УДК 581.1
КИНЕТИКА ИНДУКЦИИ АКТИВИРУЕМОГО ФОТОСИСТЕМОЙ I ОКИСЛЕНИЯ P700 В ЛИСТЬЯХ РАСТЕНИЙ И ЕЕ ЗАВИСИМОСТЬ ОТ ПРЕЭНЕРГИЗАЦИИ
© 2010 г. А. А. Булычёв*, В. Вреденберг**
* Кафедра биофизики, Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва
** Лаборатория физиологии растений, Университетский и научный центр, Вагенинген, Нидерланды
Поступила в редакцию 27.10.2009 г.
По изменениям поглощения ΔA810 наблюдали за изменениями редокс-состояния хлорофилла Р700 в листьях растений гороха (Pisum sativum L., сорт Премиум) во время и после облучения длинноволновым красным светом (ДКС) при варьировании условий предварительного освещения, а также при действии ингибиторов и протонофорного разобщителя фотосинтетического транспорта электронов. Циклический транспорт электронов (ЦТЭ) в хлоропластах листьев гороха протекал с наибольшей скоростью после предварительного освещения листьев белым светом и существенно подавлялся после предварительного действия ДКС. Подавление, вызванное ДКС, частично снималось при длительной темновой адаптации листа. Действие ДКС на адаптированные к темноте листья сопровождалось индукционными изменениями ЦТЭ, включающими стадии возрастания и последующего замедления ЦТЭ. Показано, что кинетические кривые окисления P700, индуцированного ДКС различной интенсивности после предварительного освещения листьев белым светом, хорошо моделируются сигмоидной кривой на основе уравнения с двумя переменными. В листьях, обработанных протонофором карбонилцианид-п-трифторметоксифенилгидразоном (FCCP), амплитуда сигналов ΔA810 в ответ на действие ДКС существенно снижалась, что указывает на зависимость скорости ЦТЭ от градиента pH на тилакоидной мембране.
______________
Сокращения: БС – белый свет; ДКС – длинноволновый красный свет; МВ – метилвиологен; ЦТЭ – циклический транспорт электронов; ФНР – ферредоксин-НАДФ-редуктаза; ЭТЦ – электрон-транспортная цепь; FCCP – карбонилцианид-п-трифторметоксифенилгидразон; P700 – хлорофилл реакционного центра ФС I; PQ – пластохинон.
Адрес для корреспонденции: Булычёв Александр Александрович. 119991 Москва, Московский государственный университет, биологический факультет, кафедра биофизики. Факс: 007 (495) 939-11-15; электронная почта: bulychev@biophys.msu.ru
Ключевые слова: Pisum sativum – циклический поток электронов – редокс-состояние P700 – ΔpH тилакоидов – метилвиологен – протонофор
     ВВЕДЕНИЕ
     Известно, что ФС I в хлоропластах растений способна осуществлять циклический транспорт электронов (ЦТЭ), наряду с переносом электронов от воды к НАДФ+ и на другие альтернативные акцепторы [1−3]. В суспензиях хлоропластов в присутствии ряда редокс-медиаторов ЦТЭ сопряжен с обратимым поглощением заряженного кофактора из среды, что облегчает выявление и изучение свойств искусственно создаваемого ЦТЭ [4]. Обнаружение ЦТЭ в интактных листьях представляет более трудную задачу, так как каждый компонент ЭТЦ отдает и получает электроны, в результате чего редокс-состояние переносчиков может оставаться неизменным длительное время. Несмотря на методические трудности, становится очевидным, что ЦТЭ играет важную роль в биоэнергетике и регуляции фотосинтеза (см. обзоры [5, 6]).
     Принято считать, что ЦТЭ, так же как и нециклический поток электронов, способен создавать электрохимический градиент Н+ [7]. Благодаря дополнительному синтезу АТФ, ЦТЭ способствует поддержанию оптимального соотношения АТФ/НАДФ∙Н [8]. Эта функция может быть особенно важной для запуска реакций фиксации СО2 в индукционный период фотосинтеза. Создание градиента протонов (ΔpH) на мембране тилакоидов при ЦТЭ может играть и регуляторную роль, поскольку ΔpH понижает фотохимическую активность ФС II, вызывая нефотохимическое тушение в условиях избыточного освещения и ограниченных возможностей для фиксации СО2 [8, 9]. Предполагают, что при низком потреблении НАДФ∙Н в реакциях цикла Кальвина–Бенсона поток электронов может быть перенаправлен на циклический путь вокруг ФС I, что приводит к созданию ΔрН и усилению нефотохимического тушения в ФС II.
     Один из подходов к изучению ЦТЭ в листьях растений основан на анализе изменений поглощения хлорофилла реакционного центра ФС I, Р700 [3, 10, 11]. За редокс-состоянием Р700 можно следить по дифференциальным изменениям поглощения в области 810 нм относительно 870 нм (ΔA810) [11]. Выявление ЦТЭ основано на анализе кинетики ΔA810 при освещении листа длинноволновым красным светом (ДКС), возбуждающим только ФС I. Поскольку поток электронов от ФС II к ФС I в этом случае исключен, ДКС вызывает почти полное окисление Р700 до P700+. В последующий темновой период Р700+ медленно восстанавливается за счет притока электронов к Р700 по циклическому пути, а также от доноров, присутствующих в строме хлоропласта [12, 13]. Разложение кинетической кривой темнового восстановления Р700+ на отдельные экспоненциальные компоненты позволяет сравнивать скорости притока электронов к Р700 по циклическому пути и из других источников [13−15]. Другой способ количественной оценки ЦТЭ основан на возбуждении листа белым светом (БС) в контрольных условиях и в присутствии метилвиологена (МВ), который эффективно забирает все электроны на акцепторной стороне ФС I и исключает тем самым ЦТЭ [15, 16].
     Значительные усилия были направлены на определение стационарных характеристик ЦТЭ в стрессовых условиях и выявление доли ЦТЭ в суммарном потоке электронов, проходящем через ФС I [8, 14, 15, 17]. Значительно меньше известно о динамике изменений ЦТЭ в индукционный период фотосинтеза. На основе анализа индукционных изменений ΔA810, вызываемых возбуждением ФС I под действием ДКС, удалось установить некоторые важные свойства ЦТЭ и определить количественно содержание доноров и акцепторов в области ФС I [6, 18, 19]. Установлено, что сложная кинетика окисления Р700 в ответах на действие ДКС отражает изменение соотношения ЦТЭ и потоков электронов по альтернативным путям от эндогенных (стромальных) доноров [12, 13]. Вместе с тем, свойства ЦТЭ охарактеризованы отнюдь неполно. Зависимость сигналов ΔA810 от действия ионофоров [20] может указывать на важную роль трансмембранного ΔpH тилакоидов в регуляции ЦТЭ, что требует более подробного изучения. Не решен вопрос о причинах немонотонности кинетических кривых ΔA810 при действии ДКС и БС. Нет достаточных сведений о влиянии условий предварительного освещения на скорость ЦТЭ.
     В связи с этим, цель данной работы состояла в изучении свойств ЦТЭ в листьях растений гороха на основе анализа индуцируемых ДКС сигналов ΔA810 при варьировании длительности темновой адаптации, продолжительности и качественного состава света в ходе предварительного освещения, а также при повышении Н+-проводимости тилакоидных мембран. Полученные результаты говорят о том, что в листьях, облучаемых ДКС после предварительного освещения БС, скорость ЦТЭ максимальна в начале освещения и замедляется в ходе световой экспозиции. Это замедление ослабляется в присутствии протонофорного индуктора H+-проводимости тилакоидных мембран, снимающего светозависимый электрохимический градиент протонов. В отличие от этого, в листьях, адаптированных к темноте, зависимость скорости ЦТЭ от времени имеет куполообразную форму с переходом через максимум.
       МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
     Растения гороха (Pisum sativum L., сорт Премиум) выращивали при освещении люминесцентными лампами (фотопериод 12 ч, освещенность 1.5 клк) и температуре 25ºС на минеральной среде, содержавшей 1 мМ MgSO4, 3 мM Ca(NO3)2, 1.25 мM KNO3 и 0.9 мM KH2PO4. В опытах использовали листья 10–14-дневных проростков. Перед измерениями отделенные листовые пластинки или неотделенные листья целых проростков выдерживали в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре.
     Окислительно-восстановительные переходы хлорофилла реакционного центра ФС I P700 регистрировали по разности изменений поглощения в области 810 и 870 нм (ΔA810) [11], используя метод, описанный в работе [20], с некоторыми модификациями. Для измерений использовали систему PAM-101 (частота модуляции измерительного света 100 кГц) в сочетании с двухволновым эмиттерно-детекторным блоком ED-P700DW ("Walz", Германия). Для подведения измерительного и действующего света к объекту, а также для отведения пропущенного ИК света на детектор использовали разветвленный оптоволоконный кабель. Лист располагали между зеркальной отражающей поверхностью и торцом световода.
     Объект освещали белым светом (БС) от источника со светодиодом Luxeon LXK2-PWN2-S00 (100 лм, 700 мА, 4100 K; "Lumileds", США). Длинноволновый красный свет получали путем помещения интерференционного светофильтра (717 нм) на выходе светодиодного источника или осветителя ОИ-28 (галогенная лампа, 70 Вт), снабженного электромагнитным затвором. Максимальные плотности потока квантов, создаваемые светодиодным излучателем (БС) и источником ДКС, составляли 1000 и 100 мкмоль/(м2 с) соответственно. Для предварительного освещения листа использовали осветитель KL-1500 ("Schott", Германия), соединенный с блоком управления РАМ-103 ("Walz"), задающим длительность светового импульса. Запись сигналов ΔA810 и управление световыми импульсами от светодиодного источника осуществляли посредством АЦП–ЦАП преобразователя PCI-6024E ("National Instruments", США) и программы WinWCP (Strathclyde Electrophysiology Software).
     Кинетические кривые темнового восстановления Р700+ аппроксимировали в виде суммы трех экспонент, используя возможности программы WinWCP. Отдельные компоненты характеризовали их амплитудами (А1–А3) и постоянными времени (τ1–τ3). Об активности ЦТЭ судили по относительной амплитуде быстрой компоненты A1/(A1 + A2 + A3). Ранее показано, что эта компонента отражает ЦТЭ [16].
     Влияние ингибиторов на сигналы ΔA810 изучали после инфильтрации листьев искусственной прудовой водой (0.1 мМ KCl, 1.0 мМ NaCl и 0.1 мМ CaCl2) с добавлением соответствующих реагентов. В шприц объемом 100 мл помещали отделенный лист и добавляли 20 мл инфильтрирующего раствора. С помощью поршня в шприце периодически создавали и удерживали пониженное давление. Продолжительность инфильтрации составляла 5–10 мин. В контрольных опытах использовали листья, инфильтрированные водой без добавления реагентов. При такой инфильтрации сохранялись все основные стадии ΔA810, включая начальный пик окисления и вторую волну окисления–восстановления P700 в ответ на действие БС. Амплитуда сигнала ΔA810 у инфильтрированных листьев была меньше, чем в интактном листе, так как инфильтрация понижает светорассеяние образца и сокращает оптический путь измерительного луча.
     На рисунках представлены результаты типичных опытов, выполненных не менее чем в 4-кратном воспроизведении. Кинетические кривые, представленные на рис. 1, получены путем усреднения по трем записям, сделанным в идентичных условиях. В работе использовали диурон, метилвиологен и протонофор FCCP (карбонилцианид-п-трифторметоксифенилгидразон) производства "Serva" (Германия), "Acros Organics" (Бельгия) и "Boehringer Mannheim" (Германия) соответственно.
    
     РЕЗУЛЬТАТЫ
Модуляция фотоокисления Р700 при воздействиях на транспорт электронов и проводимость мембран выявляет их влияние на ЦТЭ
    
     На рис. 1 показаны изменения поглощения ΔA810 в листьях гороха, вызванные действием ДКС умеренной интенсивности (40 мкмоль/(м2 с)) после 10-минутной темновой адаптации листа (кривые 1), через 30 с после предварительного освещения листа 10-секундным импульсом ДКС (кривые 2) и через 10 с после предварительного освещения листа белым светом (БС, 1100 мкмоль/(м2 с), 20 с) (кривые 3). Измерения проводили при четырех вариантах обработки листьев: (а) контроль (без обработки); (б) инфильтрация листа 200 мкМ раствором диурона; (в) инфильтрация листа 250 мкМ раствором метилвиологена; (г) инфильтрация 5 мкМ раствором FCCP.
     В контрольных условиях окисление Р700, индуцированное импульсом ДКС после 10 мин темноты (кривая 1), происходило медленнее, чем в ответ на повторное действие ДКС через 30 с после первого импульса (кривая 2). В случае, когда импульсу ДКС предшествовало 20-секундное освещение белым светом, индуцируемое ДКС окисление Р700 развивалось после длительного лаг-периода и не достигало стационарного уровня за время измерения (кривая 3), а темновое восстановление Р700+ заметно ускорялось.
     В работе [6] ДКС-индуцированные сигналы ΔA810, аналогичные кривой 2 на рис. 1а, наблюдали после долгой (> 10 мин) предварительной экспозиции листьев на свету, возбуждающем обе фотосистемы – ФС I и ФС II. Исходя из этого, был сделан вывод, что фотоокисление Р700 с крутым фронтом нарастания происходит в условиях с активной ферредоксин-НАДФ-редуктазой (ФНР), когда ЭТЦ полностью подготовлена для нециклического переноса электронов. В нашем опыте сигналы фотоокисления с крутым фронтом нарастания под действием ДКС (кривая 2) получены для условий, когда ФНР инактивирована в ходе предшествующей темновой адаптации. Как известно, восстановление НАДФ на интенсивном белом свету, происходящее при участии ФНР, начинается лишь после 10–20 с освещения листа. Очевидно, что длительная световая экспозиция (> 10 мин), обеспечивающая перенос электронов по нециклическому пути, не является необходимым условием для наблюдения кинетики окисления Р700, представленной кривой 2 на рис. 1а.
     Можно предполагать, что медленное S-образное нарастание ΔA810 в ответ на ДКС после предварительного освещения БС (рис. 1а, кривая 3) связано с восстановлением на белом свету пула пластохинона (PQ) и что восстановленный PQ используется при последующем действии ДКС в качестве источника электронов для ФС I. Для проверки этого предположения было изучено фотоокисление Р700 в листьях, инфильтрированных раствором диурона (рис. 1б). Из рисунка видно, что в обработанных диуроном листьях кинетические кривые ΔA810, измеренные после 10-минутной темновой адаптации и после предварительного освещения ДКС, были весьма схожи с наблюдаемыми в контрольных условиях (кривые 1, 2 на рис. 1а, 1б). Вместе с тем, диурон не только ингибировал влияние предварительного импульса БС, наблюдаемое в контрольных условиях, но и оказывал действие, аналогичное предварительному освещению ДКС (ср. кривые 3 на рис. 1а, 1б). Такое действие предварительной подсветки белым светом, по-видимому, обусловлено окислением пула PQ на белом свету в присутствии диурона. Обнаруженное влияние диурона указывает на то, что медленное окисление Р700 при экспозиции на ДКС после предварительного освещения БС в необработанных листьях связано с восстановленным редокс-состоянием PQ на момент воздействия ДКС.
     Возникает вопрос, используется ли восстановленный PQ в качестве донора электронов для линейного потока на ферредоксин и последующие акцепторы, либо восстановленный PQ обеспечивает запуск и активность ЦТЭ. Для ответа на этот вопрос листья инфильтрировали раствором метилвиологена (МВ), который эффективно забирает электроны от Fe–S центров в акцепторной части ФС I и препятствует их переносу на ферредоксин и в цепь ЦТЭ. Из рис. 1в видно, что в присутствии МВ кинетические кривые окисления Р700, индуцируемые ДКС после темновой адаптации и после предварительного освещения, практически совпадали. Наблюдаемая в контроле задержка окисления при действии ДКС после предоблучения белым светом исчезала полностью в присутствии МВ, так же как после инфильтрации диуроном (кривые 3 на рис. 1а–1в). Темновое восстановление Р700+ после импульса ДКС в присутствии МВ происходило заметно медленнее, чем в контроле или в листьях, инфильтрированных диуроном: постоянная времени темновой релаксации ΔA810 составляла 7.0–9.5 с. Исчезновение лаг-периода в сигнале ΔA810 после предварительного освещения БС в присутствии МВ говорит о том, что лаг-период на кривой окисления Р700 (рис. 1а, кривая 3) не связан с нециклическим потоком электронов через ФС I от восстановленного PQ в качестве донора электронов. Следовательно, медленное фотоокисление Р700 под действием ДКС после предварительного освещения листьев белым светом в контрольных условиях отражает ЦТЭ вокруг ФС I. Ускоренное темновое восстановление P700+ при выключении света в период медленного фотоокисления Р700 подтверждает предположение о том, что предварительное освещение БС сдвигает соотношение циклического и нециклического потоков в пользу ЦТЭ.
     Подавление ЦТЭ под действием МВ проявлялось не только в повышении крутизны нарастания ΔA810, но и в замедлении темнового восстановления Р700+ после импульса ДКС по сравнению с ΔA810 в контрольных и инфильтрированных диуроном листьях (медленное восстановление Р700+ отражает низкую скорость поступления электронов к Р700+ от эндогенных восстановителей, присутствующих в строме). Результаты, представленные на рис. 1а, отражают существенные свойства ЦТЭ, создаваемого ФС I. Можно утверждать, что ЦТЭ, индуцируемый при действии ДКС, значительно усиливается после предварительного освещения листа белым светом. Создаваемый ФС I циклический поток постепенно замедляется в ходе освещения ДКС. Вследствие этого ЦТЭ оказывается сильно или полностью подавленным при последующих воздействиях ДКС. После длительной темновой адаптации листа способность ФС I поддерживать ЦТЭ проявлялась намного слабее, чем после предварительного освещения БС (рис. 1а, кривые 1, 3). Причины более низкой активности ЦТЭ после темновой адаптации, по сравнению с условиями предварительного освещения БС, требуют дальнейшего изучения. Один из факторов регуляции ЦТЭ, возможно, связан с различиями в уровне восстановления PQ при указанных воздействиях.
     Предполагаемая функциональная роль ЦТЭ состоит в формировании протондвижущей силы (ΔμH) в тилакоидах, которая вносит вклад в синтез АТФ. Исходя из этого, можно ожидать, что генерация ΔpH при освещении листа ДКС может служить важным фактором, замедляющим ЦТЭ параллельно с накоплением фотохимически неактивной окисленной формы P700+. Для проверки этого предположения листья инфильтрировали раствором FCCP – липофильным H+-ионофором, который повышает проводимость мембраны для Н+ и снижает трансмембранный ΔμH (ΔpH). Как видно из рис. 1г, сигналы ΔA810 в ответ на ДКС в присутствии FCCP были значительно меньше, чем в контроле и других вариантах опытов (рис. 1а–1в). Ослабление фотоокисления Р700 в присутствии FCCP свидетельствует о том, что снижение ΔpH стимулирует ЦТЭ, обеспечивая баланс скоростей окисления и восстановления Р700 (фотохимическое разделение зарядов и приток электронов от доноров ФС I соответственно). Скорости начального возрастания ΔA810 при действии ДКС после темновой адаптации листа и после предварительного освещения ДКС, заметно различались, так же как в контрольных условиях (рис. 1г, кривые 1, 2). В листьях, обработанных FCCP, предварительное освещение белым светом вызывало заметное повышение амплитуды ΔA810 в ответ на последующий импульс ДКС (кривая 3) и замедляло скорость темновой релаксации. Такое влияние БС было противоположно эффектам, вызываемым белым светом в необработанных листьях. Подавление ДКС-индуцируемого накопления Р700+ говорит о том, что присутствие протонофора ослабляет торможение ЦТЭ, развивающееся в норме при действии ДКС. Это, в свою очередь, свидетельствует о том, что постепенное замедление ЦТЭ при действии ДКС связано с формированием ΔpH при циклическом потоке электронов.
    
Зависимость кинетики фотоокисления Р700 от предварительных световых условий
    
     Кинетические кривые ΔA810, индуцируемые в адаптированных к темноте листьях при действии ДКС высокой интенсивности, включают точки перегиба, которые часто незаметны при более низкой интенсивности ДКС, как в случае опытов, представленных на рис. 1. Немонотонный ход кривых окисления Р700 отчетливо виден при высоких интенсивностях ДКС [19]. На рис. 2а приведены индукционные изменения ΔA810 в ответ на действие ДКС высокой интенсивности (100 мкмоль/(м2 с)), измеренные при разных периодах темновой инкубации после предшествующего 10-секундного импульса ДКС той же интенсивности. Видно, что начальные изменения редокс-состояния Р700, проявляющиеся в виде переходного пика, сменяются более медленной S-образной стадией накопления P700+. Две кинетически различные составляющие сигнала – первый пик окисления–восстановления и последующее плавное накопление Р700+ до стационарного уровня – по-разному менялись в зависимости от условий предварительного освещения. Переходный пик окисления существенно ослаблялся с увеличением темнового периода (рис. 2б), предшествующего освещению ДКС, и полностью исчезал после предварительного освещения 20-секундным импульсом БС (рис. 2в). Более короткий импульс БС (200 мс) также вызывал сильное, но неполное подавление первого пика окисления P700+ (рис. 2г).
     В отличие от быстрого пика фотоокисления, S-образная стадия медленного окисления Р700 полностью исчезала после предварительного освещения ДКС (рис. 2а, кривая 1), но становилась более выраженной при увеличении длительности темновой инкубации (рис. 2а, кривые 2–5) и проявлялась в чистом виде (без наложения других компонент) после импульса белого света (рис. 2в, 2г). Следует отметить некоторое сходство в эффектах длительной темновой адаптации и влиянии 20-секундного предварительного освещения БС: стационарный уровень окисления Р700, достигаемый к концу импульса ДКС, был в обоих случаях ниже, а темновое восстановление Р700+ происходило быстрее, чем после коротких периодов темноты (рис. 2а, кривая 5 и рис. 2в, кривая 2). Если действию ДКС предшествовал короткий импульс БС (200 мс), то темновое восстановление Р700 происходило с такой же скоростью, как без предварительного освещения (рис. 2г). Эти наблюдения согласуются с представлением о том, что неполное окисление Р700 при действии ДКС обусловлено существованием ЦТЭ, который препятствует фотохимическому окислению P700.
    
Формальное описание кинетики монотонного окисления Р700 на ДК свету
и анализ темнового восстановления Р700+
    
     Сигмоидные кинетические кривые фотоокисления Р700 в листьях, подвергнутых действию ДКС после предварительного импульса БС, хорошо аппроксимируются математическими выражениями. Одна из наиболее простых формул, включающая всего две переменных, известна как уравнение Ходжкина–Хаксли: A(t) = A(1 – exp(–t/τ))P, где А – амплитуда изменений поглощения ΔА810, τ – характеристическая постоянная времени, определяющая (при постоянном P) время задержки и крутизну ответной реакции, а P – эмпирическая константа, связанная в основном с длительностью задержки изменений A(t) при постоянной величине τ. На рис. 3а показан пример экспериментальной записи ΔA810 и соответствующая расчетная кривая. Величина τ существенно возрастала при снижении интенсивности ДКС. Величина обратная времени τ (константа скорости) менялась примерно пропорционально интенсивности ДКС (рис. 3б), что указывает на связь этого параметра с фотохимическим процессом. Такое формальное описание кинетики ΔA810 может служить удобным подходом к количественному описанию окисления P700 при действии ДКС после предварительного освещения белым светом. В ходе дальнейших исследований потребуется обосновать применение предложенного уравнения для описания экспериментальных кривых ΔA810 и раскрыть физиологическое значение входящих в него переменных.
     Циклический перенос электронов в стационарном режиме не должен сопровождаться накоплением P700+. Поэтому очевидно, что наблюдаемое накопление P700+ при действии ДКС отражает монотонное замедление ЦТЭ. Это заключение относится к случаю, когда активность ЦТЭ максимальна с самого начала импульса ДКС (листья, предварительно экспонированные на БС; рис. 2в, 2г, 3а). У листьев, инкубированных в темноте, начальная переходная стадия в немонотонных сигналах ΔA810, показанная на рис. 2а, по-видимому, отражает окисление донорной стороны ФС I при некомпенсированном переносе электронов из донорной в акцепторную часть, происходящее на фоне ЦТЭ. Чтобы проследить динамику ЦТЭ в листьях, адаптированных к темноте, мы анализировали темновую релаксацию сигналов ΔA810 после действия импульсов ДКС различной длительности.
     В соответствии с опубликованными данными [15, 16], кинетические кривые темнового восстановления Р700+, накопленного в период действия ДКС, хорошо аппроксимируются суммой трех экспонент. Быстрая компонента с характерной постоянной времени τ1 = 150–300 мс предположительно связана с ЦТЭ, а две медленные компоненты с характерными временами τ2 ~ 1.5 с и τ3 ~10 с – отражают потоки электронов к P700 от различных восстановителей в составе стромы. Мы использовали разделение компонент темновой релаксации сигнала ΔA810 для того, чтобы выяснить, как меняется активность ЦТЭ на разных стадиях индукционной кривой. Пользуясь этим подходом, мы нашли, как изменяется амплитуда быстрой компоненты темновой релаксации ΔA810 после освещения ДКС разной длительности. Для этого перед каждым измерением лист выдерживали в темноте в течение 7 мин, а затем давали импульс ДКС заданной длительности (рис. 4а). Кривые темновой релаксации ΔA810 разлагали на компоненты, и определяли относительный вклад быстрой составляющей (показатель ЦТЭ) в суммарную амплитуду сигнала. Полученные результаты представлены на рис 4б. Из рис. 4а и 4б видно, что относительная амплитуда быстрой компоненты А1/(А1 + А2 + А3) в кривой релаксации сигнала ΔA810 возрастала при увеличении длительности освещения примерно до 1 с. К этому времени на кинетических кривых ΔA810 отмечаются точки перегиба. Последующее после периода задержки S-образное нарастание уровня Р700+ сопровождалось постепенным уменьшением относительного вклада быстрой, отражающей ЦТЭ компоненты в темновое восстановление P700+. График на рис. 4б соответствует предположению о том, что в адаптированных к темноте хлоропластах ЦТЭ претерпевает быструю индукцию под действием ДКС, а затем постепенно замедляется параллельно с накоплением P700+.
Влияние FCCP на индукционные переходы ΔA810 при действии БС и ДКС
    
     На рис. 5 показаны типичные изменения ΔA810, индуцированные импульсом БС в предварительно освещенном листе после его инфильтрации водой без добавления и с добавлением FCCP. В отсутствие протонофора сигнал ΔA810 включал две волны окисления P700. Предполагают, что вторая волна фотоокисления P700, возникающая при повторном воздействии БС, связана с активацией ФНР [10, 20, 21]. В наших опытах установлено, что протонофор FCCP устраняет вторую волну фотоокисления P700.
     Как уже было отмечено выше (см. рис. 1г), FCCP подавлял амплитуду S-образной компоненты в сигналах ΔA810, индуцируемых действием ДКС. Учитывая сходное влияние FCCP на кинетические кривые ΔA810, индуцируемые действием ДКС и БС, нельзя исключать, что вторая волна в ответной реакции ΔA810 на действие белого света связана с изменениями активности ЦТЭ.
    
ОБСУЖДЕНИЕ
    
     При анализе сигналов ΔA810 в листьях растений следует учитывать несколько процессов, происходящих после первичного разделения зарядов в ФС I: рекомбинация зарядов в реакционном центре, циклический и нециклический потоки электронов, а также накопление Р700+ в случае недостатка донора электронов [22]. Задержанное медленное изменение состояния Р700 при действии ДКС после предварительного освещения БС (рис. 1а, 3а) не означает низкой фотохимической эффективности ФС I, хотя быстрое окисление Р700 под действием интенсивного БС (рис. 5) может создать такое впечатление. Ранее показано, что при облучении листьев ДКС после предварительного освещения БС высокая фотохимическая активность ФС I проявляется в эффективной генерации электрического потенциала тилакоидов, тогда как электрогенный эффект резко снижался после предварительного освещения ДКС [23]. Сравнение электрогенной активности ФС I после предварительного освещения БС и ДКС с соответствующими ответными реакциями ΔA810 (не показано) свидетельствует о том, что возбуждение ФС I под действием ДКС после предварительного освещения БС вызывает эффективный электрогенез при незначительных изменениях редокс-состояния Р700. И, наоборот, низкая электрогенная активность ФС I в листьях, предварительно освещенных ДКС, сопровождается накоплением P700+.
     Сходство сигналов ΔA810 в ответах на ДКС после предварительного освещения ДКС (рис. 1а, кривая 2) и после обработки листа ингибитором ЦТЭ метилвиологеном (рис. 1в) говорит о том, что предварительное облучение листа ДКС приводит к сильному подавлению ЦТЭ. С другой стороны, предварительное освещение листа белым светом вызывало максимальную активацию ЦТЭ, что проявлялось в медленном нарастании сигнала ΔA810 после длительного латентного периода (рис. 1а, кривая 3), чувствительном к действию МВ (рис. 1в, кривая 3). Стимуляция ЦТЭ после предварительного облучения БС проявлялась особенно сильно в случае длительной (20 с) предварительной подсветки, но сохранялась также после коротких (0.2 с) интервалов предварительного освещения (рис. 2в, 2г). Это говорит о том, что стимулирующее влияние предварительного освещения на ЦТЭ не связано с фотоактивацией переносчиков электронов в акцепторной части ФС I (для активации ФНР требуются периоды освещения ≥ 1–10 с), а опосредовано электрон-транспортными реакциями на участке между ФС II и ФС I.
     Функционирование ЦТЭ проявлялось в более низком содержании Р700+ на разных стадиях индукционной кривой, а также в более быстром темновом восстановлении Р700+ (рис. 1а, кривая 3). Аналогичные изменения индукционных кривых ΔA810 наблюдали при обработке листьев протонофором FCCP. Это свидетельствует о том, что ЦТЭ сопряжен с генерацией ΔpH, нарастание которого замедляет ЦТЭ. В адаптированных к темноте листьях функционирование ЦТЭ при освещении ДКС не зависит от присутствия в среде диурона, о чем свидетельствует сравнение кривых 1 и 2 на рис. 1а и 1б. Вместе с тем, предварительное освещение листа в присутствии диурона вызывало полное подавление ЦТЭ, по-видимому, вследствие окисления пула PQ и других доноров ФС I в ходе предварительного освещения (ср. кривые 3 на рис. 1а и 1б).
     Немонотонный ход ΔA810 при интенсивном освещении ДКС говорит о том, что на разных стадиях индукционной кривой электроны поступают к Р700+ из разных источников – по циклическому пути, от стромальных доноров и, возможно, от ФС II [19]. Хотя природа переходной стадии восстановления Р700+ при освещении ДКС после темновой адаптации остается неясной, происхождение быстрого окисления Р700 под действием ДКС в этих условиях не вызывает больших разногласий. Предполагают, что эта стадия отражает некомпенсированное перемещение электронов от доноров ФС I в ее акцепторную часть (ферредоксин + ФНР) [19]. Суммарная емкость акцепторной стороны оценивается в 6–8 электронов в расчете на один Р700, а емкость донорной части (P700 + пластоцианин) составляет 4 электрона в расчете на один Р700 [19].
     Представленная на рис 3а S-образная кривая окисления Р700 отражает динамику ЦТЭ в "чистом виде" без наложения других компонент. После предварительного импульса БС скорость переноса электронов максимальна в начале индукционной кривой и замедляется по мере возрастания ΔpH, уменьшения доли фотохимически активной формы Р700 и неизбежной утечки электронов из циклической цепи на альтернативные акцепторы (О2, нитрит и др.). Такие S-образные кинетические кривые хорошо описываются уравнением, включающим постоянную времени τ и параметр P, связанный предположительно со скоростью генерации ΔpH. Вопрос об интерпретации этих параметров остается открытым и требует дальнейшего исследования.
     В листе, предварительно освещенном белым светом, максимальная активность ЦТЭ достигается непосредственно после включения ДКС. В отличие от этого, ЦТЭ, вызванный ДКС после темновой адаптации листа, характеризовался низкой начальной скоростью. Действительно, вклад связанной с ЦТЭ быстрой компоненты темнового восстановления P700 [16], возрастал в течение 1.0–1.5 с момента включения, а затем снижался (рис. 4б).
     В литературе обсуждают возможность, что разные компоненты в сложных изменениях ΔA810, аналогичных кривым на рис. 2, относятся к разным пулам реакционных центров ФС I, осуществляющим нециклический или циклический транспорт электронов [8]. Однако впоследствии эта точка зрения была пересмотрена [19, 24]. Действительно, если бы вклады этих пулов были аддитивны, то подавление одной из компонент сигнала ΔA810 после предварительного освещения БС или ДКС (см. рис. 2а и 2в) должно было приводить к снижению суммарной амплитуды ΔA810. Однако в действительности указанные воздействия не оказывали существенного влияния на общую амплитуду сигналов ΔA810. Это позволяет рассматривать следующую гипотезу. Функциональная активность и способность к преобразованию энергии у ФС I основана на динамической гетерогенности ее реакционных центров, осуществляющих циклический или нециклический транспорт электронов [24]. Динамические свойства такой комплементарной гетерогенности проявляются и могут быть поняты при изучении кинетики ДКС-индуцированных ответных реакций ΔA810 в зависимости от световых и темновых условий на стадии предварительной обработки листа.
     Важная задача для понимания процессов, связанных с функционированием ЦТЭ, заключается в разработке математической модели, которая бы описывала накопленные к настоящему времени экспериментальные данные. Модель должна описывать кинетические кривые с учетом констант скоростей реакций в области ФС I и электрохимических мембранных процессов. Важная роль электрохимических эффектов подтверждается при исследовании фотореакций, протекающих в ФС II и ее окружении [25].
     Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект № 07-04-00132).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.  Schreiber U., Hormann H., Asada K., Neubauer C. O2-Dependent Electron Flow in Spinach Chloroplasts: Properties and Possible Regulation of the Mehler Ascorbate Peroxidase Cycle // Photosynthesis: From Light to Biosphere / Ed. Mathis P. Dordrecht: Kluwer, 1995. P. 813-818.
2.  Joet T., Cournac L., Peltier G., Havaux M. Cyclic Electron Flow around Photosystem I in C3 Plants. In Vivo Control by the Redox State of Chloroplasts and Involvement of the NADH-Dehydrogenase Complex // Plant Physiol. 2002. V. 128. P. 760-769.
3.  Joliot P., Joliot A. Quantification of Cyclic and Linear Flows in Plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 4913-4918.
4.  Bulychev A.A., Voorthuysen T.V., Vredenberg W.J. Transmembrane Movements of Artificial Redox Mediators in Relation to Electron Transport and Ionic Currents in Chloroplasts // Physiol. Plant. 1996. V. 98. P. 605-611.
5.  Johnson G.N. Cyclic Electron Transport in C3 Plants: Fact or Artefact? // J. Exp. Bot. 2005. V. 56. P. 407-416.
6.  Joliot P., Joliot A. Cyclic Electron Flow in C3 Plants // Biochim. Biophys. Acta. 2006. V. 1757. P. 362-368.
7.  Hald S., Pribil M., Leister D., Gallois P., Johnson G.N. Competition between Linear and Cyclic Electron Flow in Plants Deficient in Photosystem I // Biochim. Biophys. Acta. 2008. V. 1777. P. 1173-1183.
8.  Golding A.J., Finazzi G., Johnson G.N. Reduction of the Thylakoid Electron Transport Chain by Stromal Reductants − Evidence for Activation of Cyclic Electron Transport upon Dark Adaptation or under Drought // Planta. 2004. V. 220. P. 356-363.
9.  Miyake C., Miyata M., Shinzaki Y., Tomizawa K.-I. CO2 Response of Cyclic Electron Flow around PSI (CEF-PSI) in Tobacco Leaves: Relative Electron Fluxes through PSI and PSII Determine the Magnitude of Non-Photochemical Quenching (NPQ) of Chl Fluorescence // Plant Cell Physiol. 2005. V. 46. P. 629-637.
10.  Harbinson J., Hedley C.L. Changes in P-700 Oxidation during the Early Stages of the Induction of Photosynthesis // Plant Physiol. 1993. V. 103. P. 649-660.
11.  Klughammer C., Schreiber U. Measuring P700 Absorbance Changes in the Near Infrared Spectral Region with a Dual Wavelength Pulse Modulation System // Photosynthesis: Mechanisms and Effects / Ed. Garab G. Dordrecht: Kluwer, 1998. P. 4357-4360.
12.  Bukhov N., Carpentier R. Alternative Photosystem I-Driven Electron Transport Routes: Mechanisms and Functions // Photosynth. Res. 2004. V. 82. P. 17-33.
13.  Егорова Е.А., Дроздова И.О., Бухов Н.Г. Индуцированные дальним красным светом модуляции активности альтернативных путей электронного транспорта, связанных с фотосистемой I // Физиология растений. 2005. Т. 805. С. 805-813.
14.  Fan D.-Y., Hope A.B., Jia H., Chow W.S. Separation of Light-Induced Linear, Cyclic and Stroma-Sourced Electron Fluxes to P700+ in Cucumber Leaf Discs after Pre-Illumination at a Chilling Temperature // Plant Cell Physiol. 2008. V. 49. P. 901-911.
15.  Jia H., Oguchi R., Hope A.B., Barber J., Chow W.S. Differential Effects of Severe Water Stress on Linear and Cyclic Electron Fluxes through Photosystem I in Spinach Leaf Discs in CO2-Enriched Air // Planta. 2008. V. 228. P. 803-812.
16.  Бухов Н.Г., Егорова Е.А. Идентификация ферредоксин-зависимого циклического переноса электронов вокруг фотосистемы I в интактных листьях с помощью кинетики темнового восстановления Р700+ // Физиология растений. 2005. Т. 52. С. 325-330.
17.  Clarke J.E., Johnson G.N. In Vivo Temperature Dependence of Cyclic and Pseudocyclic Electron Transport in Barley // Planta. 2001. V. 212. P. 808-816.
18.  Oja V., Eichelmann H., Peterson R.B., Rasulov B., Laisk A. Deciphering the 820 nm Signal: Redox State of Donor Side and Quantum Yield of Photosystem I in Leaves // Photosynth. Res. 2003. V. 78. P. 1-15.
19.  Talts E., Oja V., Ramma H., Rasulov B., Anijalg A., Laisk A. Dark Inactivation of Ferredoxin-NADP Reductase and Cyclic Electron Flow under Far-Red Light in Sunflower Leaves // Photosynth. Res. 2007. V. 94. P. 109-120.
20.  Булычев А.А., Безменов Н.Н., Рубин А.Б. Влияние электрохимического градиента протонов на перенос электронов в фотосистеме I листьев гороха // Физиология растений. 2008. Т. 55. С. 483-491.
21.  Schansker G., Srivastava A., Govindjee, Strasser R.J. Characterization of the 820-nm Transmission Signal Paralleling the Chlorophyll a Fluorescence Rise (OJIP) in Pea Leaves // Funct. Plant Biol. 2003. V. 30. P. 785-796.
22.  Ke B. Photosynthesis Photobiochemistry and Photobiophysics // Advances in Photosynthesis. V. 10 / Dordrecht: Kluwer, 2001. 763 p.
23.  Bulychev A.A., Andrianov V.K., Kurella G.A., Litvin F.F. Photoinduction Kinetics of Electrical Potential in a Single Chloroplast as Studied with Micro-Electrode Technique // Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 430. P. 336-351.
24. Breyton C., Nandha B., Johnson G.N., Joliot P., Finazzi J. Redox Modulation of Cyclic Electron Flow around Photosystem I in C3 Plants // Biochemistry. 2006. V. 45. P. 13 465-13 475.
25.  Vredenberg W., Durchan M., Prášil O. Photochemical and Photoelectrochemical Quenching of Chlorophyll Fluorescence in Photosystem II // Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1787. P. 1468-1478.
Подписи к рисункам

Рис. 1. Кинетические кривые окисления P700, наблюдаемые при освещении листьев гороха длинноволновым красным светом (ДКС, 40 мкмоль/(м2 с)) после 10-минутной темновой адаптации (кривые 1); через 30 с после предварительного 10-секундного освещения ДКС (кривые 2) и через 10 с после предварительного 20-секундного освещения белым светом (БС, 1100 мкмоль/(м2 с)) (кривые 3) в различных экспериментальных условиях.
а − необработанный лист (контроль); б − лист, инфильтрированный 0.2 мМ диуроном; в − инфильтрация 0.25 мМ метилвиологеном; г − инфильтрация 5 мкМ карбонилцианид-п-трифторметоксифенилгидразоном. Начало импульса ДКС соответствует времени t = 1 c.

Рис. 2. Влияние условий предварительного освещения на окисление P700 при действии ДКС (100 мкмоль/(м2 с)) и на последующее темновое восстановление P700+ в листьях гороха.
а − зависимость кинетических кривых ДКС-индуцированного окисления P700 в листьях гороха от длительности темнового интервала (Т) после предшествующего 10-секундного освещения ДКС: 1 − темновой период (Т) = 30 с, 2 − Т = 2 мин, 3 − Т = 5 мин, 4 − Т = 20 мин, 5 − Т = 40 мин; б − зависимость относительной амплитуды переходного максимума на индукционных кривых ∆A810 при действии ДКС от длительности темновой адаптации листа. Atotal – общая амплитуда изменений ∆A810, A1 – амплитуда начального пика на кривых ∆A810; в – полное подавление начальной переходной стадии в сигналах ∆A810, индуцированных ДКС после предварительного 20-секундного освещения белым светом (1100 мкмоль/(м2 с)). Записи сделаны через 2 мин Т после предварительного освещения ДКС (1) и через 10 с Т после 20-секундного освещения белым светом (2); г – сильное подавление переходного "плеча" в ДКС-индуцированных сигналах ∆A810 после предварительного освещения 0.2-секундным импульсом БС (1100 мкмоль/(м2 с)). Записи сделаны через 6 мин Т после 10-секундного освещения ДКС (1) и через 10 с Т после 0.2-секундного импульса БС (2).

Рис. 3. Кинетические кривые ДКС-индуцированного окисления Р700 при циклическом транспорте электронов.
а – сравнение экспериментальных данных и аппроксимирующей кривой. Листья гороха адаптировали 15 мин в темноте, освещали 200-миллисекундным импульсом БС (1100 мкмоль/(м2 с)), а затем после 5 с темноты подвергали действию ДКС (40 мкмоль/(м2 с)). Экспериментальные данные показаны значками (круги), расчетная кривая – сплошной линией. На вставке приведены уравнение, используемое для аппроксимации, и значения фитирующих параметров. Момент включения ДКС соответствует времени t = 0; б – зависимость параметра, обратного постоянной времени τ в уравнении аппроксимации, от интенсивности освещения ДКС. Лист выдерживали 7 мин в темноте, освещали 1-секундным импульсом БС (1100 мкмоль/(м2 с)) и спустя 10 с подвергали действию ДКС различной интенсивности. Приведены средние значения и стандартные ошибки.

Рис. 4. Зависимость кинетики темнового восстановления Р700+ в листьях гороха от длительности предшествующей экспозиции на ДКС (100 мкмоль/(м2 с)).
а – кинетические кривые ∆A810, индуцированные импульсами ДКС различной длительности после 7 мин темновой адаптации листа; длительность импульсов ДКС для кривых 1–7 составляла, соответственно, 0.22, 0.35, 1.1, 1.9, 2.35, 3.4 и 6.1 с; б – относительный вклад быстрой компоненты в сигналах темнового восстановления Р700+ (A1/(A1 + A2 + A3)), оцененный на разных стадиях в период освещения ДКС после 7 мин темновой адаптации листа.

Рис. 5. Влияние протонофора FCCP на изменения ΔA810 в листьях гороха, вызванные импульсом белого света (БС, 1000 мкмоль/(м2 с)).
1 – сигналы ∆A810 в инфильтрированном водой листе, вызванные импульсом БС после предварительного 20-секундного освещения БС (1100 мкмоль/(м2 с)); 2 – селективное подавление замедленной волны окисления Р700 в аналогичном опыте при инфильтрации листа водой с добавлением 10 мкМ FCCP.