий [18, 19, 45].
Park с соавт. [18] и Zhou с соавт. [45] первыми произвели трансформацию R. glutinosa, используя для этого Agrobacterium tumefaciens LBA4404 и A. rhizogenes (штамм 15834). Экспланты листьев, трансформированные агробактериями, выращивали на питательной среде с канамицином (50 мг/л) для отбора трансформантов. В росте трансформированных растений, несущих ген GUS, не было замечено никаких патологий и период их цветения составил три месяца [18]. Эта работа открывает новые возможности по изучению генной регуляции и экспрессии у R. glutinosa посредством трансформирования ее агробактериями. Liu с соавт. [59], использовав cv. 85-5, разработали систему регенерации листьев для проведения трансформации R. glutinosa. Они показали, что требуемые концентрации канамицина и карбенициллина составляют 20 и 400 мг/л соответственно. Zhou с соавт. [45] в своих исследованиях показали, что после трансформации с помощью A. rhizogenes экспланты (фрагменты листьев, стеблей и черешков) давали "бородатые" корни. Содержание каталпола в этих корнях составило лишь 48.5 и 18% от такового в сыром и сушеном корне соответственно. Более того, в трансформированных растениях обнаружили ряд морфологических отклонений: карликовость, укороченность междоузлий, сильное ветвление корня. Согласно вышеприведенным данным, трансформирование R. glutinosa с помощью A. tumefaciens более перспективно для ее изучения. Возможность использования "бородатых" корней в качестве "фабрики" по производству вторичных метаболитов требует дальнейших исследований.
Позднее была опубликована первая работа по метаболической инженерии R. glutinosa. После трансформации R. glutinosa с помощью A. tumefaciens из-за суперэкспрессии гена AhRS3, работающего под контролем промотора CaMV35S, внутриклеточная концентрация резвератрола и 3'-H-резвератрол-3-O-β-D-гликозида (R-Gluc) в сотни раз превышала соответствующую концентрацию этих веществ в семенах арахиса [19]. В полученных путем непрямого органогенеза 11 линиях трансгенов концентрация резвератрола и R-Gluc еще более увеличивались после обработки растений паракватом, этиленом, действии на них холода и УФ-излучения. В росте и развитии трансгенных растений не обнаружено никаких отклонений от нормы. Результаты этого исследования закладывают основу для других экспериментов, связанных с метаболической инженерией других метаболитов R. glutinosa. В связи с тем, что продукт экспрессии гена RgPAL1 является участником фенилпропаноидного сигнального пути, он может быть использован для повышения внутриклеточного содержания фенилпропаноида с помощью генно-инженерных методов. В будущем выделение и исследование еще не изученных генов R. glutinosa предоставит новый материал для моделирования генно-инженерными методами биосинтеза нужных человеку метаболитов в R. glutinosa.
Кроме моделирования метаболизма нужных человеку веществ, методы генной инженерии позволяют улучшить сельскохозяйственные характеристики R. glutinosa. Растения R. glutinosa, трансгенные по гену AhRS3, обладают высокой устойчивостью к Fusarium oxysporum [19]. Существуют и другие гены, которые, возможно, придадут R. glutinosa повышенную устойчивость к различным заболеваниям, засухе и другим стрессам. Наша исследовательская группа проводит интенсивную работу по созданию растений R. glutinosa, устойчивых к действию широкого спектра вирусов путем трансформации геном токсичного белка лаконоса.
В связи с медицинским аспектом применения R. glutinosa необходимо принимать во внимание следующее. Во-первых, корни трансгенных растений должны быть безопасны для потребления и лечения с их помощью. Во-вторых, необходимо, чтобы трансгенные формы растений давали хороший урожай корня. В-третьих, необходимо избегать ухудшения фармакологических показателей растений, вызванных применением методов генетической инженерии. Обобщая вышесказанное, можно сделать следующие выводы: (а) необходимо подбирать подходящие маркеры для отбора растений (в том числе, NPTII); (б) трансформацию проводить только с использованием нетоксичных чужеродных генов; (в) осуществлять ткане- или органоспецифическую экспрессию чужеродных генов, находящихся под контролем эндогенных ткане- и органоспецифических промоторов в R. glutinosa. Однако на сегодняшний день не было выделено ни одного подобного гена или промотора. В связи с этим, особенно важными являются задачи по выделению и изучению подобных генов и промоторов.
В данном обзоре обобщены сведения в области метаболического профилирования, клеточных культур, роста и его регуляции, а также функциональной геномики R. glutinosa. Приведены данные о культивировании, метаболической инженерии, фингерпринтингу и обработке этого растения. Тем не менее, остаются открытыми и требуют дополнительных исследований такие важные проблемы как вредное влияние культивирования на одних и тех же площадях, вирусные заболевания, контроль качества и других характеристик трансгенных R. glutinosa. Несомненно, что будущие исследования с применением современных биотехнологий ускорят темпы изучения R. glutinosa.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.Gao L., Zhang Z. The Chromosome Numbers of Some Seed Plants // Chin. Bull. Bot. 1984. V. 2. P. 43-44.
2.Gong W.Z., Long Y.Y. Observation on Chromosomes of Wild Flowers in China // Zhi Wu Fen Lei Xue Bao. 1990. V. 28. P. 129-132.
3.Hong D.Y., Yang H.B., Jin C.L., Holmgren N.H. Scrophulariaceae // Flora of China / Eds Wu Z.Y., Raven P.H. Beijing: Sci. Press, and St. Louis: Missouri Bot. Garden Press, 1998. V. 18. P. 53-55.
4.Zhang R.X., Li M.X., Jia Z.P. Rehmannia glutinosa: Review of Botany, Chemistry and Pharmacology // J. Ethnopharmacol. 2008. V. 117. P. 199-214.
5.Kim H., Lee E., Lee S., Shin T., Kim Y., Kim J. Effect of Rehmannia glutinosa on Immediate Type Allergic Reaction // Int. J. Immunopharmacol. 1998. V. 20. P. 231-240.
6.Kim S.S., Son Y.O., Chun J.C., Kim S.E., Chung G.H., Hwang K.J., Lee J.C. Antioxidant Property of an Active Component Purified from the Leaves of Paraquat-Tolerant Rehmannia glutinosa // Redox Rep. 2005. V. 10. P. 311-318.
7.Oh K.O., Kim S.W., Kim J.Y., Ko S.Y., Kim H.M., Baek J.H., Ryoo H.M., Kim J.K. Effect of Rehmannia glutinosa Libosch. Extracts on Bone Metabolism // Clin. Chim. Acta. 2003. V. 334. P. 185-195.
8.Prieto J.M., Recio M.C., Giner R.M., Máñez S., Giner-Larza E.M., Ríos J.L. Influence of Traditional Chinese Anti-Inflammatory Medicinal Plants on Leukocyte and Platelet Functions // J. Pharm. Pharmacol. 2003. V. 55. P. 1275-1282.
9.Yokozawa T., Kim H.Y., Yamabe N. Amelioration of Diabetic Nephropathy by Dried Rehmanniae Radix (Di Huang) Extract // Am. J. Chin. Med. 2004. V. 32. P. 829-839.
10.Zhang R.X., Jia Z.P., Kong L.Y., Ma H.P., Ren J., Li M.X., Ge X. Stachyose Extract from Rehmannia glutinosa Libosch. to Lower Plasma Glucose in Normal and Diabetic Rats by Oral Administration // Pharmazie. 2004. V. 59. P. 552-556.
11.Zhang X.L., Jiang B., Li Z.B., Hao S., An L.J. Catalpol Ameliorates Cognition Deficits and Attenuates Oxidative Damage in the Brain of Senescent Mice Induced by D-Galactose // Pharmacol. Biochem. Behav. 2007. V. 88. P. 64-72.
12.Chao J.C., Chiang S.W., Wang C.C., Tsai Y.H., Wu M.S. Hot Water-Extracted Lycium barbarum and Rehmannia glutinosa Inhibit Proliferation and Induce Apoptosis of Hepatocellular Carcinoma Cells // World J. Gastroenterol. 2006. V. 12. P. 4478-4484.
13.Chang W.T., Thissen U., Ehlert K.A., Koek M.M., Jellema R.H., Hankemeier T., van der Greef J., Wang M. Effects of Growth Conditions and Processing on Rehmannia glutinosa Using Fingerprint Strategy // Planta Med. 2006. V. 72. P. 458-467.
14.Paek K.Y., Yu K.J., Park S.I., Sung N.S., Park C.H. Micropropagation of Rehmannia glutinosa as Medicinal Plant by Shoot Tip and Root Segment Culture // Acta Hortic. 1995. V. 390. P. 113-119.
15.Zheng J.H., Li X.E., Ma X.J., Yang S.L., Wen X.S., Huo D.L. Multiplication of Virus-Free Seedlings of Rehmannia glutinosa cv. 85-5 In Vitro // Zhong Cao Yao. 2002. V. 33. P. 452-455.
16.Liu M.L., Ju X., Cui H., Wang Z., Li X.J. Study on the Condition of Callus Induction of Rehmannia glutinosa Libosch. // J. Anhui Agric. Sci. 2006. V. 34. P. 5542-5543.
17.Chen M.Y., Liang Z.S., Wang Z.Z., Yan J.T. Tissue Culture and Plantlet Regeneration of Rehmannia glutinosa // Xibei Zhiwu Xuebao. 2004. V. 24. P. 1083-1087.
18.Park S.U., Kim H.H., Yu C.Y., Park C.H., Chae Y.A. Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation of Chinese Foxglove, Rehmannia glutinosa L. // Biotechnol. Lett. 2002. V. 24. P. 547-550.
19.Lim J.D., Yun S.J., Chung I.M., Yu C.Y. Resveratrol Synthase Transgene Expression and Accumulation of Resveratrol Glycoside in Rehmannia glutinosa // Mol. Breed. 2005. V. 16. P. 219-233.
20.Matsumoto M., Shoyama Y., Nishioka I., Iwai H., Wakimoto S. Identification of Viruses Infected in Rehmannia glutinosa L. var. purpurea Makino and Effect of Virus Infection on Root Yield and Iridoid Glycoside // Plant Cell Rep. 1989. V. 7. P. 636-638.
21.Ross-Karstens G.S., Ebert G., Ludders P. Influence of In Vitro Growth Conditions on Stomatal Density, Index and Aperture of Grape, Coffee and Banana Plantlets // Plant Tissue Cult. Biotechnol. 1998. V. 4. P. 21-27.
22.Paek K.Y., Yu K.J., Park S.J., Sung N.S., Park C.H. Field Performance Test of Micropropagated Rehmannia glutinosa and Virus Detection // Acta Hortic. 1995. V. 390. P. 121-126.
23.Seon J.H., Cui C.H., Paek K.Y., Yang C.S., Gao W.Y., Park C.H., Sung S.N. Effects of Air Exchange, Sucrose, and PPF on Growth of Rehmannia glutinosa under Enriched CO2 Concentration In Vitro // Acta Hortic. 1999. V. 502. P. 313-318.
24.Seon J.H., Cui Y.Y., Kozai T., Paek K.Y. Influence of In Vitro Growth Conditions on Photosynthetic Competence and Survival Rate of Rehmannia glutinosa Plantlets during Acclimatization Period // Plant Cell, Tissue Organ Cult. 2000. V. 61. P. 135-142.
25.Cui Y.Y., Hahn E.J., Kozai T., Paek K.Y. Number of Air Exchanges, Sucrose Concentration, Photosynthetic Photon Flux, and Differences in Photoperiod and Dark Period Temperatures Affect Growth of Rehmannia glutinosa Plantlets In Vitro // Plant Cell, Tissue Organ Cult. 2000. V. 62. P. 219-226.
26.Kim J.S., Chun J.C. Resistance of the Medicinal Plant Jiwhang (Rehmannia glutinosa) to Paraquat // Korean J. Weed Sci. 1992. V. 12. P. 374-379.
27.Chun J.C., Kim S.E., Ma S.Y. Inactivation of Paraquat by an Aqueous Extract of Rehmannia glutinosa // Pestic. Sci. 1997. V. 50. P. 5-10.
28.Chun J.C., Ma S.Y., Kim S.E., Lee H.J. Physiological Responses of Rehmannia glutinosa to Paraquat and Its Tolerance Mechanisms // Pestic. Biochem. Physiol. 1997. V. 59. P. 51-63.
29.Choi D.G., Yoo N.H., Yu C.Y., de los Reyes B., Yun S.J. The Activities of Antioxidant Enzymes in Response to Oxidative Stresses and Hormones in Paraquat-Tolerant Rehmannia glutinosa Plants // J. Biochem. Mol. Biol. 2004. V. 37. P. 618-624.
30.Zhao H.J., Tan J.F., Qi C.M. Photosynthesis of Rehmannia glutinosa Subjected to Drought Stress Is Enhanced by Choline Chloride through Alleviating Lipid Peroxidation and Increasing Proline Accumulation // Plant Growth Regul. 2007. V. 51. P. 255-262.
31.Chung I.M., Kim J.J., Lim J.D., Yu C.Y., Kim S.H., Hahn S.J. Comparison of Resveratrol, SOD Activity, Phenolic Compounds and Free Amino Acids in Rehmannia glutinosa under Water and Temperature Stress // Environ. Exp. Bot. 2006. V. 56. P. 44-53.
32.Lee B.K., Park M.R., Srinivas B., Chun J.C., Kwon I.S., Chung I.M., Yoo N.H., Choi K.G., Yun S.J. Induction of Phenylalanine Ammonia-lyase Gene Expression by Paraquat and Stress-Related Hormones in Rehmannia glutinosa // Mol. Cells. 2003. V. 16. P. 34-39.
33.Nishmura H., Sasaki H., Morota T., Chin M., Mitsuhashi H. Six Iridoid Glycosides from Rehmannia glutinosa // Phytochemistry. 1989. V. 28. P. 2705-2709.
34.Tomoda M., Miyamoto H., Shimizu N., Gonda R., Ohara N. Two Acidic Polysaccharides Having Reticuloendothelial System-Protentiating Activity from the Raw Root of Rehmannia glutinosa // Biol. Pharm. Bull. 1994. V. 17. P. 1456-1459.
35.Kitagawa I., Fukuda Y., Taniyama T., Yoshiawa M. Chemical Studies on Crude Drug Processing. VIII. On the Constituents of Rehmanniae radix. (2). Absolute Stereostructures of Rehmglutin C and Glutinoside Isolated from Chinese Rehmanniae Radix, the Dried Root of Rehmannia glutinosa Libosch. // Chem. Pharm. Bull. 1995. V. 43. P. 1096-1100.
36.Yoshikawa M., Fukuda Y., Taniyama T., Kitagawa I. Chemical Studies on Crude Drug Processing. IX. On the Constituents of Rehmanniae Radix. (3). Absolute Stereostructures of Rehmanniosides A, B, C and Rehmapicroside, Biologically Active Ionone Glucosides and a Monoterpene Glucoside Isolated from Chinese Rehmanniae Radix // Chem. Pharm. Bull. 1996. V. 44. P. 41-47.
37.Chun J.C., Kim J.C., Hwang I.T., Kim S.E. Acteoside from Rehmannia glutinosa Nullifies Paraquat Activity in Cucumis sativus // Pestic. Biochem. Physiol. 2002. V. 72. P. 153-159.
38.Wen X.S., Yang S.L., Ma X.J., Zheng J.H. HPLC Chromatogram Changes with Processing for Roots of Radix Rehmannia // Zhong Cao Yao. 2004. V. 35. P. 153-156.
39.Bai Y., Sun S., Fan K., Li J., Wang D., Lou Y. Identification of Categories of Radix Rehmannia by IR Spectroscopy and Compare Software // Zhong Yao Cai. 2005. V. 28. P. 281-284.
40.Shoyama Y., Nagano M., Nishioka I. Clonal Multiplication of Rehmannia glutinosa // Planta Med. 1983. V. 48. P. 124-125.
41.Mao W.Y., Liu Q.Q., Yu C.S., Zhu B.M. Studies on the Meristem Culture of Rehmannia glutinosa // Chin. Bull. Bot. 1983. V. 1. P. 443-446.
42.Wu M.F., Chen W.D. Tissue Culture of Tubers and Stems of Rehmannia glutinosa f. hueichingensis // Zhi Wu Sheng Li Xue Tong Xun. 1986. V. 22. P. 41.
43.Li M.J., Zhao J.B., Liu P. In Vitro Culture of Rehmannia glutinosa and Formation and Growth Regulation of Regenerated Plantlet // J. Henan Norm. Univ. 1996. V. 24. P. 60-63.
44.Xue J.P., Zhang A.M., Li M.J. Study on Shoot-Tip Culture and Plantlets Regeneration of Rehmannia glutinosa // J. Xinxiang Med. Coll. 2000. V. 1. P. 18-20.
45.Zhou Y.Q., Niu J.Y., Hao R.W., Lin X., Jia J.F., Hao J.G., Lu L.D. Hairy Root Induction and Plant Regeneration of Rehmannia glutinosa Libosch. f. Hueichingensis (Chao et Schih) Hsiao Transformation by Agrobacterium rhizogenes // J. Mol. Cell Biol. 2007. V. 40. P. 223-231.
46.Chae Y.A., Park S.U. Callus Induction and Somatic Embryogenesis in Suspension Culture of Rehmannia glutinosa // Hanguk Yakyong Changmul Hakhoe Chi. 1993. V. 1. P. 184-190.
47.Fila G., Ghashghaie J., Hoarau J., Cornic G. Photosynthesis, Leaf Conductance and Water Relations of In Vitro Cultured Grapevine Rootstock in Relation to Acclimatization // Physiol. Plant. 1998. V. 102. P. 411-418.
48.Zhang Z.C., Zhang L.F., Qiao Q., Wang Y.J., Jin X.L. Identification of Viral Pathogens of Rehmannia glutinosa Disease in Henan Province // Zhi Wu Bing Li Xue Bao. 2004. V. 34. P. 395-399.
49.Tian P. A Virus from Degenerated Rehmannia glutinosa in Honan // Acta Microbiol. Sinica. 1962. V. 8. P. 418-419.
50.Yu F.P., Yang L. A Mosaic Disease of Glutinosa rehmannia // Zhi Wu Bing Li Xue Bao. 1994. V. 24. P. 310.
51.Zhang Z.C., Lei C.Y., Zhang L.F., Yang X.X., Chen R., Zhang D.S. The Complete Nucleotide Sequence of a Novel Tobamovirus, Rehmannia Mosaic Virus // Arch. Virol. 2008. V. 153. P. 595-599.
52.Wang M., Li M.F., Huang L.Q., Chen Y.F., Wu Z.G., Li G.F., Wei M.S., Fang R.X. TMV and CMV Widely Infect Cultivated Rehmannia glutinosa Libosch. // Zhi Wu Bing Li Xue Bao. 2006. V. 36. P. 189-192.
53.Cao Y.X. The Resistance Mediated by Movement Protein and Coat Protein Gene from Rehmannia Mosaic Virus: Diss. Zhengzhou (China): Henan Agric. Univ., 2006.
54.Wen X.S., Li X.E., Yang S.L. Viral Diseases of Rehmannia glutinosa and Problems Demanding Prompt Solution // Zhong Cao Yao. 2001. V. 32. P. 662-664.
55.Liu H.Y., Wang F., Wang Y.P., Lu C.T. The Causes and Control of Continuous Cropping Barrier in Dihuang (Rehmannia glutinosa Libosch.) // Acta Agric. Boreali-Sinica. 2006. V. 21. P. 131-132.
56.Albach D.C., Li H.Q., Zhao N., Jensen S.R. Molecular Systematics and Phytochemistry of Rehmannia (Scrophulariaceae) // Biochem. Syst. Ecol. 2007. V. 35. P. 293-300.
57.Yan K., Zhao N., Li H.Q. Systematic Relationships among Rehmannia (Scrophulariaceae) Species // Xibei Zhiwu Xuebao. 2007. V. 27. P. 1112-1120.
58.Wang C.N., Möller M., Cronk Q.C.B. Phylogenetic Position of Titanotrichum oldhamii (Gesneriaceae) Inferred from Four Different Gene Regions // Syst. Bot. 2004. V. 29. P. 407-418.
59.Liu Z.G., Li M.J., Zhang Z.C. Establishment of Leaf Regenerating System for Genetic Transformation of Rehmannia glutinosa // J. Henan Agric. Sci. 2006. V. 11. P. 83-85.

 

ПОДПИСЬ К РИСУНКУ

Схематическое изображение теоретических моделей механизмов устойчивости R. glutinosa к параквату.
Обобщенные данные публикаций последних лет [28, 29, 32, 37]. СОД ( супероксиддисмутаза; АПО ( аскорбатпероксидаза; ПО ( пролиноксидаза.