УДК 581.1

ИЗБЫТОЧНАЯ ОСВЕЩЕННОСТЬ УВЕЛИЧИВАЕТ ТЕРМОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА, КОЛИЧЕСТВО МЕМБРАН И ПОЛЯРНЫХ ЛИПИДОВ В ЛИСТЬЯХ ПШЕНИЦЫ

© 2013 г. И. М. Кислюк, Л. С. Буболо, О. Д. Быков, И. Е. Каменцева, Е. Р. Котлова,

М. А. Виноградская

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Ботанический институт им. В.Л. Комарова, Санкт-Петербург

Поступила в редакцию 30.01.2012 г.

Изучали действие избыточной освещенности на устойчивость фотосинтетического аппарата пшеницы (Triticum aestivum L.) к нагреву в темноте и на свету, на ультраструктуру клеток листьев и их липидный и жирнокислотный состав. Листья 1416-дневных растений, выросших при низкой освещенности (около 20 Вт/м2), выдерживали в течение 1 ч при 370 или 600 Вт/м2Избыточное освещение вызвало подъем устойчивости к 10-минутному прогреву при 4045°С видимого фотосинтеза, определяемого методом инфракрасного газоанализа, и реакции Хилла, которую определяли по восстановлению 2,4-дихлорфенолиндофенола хлоропластами из прогретых листьев. За время действия на листья сильного света в клетках мезофилла увеличилось количество митохондрий, пероксисом, цистерн эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи. В хлоропластах увеличились протяженность и число тилакоидов и число гран. Одновременно в листьях повысилось содержание основных классов мембранных глицеролипидов и соотношения фосфолипиды/гликолипиды и липиды/хлорофилл. Увеличился индекс ненасыщенности мембранных липидов, в основном, за счет увеличения содержания линоленовой кислоты. Таким образом, избыточный (не используемый полностью в фотосинтезе) свет вызывал в листьях пшеницы ряд неспецифических адаптивных изменений, которые происходят также под действием других экологических факторов – теплового шока, охлаждения, солевого и осмотического стрессов.

---------------------------------

Сокращения: ГЛ  гликолипиды; ДГДГ – дигалактозилдиацилглицерины; ДХФИФ – 2,6-дихлорфенолиндофенол; ЖАК  жасмоновая кислота; ИН  индекс ненасыщенности ЖК; МГДГ – моногалактозилдиацилглицерины; СХДГ – сульфохиновозилдиацилглицерины; ТШ – тепловой шок; ФГ – фосфатидилглицерины; ФИ – фосфатидилинозиты; ФЛ – фосфолипиды; ФХ – фосфатидилхолины; ФЭ – фосфатидилэтаноламины; Хл  хлорофилл; ЭР – эндоплазматический ретикулум.

Адрес для корреспонденции: Кислюк Ирина Марковна. 197376 Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 2. Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН. Электронная почта: imkis@mail.ru

 Ключевые слова: Triticum aestivum  терморезистентность – фотоингибирование – фотосинтез  реакция Хилла – ультраструктура  хлоропласты  полярные липиды – жирные кислоты

 

ВВЕДЕНИЕ

Уровень теплоустойчивости фотосинтетического аппарата растения зависит от внешних условий, в том числе, от освещенности листьев во время и после действия на них высокой температуры. Известно, что слабый или умеренный свет во время нагрева уменьшает тепловое повреждение, а после нагрева стимулирует репарацию фотосинтеза [13]. Насыщающий фотосинтез и более сильный свет при нагреве оказывает либо дополнительное повреждающее, либо защитное действие на фотосинтетический аппарат в зависимости от дозы температурного воздействия [2]. Можно предположить, что защитный эффект избыточного (не используемого полностью в фотосинтезе) света во время умеренного нагрева связан с тем, что процессы, которые он включает, защищают фотосинтетический аппарат как от фотоокислительного, так и от теплового повреждения. Показано, что сильный свет индуцирует экспрессию генов белков, которые участвуют в защитных реакциях растительных клеток. Свет стимулирует синтез стрессовых белков (в том числе белков теплового шока), антиокислительных ферментов, некоторых десатураз [4, 5]. Образующийся на сильном свету зеаксантин участвует в тушении возбужденного состояния хлорофилла и одновременно повышает терморезистентность фотосинтетических мембран [6].

Мы предположили, что сильный свет при нормальной температуре может вызвать повышение теплоустойчивости фотосинтетического аппарата. Об этом говорили полученные ранее [7] данные о сходных изменениях в ультраструктуре хлоропластов, которые развиваются под действием как теплового шока (ТШ) (3 ч при 38°С и освещенности около 10 Вт/м2), так и сильного света (1 ч при 30°С и 370 Вт/м2). В обоих случаях произошло увеличение объема тилакоидной системы в хлоропластах зрелых листьев. ТШ, вызвавший увеличение устойчивости фотосинтетического аппарата к нагреву, привел к увеличению содержания основных мембранных липидов [8].

В настоящей работе было исследовано действие предварительного освещения листьев пшеницы сильным светом (370 и 600 Вт/м2) на устойчивость фотосинтеза, реакции Хилла и структуры хлоропластов к нагреву в темноте и на свету. Исследовали также действие избыточной освещенности при 25°С на ультраструктуру клеток мезофилла, содержание в листьях полярных липидов и их жирнокислотный состав.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растения озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Мироновская 808 выращивали на растворе Кнопа при 23/18°С (день/ночь), освещенности около 20 Вт/м2 (лампы ДC-20 и лампы накаливания, Россия) и 16-часовом фотопериоде. В опытах использовали первые и вторые листья 1416-дневных растений.

При определении эффекта предварительного освещения на терморезистентость фотосинтетического аппарата, ультраструктуру клеток и липидный состав листьев, отрезанные листовые пластинки помещали в тонкий слой воды на дно термостатированной камеры и выдерживали в течение 1 ч при температуре от 20 до 30°С и освещенности 0, 20, 370 или 600 Вт/м2. Использовали лампу ДРИЗ-400 (“Эталон”, Россия), снабженную водным фильтром-конденсором.

Для определения термо- и фоторезистентности фотосинтетического аппарата листья прогревали в той же камере при температуре от 40 до 45С в течение 10 мин при освещенности 0, 370 или 600 Вт/м2. После прогрева измеряли интенсивность фотосинтеза листьев, восстановление 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ, “Sigma”, США) хлоропластами, выделенными из прогретых листьев, и исследовали ультраструктуру клеток мезофилла.

Видимый фотосинтез измеряли при 25С и освещенности 150 Вт/м2 в открытой системе газообмена при естественной концентрации СО2 с помощью инфракрасного газоанализатора ГИАМ-5М (“Аналитприбор”, Россия).

Фотохимическую активность хлоропластов (реакцию Хилла) измеряли в суспензии подвергнутых осмотическому шоку хлоропластов. 200 мг листьев растирали в плексигласовой ступке в течение 1 мин в 4 мл раствора, содержавшего 50 мМ Трис-HCl буфера (pH 7.6), 2 мМ ЭДТА, 1 мМ MgCl2. После фильтрования через 2 слоя капрона гомогенат центрифугировали 1.5 мин при 4 000 g. Осадок ресуспендировали в среде выделения. Все операции проводили при 35°С. Сразу после получения суспензии подвергнутых осмотическому шоку хлоропластов определяли активность реакции Хилла по скорости восстановления ДХФИФ. В 3 мл суспензии, содержащей 56 мкг хлорофилла, вносили 2 мкмоль ДХФИФ. Реакцию проводили в течение 1 мин при насыщающем свете 45 Вт/м2 и комнатной температуре. Уменьшение оптической плотности ДХФИФ регистрировали на СФ-40 (“ЛОМО”, Россия) при 540 нм.

Содержание хлорофиллов а и b (Хл) определяли спектрофотометрическим методом в 100% ацетоновом экстракте и рассчитывали по формулам, описанным в работе [9].

Для электронно-микроскопических исследований высечки из средней части листовой пластинки фиксировали 3% раствором глутаральдегида (“Merck”, Германия) в 0.1 М фосфатном буфере (pН 7.4), с постфиксацией 2% раствором Os2O4 в том же буфере в течение 8 ч при 4°С, обезвоживали в спиртах повышающейся концентрации и абсолютном ацетоне и заливали в смесь аралдита-М и эпона-812 (“Fluka”, Швейцария). Ультратонкие срезы изготавливали на ультратоме LKB-3 (Швеция) и окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца. Срезы клеток мезофилла и хлоропластов просматривали под микроскопом Hitachi H-600 (Япония). Морфометрические измерения проводили на микрофотографиях ( 48 000) срединных срезов 1015 хлоропластов в 15 клетках в каждом варианте. Площадь и длину мембран определяли с помощью программы Image Tool.

Липиды экстрагировали смесью хлороформ : метанол (1 : 2) [10]. Разделение индивидуальных классов липидов проводили с помощью двумерной ТСХ на стеклянных пластинах 10  10 см (“Merck”) в системе растворителей: первое направление – хлороформ : метанол : вода (65 : 25 : 4); второе направление – хлороформ : ацетон : метанол : уксусная кислота : вода (50 : 20 : 10 : 10 : 5) [11]. Хроматографические зоны, соответствующие индивидуальным классам липидов, визуализировали, в зависимости от целей исследования, c помощью 5% раствора H2SO4 в метаноле (количественный анализ методом денситометрии) или паров йода; состав жирных кислот (ЖК) определяли методом ГЖХ-МС. 

Визуализированные йодом липиды выделяли, элюируя их с хроматографических пластин смесью хлороформ : метанол (1 : 1). Липидные соединения идентифицировали, используя стандартные свидетели и специфические реагенты на отдельные функциональные группы [12]. Содержание отдельных классов липидов на хроматограммах определяли на денситометре ДенСкан (“Ленхром”, Россия). Расчеты проводили с помощью программы DENS-14-12-03 в режиме линейной аппроксимации по калибровочным кривым, построенным по стандартным растворам ФХ (“Sigma”), МГДГ и ДГДГ (“Larodan”, Швеция). Использовали метод внешнего стандарта, для чего после разведения исследуемой смеси в первой системе на пластины наносили стандартные растворы ФХ, МГДГ и ДГДГ (каждый в двух концентрациях), затем проводили разделение во второй системе. Содержание липидов в листьях (С), выраженное в мг/г сухой массы, определяли по формуле:

С = (D  k  V1)/(V2  P),

где D – денситометрический сигнал пятна на хроматограмме (усл. ед.); k – переводной коэффициент, рассчитанный на основе калибровочной зависимости денситометрического сигнала пятна от содержания в нем анализируемого соединения (мг); V1 –общий объем экстракта (мкл); V2 – объем пробы, нанесенной на хроматограмму (мкл); P – сухая масса навески растительного материала (г).

Жирные кислоты (ЖК), входящие в состав отдельных классов глицеролипидов, анализировали в виде метиловых эфиров методом ГЖХ-МС на хроматографе Agilent 6850 (“Agilent”, США) с квадрупольным масс-спектрометром 5975С в качестве детектора. Метиловые эфиры ЖК получали в процессе гидролиза липидов 2.5% H2SO4 в метаноле при 70°С в течение 2 ч. Капиллярная колонка Supelco Omega Wax 250 (США) (30 м × 0.25 мм × 0.25 мкм); температура испарителя – 250°С; деление потока – 1 : 20; скорость газа-носителя (гелий) – 1.0 мл/мин; температура термостата – 170°С с повышением до 220°С со скоростью 4°С/мин. 

Для идентификации соединений использовали стандартную масс-спектрометрическую библиотеку NIST, а также значения времен удерживания, которые сопоставляли с имеющимися свидетелями (“Sigma”). Относительное содержание ЖК в пробе (% от общего количества ЖК) определяли методом нормализации c помощью программного обеспечения MSD ChemStation E.02.02.1431 (“Agilent”). Индекс ненасыщенности (ИН) ЖК рассчитывали по формуле, приведенной в работе [13].

На рисунках и в таблицах приведены средние арифметические значения результатов не менее 3 опытов с 2–4 биологическими повторностями и их стандартные ошибки. Разницу между средними значениями считали значимой при P ≤ 0.05.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

Устойчивость фотосинтеза к прогреву

 

В первой серии опытов исследовали влияние температуры во время предварительного освещения на теплоустойчивость фотосинтеза.

Листья выдерживали в течение 1 ч во влажной камере при 20, 25, 30°С и освещенности 20 и 370 Вт/м2. После каждой экспозиции определяли интенсивность фотосинтеза при 25°С и 150 Вт/м2 (оптимальная температура и насыщающий свет) и его устойчивость к 10-минутному прогреву при 42°С в темноте. При слабой освещенности (20 Вт/м2) изменение температуры от 20 до 30°С не оказывало заметного последействия на интенсивность фотосинтеза (рис. 1а, 1). При освещенности 370 Вт/м2 по мере увеличения температуры предварительной экспозиции фотосинтез снижался (рис. 1а, 2).

Устойчивость фотосинтеза к прогреву была одинакова у листьев, выдержанных 1 ч на слабом свету при 20 и 25°С, и повышенной – у выдержанных 1 ч при 30°С (рис. 1б, 1). Предварительное освещение сильным светом при 25 и 30°С приводило к увеличению устойчивости фотосинтеза (рис. 1б, 2). Из рисунка следует, что подъем теплоустойчивости фотосинтеза после экспозиции на сильном свету при 25°С был вызван действием сильного света, а после экспозиции при 30°С  совместным действием повышения температуры и сильного света.

В следующей серии опытов была проведена оценка влияния предварительного освещения при 370 и 600 Вт/м2 на устойчивость фотосинтеза к прогреву при разной температуре и освещенности.

Листья, находившиеся в течение 1 ч при 25°С на слабом (20 Вт/м2) свету (контроль) прогревали 10 мин при 4044°С в темноте или при 370 Вт/м2. По сравнению с прогревами в темноте освещенность 370 Вт/м2 во время прогрева не оказывала дополнительного повреждающего действия при 40°С и увеличивала подавление фотосинтеза более интенсивными прогревами  при 42 и 44°С (рис. 2а, кривые 1, 2).

Предварительная 1-часовая экспозиция листьев при 25°С и 370 Вт/м2 вызывала достоверное увеличение устойчивости фотосинтеза к прогревам при 42 и 44°С, как в темноте, так и на свету (рис. 2а, кривые 3, 4). Устойчивость фотосинтеза к прогревам на свету у предварительно освещавшихся листьев (кривая 4) была выше, чем устойчивость фотосинтеза контрольных листьев к прогревам в темноте (кривая 1). Эти данные показывают, что предварительное освещение листьев сильным светом уменьшает фотоингибирование фотосинтеза, усиленное интенсивными прогревами.

Освещение листьев пшеницы более мощным светом также сопровождалось подъемом терморезистентности фотосинтеза. 1-часовая экспозиция при 600 Вт/м2 и 25°С вызвала снижение фотосинтеза в среднем на 20%. 10-минутные прогревы контрольных листьев при 4044°С и такой же освещенности ингибировали фотосинтез сильнее, чем прогревы в темноте (рис. 2б, кривые 1, 2) и прогревы при 370 Вт/м2 (рис. 2а, кривая 2). Сразу после экспозиции при 600 Вт/м2 и 25°С устойчивость фотосинтеза к прогревам при 4044°С и той же освещенности, как и к прогревам в темноте, увеличилась (рис. 2б, кривые 3, 4). В результате предварительного освещения листьев при 600 Вт/м2 увеличилась устойчивость фотосинтеза и к прогревам при 370 Вт/м2 (данные не приведены).

 

Фотохимическая активность хлоропластов

Терморезистентность участка электрон-транспортной цепи от воды через ФС II к искусственному акцептору ДХФИФ определяли по восстановлению ДХФИФ в суспензии подвергнутых осмотическому шоку хлоропластов, выделенных из прогретых листьев. Ранее было показано [2], что способность изолированных хлоропластов к осуществлению транспорта электронов более устойчива к прогреву, чем фотосинтез листьев. Кроме того, сильный свет во время прогрева листьев не увеличивал подавление реакции Хилла, а, напротив, стимулировал ее активность. Такие данные были получены и в настоящей работе. На рис. 3 показаны результаты действия прогрева листьев в темноте и при 600 Вт/м2 на скорость восстановления ДХИФ хлоропластами, изолированными из этих листьев.

Прогревали контрольные листья и листья, которые предварительно освещали в течение 1 ч сильным светом (600 Вт/м2) при 25°С. В обоих вариантах активность хлоропластов из листьев, прогретых в темноте (рис. 3, кривые 1, 3), была ниже, чем активность хлоропластов из листьев, прогретых на свету (рис. 3, кривые 2, 4). Из рисунка также следует, что предварительное освещение листьев мощным светом увеличивает устойчивость реакции Хилла к прогревам в темноте и на свету.

 

Липиды и их ЖК-состав

Сразу после 1 ч экспозиции при 600 Вт/м2 и 25°С из листьев было выделено в 2 раза больше суммарных мембранных липидов (табл. 1). Содержание разных классов липидов возрастало неравномерно. Среди липидов, в норме локализованных преимущественно в хлоропластах, увеличилось количество МГДГ в 1.9 раза, СХДГ – 1.5 раза. Содержание ДГДГ не изменилось. Соответственно резко возросло соотношение МГДГ/ДГДГ – от 1.6 до 3.2. В 2.3 раза увеличилось количество ФГ, локализованных, главным образом, в состыкованных (appressed) мембранах гран.

В еще большей степени увеличилось количество основных внехлоропластных фосфолипидов: ФХ – в 3.3 раза, ФЭ – 3.5 раза. Резко возросло содержание ФИ. В результате выросло и соотношение ФЛ/ГЛ (табл. 1).

Поскольку под действием избыточного освещения при нормальной температуре в листьях не изменилось содержание Хл (а также соотношение Хл а/b), резко возросло соотношение липиды/Хл (табл. 1).

Под действием избыточной освещенности однотипно изменился ЖК-состав исследованных индивидуальных классов липидов: в них увеличилось относительное содержание ненасыщенных ЖК (табл. 2). В доминирующих хлоропластных липидах МГДГ и ДГДГ возросла доля линоленовой (18:3) кислоты на 19 и 8% соответственно. 

Отличительной особенностью локализованных в гранах ФГ является высокое содержание трансгексадеценовой кислоты (16:1 trans). Экспозиция на сильном свету привела почти к двукратному увеличению ее доли в сумме ЖК.

Увеличение относительного содержания линоленовой кислоты произошло также в составе основных внехлоропластных ФЛ – фосфатидилхолинов (ФХ).

Таким образом, результатом действия сильного света на ЖК-состав полярных липидов явилось увеличение их ИН (табл. 2).

 

Ультраструктура клеток мезофилла

Освещение листьев в течение 1 ч мощным светом 600 Вт/м2 при 25°С вызвало значительные изменения в структуре клеток мезофилла. По сравнению с клетками контрольных листьев, не подвергавшихся световому воздействию (рис. 4а), в цитоплазме увеличилось количество органелл – митохондрий, пероксисом (табл. 3), полисом (рис. 4б4г). Возросли протяженность и число цистерн гранулярного и агранулярного эндоплазматического ретикулума (ЭР) и аппарата Гольджи (рис. 4г, 4д). Число хлоропластов в клетке не изменилось. У них появились выросты и инвагинации, в которых нередко размещались митохондрии (рис. 4е, 4ж). В результате возросла частота мембранных контактов между хлоропластами, митохондриями, пероксисомами, а также между ЭР и другими органеллами (рис. 4г4ж). В цитоплазме появились миелиновые тела и липидные капли (рис. 4е, 4ж).

Существенные изменения произошли в структуре тилакоидной системы хлоропластов. Увеличилось число гран, гранных и межгранных тилакоидов. Площадь тилакоидной системы на срезе возросла почти в 1.7 раза (табл. З). Сильный свет вызывал образование крупных гран “теневого” типа, часто имеющих неправильную (ступенчатую и др.) форму (рис. 4з). Относительное число гран, состоящих более, чем из 20 (в отдельных случаях более 40) тилакоидов (рис. 4з), возросло от 1% (контроль) до 23%.

10-минутный прогрев контрольных листьев при 42оС и 600 Вт/м2 вызвал повреждение структуры около 50% хлоропластов. К обратимым нарушениям относились разбухание стромы, приобретение пластидами необычной (нередко угловатой) формы (рис. 5а), слияние пластид под одной оболочкой с сохранением индивидуальных тилакоидных систем (рис. 5б). Обратимыми изменениями являлись также потеря контактов между тилакоидами в гранах, извилистость и разбухание тилакоидов, их перпендикулярное или наклонное расположение относительно продольной оси хлоропласта (рис. 5в). Часть хлоропластов разрушилась необратимо. Их тилакоидная система распалась на отдельные тилакоиды и обрывки мембран, оболочка частично фрагментировалась.

Важно, что 10-минутный прогрев контрольных листьев при 42°С на сильном свету вызвал примерно у половины хлоропластов такие же изменения, как 1-часовое освещение сильным светом при 25°С. В хлоропластах появились крупные (до 30 тилакоидов) граны причудливой формы, увеличилось число гран и тилакоидов (рис. 5г5е). В цитоплазме возросло количество митохондрий и пероксисом (до 8.0 ± 0.3 и 1.5 ± 0.1 органелл на срез клетки соответственно), цистерн ЭР и аппарата Гольджи. Появились крупные, сравнимые по размеру с митохондриями, липидные капли и миелиновые тела (рис. 5е, 5ж).

В листьях, предварительно испытавших избыточное освещение в течение 1 ч, 10-минутный прогрев при 42°С и 600 Вт/м2 вызвал меньше деструктивных изменений в клетках мезофилла. Сохранилась такая же, как после экспозиции при 25°С и 600 Вт/м2, наполненность цитоплазмы органеллами. В ней, однако, отсутствовали крупные липидные капли (в отличие от прогретого контроля). Разбухшие и слившиеся хлоропласты с деформированной тилакоидной системой встречались реже, чем в клетках прогретого контроля. Хлоропласты с фрагментированными тилакоидами и разрушенной оболочкой практически не встречались. Значительная часть пластид сохранила ультраструктуру, приобретенную в результате освещения листьев при 600 Вт/м2 и 25°С  с многотилакоидными гранами, повышенным числом гран и тилакоидов.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты экспериментов показали, что избыточное освещение в сублетальных дозах, подобно многим неблагоприятным воздействиям, вызывает неспецифическое повышение устойчивости растительных клеток к другим повреждающим факторам.

Предварительное освещение сильным светом листьев пшеницы, выросших при слабом освещении, вызвало повышение устойчивости фотосинтеза и реакции Хилла к прогревам на свету и в темноте. Так же, как в экспериментах, описанных ранее [2], фотосинтез листьев оказался менее устойчив к прогревам, чем способность хлоропластов, выделенных из тех же листьев, восстанавливать ДХФИФ. Сохранение транспорта электронов в хлоропластах in vitro говорит о том, что прогрев, подавляющий фотосинтез, еще не инактивирует ФС II. Однако это не исключает подавление in situ репараторного цикла ФС II, который обладает повышенной чувствительностью к тепловому повреждению [3]. Способность хлоропластов восстанавливать ДХФИФ зависит также от его доступности для мембранных восстановителей, которая может возрастать при повреждении мембран в листе и увеличении их проницаемости. Возможно, этим объясняется более высокая активность реакции Хилла после прогрева на сильном свету (резко подавляющем фотосинтез) по сравнению с прогревом в темноте (рис. 3).

Изменение ультраструктуры клеток мезофилла, вызванное избыточным освещением, демонстрирует подвижность мембранной организации клеток, ее способность к быстрым изменениям и обновлению в меняющихся условиях. Увеличение протяженности фотосинтетических и цитоплазматических мембран и количества органелл в клетках мезофилла происходило также под действием теплового шока – 3-часового прогрева растений земляники при 3844°С при слабом освещении [14]. Отметим, что увеличение количества ЭР и аппарата Гольджи происходило и в нейронах суслика в течение 23-часового спонтанного разогрева тела во время зимней спячки [15]. По мнению авторов, восстановление мембран и рибосом осуществлялось в форме сборки из фрагментов, частично переваренных в аутофагосомах.

В клетках пшеницы под действием ТШ возрастание объема фотосинтетических мембран сопровождалось увеличением содержания мембранных липидов [8].

Глицеролипиды составляют основу мембран хлоропластов. Увеличение их суммарного содержания в листьях под действием избыточного освещения (табл. 1) корреллирует с увеличением размеров тилакоидной системы хлоропласта (табл. 3) и, следовательно, с увеличением общего объема мембран в листе.

Содержание липидов, локализованных в хлоропластах, возросло в основном за счет моногалактозилдиглицеринов (МГДГ) и фосфатидилглицеринов (ФГ). Липиды этих классов напрямую включены в фотосинтетические реакции. Накопление МГДГ увеличивает долю гексагональных структур в липидном матриксе тилакоидов, что должно стабилизировать мембранные белки в условиях стресса [16]. МДГД и ФГ структурно и функционально связаны с белками ФС II. ФГ синтезируются на свету и обеспечивают нормальное развитие тилакоидов [17, 18]. Важную роль в формировании гран играет трансгексадеценовая кислота (16:1trans). Одновременное двукратное увеличение в тканях листа количества ФГ, содержания в их составе ЖК 16:1trans и такое же увеличение числа гран и тилакоидов (табл. 13) указывает на участие ФГ в образовании дополнительных тилакоидов и сверхкрупных гран под действием избыточного освещения. Увеличение синтеза ФГ отмечено у растений с повышенной терморезистентностью фотосинтетического аппарата [19 и др.].

Общее содержание фосфолипидов, относящихся к внехлоропластной фракции, под действием избыточного освещения возросло почти в 3 раза. Основной компонент этой фракции фосфатидилхолины (ФХ) входят в состав мембран плазмалеммы, наружной мембраны хлоропласта и внутренних цитоплазматических мембран. В наших экспериментах увеличение абсолютного и относительного содержания ФХ происходит одновременно с увеличением количества цитоплазматических мембран в клетках листьев пшеницы (табл. 3, рис. 4б4ж). 

Адаптивное значение накопления ФХ в тканях растений заключается также в способности ФХ служить источником свободного холина, двухступенчатое окисление которого приводит к образованию глицинбетаина (ГБ). Трансгенные линии цианобактерий и растений, в клетках и хлоропластах которых активно синтезируются ГБ, обладают повышенной устойчивостью к разнообразным стрессовым воздействиям: промораживанию, засолению, избыточному свету, высокой температуре и засухе. Высокая концентрация ГБ защищает от теплового повреждения ФС II, ферменты ксантофиллового цикла и цикла Кальвина, в том числе – активазу Рубиско [3, 20].

Суммарное увеличение содержания липидов, соотношений ФЛ/ГЛ и липиды/Хл, реорганизация структуры хлоропластов (увеличение или сокращение числа тилакоидов в зависимости от вида растения), возрастание количества ЭР, митохондрий, диктиосом в клетках характерны для морозостойких растений в осеннезимний период и при холодовом закаливании и связаны с формированием морозостойкости [14, 21, 22 и др.].

Было обнаружено, что количество основных мембранных глицеролипидов и отношения МГДГ/ДГДГ увеличивалось у цветкового растения Ruppia spiralis в процессе адаптации к осмотическому и солевому стрессам [23].

Увеличение ненасыщенности мембранных липидов за счет повышения относительного содержания линоленовой кислоты в наших экспериментах можно объяснить тем, что свет активирует некоторые десатуразы ЖК, индуцируя экспрессию их генов [4, 5, 24, 25]. Такие же изменения в составе ЖК сопровождают адаптацию растений к холоду и засухе [26]. Мутанты и трансгенные линии цианобактерий и растений с повышенным содержанием ненасыщенных ЖК обладают высокой устойчивостью белка D1 и фотосинтеза к фотоповреждению, охлаждению и солевому стрессу [18, 27]. Напротив, увеличение относительного содержания насыщенных ЖК в мембранных липидах обычно приводит к повышению жаростойкости растительных клеток [3, 19, 26]. Однако при значительном увеличении насыщенности хлоропластных липидов высокая терморезистентность сопровождалась снижением устойчивости фотосинтеза к фотоингибированию в результате торможения репараторного цикла ФС II [28]. Эти данные подтверждают значение уровня текучести (флюидности) липидного бислоя мембран для диссоциации и сборки пигментбелковых комплексов фотосистем, конформационных изменений и взаимодействия интегральных белков [25, 28].

Высокая подвижность липидного бислоя способствует образованию мембран. Например, у картофеля введение гена ацил-липидной десатуразы цианобактерии вызвало повышение содержания ненасыщенных ЖК в мембранных липидах, увеличение холодостойкости и, одновременно, увеличение количества гран и тилакоидов в хлоропластах [29]. Учитывая данные нашей работы, а также тот факт, что адаптация растений к засолению, засухе и низкой температуре, как правило, сопровождается увеличением терморезистентности фотосинтеза, следует признать, что повышение устойчивости фотосинтетического аппарата к тепловому и фотоповреждению может сопровождаться не только понижением [3, 19, 26,], но и повышением уровня ненасыщенности мембранных липидов. 

Определенную роль в повышении терморезистентности фотосинтетического аппарата под действием избыточного освещения может играть жасмоновая кислота (ЖАК), которая синтезируется в хлоропластах из линоленовой кислоты. ЖАК и ее производные, наряду с другими стрессовыми гормонами (АБК, салициловой кислотой), быстро накапливаются в растительных тканях в ответ на биотические и абиотические стрессы, и как сигнальные медиаторы участвуют в активизации защитных механизмов. Финальные стадии синтеза ЖАК проходят в пероксисомах [26, 30]. Резкое увеличение количества пероксисом в клетках (табл. 3), наряду с увеличением количества линоленовой кислоты в глицеролипидах (табл. 2), указывает на возможную стимуляцию синтеза ЖАК под действием избыточного освещения. Частые и тесные соприкосновения пероксисом и хлоропластов (рис. 4е) говорят о том, что интермедиаты синтеза ЖАК могут передвигаться из пластид в пероксисомы через мембранные контакты.

Таким образом, в листьях пшеницы под действием избыточного освещения развиваются неспецифические структурные и биохимические изменения, которые появляются также в процессе адаптации к повышению и понижению температуры, обезвоживанию и солевому стрессу. В запуске этих адаптивных реакций, вероятно, участвуют активные формы кислорода (АФК), образование которых в растительных клетках резко возрастает на сильном свету. Известно, что АФК, наряду со стрессовыми гормонами (АБК, салициловой и жасмоновой кислотами), участвуют в формировании неспецифической (перекрестной) устойчивости (cross-toleranсe), индуцируя экспрессию генов белков, повышающих устойчивость к окислительному, тепловому, холодовому и осмотическому стрессам [4, 5]. Можно предположить, что сильный свет (интенсивность которого выше, чем необходимо для насыщения фотосинтеза) при нормальной температуре может вызвать повышение устойчивости не только к нагреву и фотоингибированию, но и к другим стрессовым воздействиям.

 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Powles S.B. Photoinhibition of photosynthesis induced by visible light // Annu. Rev. Plant Physiol. 1984. V. 35. P. 1544.

2. Кислюк И.М., Буболо Л.С., Быков О.Д., Каменцева И.Е., Шерстнева О.А. Защитное и повреждающее действие видимого света на фотосинтетический аппарат пшеницы при гипертермии // Физиология растений. 2008. Т. 55. С. 681689.

3. Allakhverdiev S.I., Kreslavski V.D., Klimov V.V., Los D.A., Carpentier R., Mohanty P. Heat stress: an overview of molecular responses in photosynthesis // Photosynth. Res. 2008. V. 98. P. 541550.

4. Li Z., Wakao S., Fischer B.B., Niyogi K.K. Sensing and responding to excess light // Annu. Rev. Plant Biol. 2009. V. 60. P. 239260.

5. Foyer C.H., Noctor G. Redox regulation in photosynthetic organisms: signaling, acclimation, and practical implication // Antiox. Redox Signal. 2009. V. 11. P. 862904.

6. Tardy F., Havaux M. Thylakoid membrane fluidity and thermostability during the operation of the xanthophyll cycle in higher plant chloroplasts // Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1330. P. 179193.

7. Кислюк И.М., Буболо Л.С., Палеева Т.В., Шерстнева О.А. Термоиндуцированное увеличение устойчивости фотосинтетического аппарата пшеницы к совместному действию высокой температуры и видимого света. Фиксация СО2, фотосинтетические пигменты и ультраструктура хлоропластов // Физиология растений. 2004. Т. 51. С. 507515.

8. Кислюк И.М., Буболо Л.С., Каменцева И.Е., Котлова Е.Р., Шерстнева О.А. Тепловой шок увеличивает терморезистентность фотосинтетического транспорта электронов, количество мембран и липидов в хлоропластах листьев пшеницы // Физиология растений. 2007. Т. 54. С. 517525.

9. Lichtenthaler H.K., Wellburn A.R. Determination of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents // Biochem. Soc. Trans. 1983. V. 11. P. 591592.

10. Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification // Can. J. Biochem. Physiol. 1959. V. 37. P. 911915.

11. Benning C., Huang Z.H., Gage D.A. Accumulation of a novel glycolipid and a betaine lipid in cell of Rhodobacter sphaeroides grown under phosphate limitation // Arch. Biochem. Biophys. 1995. V. 317. P. 103–111.

12. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов. Москва: Мир, 1975. 322 с.

13. Lyons J.M., Wheaton T.A., Pratty Y.K. Relationship between the physical nature of mitochondrial membranes and chilling sensitivity in plants // Plant Physiol. 1964. V. 39. P. 262268.

14. Палеева Т.В., Буболо Л.С., Кислюк И.М. Влияние температуры на фотосинтез, дыхание и ультраструктуру клеток листьев земляники Fragaria vesca // Цитология. 1993. Т. 35. С. 6069.

15. Бочарова Л.С., Гордон Р.Я., Рогаческий В.В., Игнатьев Д.А., Хуцян С.С. Циклические изменения структуры ЭР и аппарата Гольджи нейронов гиппокампа сусликов во время зимней спячки // Цитология. 2011. Т. 53. С. 259269.

16. Somerville C., Browse J. Plant lipids: metabolism, mutants and membranes // Science. 1991. V. 252. P. 8087.

17. Hagio M., Sakurai I., Sato S., Kato T., Tabata S., Wada H. Phosphatidylglycerol is essential for the development of thylakoid membranes in Arabidopsis thaliana // Plant Cell Physiol. 2002. V. 43. P. 14561464.

18. Sun Y.L., Li F., Su N., Sun X.L., Zhao S.J., Meng Q.W. The increase in unsaturation of fatty acids of phosphatidylglycerol in thylakoid membrane enhanced salt tolerance in tomato // Photosynthetica. 2010. V. 48. P. 400408.

19. Liu X., Yang J.-H., Li B., Yang X.-M., Meng Q.-W. Antisense expression of tomato chloroplast omega-3 fatty acid desaturase gen (LeVADY) enhances the tomato high-temperature tolerance through reduction of trienic fatty acids and alterations of physiological parameters // Photosynthetica. 2010. V. 48. P. 5966.

20. Wang G.P., Li F., Zhang J., Zhao M.R., Hui Z., Wang W. Overaccumulation of glycine betaine enhances tolerance of the photosynthetic apparatus to drought and heat stress in wheat // Photosynthetica. 2010. V. 48. P. 3041.

21. Senser M., Beck E. Correlation of chloroplast ultrastructure and membrane lipid composition to the different degrees of frost resistance achieved in leaves of spinach, ivy, and spruce // Plant Physiol. 1984. V. 117. P. 4155.

22. Климов С.В., Давыденко С.В., Новицкая Г.В., Астахова Н.В., Карасев Г.С., Суворова Т.А., Трунова Т.И. О причинах различий в морозостойкости озимой ржи и пшеницы. 2. Влияние холодового закаливания на ультраструктуру хлоропластов, фотосинтез, белковый, липидный и жирнокислотный состав первого листа // Физиология растений. 1993. Т. 40. С. 627635.

23. Шерстнева О.А., Котлова Е.Р., Киселева М.А. Формирование гидрофобного комплекса клеточных мембран Ruppia spiralis (Ruppiaceae) в норме и в условиях осмотического стресса // Ботан. журн. 2008. Т. 93. С. 14531463.

24. Kis M., Zsiros O., Farcas T., Wada H., Nagy F., Gombos Z. Light-induced expression of fatty acid desaturase genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 42094214.

25. Klyachko-Gurvich G.L., Tsoglin L.N., Doucha J., Kopetskii J., Shebalina (Ryabykh) I.B., Semenenko V.E. Desaturation of fatty acids as an adaptive response to shifts in light intensity // Physiol. Plant. 1999. V. 107. P. 240249.

26. Upchurch R.G. Fatty acid unsaturation, mobilization, and regulation in the response of plants to stress // Biotechnol. Lett. 2008. V. 30. P. 967977.

27. Gombos Z., Kanervo E., Tsvetkova N., Sakamoto T., Aro E.-M., Murata N. Genetic enhancement of the ability to tolerate photoinhibition by introduction of unsaturated bonds into membrane glicerolipids // Plant Physiol. 1977. V. 115. P. 551559.

28. Alfonso M., Collados R., Yruela I., Picorel R. Photoinhibition and recovery in herbicide-resistant mutant from Glycine max (L.) Merr. cell cultures deficient in fatty acid desaturation // Planta. 2004. V. 219. P. 428439.

29. Астахова Н.В., Дёмин И.Н., Нарайкина Н.В., Трунова Т.И. Влияние гена desA Δ12-ацил-липидной десатуразы на структуру хлоропластов и устойчивость к гипотермии растений картофеля // Физиология растений. 2011. Т. 58. С. 2127.

30. Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Жасмонат-зависимая защитная сигнализация в тканях растений // Физиология растений. 2009. Т. 56. С. 643653.

ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

 

Рис. 1. Последействие 1-часовой экспозиции листьев пшеницы при освещенности 20 и 370 Вт/м2 и разной температуре на интенсивность (а) и терморезистентность (б) фотосинтеза.

а – фотосинтез после экспозиции при 20 (1) и 370 Вт/м2 (2); б – фотосинтез листьев, прогретых 10 мин в темноте при 42°С сразу после экспозиции при 20 (1) и 370 Вт/м2 (2). Фотосинтез измеряли при 25°С и 150 Вт/м2.

 

Рис. 2. Последействие 1-часовой экспозиции листьев пшеницы при 25°С и освещенности 370 (а) и 600 Вт/м2 (б) на устойчивость фотосинтеза к 10-минутным прогревам при разной освещенности.

а – прогрев в темноте (1) и при 370 Вт/м2 (2) контрольных листьев; прогрев в темноте (3) и при 370 Вт/м2 (4) листьев после 1-часовой экспозиции 25°С и 370 Вт/м2; б – прогрев в темноте (1) и при 600 Вт/м2 (2) контрольных листьев; прогрев в темноте (3) и при 600 Вт/м2 (4) после 1-часовой экспозиции при 25°С и 600 Вт/м2. Фотосинтез измеряли при 25°С и 150 Вт/м2. Контрольные листья выдерживали при 25°С и 20 Вт/м2 во влажной камере на воде.

 

Рис. 3. Последействие 1-часовой экспозиции листьев пшеницы при 25°С и освещенности 600 Вт/м2 на устойчивость реакции Хилла к 10-минутным прогревам при разной освещенности.

1  прогрев контрольных листьев в темноте, 2  прогрев контрольных листьев при 600 Вт/м2; 3  прогрев листьев после 1-часовой экспозиции при 25°С в темноте, 4  прогрев листьев после 1-часовой экспозиции при 25°С при 600 Вт/м2. Восстановление ДХФИФ хлоропластами из прогретых листьев измеряли при комнатной температуре и освещенности 45 Вт/м2. Контрольные листья – как на рис. 2.

 

Рис. 4. Действие 1-часовой экспозиции листьев пшеницы при 25°С и 600 Вт/м2 на ультраструктуру клеток мезофилла.

а – контроль: фрагмент хлоропласта и цитоплазмы с малочисленными разрозненными рибосомами; б–з – после1-часовой экспозиции листьев при 600 Вт/м2 и 25°С; б – фрагменты хлоропласта и пероксисомы, митохондрии; в – фрагмент хлоропласта и цитоплазмы с крупными многочисленными полисомами, ЭР (указан стрелками); г, д – аппарат Гольджи и митохондрии; е, ж – выросты и инвагинации хлоропластов с митохондриями; з – многоступенчатая грана, состоящая из 45 тилакоидов. Масштабная линейка: а–ж – 0.5 мкм; з – 0.15 мкм. Вр – вырост хлоропласт, Г – аппарат Гольджи, И – инвагинация, КО – клеточная оболочка, ЛК – липидная капля, М – митохондрия, П – пероксисома, Хл – хлоропласт.

 

Рис. 5. Действие 10-минутного прогрева контрольных листьев пшеницы при 42°С и 600 Вт/м2 на ультраструктуру клеток мезофилла.

а – деформированный хлоропласт; б – фрагмент двух слившихся хлоропластов (стрелками указано место слияния и отсутствие оболочек); в – разбухший хлоропласт с распадающимися гранами и извилистыми тилакоидами; г – хлоропласт с обратным контрастом мембран и пластоглобулами, крупная липидная капля в цитоплазме; д – грана сложной формы, состоящая из 54 тилакоидов; е – хлоропласт с многотилакоидными гранами, миелиновое тело между пластидой и плазмалеммой; ж – скопление липидных капель и митохондрий в цитоплазме. Масштабная линейка: а–г, е – 0.5 мкм; д – 0.15 мкм; ж – 0.25 мкм. B – вакуоль, КО – клеточная оболочка, ЛК – липидная капля, М – митохондрия, П – пероксисома, ПР – периферический ретикулум хлоропласта.