УДК 581.1

ФЕНОТИПИЧЕСКОЕ ПРОЯВЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА КСИЛОГЛЮКАНАЗЫ ИЗ Penicillium canescens В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ ОСИНЫ

© 2012 г. К. А. Шестибратов*, А. С. Подрезов*, М. А. Салмова*, Ю. А. Ковалицкая*, 

Е. О. Видягина*, Д. С. Логинов**, О. В. Королева**, А. И. Мирошников*

* Филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки

 Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино

** Федеральное государственное бюджетное учреждение науки 

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва

Поступила в редакцию 08.11.2011 г.

Ксилоглюканы растений имеют важное значение в процессах растяжения клеточных стенок, определяют их механические свойства и, тем самым, влияют на рост и морфологию отдельных клеток и целых органов. Особую физиологическую роль ксилоглюканы как один из основных компонентов гемицеллюлозы играют в древесных растениях. С целью изучения физиологической роли ксилоглюканов получены трансгенные растения осины (Populus tremula L.) с рекомбинантным геном sp-Xeg ксилоглюканазы из гриба Penicillium canescens. Конститутивная экспрессия гена sp-Xeg в гетерологичном окружении на уровне транскрипции подтверждена методом ОТ-ПЦР. Анализ белковых экстрактов из листьев тепличных растений и микропобегов in vitro показал повышение ксилоглюканазной активности у трансгенных линий. Максимальное повышение активности в экстрактах из листьев составило 1.6 (клон PtXVXeg1b), из микропобегов in vitro – 2.1 (клон PtXVXeg1c). У трансгенных растений отмечено снижение удельного содержания пентозанов в древесине. В контрольных растениях (генотип Pt) оно составляло 148 мг/г сухого веса, тогда как в исследованных клонах (PtXVXeg1a, PtXVXeg1b, PtXVXeg1c) варьировало в диапазоне от 100 до 140 мг/г сухого веса. Максимальное снижение (на 31%) содержания пентозанов зафиксировано в линии PtXVXeg1с, оно составляло 102.1 ± 1.5 мг/г сухого веса. Сравнительный анализ морфологии листьев выявил увеличениие длины черешка и сокращение длины главной жилки у трансгенных линий. Отношение длины черешка к длине главной жилки у растений контрольной группы равнялось 0.49, тогда как у трансгенных растений оно варьировало от 0.51 до 0.66. Достоверное увеличение этого критерия отмечено у 12 линий из 14.

-----------------------------------

Сокращения: ДГЖ - длина главной жилки листа; ДЧ - длина черешка; ИМК – индолилмасляная кислота; СТАВ – цетилтриметиламмониумбромид (от cetyltrimetyl ammonium bromide); nptII – ген, кодирующий неомицинфосфотрансферазу; GUS – ген, кодирующий Я-глюкуронидазу.

Адрес для корреспонденции: Шестибратов Константин Александрович. 142290 Пущино Московской обл., Проспект Науки, 6. Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Электронная почта: schestibratov@fibkh.serpukhov.su

Ключевые слова: Populus tremula - Penicillium canescens - конститутивная экспрессия – активность ксилоглюканазы – пентозаны - морфология листьев

 

ВВЕДЕНИЕ

 

Ксилоглюканы наряду с ксиланами и маннанами являются основными полисахаридами гемицеллюлозы. Они жестко связаны с целлюлозными микрофибрилами, стягивая их, формируют прочный, но гибкий полисахаридный матрикс [1]. Таким образом, они в значительной степени определяют механические характеристики клеточных стенок и, в итоге, влияют на морфологию клеток и органов. При ростовых процессах клеточные стенки должны растягиваться. Они обладают этой способностью также благодаря ксилоглюканам, гидролиз которых активируется ауксинами. В результате полисахаридный матрикс клеточной стенки становится эластичным, целлюлозные нити скользят относительно друг друга, клеточная стенка растягивается [2].

В связи с важной физиологической ролью ксилоглюканов в морфогенезе клеточной стенки особое внимание уделяется ферментам, участвующим в метаболизме этих полисахаридов. Известны мутантные формы арабидопсиса mur1 и mur2 с нарушенным биосинтезом ксилоглюканов. В обоих случаях у растений обнаружили сильное снижение содержания фукозы, которая является терминальным гликозидным остатком полисахаридной цепи ксилоглюканов. Мутанты mur2, дефектные по гену ксилоглюканфукозилтрансферазы 1 (AtFUT1) [3], содержат не более 2% от нормы фукозилированных ксилоглюканов [4]. Предполагают, что фукозилированные ксилоглюканы являются источником сигнальных молекул, контролирующих ауксин-зависимое растяжение клеток. Однако мутанты mur2 фенотипических отличий от контроля не проявляют. Мутанты mur1, напротив, являются карликами [5]. У них нарушено фукозилирование не только ксилоглюканов, а также пектинов и гликопротеинов. Возможно, это является причиной нарушения ростовых процессов.

Важную роль в биосинтезе ксилоглюканов также играет ксилоглюкан-α-1,6-ксилозилтрансфераза. Zabotina с соавт. [6] показали, что мутанты арабидопсиса, дефектные по гену XXT-5, кодирующего ксилозилтрансферазу, имели нарушения роста корней и сниженное содержание ксилоглюканов. Трансформация конструкцией 35S:HA-XXT5 восстанавливала мутатный фенотип. Трансгенные растения теряли дефекты роста, а содержание ксилоглюканов соответствовало контролю.

Особый интерес представляют ферменты с эндолитической активностью в отношении ксилоглюканов. Такая активность у ферментов растительного происхождения обнаружена у гликозидгидролаз GH16, кодируемых семейством XTH генов ксилоглюканэндотрансгликозилаз/гидролаз [7]. Однако бульшая часть известных ферментов, кодируемых генами XTH, не демонстрирует ксилоглюконазную активность. Так, фермент кодируемый геном Ptt-XET16A гибридной осины (Populus tremula ´ P. tremuloides), не обладает ксилоглюконазной активностью [8].

Экспрессия в растениях рекомбинантных ферментов, катализирующих деполимеризацию гемицеллюлозных и целлюлозных компонентов клеточных стенок, дает возможность изучить физиологические эффекты модификации метаболизма этих полисахаридов. Однако при использовании генов растительного происхождения возможны эффекты косупрессии из-за высокой гомологии. Ohmiya с соавт. [9] сообщают, что суперэкспрессия целлюлазы PopCel1 в растениях тополя белого приводит к подавлению экспрессии обоих копий этого гена. При использовании генов грибного происхождения подобных реакций не наблюдали. Так, конститутивная экспрессия ксилоглюканазы из Aspergillus aculeatus в растениях тополя белого приводила к значительному увеличению ксилоглюканазной активности с 9 ед./мг белка в контроле до 283 ед. в трансгенной линии trg300-2. Обнаружено также снижение содержания гемицеллюлозы на 24% и увеличение доли целлюлозы с 41 до 48% [10]. Наряду с изменением состава древесины у трансгенных растений в условиях климатических камер отмечали увеличение ростовых показателей, а именно, высоты и диаметра стебля. При культивировании этих растений в условиях защищенного грунта различий в скорости роста не обнаружили, но выявили отличия в цвете листьев [11]. Листья трансгенных линий trg300-1 и trg300-2 обладали темно-зеленой окраской. В работе Yamamoto с соавт. [12] продемонстрировано влияние ксилоглюканазы AaXeg2 на толщину целлюлозных микрофибрилл. Так, у трансгенных линий тополя она равнялась 6 нм, а у контрольных растений 5 нм.

В настоящей работе впервые получены растения осины с экспрессией рекомбинантного гена ксилоглюконазы из гриба Penicillium canescens и охарактеризованы некоторые их свойства. К примеру, ксилоглюканаза XegA отличается от других ксилоглюканаз грибного происхождения субстратной специфичностью и активностью [13]. Рекомбинантный фермент в растениях осины обладал ксилоглюканазной активностью. В древесине трансгенных растений было зафиксировано значительное снижение содержания пентозанов. Бульшая часть клонов характеризовалась изменениями в морфологии листьев, а именно удлинением черешка и сокращением главной жилки листа.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

 

Получение трансгенных растений осины. Генетическую трансформацию растений осины (Populus tremula L.) проводили с использованием растительного материала in vitro генотипа Pt, любезно предоставленного сотрудниками Института леса НАНБ (Падутов В.Е., Гомель, Республика Беларусь). Для проведения агробактериального переноса использовали супервирулентный штамм CBE21 [14], несущий бинарный вектор pBI-Xeg [15]. В Т-ДНК вектора находится химерный ген sp-Xeg длиной 824 п.о. под транскрипционным контролем 35S промотора и нопалинсинтетазного терминатора. Ген sp-Xeg кодирует химерную ксилоглюканазу XegA из Penicillium canescens с сигнальным пептидом целлюлазы тополя белого [15]. В качестве селективного гена Т-ДНК бинарного вектора содержит ген nptII под контролем нопалинсинтетазного промотора. Для инокуляции использовали междоузлия длиной 4-6 мм, взятые с микрорастений in vitro. Регенерацию и селекцию трансформантов проводили на среде МС [16], модифицированной по содержанию нитратов [17], содержавшей 2 мг/л зеатина, 0.5 мг/л индолилмасляной кислоты (ИМК), 30 мг/л канамицина и 500 мг/л клафорана.

ПЦР-анализ. Трансформанты анализировали методом ПЦР с целью обнаружения последовательностей перенесенных из Т-ДНК бинарного вектора pBI-Xeg. Анализ проводили с использованием препаратов тотальной растительной ДНК, выделенной по методике Rogers и Bendich [18] с применением 2ЧСТАВ-буфера. Для постановки ПЦР использовали праймеры на гены VirB, nptII и sp-Xeg (табл. 1). Возможное загрязнение препаратов растительной ДНК следовыми количествами агробактериальной ДНК исключалась путем амплификации фрагмента (670 п.о.) гена VirB с использованием пары олигонуклеотидов VirB1 и VirB2. Присутствие селективного гена nptII оценивали постановкой ПЦР с олигонуклеотидами Nos и NptII. Размер ожидаемого фрагмента 741 п.о. Для амплификации фрагмента химерного гена ксилоглюканазы (762 п.о.) использовали пару олигонуклеотидов Xeg-up и Xeg-low (табл. 1). Амплификацию проводили в следующих условиях: реакционная смесь содержала 16 мМ (NH4)2SO4, 200 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 200 мкМ каждого дНТФ, 0.8 мкМ каждого олигонуклеотида, 0.15 U/мкл Taq полимеразы, 1-5 нг/мкл геномной ДНК. Режим амплификации: денатурация при 96°С (горячий старт) - 3 мин; денатурация при 95°С - 45 с; отжиг при 62°С или 58°С (в случае гена VirB) – 45 с; элонгация 1 мин при 72°С, достройка в течении 5 мин при 72°С; 30 циклов. Реакции проводили в тонкостенных пробирках, объемом 200 мкл (QSP) на амплификаторе MJ MiniTM Gradient Thermal Cycler (“Bio-Rad”, США).

ОТ-ПЦР-анализ. Транскрипцию химерного гена sp-Xeg анализировали методом ОТ-ПЦР. Тотальную растительную РНК экстрагировали с помощью TRIzol® реагента (“Invitrogen”, США) по прилагаемой коммерческой методике (http://www.invitrogen.com) из растительного материала in vitro. Удаление геномной ДНК из проб проводили с помощью ДНказыI (“Fermentas”, Литва) по прилагаемому протоколу. Синтез кДНК проводили с помощью M-MuLV обратной транскриптазы, RNaseH- (“СибЭнзим”, Россия) с использованием олиго-д(Т)15 праймера (“Синтол”, Россия) при температуре 37°С в течение 75 мин. Для инактивации ревертазы смесь нагревали до 70°C. Реакционную смесь разводили в пять раз Milli-Q водой, а затем брали по 2 мкл в качестве матрицы для постановки ПЦР с использованием праймеров Xeg-up и Xeg-low при условиях, аналогичных ПЦР-анализу тотальной ДНК. Для контроля загрязнения РНК остатками геномной ДНК проводили ПЦР с препаратами РНК каждого из клонов без обработки ревертазой. 

Анализ ксилоглюканазной активности. Ферментативную активность оценивали по отношению к двум субстратам – арабиноксилану (“Sigma”, США) и ксилоглюкану тамариска, ковалентно связанному с красителем азурином (“Megazyme”, Австралия). Для получения белковых экстрактов из растительного материала двух типов, листьев с тепличных растений и микропобегов in vitro, использовали калий-фосфатный буфер (20 мМ, рН 6.5). Содержание тотального белка в экстрактах оценивали по методу Bradford [19]. Активность ксилоглюканазы по отношению к субстрату арабиноксилану определяли модифицированным методом Somogyi–Nelson по схеме: смесь из 100 мкл 1% раствора субстрата и 60 мкл 0.1 М натрий-ацетатного буфера (pH 5.0) прогревали в течение 10 мин при 50°С в водяном термостате, затем вносили 40 мкл образца и инкубировали 10 мин при 50°С [20, 21]. К реакционной смеси добавляли 200 мкл раствора Somogyi и кипятили на водяной бане в течение 40 мин, охлаждали и добавляли 200 мкл раствора Nelson, перемешивали, выдерживали в течение 10 мин при комнатной температуре. Реакцию прекращали добавлением 400 мкл ацетона и 1 мл дистиллированной воды. Оптическую плотность раствора измеряли при длине волны 610 нм (“Perkin Elmer”, США).

Активность фермента оценивали по отношению к ксилоглюкану тамариска по методике, предложенной Чулкиным и соавт. [22], модифицированной для данного субстрата. Для проведения реакции использовали буферный раствор, рекомендованный производителем ксилоглюкана (“Megazyme”). Для проведения реакции к 1 мл раствора субстрата (10 мг/мл) в натрий-ацетатном буфере (25 мМ, pH 4.5) добавляли 200 мкл образца соответствующего разведения, инкубировали 10 мин при 53°С в термошейкере, затем центрифугировали в течение 5 мин при 10 000 g (MiniSpin, “Eppendorf”). Оптическую плотность раствора (OD) измеряли при длине волны поглощения азурина 590 нм. Количество сахаров определяли по калибровочной кривой для глюкозы, исходный раствор 5.56 мМ. За единицу ксилогюканазной активности принимали такое количество фермента, которое освобождает из субстрата 1 мкмоль восстанавливающих сахаров за 1 мин при данных условиях реакции. Результаты измерений выражали в относительных единицах, принимая значение для контрольного (нетрансгенного) образца за единицу.

Анализ содержания пентозанов. Удельное содержание пентозанов в древесине оценивали модифицированным методом Толленса [23, с. 108-115] путем превращения их в фурфурол при перегонке в присутствии HCl. Из стеблей, очищенных от коры, готовили навеску воздушно-сухих опилок массой 0.1 г. Величину оптического поглощения дистиллята определяли на двухлучевом спектрофотометре при длине волны 277 нм. Коэффициент сухости (Ксух) древесины определяли по формулам: 

 

 

где W - относительная влажность древесины; m - масса пустого бюкса, г; m1 – масса бюкса с навеской до высушивания, г; m2 – масса бюкса с навеской после высушивания, г. Последующий расчет содержания пентозанов в сухом веществе проводили по формуле:

 

где А – процентное содержание пентозанов в воздушно-сухой навеске; D – средняя величина оптического поглощения раствора фурфурола, полученного в результате перегонки; n - коэффициент пересчета процентного содержания фурфурола на пентозаны (для лиственных пород – 2.434); m – масса навески опилок, г; Ксух – коэффициент сухости. Для наглядности процентное содержание пентозанов переводили в абсолютные значения – мг/г сухого веса.

Анализ морфологии листьев. Для изучения влияния экспрессии рекомбинантного гена sp-Xeg на фенотип трансгенных растений осины было подготовлено по 40-50 клонально микроразмноженных растений каждого из 14 клонов, нетрансгенного контроля Pt и трансгенного контроля PtIGUS5a. В условиях защищенного грунта (ФИБХ, станция Биотрон) были получены растения с закрытой корневой системой в возрасте 3 мес. На этих растениях проводили сравнительный анализ морфологии листьев. Оценку проводили по трем критериям – длине черешка (ДЧ), длине главной жилки листа (ДГЖ), отношению ДЧ/ДГЖ.

Все данные получены в трех повторностях. Обработку данных проводили методами математической статистики [24]. На рисунках представлены средние значения анализируемых параметров. Бары на рисунках обозначают стандартные отклонения от среднего значения параметра при 5% уровне значимости. Ранжирование данных проводили по ранговому тесту Дункана по ANOVA-1.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

 

Получение трансгенных растений осины с рекомбинантным геном sp-Xeg

 

В результате агробактериальной трансформации стеблевых эксплантов осины получено 14 предположительно трансгенных линий, отобранных на селективной среде с канамицином. Растения всех линий хорошо росли и формировали корни на селективной среде с 25 мг/л канамицина. Контрольные растения генотипа Pt на среде с канамицином не укоренялись и быстро погибали. По морфологическим признакам отклонений от исходного генотипа у всех 14 линий в культуре in vitro не было обнаружено.

Для исключения возможности ложноположительных результатов ПЦР-анализа на присутствие последовательностей Т-ДНК из вектора pBI-Xeg мы провели анализ препаратов тотальной растительной ДНК на присутствие агробактериального загрязнения. Анализ осуществляли путем постановки ПЦР с использованием двух праймеров на ген virB. Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента - 670 п.о. Все проанализированные образцы не показали присутствия агробактериального загрязнения (данные не приводятся).

ПЦР-анализ препаратов геномной ДНК полученных канамицин-устойчивых линий осины на присутствие селективного гена nptII показал, что все трансформанты содержат искомую последовательность, размер амплифицируемого фрагмента соответствовал ожидаемому (741 п.о.). Последующий анализ трансформантов на присутствие последовательности рекомбинантного гена sp-Xeg показали ее наличие у всех исследуемых линий. Размер амплифицируемого участка соответствовал ожидаемому значению (762 п.о.). Результаты анализа препаратов ДНК на присутствие гена sp-Xeg у некоторых трансгенных линий приведены на рис. 1.

 

ОТ-ПЦР-анализ экспрессии рекомбинантного гена sp-Xeg

 

Для подтверждения функциональности рекомбинантного гена sp-Xeg, кодирующего ксилоглюканазу грибного происхождения, был проведен ОТ-ПЦР-анализ препаратов тотальной РНК полученных трансформантов. Исследовали препараты 14 трансгенных линий осины, в качестве контроля использовали нетрансгенные растения осины генотипа Pt и трансгенную линию PtIGUS5a, содержавшую репортерный ген β-глюкуронидазы (GUS). Олигонуклеотиды Xeg-up и Xeg-low, взятые для анализа, позволяют амплифицировать всю кодирующую часть гена sp-Xeg с кДНК матрицы. Продукт амплификации соответствовал ожидаемому размеру (762 п.о.), что подтверждает транскрипционную активность гена sp-Xeg в гетерологичном окружении (рис. 2), а также исключает вероятность сильных модификаций мРНК в результате сплайсинга по скрытым сайтам.

 

Анализ ксилоглюканазной активности в трансгенных растениях осины

 

Ксилоглюканазную активность в белковых экстрактах растений трансгенных линий оценивали двумя способами: по модифицированному методу Somogyi–Nelson [20, 21] с использованием субстрата арабиноксилана и по модифицированной методике Чулкина с соавт. [22], с использованием субстрата ксилоглюкана тамариска. 

При анализе активности ксилоглюканазы по субстрату арабиноксилану достоверных изменений в сравнении с контролем обнаружено не было. Однако при использовании в качестве субстрата ксилоглюкана, окрашенного азурином, наблюдали повышение ксилоглюканазной активности в экстрактах растений трансгенных линий (рис. 3).

Эти данные указывают на субстратную специфичность рекомбинантной ксилоглюканазы P. canescens и совпадают с результатами, полученными при изучении свойств ксилогюканаз, опубликованными в работе Синицыной с соавт. [13]. Активность оценивали в экстрактах из растительного материала двух типов – микропобегов in vitro и листьев тепличных растений. В первом случае из трех образцов максимальная относительная активность была обнаружена у линии PtXVXeg1c (2.1), во втором – из четырех исследованных образцов - у клона PtXVXeg1b (1.6). Необходимо отметить, что у линии PtXVXeg4a повышение активности было обнаружено только в случае растительного материала in vitro. В экстрактах листьев тепличных растений данного клона ксилоглюканазная активность оставалась на уровне контроля. Это может объясняться наличием в растениях специфических защитных белков – ингибиторов литических ферментов грибного происхождения [25], что, в свою очередь, в значительной степени зависит от физиологического состояния растений. Однако данный факт нуждается в более детальном изучении.

 

Анализ удельного содержания пентозанов

 

Ожидаемым эффектом суперэкспрессии рекомбинантной ксилоглюканазы и, как следствие, повышенной ксилоглюканазной активности, является понижение удельного содержания ксилоглюканов в клеточных стенках трансгенных растений. Очевидно, что изменение количественного и качественного состава ксилоглюканов может оказать влияние на содержание пентозанов, из которых преимущественно сформирована гемицеллюлоза. Для получения подтверждения этого предположения был проведен анализ удельного содержания пентозанов в древесине трансгенных и контрольных растений. В контрольных растениях (генотип Pt) удельное содержание пентозанов составляло 148 мг/г сухого веса, тогда как в исследованных клонах (PtXVXeg1a, PtXVXeg1b, PtXVXeg1c) оно варьировало в диапазоне от 100 до 140 мг/г сухого веса. Максимальное снижение (на 31%) содержания пентозанов зафиксировано в линии PtXVXeg1с. Удельное содержание пентозанов в данной линии составляло 102.1 ± 1.5 мг/г сухого веса (рис. 4).

 

Сравнительный анализ морфологии листьев

 

При культивировании в условиях in vitro у трансгенных растений достоверных морфологических отличий от контроля не наблюдали. После адаптации и доращивания в условиях защищенного грунта в течение 3 мес. у трансгенных линий проявилась значительная изменчивость в размерах листьев. Сравнительный морфологический анализ размеров листьев проводили на 14 трансгенных линиях и контрольной группе, состоявшей из нетрансгенных растений и трансформантов PtIGUS5a с репортерным геном GUS. Результаты анализа приведены в табл. 2. У шести линий из 14 наблюдали увеличение длины черешка на 11-23% относительно контрольной группы. У остальных линий по данному критерию достоверных отличий от контрольной группы не обнаружено. Противоположная картина наблюдалась при изучении другого критерия - длины главной жилки. Только у трех клонов значение данного критерия не отличалось от контрольного значения. У растений остальных 11 клонов укорочение главной жилки варьировало от 3 до 30%. Особый интерес представляет критерий, отражающий отношение длины черешка к длине осевой жилки листа. У растений контрольной группы оно равнялось 0.49, тогда как у трансгенных растений варьировало от 0.51 до 0.66. Достоверное увеличение данного критерия отмечали у образцов 12 линий (рис. 5).

 

ОБСУЖДЕНИЕ

 

Полученные в данной работе результаты являются вторым экспериментальным примером конститутивной суперэкспрессии ксилоглюканаз грибного происхождения в растениях. В ранее опубликованных работах использовали ген ксилоглюканазы AaXeg2 из гриба Aspergillus aculeatus. Экспрессия этого гена в таких растениях, как тополь [10, 11], инга (Paraserianthes falcataria) [26] и акация [27], повышала скорость роста [10], изменяла содержание целлюлозы и ксилоглюканов [11], приводила к увеличению диаметра целлюлозных микрофибрилл [12], вызывала изменение цвета листьев [11], а также повышала эффективность ферментативного гидролиза углеводов трансгенной древесины до моносахаров [27].

Трансгенные растения осины с геном рекомбинантной ксилоглюканазы из P. canescens, полученные в данной работе, обладали рядом новых свойств. Все проанализированные линии показали сниженное содержание пентозанов, что, по-видимому, является следствием активности рекомбинантного фермента в отношении ксилоглюканов. В белковых экстрактах листьев тепличных растений линии PtXVXeg1b детектировали повышение ксилоглюканазной активности в сравнении с контролем в 1.6 раза. При этом содержание пентозанов в древесине таких растений составило 131.8 мг/г сухого веса, что на 11% ниже контрольного значения (148 мг/г сухого веса). Taniguchi с соавт. [11] при экспрессии ксилоглюканазы AaXeg2 в растениях тополя линии Trg300 детектировали 26-30-кратное увеличение ксилоглюканазной активности. В более ранней работе этой же группы авторов [10] приведены данные о снижении доли гемицеллюлозной фракции, образованной преимущественно пентозанами, на 24% (с 243 до 185 мг/г сухого веса). Следует отметить, что при незначительном повышении ксилоглюканазной активности в линии PtXVXeg1b мы наблюдали достоверное снижение содержания пентозанов, сопоставимое с результатами Park с соавт. [10] о снижении доли гемицеллюлозы, которое имело место при многократном повышении ксилоглюканазной активности. Такие различия могут объясняться, в первую очередь, иной субстратной специфичностью ксилоглюканазы P. canescens [13].

Очевидно, что в основе изменений химического состава древесины трансгенных растений осины лежит модификация состава и свойств клеточной стенки. Поскольку для экспрессии рекомбинантного гена используется конститутивный 35S промотор, биосинтез ксилоглюканазы с той или иной эффективностью может протекать почти во всех тканях и органах растения, в том числе и в листьях. Сравнительный анализ морфологии листьев трансгенных клонов осины позволил обнаружить неожиданный эффект гена sp-Xeg. Изменения затрагивали длину черешка и длину главной жилки листа. Увеличение длины черешка могло сопровождаться уменьшением длины главной жилки. Данная тенденция наблюдалась у трех линий (PtXIVXeg1a, PtXVXeg1a, PtXVXeg1b). У трех других линий (PtXVXeg4b, PtXVXeg4c, PtXVXeg5a) имело место увеличение длины черешка без изменения длины главной жилки. Анализ соотношения длины черешка к длине главной жилки выявил достоверное увеличение этого индекса у 12 линий из 14. Подобный феномен в ранее опубликованных работах [10-12, 26, 27] по конститутивной экспрессии ксилоглюканаз грибного происхождения не обсуждался.

Известно, что ксилоглюканы играют значительную роль в растяжении клеточных стенок [28] и, тем самым, оказывают влияние на рост органов и механические свойства древесины [29]. Вероятно, что такие изменения могут сопровождаться и модификацией морфологических признаков вегетативных органов, как в случае листьев трансгенных растений осины с геном sp-Xeg.

В заключение необходимо отметить, что точный механизм действия рекомбинантных ксилоглюканаз, приводящий к морфологическим изменениям, остается неясным. Есть основания предполагать, что причиной наблюдаемых модификаций фенотипа трансгенных растений может являться не только прямая литическая активность в отношении ксилоглюканов, но и нарушение их метаболизма, например, фукозилирования. Для доказательства данного предположения требуются дальнейшие исследования.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках Государственных контрактов № 14.740.11.0795 от 30.11.2010 г. и № 16.М04.12.0009 от 14.04.2011 г.

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Carpita N., McCann M. The Cell Wall // Biochemistry and Molecular Biology of Plants / Eds Buchanan B., Gruissem W., Somerset J.R. New York: John Wiley & Sons, 2000. P. 52–108.

Cosgrove D.J. Growth of the Plant Cell Wall // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. V. 6. P. 850–861.

Perrin R.M., DeRocher A.E., Bar-Peled M., Zeng W., Norambuena L., Orellana A., Raikhel N.V., Keegstra K. Xyloglucan Fucosyltransferase, an Enzyme Involved in Plant Cell Wall Biosynthesis // Science. 1999. V. 284. P. 1976-1979.

Vanzin G.F., Madson M., Carpita N.C., Raikhel N.V., Keegstra K., Reiter W.-D. The mur2 Mutant of Arabidopsis thaliana Lacks Fucosylated Xyloglucan because of a Lesion in Fucosyltransferase AtFUT1 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 3340-3345.

Reiter W.-D., Chapple C., Somerville C.R. Altered Growth and Cell Walls in a Fucose-Deficient Mutant of Arabidopsis // Science. 1993. V. 261. P. 1032–1035.

Zabotina O.A., van de Ven W.T., Freshour G., Drakakaki G., Cavalier D., Mouille G., Hahn M.G., Keegstra K., Raikhel N.V. Arabidopsis XXT5 Gene Encodes a Putative Alpha-1,6-Xylosyltransferase That Is Involved in Xyloglucan Biosynthesis // Plant J. Cell Mol. Biol. 2008. V. 56. P. 101-115.

Rose J.K.C., Braam J., Fry S.C., Nishitani K. The XTH Family of Enzymes Involved in Xyloglucan Endotransglucosylation and Endohydrolysis: Current Perspectives and a New Unifying Nomenclature // Plant Cell Physiol. 2002. V. 43. P. 1421–1435.

Kallas A.M., Piens K., Denman S.E., Henriksson H., Faldt J., Johansson P., Brumer H., Teeri T.T. Enzymatic Properties of Native and Deglycosylated Hybrid Aspen (Populus tremula ´ P. tremuloides) Xyloglucan Endotransglycosylase 16A Expressed in Pichia pastoris // Biochem. J. 2005. V. 390. P. 105–113.

Ohmiya Y., Nakai T., Park Y.W., Aoyama T., Oka A., Sakai F., Hayashi T. The Role of PopCel1 and PopCel2 in Poplar Leaf Growth and Cellulose Biosynthesis // Plant J. 2003. V. 33. P. 1087-1097.

Park Y.W., Baba K., Furuta Y., Iida I., Sameshima K., Arai M., Hayashi T. Enhancement of Growth and Cellulose Accumulation by Overexpression of Xyloglucanase in Poplar // FEBS Lett. 2004. V. 564. P. 183-187.

Taniguchi T.,·Ohmiya Y., Kurita M., Tsubomura M., Kondo T., Park Y.W., Baba K.,·Hayashi T. Biosafety Assessment of Transgenic Poplars Overexpressing Xyloglucanase (AaXEG2) prior to Field Trials // J. Wood Sci. 2008. V. 54. P. 408–413.

Yamamoto M., Saito T., Isogai A., Kurita M., Kondo M., Taniguchi T., Kaida R., Baba K., Hayashi T. Enlargement of Individual Cellulose Microfibrils in Transgenic Poplars Overexpressing Xyloglucanase // J. Wood Sci. 2011. V. 57. P. 71–75.

Синицына О.А., Федорова Е.А., Правильников А.Г., Рожкова А.М., Скомаровский А.А., Матыс В.Ю., Бубнова Т.М., Окунев О.Н., Винецкий Ю.П., Синицын А.П. Выделение и свойства ксилоглюканаз Penicillium sp. // Биохимия. 2010. Т. 75. С. 52–62.

Revenkova E.V., Kraev A.S., Skryabin K.G. Construction of a Disarmed Derivative of the Supervirulent Ti Plasmid pTiBo542 // Plant Biotechnology and Molecular Biology / Ed. Skryabin K.G. Moscow, Pushchino: Pushchino Research Centre, 1993. P. 67-76.

Шестибратов К.А., Лебедев В.Г., Шадрина Т.Е., Булатова И.В., Окунев О.Н., Леонтьевский А.А., Лисов А.В. Бинарный вектор pBI-4CL, бинарный вектор pBI-Xeg, бинарный вектор pGS, способ получения трансгенных растений, содержащих пониженное количество лигнина, повышенное количество целлюлозы и повышенную скорость роста. Приоритет от 24 ноября 2009 г. Заявка на изобретение № 2009143124.

Murashige T., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473–497.

Шестибратов К.А., Булатова И.В., Шадрина Т.Е., Мирошников А.И. Генетическая трансформация триплоидных форм осины и плюсовых форм березы повислой // Матер. VIII межд. конф. молодых ученых “Леса Евразии – Северный Кавказ” / Сочи, 2008. Ч. 1. С. 151.

Rogers S., Bendich A. Extraction of Total Cellular DNA from Plants, Algae and Fungi / Eds Gelvin S., Schiperoort R. Dordrecht; Boston; London: Kluwer, 1995. Section 7-1.

Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

Nelson N. Photometric Adaptation of Somogyi Method for Determination of Glucose // J. Biol. Chem. 1944. V. 153. P. 375–379.

Somogyi M. Notes on Sugar Determination // J. Biol. Chem. 1952. V. 195. P. 19–23.

Чулкин А.М., Логинов Д.С., Вавилова Е.А., Абянова А.Р., Зоров И.Н., Курзеев С.А., Королева О.В., Беневоленский С.В. Энзимологические свойства эндо-(1-4)-β-глюканазы Egl2p Penicillium canescens и характеристика структурного гена egl2 // Биохимия. 2009. Т. 74. С. 805-813.

Оболенская А.В., Ельницкая З.П., Леонович А.А. Лабораторные работы по химии древесины. Москва: Экология, 1991. 320 с.

Зайцев Г.Н. Математическая статистика в экспериментальной ботанике. Москва: Наука, 1984. 424 с.

Гусаков А.В. Белковые ингибиторы микробных ксиланаз // Биохимия. 2010. Т. 75. С. 1331-1347.

Hartati N.S., Rahayuningsih L., Kaida R., Sudarmonowati E., Hayashi T. Overexpression of Xyloglucanase Gene in Sengon (Paraserianthes falcataria) for Growth Acceleration // J. Bitech. Res. Trop. Reg. 2009. V. 2. P. 1-4.

Kaku T., Kaida R., Baba K., Hartati S., Sudarmonowati E., Hayashi T. Improvement of Fermentable Sugar Yields of Mangium through Transgenic Overexpression of Xyloglucanase // J. Wood Sci. 2011. V. 57. P. 545-548.

Cosgrove D.J. Growth of the Plant Cell Wall // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. V. 6. P. 850–861.

Mellerowicz E., Immerzeel P., Hayashi T. Xyloglucan: The Molecular Muscle of Trees // Ann. Bot. 2008. V. 102. P. 659–665.

ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

 

Рис. 1. ПЦР-анализ растений трансгенных линий осины на присутствие гена sp-Xeg.

М – молекулярный маркер (“Сибэнзим”, М11); К+ – плазмида pBI-Xeg; B – вода; 1 - PtXVXeg1c; 2 - PtXVXeg4a; 3 - PtXVXeg4b; 4 - PtXVXeg4c; 5 - PtXVXeg5a; 6 - PtXVXeg3a; 7 - PtXVXeg5c; К- – нетрансгенное растение. Размер ожидаемого амплифицируемого фрагмента - 762 п.о.

 

Рис. 2. ОТ-ПЦР-анализ экспрессии гена sp-Xeg в трансгенных растениях осины.

“+” - препараты РНК после обработки обратной транскриптазой; “-” - препараты без обработки обратной транскриптазой; B – вода; К+ - плазмида pBI-Xeg; Pt – нетрансгенный контроль; G – трансгенный контроль PtIGUS5a; 1-8 – трансгенные линии: 1 - PtXIVXeg1a, 2 - PtXVXeg1a, 3 - PtXVXeg1b, 4 - PtXVXeg1c, 5 - PtXVXeg2b, 6 - PtXVXeg3a, 7 - PtXVXeg4a, 8 - PtXVXeg5b; М – молекулярный маркер (“Сибэнзим”, М11).

 

Рис. 3. Анализ ксилоглюканазной активности в трансгенных растениях осины.

К – нетрансгенное растение, 1–11 – трансгенные растения осины с геном sp-Xeg (1 - PtXIVXeg1b; 2 - PtXVXeg2b; 3, 11 - PtXVXeg5a; 4 - PtXVXeg5c; 5 - PtXIVXeg1c; 6 - PtXVXeg1c; 7, 10 - PtXVXeg4a; 8 - PtXVXeg1b; 9 - PtXVXeg3a). Первая группа (К, 1-4) и вторая группа (К, 5-7) – растительный материал in vitro, третья группа (К, 8-11) – растительный материал, полученный на тепличных растениях.

 

Рис. 4. Анализ удельного содержания пентозанов в древесине трансгенных линий и контрольных растений осины (Pt).

 

Рис. 5. Отношение длины черешка (ДЧ) к длине главной жилки (ДГЖ) листа трансгенных линий и растений осины контрольной группы. 

* Различия достоверны при P ≤ 0.05.