УДК 581.1
В НАЧАЛЕ ПУТИ: ВОСПРИЯТИЕ АБК И ПЕРЕДАЧА ЕЕ СИГНАЛА
У РАСТЕНИЙ
© 2009 г. Г. В. Новикова, Н. С. Степанченко, А. В. Носов, И. Е. Мошков
Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 04.12.2008 г.
К настоящему времени получены принципиально важные данные о молекулярных механизмах действия фитогормонов, начиная с восприятия гормональных сигналов их рецепторами до изменений экспрессии гормон-регулируемых генов. Сигнальные механизмы, обеспечивающие возникновение ответов клеток растений на АБК, оставались наименее изученными. Хотя понимание роли протеинкиназ и протеинфосфатаз, функционирующих на пострецепторном уровне, достигло существенного прогресса, в работах по идентификации рецепторов АБК получены данные, ставшие предметом чрезвычайно острой дискуссии. В обзоре обобщена информация, полученная за последние несколько лет, о молекулярных механизмах рецепции АБК и трансдукции ее сигнала у растений.

Ключевые слова: растение  АБК  рецепторы АБК  трансдукция сигнала АБК  протеинкиназы  митоген-активируемые протеинкиназы  протеинфосфатазы.

 
-----------------------------------------
Сокращения: AAPK – ABA-activated protein kinase; ABAP1 – ABA-binding Protein 1; ABAR –putative abscisic acid receptor; abi – ABA insensitive; AHG1/3 – ABA hypersensitive germination 1/3; AKIP1 – AAPK interacting protein 1; AMBP – ABA-activated MBP kinase; AMPK – AMP-activated protein kinase (протеинкиназа, активируемая АМФ); AREB – ABA Responsive Element Binding protein; b-ZIP – basic-leucine Zipper; CHLH – Н-субъединица тримерного Mg2+-протопорфирин-IX хелатазного комплекса (Mg-хелатазы); CK2 – casein kinase 2; era1 – enchanced response to ABA; ERK – extracellular signal-regulated kinase; FCA – Flowering time Сontrol protein A; FLC– Flowering Locus C; FY – Flowering locus Y; GCL1 и GCL2 – GCR2-like protein 1 и 2; GCR1 – G-protein-coupled receptor 1; GCR2 – G-protein-coupled receptor 2; GPCR – G-protein-coupled receptor; G-белки – ГТФ-связывающие белки; HAB1/2 – hypersensitive to ABA 1/2; LANCL1 и LANCL2 – Lanthionine synthetase C-like 1 и 2; LRR – Leu-Rich Repeat; MAPK – mitogen-activated protein kinase (митоген-активируемая протеинкиназа); MAPKК или MAP2K – киназа MAPK; MAPKКК, MAP3K или МЕКК – киназа MAPK киназы; MBP – myelin basic protein; OST1 – open stomata1; PA – phosphatidic acid (фосфатидная кислота); PLD1 – фосфолипаза D1; PP – protein phosphatase (протеинфосфатаза); PTP – protein Tyr phosphatase; rcn1 – roots curl naphthylphtalamic acid1; RPK1 – Receptor-like Protein Kinase 1; SAPK – stress-activated protein kinase; SNF1 – Sucrose Non-fermenting kinase 1; SnRK киназа – Sucrose Non-fermenting related kinase; UBA2a и UBA2b – poly(U)-binding associated.
Адрес для корреспонденции: Новикова Галина Викторовна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18, электронная почта: gv.novikova@mail.ru
 ВВЕДЕНИЕ

На протяжении всего жизненного цикла растений классический фитогормон абсцизовая кислота играет важную, а порой, и критическую роль. Она медиирует комплекс ответов на абиотические стрессы, вызывает торможение роста, ускоряет старение тканей, участвует в регуляции таких сложных и жизненно важных для растений процессов как созревание и поддержание покоя семян и почек, переход к цветению и многих других. Формирование ответов на стрессы в значительной степени связано с изменениями синтеза АБК de novo. Увеличивающийся при водном дефиците уровень эндогенной АБК вызывает закрывание устьиц, снижение транспирации и является причиной усиления экспрессии АБК-регулируемых генов, что повышает устойчивость растений. Рост уровня АБК в эмбриогенезе семян необходим для активации экспрессии генов, ответственных за синтез веществ, повышающих устойчивость к высыханию.
Все разнообразие ответов растений на АБК можно разделить на быстрые и медленные. Одним из детально изученных и, вероятно, самых быстрых ответов на АБК является движение замыкающих клеток устьиц, где АБК управляет активностью ионных каналов плазмалеммы и тонопласта [1]. Однако большинство опосредуемых АБК ответов следует отнести к медленным, требующим дифференциальной экспрессии генов. При помощи кДНК-микрочипов в надземных органах модельного растения Arabidopsis thaliana обнаружено, что АБК и ее гомологи регулируют экспрессию 14% генов [26]. Впечатляющий прогресс в идентификации АБК-регулируемых генов стал возможным вследствие того, что ранее были изолированы и генетически охарактеризованы мутанты с измененной чувствительностью к экзогенной АБК и мутанты с дефицитом эндогенной АБК. По мере совершенствования методов прямой и обратной генетики ежегодно список АБК-регулируемых генов удлиняется, а число разнообразных белков, кодируемых вновь идентифицированными генами, растет. И хотя по-прежнему роль АБК остается наиболее подробно изученной при передаче стрессовых сигналов, становится все яснее значение этого фитогормона в осуществлении функций растений в нормальных физиологических условиях.
При оптимальном для роста водообеспечении у растений A. thaliana с дефицитом АБК (мутанты серии aba1) большинство морфологических параметров снижено, тогда как обработка экзогенной АБК ведет к их восстановлению, указывая на способность АБК усиливать вегетативный рост [7]. С другой стороны, АБК сдерживает продукцию этилена [8, 9], тогда как этилен способен усиливать синтез АБК [10, 11], что говорит о наличии отрицательной обратной связи в регуляции синтеза этих фитогормонов.
За последнее время опубликовано несколько обзоров, в которых суммированы данные, касающиеся биосинтеза АБК [12], а также физиологических и молекулярных аспектов ее регуляторного действия [1317]. Наиболее существенный вывод, который можно сделать, основываясь на огромном массиве полученных к настоящему времени данных, состоит в том, что пока невозможно построить универсальную модель, непротиворечиво описывающую процессы восприятия и передачи АБК-сигнала. Отчасти это обусловлено тем, что в проявлении своих эффектов АБК настолько многолика, что в разных типах клеток она способна вызывать сильно различающиеся ответы. Как уже упоминалось, действие АБК продолжают связывать, главным образом, с адаптацией растений к абиотическим стрессам, хотя этот фитогормон “активен” и при биотических стрессах [18]. Новые данные также указывают, что АБК вовлекается и в регуляцию программы развития, ранее не связываемую с ее действием: в регуляцию развития боковых корней [19].
Задача нашего обзора – на основании данных, полученных при помощи новых технологий, которые все шире используются биологами растений, показать, в чем проявляется уникальность молекулярных механизмов действия классического фитогормона АБК.

ПРЕДПОЛАГАЕМЫЕ РЕЦЕПТОРЫ АБК

Подобно другим фитогормонам, возникновение биологического ответа на АБК на клеточном уровне является результатом инициации биохимических реакций, обеспечивающих работу пути передачи гормонального сигнала, который включается после связывания АБК с ее рецепторами. Восприятие гормона может происходить либо на плазмалемме, либо в цитозоле, либо на внутриклеточных мембранах, например, эндоплазматического ретикулума. Еще в "прегеномную эру" исследователи процессов восприятия гормональных сигналов осознали, что один из путей идентификации рецепторов – отбор растений-мутантов с измененной чувствительностью к изучаемому фитогормону. Первым, наиболее ярким примером успешного использования указанного подхода стало открытие рецепторов этилена. Применение генетического подхода не привело к выявлению ни одного мутанта по предполагаемым рецепторам АБК. Более продуктивным оказалось использование биохимического подхода, позволившего получить сведения об АБК-связывающих белках. Однако наличие таких белков было невозможно соотнести с их ролью в проявлении физиологических эффектов АБК. Задача осложнялась еще и тем, что не только природная АБК, но и ряд ее аналогов, традиционно считавшихся неактивными, способны вызывать некоторые характерные для АБК ответы. Отсюда следует, что в клетках растений должны иметься АБК-связывающие белки с разными стереохимическими свойствами, а важнейшим критерием при изучении рецепторов АБК является использование аналогов АБК, позволяющих сопоставить специфичность связывания со степенью биологического ответа. Учитывая эти особенности, рассмотрим результаты исследований восприятия АБК, полученные в "постгеномную эру".
Еще в 2004 г. Razem с соавт. [20] клонировали ген, кодирующий белок плазмалеммы ABAP1 (от ABA-Binding Protein 1), который специфически связывал АБК. Наличие гена ABAP1 у многих видов одно- и двудольных растений указывало на универсальную природу кодируемого этим геном белка. Важно, что и очищенный рекомбинантный ABAP1, и ABAP1 в препаратах плазмалеммы клеток алейронового слоя ячменя специфично связывали природную АБК, а величины Kd (28 и 26.5 нМ соответственно) оказались практически одинаковыми. Только физиологически активная (+)-АБК эффективно конкурировала за связывание меченой АБК с ABAP1; ни (–)-АБК, ни транс-АБК, ни фазеевая и дигидрофазеевая кислоты, а также глюкозный эфир АБК не вытесняли (+)-АБК из комплекса с ABAP1. Однако предшественники АБК (с СНО- или ОН-группами в положении 1) были активными вытеснителями (+)-АБК. Так как (+)-абсцизовый альдегид и (+)-абсцизовый спирт также проявляют биологическую активность, можно заключить, что ABAP1 стереоспецифичен в отношении физиологически активной (+)-АБК. Белок ABAP1 соответствует ряду критериев рецептора АБК, но его количество во фракции плазмалеммы (около 2%) слишком высоко для предполагаемого белка-рецептора.
Годом позже у A. thaliana удалось изолировать локализованную в плазмалемме протеинкиназу RPK1 (от Receptor-Like Protein Kinase 1), которая содержит внеклеточный LRR (от Leu-Rich Repeat) Сер/Тре-киназный домен [21]. В геноме Arabidopsis кодируется более 600 белков подобных RPK1, причем для нескольких из них предсказана и/или продемонстрирована их рецепторная функция. В отличие от ABAP1 параметры связывания АБК с RPK1 не были изучены, однако показано, что белок RPK1 функционирует в АБК-зависимом сигнальном пути при прорастании семян, закрывании устьиц, росте корней, пролиферации клеток, а также в регуляции экспрессии генов ответа на АБК. Это давало основания предположить, что RPK1 может функционировать в качестве позитивного регулятора при передаче АБК-сигнала. Однако убедительных доказательств роли RPK1 в качестве рецептора АБК пока не получено.
Очевидно, что дифференциальная чувствительность к синтетическим аналогам АБК, которые химически стабильнее природной (+)-АБК, может быть использована для первичного скрининга мутантов, различающихся по способности дискриминировать изомеры АБК [22]. Однако и этот подход не позволил обнаружить мутанты по предполагаемым рецепторам АБК, хотя и аналоги АБК для осуществления своих физиологических свойств обязаны связываться с bona fide рецепторами. В 2006 г. появились сразу две работы, авторы которых претендовали на открытие внутриклеточных рецепторов АБК. Эти работы стали прологом почти детективной истории, о которой должны знать наши читатели.
Ядерный РНК-связывающий белок FCA (от Flowering Time Сontrol Protein A) ускоряет цветение растений Arabidopsis [23]. До исследований Razem с соавт. [24] РНК-связывающие белки – ключевые регуляторы экспрессии генов – не рассматривали в качестве непосредственных мишеней фитогормонов, тогда как некоторые ответы на АБК связаны с регуляцией метаболизма мРНК [25]. У Arabidopsis функция FCA как компонента автономного пути перехода к цветению состоит в том, чтобы препятствовать накоплению мРНК FLC (от Flowering Locus C) – репрессора генов флорального развития. Белок FCA Arabidopsis, идентифицированный благодаря наличию гомологии с белком плазмалеммы клеток алейронового слоя ячменя ABAP1 [20], способен с высокой аффинностью связывать физиологически активную АБК [24]. В присутствии АБК не проявлялась функциональная активность FCA, так как этот белок не был способен взаимодействовать со своим партнером 3РНК-процессинг фактором FY (от Flowering Locus Y). На основании этих данных был сделан вывод, что пóзднее цветение растений Arabidopsis, обработанных АБК, связано с повышением уровня FLC [24]. Более того, на основании этих данных, а также наличия связывания FCA с АБК Razem с соавт. [24] заключили, что FCA – внутриклеточный рецептор АБК, который, однако, не задействован в инициации таких ответов на АБК, как прорастание семян и закрывание устьиц.
Вплоть до конца 2008 г. FCA пребывал в статусе рецептора АБК. Но незыблемость FCA зашаталась, когда сразу две группы исследователей [26, 27] указали на ошибки Razem с соав. [24] как при определении характеристик связывания АБК, так и в отношении способности АБК блокировать взаимодействие FCA и FY. Авторы публикации [24] признали допущенные ими ошибки и отозвали свою статью [28].
В настоящее время роль еще одного предполагаемого внутриклеточного рецептора АБК – локализованной в хлоропластах H-субъединицы (CHLH) крупного тримерного Mg2+-протопорфирин-IX хелатазного комплекса (Mg-хелатазы) – также оказалась неоднозначной. В работе Shen с соавт. [29] показано, что CHLH (мол. м. 150 кД) имеет гомолог ABAR (от Abscisic Acid Receptor), который ранее был выделен из листьев Vicia faba и биохимически охарактеризован как специфически связывающий АБК [30]. Рекомбинантный ABAR/CHLH in vitro стереоспецифично и высокоаффинно связывал АБК [29]. Экспрессия ABAR во всех вегетативных тканях Arabidopsis, изменения в развитии семян у мутантов с поврежденным ABAR, а также то, что снижение экспрессии ABAR подавляло транскрипцию АБК-индуцируемых генов, тогда как усиление экспрессии ABAR вело к появлению АБК-гиперчувствительного фенотипа, были истолкованы как доказательства рецепторной роли ABAR/CHLH [29]. Однако когда сходные с перечисленными эксперименты были проведены с использованием серии мутантов ячменя, несущих (а) точечные мутации в гене Xantha-f, кодирующем H-субъединицу Mg-хелатазы, а также (б) мутантов, у которых нет H-субъединицы [31], оказалось, что АБК не связывалась с H-субъединицей и не влияла на активность Mg-хелатазы ячменя. Реакции на АБК мутантов ячменя, проверенных в тестах на ингибирование АБК роста корней и проростков, а также регуляции апертуры устьиц, не отличались от таковых у растений ячменя дикого типа.
Пока едва ли возможно предложить рациональное объяснение причин обнаруженных различий в реакции на АБК H-субъединиц Mg-хелатазы Arabidopsis и ячменя, особенно учитывая, что сходство H-субъединиц обоих растений высоко [31]. Следовательно, пока следует отложить признание H-субъединицы Mg-хелатазы в качестве рецептора АБК.
В клетках растений кроме внутриклеточных рецепторов, могут иметься рецепторы мембранной локализации, отличающиеся от рецептор-подобных протеинкиназ, о которых мы уже говорили, обсуждая свойства и функции RPK1. В клетках млекопитающих самое большое и наиболее изученное семейство мембранных рецепторов – суперсемейство белков, характеризующихся наличием в их молекулах семи трансмембранных доменов, вследствие чего они получили название 7ТМ-рецепторы (от Seven Transmembrane Receptor). Рецепторы этого типа связаны с гетеротримерными ГТФ-связывающими белками (G-белками), состоящими из трех лабильно ассоциированных субъединиц: Gα, Gβ и Gγ. Представители этого суперсемейства рецепторов передают информацию как о вне-, так и о внутриклеточных сигналах. Геномом человека кодируется более 800 связанных с G-белками рецепторов, называемых GPCR (от G-Protein-Coupled Receptor). Когда химический или физический сигнал стимулирует рецептор, последний активируется за счет изменения конформации, что ведет к диссоциации связанного с рецептором G-белка. В молекуле Gα ГДФ замещается на ГТФ, и Gα-ГТФ освобождается от гетеродимера Gβ:Gγ. Затем Gα-ГТФ, а также Gβ:Gγ активируют свои эффекторы. После гидролиза ГТФ за счет присущей Gα ГТФазной активности происходит реассоциация и инактивация гетеротримера. Описанная последовательность реакций происходит при активации GPCR в клетках млекопитающих, имеющих 23 идентифицированных Gα, пять Gβ и 12 Gγ, тогда как у Arabidopsis – только по одной Gα (GPA1) и Gβ (AGB1), но две Gγ (AGG1 и AGG2) субъединицы. Использование методов прямой и обратной генетики для изучения мутантов Arabidopsis с поврежденными компонентами G-белков, в частности Gα (GPA1), показало, что G-белкам может принадлежать существенная роль при передаче сигналов, в том числе и АБК [32, 33]. Это давало основания предположить, что у растений могут иметься GPCR, лигандом которых является АБК. До середины 2006 г. имелись лишь сведения о 22 белках-кандидатах, образующих семейство, представители которого локализованы в плазмалемме и содержат в своей молекуле семь трансмембранных доменов. Поэтому неудивительно, что появление работы Liu с соавт. [34], которые утверждали, что ими открыт первый в царстве растений GPCR, являющийся мембранным рецептором АБК, привлекло пристальное внимание биологов растений.
В геноме A. thaliana Liu с соавт. [34] обнаружили ген GCR2 (от G-Protein-Coupled Receptor 2), который в соответствии с использованным для поиска алгоритмом был предсказан как ген, кодирующий GPCR, содержащий 7ТМ. У растений Arabidopsis, трансформированных конструкцией, содержащей GCR2 и ген желтого флуоресцирующего белка, авторы обнаружили флуоресценцию во фракции мембран, что соответствовало предсказанной мембранной локализации GCR2. Кроме того, показано, что GCR2 может взаимодействовать как с Gα (GPA1) [34], так и Gβ [35]. Для выяснения функций GCR2 были получены мутанты, которые оказались нечувствительными к АБК на ранних этапах развития проростков и не отличались от дикого типа по экспрессии нескольких АБК-зависимых генов; кроме того, АБК не влияла на прорастание семян и движение замыкающих клеток устьиц этих мутантов. У растений Arabidopsis с экспериментально усиленной экспрессией GCR2 наблюдалась гиперчувствительность к АБК [34]. Наконец, авторы показали, что рекомбинантный GCR2 специфично и с высокой аффинностью связывал АБК.
Казалось бы, совокупность полученных данных свидетельствует в пользу рецепторной роли GCR2. Однако очень быстро после публикации работы [34] сразу несколько групп ученых опровергли опубликованные данные. Применение наиболее жестких критериев для in silico идентификации GPCR не подтвердило наличия у белка GCR2, а также у двух его идентифицированных гомологов GCL1 и GCL2 (от GCR2-Like Protein) семи трансмембранных доменов, имеющихся у всех GPCR [3639]. Напротив, GCR2, GCL1 и GCL2 на уровне первичной структуры сходны с локализованными в цитозоле и ядре белками млекопитающих LANCL1 и LANCL2 (от Lanthionine Synthetase C-Like) [40]. Биологическая роль LANCL в клетках эукариот не установлена, тогда как у прокариот LANC участвуют в синтезе пептидных антибиотиков, называемых лантибиотиками.
В работах Gao с соавт. [37] и Guo с соавт. [39] показано, что единичные, двойные и тройные мутанты по генам GCR2, GCL1 и GCL2 по чувствительности к АБК не отличались от растений Arabidopsis дикого типа в трех использованных тест-системах, а именно: по прорастанию семян, по ранним этапам развития проростков и по экспрессии АБК-чувствительных генов. Таким образом, серьезные генетические исследования указывают, что GCR2 и его гомологи GCL1 и GCL2 не являются рецепторами АБК в трех системах, представленных в работе Liu с соавт. [34]. Если у GCR2 вообще нет трансмембранных доменов, то возникает вопрос, связан ли этот белок с белком GPA1 – единственной Gα, имеющейся у Arabidopsis. В работе Gao с соавт. [37] показано, что при прорастании семян и ранних стадиях развития проростков мутант Arabidopsis gpa1 обладал не отсутствием чувствительности к АБК, как следовало бы ожидать в соответствии с данными Liu с соавт. [34], а несколько повышенной по сравнению с диким типом чувствительность к АБК. Следовательно, генетически белки GCR2 и GPA1 не связаны, что опровергает предложенную в работе Liu с соавт. [34] модель, согласно которой АБК воспринимается GCR2, который работает как классический GPCR. Более того, у единичных, двойных и тройных мутантов по GCR2 и GCL1/2 не наблюдалось изменений формы листьев, а также морфологии этиолированных проростков, что имело место у мутантов Arabidopsis как по Gα (gpa1), так и Gβ (agb1) [39]. Таким образом, пока нельзя определить, в чем состоит биологическая роль белков GCR2 и GCL1/2, но, по всей вероятности, они вряд ли функционируют в качестве рецепторов АБК при прорастании семян и на ранних этапах развития проростков.
Итак, пройден еще один этап поиска рецепторов АБК. Начавшись с идентификации трех возможных кандидатов, он завершился демонстрацией того, что на основании имеющихся в настоящее время данных ни одному из этих трех белков невозможно делегировать функцию рецептора АБК. Однако ситуация с идентификацией рецепторов АБК выглядит совсем не безнадежно, поскольку 2009 г. начался с публикации пока еще никем не опровергнутых результатов о двух новых кандидатах на роль рецепторов АБК.
Pandey с соавт. [41] идентифицировали у Arabidopsis два новых GPCR-подобных белка, имеющих наряду с существенной гомологией с одним из GPCR человека, несколько уникальных свойств: в обоих белках Arabidopsis присутствуют АТФ/ГТФ-связывающий домен, а также домен, ответственный за усиление ГТФазной активности. Эти белки получили название GTG1 и GTG2 (от GPCR-Type G Protein 1 и 2). У обоих белков предсказано девять трансмембранных доменов, они обнаруживаются во фракции микросом, а при совместной экспрессии в протопластах клеток мезофилла листьев Arabidopsis генов зеленого флуоресцирующего белка с GTG1/2 флуоресценция наблюдалась на периферии клеток, указывая, что GTG1/2 локализованы в плазмалемме. Очищенные рекомбинантные GTG1 и GTG2 не только специфически связывали ГТФ, но и проявляли ГТФазную активность. Более того, оба белка физически взаимодействовали с Gα Arabidopsis – белком GPA1.
Для доказательства функциональной роли GTG1/2 авторы использовали генетический подход, при помощи которого показано, что двойные мутанты gtg1 gtg2 обладали пониженной чувствительностью к АБК в трех классических тестах: реакция устьиц, прорастание семян, ингибирование роста корней и позеленения семядолей [41]. Наконец, установлено, что очищенные рекомбинантные белки GTG1/2 связывают только физиологически активную АБК с Kd около 40 нМ.
Совокупность полученных в работе Pandey с соавт. [41] данных указывает, что у Arabidopsis белки GTG1/2 могут быть потенциальными рецепторами АБК, вовлеченными в передачу гормонального сигнала при помощи G-белка. На правомочность этого заключения указывают: (1) рецептор-подобная топология и мембранная локализация GTG1/2; (2) взаимодействие с GPA1; (3) высокоаффинное и специфическое связывание АБК; (4) существование GTG1/2 в двух конформациях (ГДФ- и ГТФ-связанной), что обеспечивает механизм регуляции распространения сигнала АБК; (5) зависимость связывания АБК от конформации GTG1/2 (ГДФ- или ГТФ-связанной); (6) гипочувствительность к АБК растений, утративших GTG1/2; (7) отсутствие влияния АБК на транскрипцию GTG1/2.
Следует специально подчеркнуть, что GTG1/2 отличаются от канонических GPCR тем, что ГДФ-связанные формы GTG1/2 связывают АБК и инициируют работу пути передачи сигнала АБК, тогда как у канонических GPCR пребывание Gα в ГДФ-связанной конформации выключает систему. Таким образом, идентификация белков GTG1 и GTG2 в качестве возможных рецепторов АБК, без сомнения, внесет определенный оптимизм в исследования рецепторов АБК, утраченный вследствие того, что рецепторные функции белков FCA, CHLH и GCR2 были опровергнуты.
Вывод, к которому мы приходим, рассмотрев имеющиеся в литературе данные, заключается в том, что ставшее в последние годы популярным применение методов обратной генетики оказалось не очень эффективным при идентификации рецепторов АБК. Нет сомнений, что этот подход и компьютерное моделирование крайне информативны для построения рабочих гипотез, но они не позволяют приписать белку биохимические и функциональные свойства. С другой стороны, использование для структурных и функциональных исследований рекомбинантных белков также имеет немало ограничений, особенно когда в гетерологических, как правило, прокариотических системах экспрессируют гены сложных мембранных белков, как это было сделано в работах, рассмотренных в этом разделе. Действительно, экспрессия генов растительных белков в клетках Escherichia coli позволяет избежать сложных, длительных и дорогостоящих процедур выделения препаратов высокоочищенных белков из тканей растений. Но отсутствие у бактерий пост-трансляционных модификаций, необходимых для эукариотических белков, пока мало изученные механизмы фолдинга белков и их встраивания в мембраны, а также специфичный для растительных клеток липидный состав делают затруднительным получение в клетках бактерий функционально активных белков. На наш взгляд, указанные обстоятельства необходимо учитывать всем, кто ставит перед собой задачи, направленные на исследования структуры и функций белков эукариот.

ОБРАТИМОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ В ПЕРЕДАЧЕ СИГНАЛА АБК

Процессы обратимого фосфорилирования/дефосфорилирования белков, осуществляемые протеинкиназами и протеинфосфатазами, занимают центральное положение в сигнальной трансдукции. Изменение ферментативной активности белков, их локализации и стабильности, а также белокбелковых взаимодействий – таково поле биохимических последствий для функционирования протеинкиназ и протеинфосфатаз.

Протеинкиназы

Поскольку белки подвергаются фосфорилированию на всех этапах роста и развития растения, то ферменты, осуществляющие указанные реакции, можно назвать регуляторами большинства протекающих в клетках процессов. Не удивительно, что существенная доля генов эукариот кодирует протеинкиназы: например, в клетках дрожжей их немногим более 100 [42] и более 500 у человека [43] и мыши [44]. Приведенные цифры весьма красноречиво свидетельствуют, что протеинкиназы – один из наиболее представительных классов белков клеток эукариот. О важной роли протеинкиназ растений свидетельствует тот факт, что геномом Arabidopsis с приблизительно тем же числом генов, что и в геноме человека, кодируется 1100 протеинкиназ и 100200 протеинфосфатаз, что в сумме составляет 5% генома [45, 46].
Еще несколько лет назад основным препятствием определения протеинкиназ en masse было отсутствие адекватных методов их анализа. По этой причине центральное место в работах по изучению роли фосфорилирования в сигнальных путях занимали исследования, выполненные с использованием фармакологического подхода, а для изучения отдельных протеинкиназ применяли радиоактивное мечение белков in vivo и in vitro. Несмотря на очевидную ограниченность этих методов, впервые удалось показать, что в замыкающих клетках устьиц V. faba функционирует активируемая АБК Сер/Тре-протеинкиназа ААРК (от ABA-Activated Protein Kinase) [47, 48]. Мутация, которая вела к потере этой протеинкиназой ферментативной активности, блокировала АБК-регулируемый ответ устьиц [48]. ААРК способна in vitro фосфорилировать ядерный нуклеопротеин AKIP1 (от AAPK Interacting Protein 1), связывающийся с мРНК, кодирующей дегидрин. После обработки АБК усиливалась РНК-связывающая активность AKIP1 и изменялась его локализация внутри ядра [49, 50]. Хотя значение вызванных АБК изменений внутриядерной локализации РНК-связывающих белков не совсем ясно, можно предположить, что оно необходимо для перераспределения внутри ядра факторов сплайсинга [51].
Ключевой участник, вовлеченный в регуляцию АБК размера устьичной щели у Arabidopsis, – протеинкиназа OST1 (от Open Stomata 1), являющаяся ортологом AAPK1 V. faba [52]. Если в С-концевом (киназном) домене OST1 имелись мутации, то ответ устьичных клеток на АБК не наблюдался, а ost1-мутанты приобретали гиперчувствительность даже к незначительному обезвоживанию [52, 53].
У Arabidopsis в качестве партнеров OST1 работают белки UBA2a и UBA2b (от Poly(U)-Binding Associated). Из названия этих белков ясно, что они взаимодействуют с поли(U)-связывающими белками, характеризующимися наличием в их молекулах двух РНК-узнающих мотивов, которые, как правило, присутствуют в РНК-связывающих белках, обладающих сродством к однонитевой РНК. Подобно AKIP1, в ответ на АБК изменяется локализация UBA2a в ядре, однако пока не удалось показать, что OST1 способна in vitro фосфорилировать UBA2a и/или UBA2b [50]. Эти данные указывают, что в процессе передачи АБК-сигнала у V. faba и Arabidopsis функционирование протеинкиназ с высоким уровнем гомологии может отличаться. В связи с этим, обсуждая экспериментальные данные, следует принимать во внимание видовую принадлежность растительного объекта.
Протеинкиназа OST1 – одна из десяти представителей семейства SnRK2 киназ (от Sucrose Non-fermenting Related Kinase 2). Структура протеинкиназ этого семейства близка протеинкиназам дрожжей SNF1 (от Sucrose Non-Fermenting Kinase 1), а также протеинкиназам млекопитающих, активируемым АМФ (AMPK, от AMP-Activated Protein Kinase). Функционирование AMPK и SNF1 связано с регуляцией метаболизма клеток млекопитающих и дрожжей при понижении энергетического обеспечения, как в случае недостатка питательных элементов.
На основании сходства первичной структуры и доменной организации SnRK растений распределены в три подсемейства: SnRK1, SnRK2 и SnRK3 [54], причем подсемейства SnRK2 и SnRK3 уникальны для растений. Генетические и биохимические исследования показали, что протеинкиназы подсемейства SnRK2 участвуют в передаче АБК-сигнала, что приводит в движение устьичные клетки [52], вовлечены в регуляцию индуцируемой АБК экспрессии генов, а также важны для АБК- и стресс-регулируемого прорастания семян [53, 55, 56]. Из десяти SnRK2, кодируемых геномом Arabidopsis, протеинкиназы SnRK2.2, SnRK2.3 и SnRK2.6 активируются АБК; активность SnRK2.8 лишь в небольшой степени зависит от АБК, но эта киназа активируется маннитом и гиперосмотическим стрессом; активность SnRK2.9 не регулируется ни АБК, ни в ответ на изменения осмолярности [54, 57]. У риса три из десяти SnRK2, которые называются SAPK (от Stress-Activated Protein Kinase), активируются АБК [58].
Фосфорилирование самих протеинкиназ – механизм, при помощи которого усиливается их активность, причем активация может быть результатом как автофосфорилирования, так и следствием работы других протеинкиназ. Если при передаче АБК-сигнала сайты авто- и субстратного фосфорилирования идентичны, то при замене аминокислотных остатков Сер в сайтах фосфорилирования на Ала должна теряться ферментативная активность, и не должно происходить фосфорилирование белка. У риса для проявления киназной активности и активации SAPK1 необходим аминокислотный остаток Сер158 [58], у Arabidopsis Сер158 риса соответствуют Сер175 в SnRK2.3 и Сер176 в SnRK2.6. Как показали Boudsocq с соавт. [59], при замене Сер175 и Сер176 на Ала у мутантов отсутствовала киназная активность, но обе протеинкиназы находились в фосфорилированном состоянии, а уровень их фосфорилирования у мутантов не зависел от обработки АБК. Следовательно, подвергнувшиеся мутации остатки Сер, скорее, необходимы для проявления киназной активности per se, чем для активации SnRK2. Можно думать, что активация АБК SnRK2 является не результатом автофосфорилирования, а последствием работы другой протеинкиназы, оперирующей раньше SnRK2 в пути передачи АБК-сигнала [59]. Использование NetPhosK алгоритма [60] позволило предсказать в SnRK2 несколько сайтов, фосфорилирование которых осуществляется протеинкиназой CK2 (от Casein Kinase 2). Только у АБК-активируемых SnRK2 обнаружен кластер из двухтрех остатков Сер – предполагаемых сайтов фосфорилирования, которые находятся в С-концевой части белка, что, по-видимому, специфично для АБК-зависимой активации SnRK2 [61].
Из процитированных работ очевидна потребность в идентификации всех сайтов фосфорилирования SnRK2 in vivo, что сейчас стало возможным благодаря использованию масс-спектрометрического анализа. Получение таких данных позволит разобраться в механизмах, посредством которых осуществляется активация АБК SnRK2. С другой стороны, идентификация протеинкиназ, фосфорилирующих SnRK2, а также мишеней SnRK2 сделает возможным корректно расположить SnRK2 в пути передачи АБК-сигнала.
В настоящее время большинство субстратов SnRK2 неизвестно, однако исследования последних лет показали, что OST1, SnRK2.2, SnRK2.3, а также SnRK2.8, активность которой при гиперосмотическом стрессе не зависит от АБК, способны фосфорилировать in vitro аминокислотные остатки Сер и Тре в так называемых С-субдоменах, содержащихся в молекулах факторов транскрипции b-ZIP (от Basic-Leucine Zipper). Такая доменная структура имеется у белков AREB (от ABA Responsive Element Binding Protein), а именно: AREB1, AREB2 и ABI5 [62]. У этих белков имеется четыре С-субдомена (С1С4), которые необходимы для димеризации и связывания с промотором-мишенью. У четырех рассматриваемых SnRK2 аминокислотные остатки Сер в С1 и С2 in vitro фосфорилируются наиболее сильно, тогда как для сайта фосфорилирования в С3, содержащего Тре, характерен низкий уровень фосфорилирования. Пока экспериментально не подтверждено фосфорилирование аминокислотных остатков Сер в С4-домене, в котором, как в С1 и С2, имеется аминокислотный остаток Арг в положении –3 относительно Сер/Тре, соответствующих положению 0. Так устроены сайты фосфорилирования у известных мишеней SnRK2. У риса SAPK также оказалась способной фосфорилировать in vitro один из b-ZIP-факторов транскрипции, причем SAPK фосфорилировала b-ZIP по двум остаткам Сер, которым предшествовал Арг в положении –3 [63]. Таким образом, регулируемые АБК SnRK2 Arabidopsis и SAPK риса проявляют сходство не только на уровне структурной организации белков, но и в отношении своих мишеней.
У искомых in vivo субстратов протеинкиназ фосфорилированию подвергаются аминокислотные остатки Сер/Тре, реже Тир, располагающиеся в сайте фосфорилирования, узнаваемом каталитическим доменом протеинкиназы. Остатки Гис также подвергаются фосфорилированию, но из-за присущей фосфо-Гис лабильности их детектирование крайне затруднено. Прежде для идентификации субстрата изучаемой киназы индивидуальные очищенные белки использовали в реакциях фосфорилирования in vitro. Сейчас в связи с развитием фосфопротеомики стало возможным одновременно тестировать тысячи белков или пептидов на принадлежность к возможным мишеням изучаемой протеинкиназы. Приведем лишь один красноречивый пример, относящийся пока не к растениям, а к клеткам дрожжей Saccharomyces cerevisiae [64]. Авторы изготовили белковые чипы с нанесенными на них ~4400 белками S. cerevisiae, далее каждый чип инкубировали с одной из 87 очищенных протеинкиназ дрожжей в присутствии [γ-33P]АТФ. Чтобы исключить автофосфорилирование, параллельно белковый чип инкубировали только в присутствии [γ-33P]АТФ. Белки, оказавшиеся радиоактивно меченными в первой реакции, но не мечеными – во второй, и являются in vitro субстратами использованной для реакции протеинкиназы. В этих экспериментах было установлено, что у более чем 1300 белков произошло ~4200 актов фосфорилирования. Каждая протеинкиназа, включая близкородственные, фосфорилировала собственный набор субстратов: из всех белков, нанесенных на чип, 73% фосфорилировались только одной, редко – двумя протеинкиназами, что указывает на сохранение специфичных белков-кандидатов при таком массовом анализе.
Хотя в последнее время исследователи протеинкиназ растений все эффективнее используют фосфопротеомные стратегии, работы по идентификации субстратов протеинкиназ in vivo – скорее исключение.
Shin с соавт. [65] сравнили наборы фосфопротеинов трансгенных растений Arabidopsis, сверхэкспрессирующих SnRK2.8, и двух мутантов snrk2.8-1 и snrk2.8-2, утративших вследствие мутации киназную активность. Для дальнейшей идентификации при помощи масс-спектрометрии выбирали только те фосфорилированные полипептиды, которые присутствовали на двумерных электрофореграммах белков, выделенных из трансгенных SnRK2.8-сверхэкспрессирующих растений, но отсутствовали в препаратах из мутантных растений. На основании данных масс-спектрометрического анализа авторы отобрали 11 белков-кандидатов, каждый из которых был индивидуально проверен в реакции in vitro с рекомбинантной SnRK2.8. Семь из протестированных белков фосфорилировались только в присутствии SnRK2.8. Идентифицированными субстратами SnRK2.8 оказались три изоформы регуляторных белков 14-3-3, фосфорилирование которых ингибирует взаимодействие 14-3-3 с их партнерами; глиоксилаза I, необходимая для детоксикации побочных продуктов гликолиза; рибозо-5-фосфатизомераза, участвующая в цикле Кальвина; аденозинкиназа, функционирующая в синтезе аденилатов и разных форм цитокининов; 60S рибосомный белок, который находится в фосфорилированной форме, когда трансляция происходит с высокой скоростью. Таким образом, мишени SnRK2.8 – белки, вовлеченные, в том числе, в метаболические процессы, связанные с регуляцией роста. Это, в свою очередь, не противоречит сведениям об усилении роста сверхэкспрессирующих SnRK2.8 растений Arabidopsis [65].
Необходимо заметить, что установленные аминокислотные последовательности сайтов фосфорилирования в белках 14-3-3 [65] и AREB1 [62] отличаются, хотя SnRK2.8 может фосфорилировать и те, и другие. В чем же причина отсутствия консервативности? С одной стороны, различие могло возникнуть из-за того, что для определения первичных последовательностей использовали разные технологии, и пока явно недостаточно экспериментальных данных, полученных при помощи одинаковых экспериментальных подходов. С другой стороны, и это крайне интересно, можно предположить, что SnRK2.8 способна фосфорилировать не один, а несколько разных мотивов в молекуле мишени. Действительно, в клетках животных многие факторы транскрипции фосфорилируются по нескольким сайтам. В результате такого множественного фосфорилирования может изменяться стабильность фактора, его локализация и взаимодействие с другими белками, т.е. фосфорилирование – это прямой способ регуляции активности факторов транскрипции.
Среди протеинкиназ, исследуемых в связи с передачей сигнала АБК, особое место занимают митоген-активируемые протеинкиназы (MAPK, от Mitogen-Activated Protein Kinase). Еще в 1996 г. Knetsch с соавт. [66] показали, что в протопластах клеток алейронового слоя ячменя АБК в физиологических концентрациях активировала киназу, способную in vitro фосфорилировать MBP (от Myelin Basic Protein) – экзогенный субстрат MAPK. На основании биохимических свойств авторы предположили, что обнаруженная протеинкиназа – это MAPK, функционирующая в составе MAPK-модуля.
В клетках эукариот основу ансамбля MAPK составляет трехкомпонентный модуль. Минимальный MAPK-модуль включает три функционально связанные протеинкиназы. Первая протеинкиназа в модуле называется киназой MAPK-киназы (MAPKКК, MAP3K или МЕКК). MAPKКК являются Сер/Тре протеинкиназами, которые после активации фосфорилируют и активируют следующие киназы в модуле: MAPK-киназы (MAPKК или MAP2K), узнающие и фосфорилирующие Тре-Х3-Тир-мотив в молекулах MAPK. По этой причине MAPKК называют киназами двойной специфичности. MAPK – терминальные киназы в модуле – фосфорилируют в своих субстратах аминокислотные остатки Сер и Тре. Важнейшими субстратами MAPK in vivo являются локализованные в ядре факторы транскрипции. Только часть активированных в цитоплазме МАРК перемещается в ядро, немало активированных МАРК остается в цитоплазме и других субклеточных компартментах, где их роль менее изучена. Тем не менее, показано, что нетранслоцировавшиеся в ядро МАРК способны фосфорилировать протеинкиназы других семейств, фосфолипазы, белки, ассоциированные с цитоскелетом, и даже протеинкиназы собственного модуля.
Какие преимущества приобретают МАРК, функционируя в составе модуля? Уникальным свойством протеинкиназ этого семейства является то, что для полной активации МАРКК должна фосфорилировать МАРК как по Тре, так и по Тир. Различные МАРКК узнают третичную структуру в “своих” МАРК, а не просто линейную последовательность, окружающую мотив фосфорилирования. Это свойство позволяет создавать специфичные комбинации MAPКKMAPK. Напротив, многочисленные МАРККК способны работать с разными комбинациями МАPКК и MAPK, что позволяет разным сигналам включать специфические MAPK-пути. Таким образом, благодаря образованию MAPK-модулей происходит сегрегация единичного сигнального пути от других сигнальных событий, происходящих в клетке.
Геномом Arabidopsis кодируется 20–23 МАРК, которые сейчас называют MPK. Для сравнения, у дрожжей имеется шесть, а у млекопитающих – 14 МАРК. Подчеркнем, что все МАРК растений сходны с киназами ERK-подсемейства млекопитающих (от Extracellular Signal-Regulated Kinase), работа которых ведет к усилению пролиферации. Внутри группы МАРК растений выделяют два подтипа: МАРК, содержащие Тре-Глу-Тир-мотив фосфорилирования (ТЕY-подтип), а также МАРК с Тре-Асп-Тир-мотивом (TDY-подтип).
Протеинкиназы МАРКК-семейства представлены 10 белками, структурно близкими между собой. Сейчас принято считать, что МАРКК – это своего рода точка, в которой сходятся сигналы от расположенных выше них в модуле МАРККК, и от которой расходятся сигналы к функционирующим после них МАРК.
Самым многочисленным семейством у растений является семейство МАРККК: у Arabidopsis оно состоит из 6080 протеинкиназ [67], но только для некоторых из них установлены биологические функции. Поскольку за пределами каталитического домена структура киназ этого семейства весьма разнообразна, т.е. основания предполагать, что их ферментативная активность может регулироваться самыми разными сигналами, что ведет к селективной активации МАРКК.
К сказанному следует добавить, что МАРКККМАРККМАРК-модули могут активироваться киназами более высокого порядка, которые были найдены пока только у дрожжей и Arabidopsis и названы МАРКККК (или МАР4К). У Arabidopsis имеется 10 генов, кодирующих эти протеинкиназы, однако ни для одной из них не показана роль в качестве регуляторов МАРК-пути [68].
Важно подчеркнуть, что у млекопитающих работа МАРК-модулей в значительной степени связана с регуляцией клеточных делений, выживаемостью клеток или индукцией апоптоза, тогда как у растений практически все установленные МАРК-модули связаны с возникновением ответов на абиотические стрессы. Тем не менее, имеются и появляются новые данные, указывающие на участие МАРК-модулей в проведении гормональных сигналов.
Все имеющиеся данные об участии МАРК в передаче АБК-сигнала получены при использовании биохимических подходов, поскольку при помощи генетических методов не выделено ни одного мутанта ни по МАРК, ни по МАРКК.
Только через несколько лет после публикации работы Knetsch с соавт. [66] Burnett с соавт. [69] показали, что в замыкающих клетках устьиц Pisum sativum АБК активировала протеинкиназу AMBP (от ABA-Activated MBP Kinase), которая имела ряд свойств, характерных для МАРК: АМВР фосфорилировала MBP; мол. м. АМВР – 45 кД – соответствовала таковым у известных МАРК клеток животных, дрожжей и некоторых видов растений; при активации АМВР происходило ее фосфорилирование по аминокислотным остаткам Тир; ферментативная активность АМВР подавлялась специфическим ингибитором МАРКК – PD98059. Однако принципиально важным представляется тот факт, что АБК-индуцированная активация АМВР коррелировала с уменьшением просвета устьичной щели [69], свидетельствуя о возможности функционирования МАРК-модуля, в котором АМВР работала в качестве МАРК. МАРК-модули способны проводить сигнал, реализующийся не только в изменении размера устьичной щели, но и плотности устьиц. Показано, что МАРККК YODA может контролировать развитие устьиц. У растений Arabidopsis с нулевыми мутациями в гене YODA отмечено увеличение плотности устьиц, тогда как при усилении экспрессии YODA число устьиц существенно снижалось [70].
За последние несколько лет стало очевидным, что в АБК-индуцируемом закрывании устьиц значительная роль принадлежит Н2О2, которая также регулирует движение устьиц, причем характер регуляторного действия Н2О2 сходен с таковым АБК. Сказанное можно отнести, в том числе, и к МАРК, так как предполагается, что АБК и Н2О2 могут активировать одну и ту же МАРК [71, 72]. Несколько позднее было установлено, что активации MAPK предшествовал рост уровня Н2О2. Этот существенный вывод был сделан после того, как удалось показать, что АБК-индуцируемая активация MAPK не наблюдалась после предобработки ткани ингибиторами НАДФН-оксидазы (т.е. в отсутствие образования АФК) или веществами, являющимися ловушками О2– и Н2О2 [73]. Таким образом, вызванное АБК образование Н2О2 активирует MAPK, которая, в свою очередь, усиливает работу антиоксидантной системы растения.
Можно ли сейчас назвать ту индивидуальную MAPK, которая в замыкающих клетках устьиц Arabidopsis участвует в передаче АБК-сигнала? Среди предполагаемых кандидатов – две MAPK: MPK3 и MPK4. Инактивация гена MPK4 не приводила к нарушению физиологических ответов на такие абиотические стрессы как солевой и высокотемпературный, но растения с инактивированным MPK4 проявляли повышенную устойчивость к биотическим стрессам [74]. В отличие от MPK4, MPK3, вероятно, участвует в возникновении ответов как на биотический, так и на абиотический стресс. Показано, что MPK3 функционирует, например, в MAPK-модуле в пути передачи сигнала бактериального элиситора флагеллина [75]. Усиление экспрессии MPK3 увеличивало чувствительность к АБК прорастающих семян Arabidopsis [71]. Экспонирование растений Arabidopsis в атмосфере О3 вызывало активацию MPK3 и ее транслокацию в ядро [76]. Недавно удалось показать, что если экспрессировать MPK3 в антисмысловой ориентации, то у таких растений Arabidopsis АБК не ингибировала открывание устьиц, тогда как закрывание устьиц оставалось АБК-чувствительным [77]. Можно допустить, что в устьицах сигнал АБК может передаваться посредством разных сигнальных путей, когда речь идет либо об открывании, либо о закрывании устьиц. Важно, что у растений с антисмысловым вариантом MPK3 уровень АБК-индуцированной Н2О2 сравним с таковым у нетрансформированных растений, но движение клеток устьиц трансгенных растений оказалось нечувствительным к экзогенной Н2О2 [77]. Таким образом, MPK3 необходима для функционирования пути передачи сигнала АБК, который включает образование Н2О2.
На каком основании можно говорить, что MPK3 работает в замыкающих клетках устьиц? Ответ на этот вопрос находим в работе Gudesblat с соавт. [77]. Если использовать для трансформации MPK3 в антисмысловой ориентации, поставленный под делетированную версию промотора KST1 картофеля, о котором известно, что он экспрессируется только в “зрелых” замыкающих клетках [78], то у трансформированных растений ген MPK3 экспрессировался в разных типах клеток листа, но антисмысловая конструкция подавляла экспрессию MPK3 только в замыкающих клетках [77]. Следовательно, использованная антисмысловая конструкция затрагивала MPK3 специфически.

Протеинфосфатазы

Фосфорилированный по специфическим сайтам одной или несколькими протеинкиназами белок является мишенью протеинфосфатаз (PP, от Protein Phosphatase). Следовательно, уровень фосфорилирования определяется соотношением изменения активности соответствующей протеинкиназы или протеинфосфатазы, или обеих. Изучение РР существенно отставало от исследований протеинкиназ, поскольку считалось, что наличие высокой конститутивной активности РР не оставляет возможности для осуществления тонкой регуляции их активности. Однако работы последних лет показали, что с изменениями функционирования РР связана эффективность работы сигнального пути, в частности, пути передачи сигнала АБК.
Прежде чем приступить к рассмотрению роли индивидуальных РР в передаче АБК-сигнала, напомним, что РР эукариот на основании их субстратных предпочтений делят на два основных типа: Сер/Тре- и Тир-фосфатазы. Поскольку у высших растений не найдены типичные Тир-киназы, то наличие у растений Тир-фосфатаз ставилось под сомнение вплоть до их открытия у Arabidopsis (см. обзор [79]).
В зависимости от биохимических свойств и структуры среди Сер/Тре-РР выделяют РР1, РР2А, РР2В и РР2С. Наибольшее представительство в клетках эукариот имеет РР2А – сложный фермент, состоящий из трех субъединиц: каталитической (С), образующей комплекс с скэффолд-субъединицей А, который связывает регуляторную субъединицу В. Геномом Arabidopsis кодируется пять изоформ С-субъединицы, три А-субъединицы и 16 В-субъединиц РР2А. Так как знания о работе РР2А растений весьма ограничены, то основываясь на данных о РР2А клеток млекопитающих, можно предположить, что, располагая указанным набором субъединиц, РР2А растений способна организовывать большое число разных по структуре, субклеточной локализации и субстратной специфичности гетеротримеров [8082], что, по-видимому, позволяет РР2А участвовать в регуляции таких протекающих в клетках процессов, как прорастание семян, акклиматизация к холоду, ответы на поранение, передача гормональных сигналов.
Роль РР2А в упомянутых выше процессах установлена с использованием фармакологического подхода, поскольку при генетическом скрининге мутантов по РР2А получена единственная серия rcn1 (от Roots Curl Naphthylphtalamic Acid 1), у которых наблюдалось снижение (по сравнению с диким типом) активности РР2А. Ген RCN1 кодирует скэффолд-субъединицу Аα (РР2А-Аα) [83]. У растений с rcn1-мутацией оказался измененным транспорт ауксина [84]; два аллеля rcn1 идентифицированы, соответственно, как АБК-нечувствительные [85] и этилен-гиперчувствительные [86], т.е. мутанты rcn1 проявляют плейотропный фенотип.
Более успешным в идентификации мутантов, у которых из-за мутации РР2А теряла ферментативную активность, оказалось использование обратной генетики. Рецессивные мутанты рр2ас-2 были получены при помощи Т-ДНК-инсерции в гены, кодирующие С-субъединицы РР2А. Мутанты рр2ас-2 проявляли гиперчувствительность к АБК в таких тестах, как рост корней, развитие проростков, покой и прорастание семян, экспрессия АБК-регулируемых генов [87]. Напротив, растения, сверхэкспрессирующие РР2Ас-2, имели пониженную чувствительность к АБК. У мутантов рр2ас-2 активность РР2А существенно снижалась, тогда как при усилении экспрессии РР2Ас-2 ферментативная активность увеличивалась. Эти результаты указывают, что использованный подход – один из успешных способов выяснения специфической роли индивидуальной субъединицы РР2А. Поскольку в геноме Arabidopsis имеется пять генов РР2Ас, проявляющих 90% идентичность и практически конститутивный уровень экспрессии, то наличие у рр2ас-2 изменений в чувствительности к АБК свидетельствует, что при передаче сигнала АБК функции РР2А не перекрываются.
Хорошо известно, что АБК координирует разные аспекты ответа на осмотический стресс, обеспечивая выживание растений. Действительно, АБК-нечувствительные и АБК-дефицитные мутанты характеризуются повышенной устойчивостью к засолению и/или высоким концентрациям сахаров [88, 89]. Изучение мутантов рр2ас-2 показало, что они, как и следовало ожидать, проявляли повышенную чувствительность к упомянутым стрессам [87]. Это тем более интересно, что АБК-гиперчувствительный мутант era1 (от Enchanced Response to ABA) более устойчив к обоим стрессам [90, 91], т.е. у Arabidopsis существует сложная связь между ответами на стрессы, чувствительностью к АБК и функционированием РР2А. Возникает вопрос: способна ли АБК регулировать активность РР2А? Показано, что у растений Arabidopsis дикого типа после обработки АБК активность РР2А быстро (уже через 10 мин) снижалась. Увеличение продолжительности экспонирования с гормоном вело к увеличению уровня РР2А мРНК, накоплению белка РР2А, а ферментативная активность возвращалась к уровню необработанных АБК растений [87]. Эти данные позволяют утвердительно ответить на сформулированный выше вопрос. Более того, можно предположить, что для передачи сигнала АБК необходимо быстро дерепрессировать РР2А. Такая регуляция, вероятно, обеспечивается АБК-индуцируемой транскрипцией РР2А и ее АБК-зависимой активацией.
Как правило, при изучении передачи гормональных сигналов наибольшее внимание уделяется активации компонентов сигнального пути, тогда как необходимо знать, какие механизмы обеспечивают возвращение клеток к исходному состоянию после включения ответа на гормон. Активация РР2Ас-2 и регуляция экспрессии РР2Ас-2 – механизм, обеспечивающий восстановление чувствительности к АБК после первичной активации. Ориентируясь на данные Pernas с соавт. [87], можно представить следующую последовательность событий. В норме высокая конститутивная активность РР2А ограничивает восприятие АБК. После обработки АБК или в случае усиления синтеза АБК, как у подвергнутых стрессу растений, активность РР2А снижается, рецептор связывает АБК, что инициирует соответствующий ответ на гормон. Если подобно скэффолд-субъединицам РР2А-А2 и РР2А-А3, которые in vitro убиквитинируются лигазой Е3 [92], РР2А подвергается этому типу посттранскрипционной регуляции, ведущей к ее быстрой протеолитической деградации, то можно ожидать проявления АБК-зависимого снижения активности РР2А. При снятии стресса или прекращении обработки АБК, АБК-зависимая транскрипция/трансляция РР2Ас-2 может усилиться, что восстановит приемлемый для клетки уровень активности РР2А, а вновь синтезированные РР2Ас-2 репрессируют передачу АБК-сигнала, обеспечивая ответ растения на следующую обработку АБК или возобновление стресса.
Мы уже говорили о центральной роли АБК в регуляции закрывания устьиц, где она регулирует активность катионных и анионных каналов [93]. Однако роль протонных насосов в регулируемом АБК закрывании устьиц весьма неоднозначна. У недавно охарактеризованных мутантов ost2 (от Open Stomata 2) выявлена конститутивно активная Н+-АТФаза, названная АНА1 [94]. Замыкающие клетки ost2 не отвечают на АБК, но при росте уровня СО2 или при включении света устьица этих мутантов закрываются. Эти наблюдения свидетельствуют, что только активацией АБК анионных каналов нельзя объяснить деполяризацию плазмалеммы, этому событию должно предшествовать снижение активности АНА1 [95]. Показано, что ферментативная активность Н+-АТФазы может снижаться при фосфорилировании консервативных аминокислотных остатков Сер и Тре, располагающихся в С-концевом регуляторном домене Н+-АТФазы [96], и, действительно, установлено их фосфорилирование in vivo [97]. В связи с обсуждением роли РР2А важно, что недавно не только удалось обнаружить взаимодействие одной из трех скэффолд-субъединиц РР2А с Н+-АТФазой АНА2 – ближайшим гомологом АНА1, но и показать, что такое взаимодействие может предотвращать активацию АНА2 [98].
Если ранние исследования РР2А фокусировались лишь на изучении ферментативной активности этих протеинфосфатаз, то теперь появляются сведения о роли индивидуальных субъединиц РР2А. Эти новые данные, в том числе, позволяют иначе взглянуть на роль в Н+-АТФаз в АБК-медиируемом закрывании устьиц. Приведенные сведения о РР2А, безусловно, указывают, что РР2А – компонент пути передачи сигнала АБК. Следовательно, необходимо определить положение этого компонента на сигнальной карте АБК.
Роль РР в передаче сигнала АБК раньше других была установлена для РР2С. Это произошло, вероятно, благодаря тому, что были получены доминантные мутанты серии abi1-1 (от ABA Insensitive).
Наличие у растений Arabidopsis abi-мутаций делает их нечувствительными к АБК, что показано в таких тестах, как прорастание семян и закрывание устьиц [13]. На молекулярном уровне у мутантов этой серии произошли существенные изменения АБК-регулируемой транскрипции [2].
Когда мутантные гены были клонированы, то оказалось, что кодируемые ими белки принципиально различаются. Так, гены ABI1 и ABI2 кодируют РР2С, тогда как ABI3, ABI4 и ABI5 – различные факторы транскрипции [99]. Для нашего рассмотрения, по понятным причинам, важны РР2С.
Анализ генома Arabidopsis предсказывает наличие от 69 до 75 РР2С, причем кроме ABI1 и ABI2 к этому большому семейству генов РР2С принадлежат AHG1/3 (от ABA Hypersensitive Germination 1/3) и HAB1/2 (от Hypesensitive to ABA 1/2) [100]. Все перечисленные РР2С на основании генетического анализа признаются негативными регуляторами передачи сигнала АБК, а мутации по любому из этих генов ведут к повышенной чувствительности к АБК. Механизм, посредством которого регулируется активность РР2С, неизвестен, но установлено, что АБК усиливает экспрессию РР2С, следовательно, можно предположить, что регуляция происходит на транскрипционном уровне. Показано, что экспрессия РР2С, относящихся к пути передачи сигнала АБК, тканеспецифична и зависит от стадии развития растений: НАВ1 преимущественно экспрессируется в замыкающих клетках устьиц [4, 101], а AHG3/1 – при развитии и прорастании семян [102, 103]. Ген AHG3 конститутивно активен весь этот период, наиболее высокий уровень его экспрессии отмечен в меристемах и проводящих пучках. Напротив, транскрипты AHG1 равномерно распределены в тканях зародыша. Такой различный характер экспрессии РР2С, вероятно, свидетельствует о принадлежности этих протеинфосфатаз к разным путям передачи АБК-сигнала. Более того, двойные мутанты hab1-1 abi1-3 оказались более чувствительными к АБК, чем каждый из родителей, что также позволяет предположить, что ABI1 и HAB1 контролируют не один, а разные пути [104].
Было принято считать, что РР не обладают специфичностью в отношении своих субстратов. Однако недавно показано, что ABI1 и ABI2 взаимодействуют с разными белками. Протеинфосфатаза ABI1 связывается с протеинкиназой OST1 и фактором транскрипции ATHB6, тогда как ABI2 – с протеинкиназой SOS2, а также с глютатионпероксидазой и фибриллином [61, 105107].
Пока неизвестно, регулирует ли ABI1 активность OST1, дефосфорилируя эту протеинкиназу, но это возможно, поскольку показано, что OST1 даже в отсутствие, например, стрессового сигнала находится в фосфорилированном состоянии [57]. Вполне вероятным представляется предположение, что при абиотическом стрессе в OST1 изменяется набор фосфорилированных аминокислот, некоторые из них дефосфорилирует ABI1, а пока неустановленная протеинкиназа осуществляет de novo фосфорилирование OST1.
Недавно показано, что ABI1 способна взаимодействовать с фосфатидной кислотой (РА), которая образуется при расщеплении липидов плазмалеммы фосфолипазой Dα1 (PLDα1) [108, 109]. У мутантов pldα1 устьичные клетки не реагируют на АБК, а у двойных мутантов abi1-3 pldα1 АБК ускоряла закрывание устьиц. Это указывало на то, что ABI1 ингибирует вызываемое АБК закрывание устьиц. Если РА связывается с ABI1 in vivo, то РА может удерживать ABI1 на цитоплазматической стороне плазмалеммы, предотвращая выполнение ABI1 ее функции негативного регулятора АБК-медиируемого закрывания устьиц [108]. Таким образом, можно допустить, что различные функции РР2С – результат их способности взаимодействовать с разными мишенями. Сходные биохимические свойства, но различия в пространственной экспрессии генов и субстратной специфичности РР2С могут приводить к проявлению как различных, так и перекрывающихся функций этих протеинфосфатаз. Поэтому когда одна из РР2С становится неспособной к работе, другие РР2С могут, но только частично компенсировать ее отсутствие. Отсюда очевидна необходимость целенаправленного изучения экспрессии генов и выяснения in vivo мишеней, по крайней мере, шести РР2С, свойства которых мы обсуждали.
Один из главнейших вопросов, связанных с протеинфосфатазами, – это вопрос о месте РР2А и РР2С в пути передачи сигнала АБК. Пока на него нет однозначного ответа, но можно попытаться осветить эту проблему, используя данные, полученные при изучении двойных мутантов abi1-1 pp2ac-2, рост корней которых оказался чувствительнее к АБК, чем у родительского мутанта abi1-1 [87]. Не исключено, что РР2Ас-2 и РР2С(ABI1) работают в одном сигнальном пути, причем РР2Ас-2 функционирует ниже или на том же уровне, что и РР2С(ABI1). Пока только для RCN1 показано участие в передаче гормонального сигнала [85]. Но RCN1 – скэффолд-субъединица РР2А, которая участвует в транспорте ауксина и ответах на этилен. В отличие от RCN1, РР2Ас-2 – каталитическая субъединица, обладающая специфической функцией при передаче сигнала АБК. Поэтому выяснение роли РР2Ас-2 в качестве негативного регулятора ответов на АБК еще в большей степени утвердило представление о роли протеинфосфатаз как ключевых негативных компонентов, регулирующих передачу сигнала этого фитогормона.
Уже упоминалось, что кроме протеинфосфатаз, дефосфорилирующих в своих субстратах фосфо-Сер и фосфо-Тре, у растений имеются РР, дефосфорилирующие фосфо-Тир – РТР (от Protein Tyr Phosphatase). Подобно РТР клеток животных и дрожжей, у растений функциональная активность РТР связана с регуляцией активности MAPK. Показано, что in vitro РТР1 Arabidopsis (AtPTP1) обратимо инактивировалась Н2О2, но изменений уровня белка AtPTP1 и его стабильности в белковых препаратах, выделенных из обработанных Н2О2 проростков, не наблюдалось [110]. В пользу роли AtPTP1 в качестве инактиватора MAPK указывало снижение способности Н2О2-активированной MAPK фосфорилировать свой in vitro субстрат в присутствии AtPTP1. MAPK, инактивированная in vitro AtPTP1, оказалась AtMPK6, участие которой в MAPK-модулях, проводящих сигнал при абиотических стрессах, убедительно показано как для Arabidopsis, так и для других растений. Важно подчеркнуть, что уровень инактивации AtMPK6 пропорционален степени дефосфорилирования фосфо-Тир в AtMPK6 [109].
Мы уже говорили, что замедление прорастания семян и роста обработанных АБК проростков Arabidopsis связано с функционированием MAPK-модуля [71]. Однако в то время авторы не представили данных об инактивации АБК-зависимой MAPK. Теперь стало известно, что дефосфорилирование фосфо-Тир в молекуле MAPK – регуляторный механизм АБК-регулируемого торможения прорастания семян и роста проростков Arabidopsis. Если в присутствии АБК подавить дефосфорилирование фосфо-Тир, то прорастание семян задерживалось из-за увеличения чувствительности к АБК [111]. При описанных обстоятельствах существенно усиливалась экспрессия АБК-регулируемого гена Rab18, уровень которого едва детектировался в отсутствие гормона. Следовательно, нельзя исключить, что при прорастании семян РТР работают в качестве негативных регуляторов MAPK-пути. На наш взгляд, однако, еще рано делать какие-то категоричные выводы, поскольку в целом количество информации о роли РТР у растений слишком малó.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы попытались суммировать результаты исследований восприятия и передачи сигналов АБК, полученные за последние несколько лет. Обсуждая их значимость для построения сигнальной карты АБК, можно заключить, что исследования рецепции АБК и событий, происходящих на пострецепторном уровне, все еще находятся в начале пути. Погоня за иллюзорными рецепторами АБК пока не увенчалась идентификацией внутриклеточных рецепторов этого фитогормона. Нельзя исключить, что для АБК будут найдены рецепторы мембранной локализации, отличающиеся от белков GTG1/2. Отвечающие критериям рецепторов гормонов белки GTG1/2 в настоящее время представляются весьма вероятными кандидатами на роль рецепторов АБК. Далее, кроме идентификации рецепторов АБК, необходимо ответить на вопрос, каким компонентам передается сигнал АБК, воспринятый рецепторами. Хотя убедительно показана роль протеинкиназ разных семейств в передаче сигнала АБК, пока нет ответа на вопрос, каков механизм передачи информации о связавшемся с рецептором гормоне. У млекопитающих и дрожжей такими “передатчиками” сигнала являются ГТФ-связывающие белки, как гетеротримерные, так и мономерные. Исследования участия этих белков в сигнальной трансдукции АБК представляется весьма перспективным. В отношении самих протеинкиназ остается много нерешенных вопросов, особенно учитывая, что в каждом из вовлеченных в передачу сигнала АБК семейств протеинкиназ насчитывается много представителей. Дополнительный уровень сложности привносят многочисленные протеинфосфатазы. У Arabidopsis их рассматривают в качестве негативных регуляторов пути передачи АБК-сигнала. Остаются практически неизвестными эндогенные субстраты протеинкиназ и протеинфосфатаз. Хотя в исследованиях с использованием белковых микрочипов уже получены новые сведения о потенциальных субстратах протеинкиназ, необходимо in planta подтвердить их физиологическую значимость.
В ближайшее время место основного аналитического подхода в исследованиях передачи гормональных сигналов, по-видимому, займет протеомика фосфорилированных белков, или, как сейчас принято говорить, фосфопротеомика. Пока этот подход наиболее успешно используется в исследованиях фосфорилированных белков клеток Arabidopsis и риса, геномы которых полностью секвенированы. Однако с увеличением числа секвенированных геномов этот подход станет возможным использовать для более широкого круга растений.
Альтернативой протеомике может стать набирающая обороты метаболомика. В наши дни метаболомика становится принципиально важным дополнительным элементом геномики и протеомики, поскольку этот подход позволяет одновременно анализировать в биологическом образце необыкновенно широкий набор метаболитов. При помощи метаболомики можно получить представление об АБК-регулируемых процессах у растений с такой степенью детализации, которая позволит корректно предсказать функции биологической системы от генетического уровня до метаболизма, физиологии и, наконец, роста и развития растений.
Работа авторов осуществляется при частичной поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 08-04-00643) и гранта Государственной поддержки научных исследований, проводимых ведущими научными школами Российской Федерации (НШ.915.2008.4).

 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Nilson S.E., Assmann S.M. The Control of Transpiration. Insights from Arabidopsis // Plant Physiol. 2007. V. 143. P. 19-27.
2. Hoth S., Morgante M., Sanchez J.P., Hanafey M.K., Tingey S.V., Chua N.H. Genome-Wide Gene Expression Profiling in Arabidopsis thaliana Reveals New Targets of Abscisic Acid and Largely Impared Gene Regulation in the abi1-1 Mutant // J. Cell Sci. 2002. V. 115. P. 4891-4900.
3. Seki M., Ishida J., Narusaka M., Fujita M., Nanjo T., Umezawa T., Kamiya A., Nakajima M., Enju A., Sakurai T., Satou M., Akiyama K., Yamaguchi-Shinozaki K., Carninci P., Kawaj J., Hayashizaki Y., Shinozaki K. Monitoring the Expression Pattern of around 7000 Arabidopsis Genes under ABA Treatments Using a Full-Length cDNA Microarray // Funct. Integr. Genom. 2002. V. 2. P. 282-291.
4. Leonhardt N., Kwak J.M., Robert N., Waner D., Leonardt G., Schroeder J.I. Microarray Expression Analyses of Arabidopsis Guard Cells and Isolation of a Recessive Abscisic Acid Hypersensitive Protein Phosphatase 2C Mutant // Plant Cell. 2004. V. 16. P. 596-615.
5. Takahashi S., Seki M., Ishida J., Satou M., Sakurai T., Narusaka M., Kamiya A., Nakajima M., Enju A., Akiyama K., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. Monitoring the Expression Profiles of Genes Induced by Hyperosmotic, High Salinity, and Oxidative Stress and Abscisic Acid Treatment in Arabidopsis Cells Culture Using a Full-Length cDNA Microarray // Plant Mol. Biol. 2004. V. 56. P. 29-55.
6. Huang D., Jaradat M.R., Wu W., Ambrose S.J., Ross A.R., Abrams S.R., Cutler A.J. Structural Analogs of ABA Reveal Novel Features of ABA Perception and Signaling in Arabidopsis // Plant J. 2007. V. 50. P. 414-428.
7. Barrero J.M., Piqueras P., González-Guzmán M., Serrano R., Rodriguez P.L., Ponce M.R., Micol J.L. A Mutational Analysis of the ABA1 Gene of Arabidopsis thaliana Highlights the Involvement of ABA in Vegetative Development // J. Exp. Bot. 2005. V. 56. P. 2071-2083.
8. Sharp R.E., LeNoble M.E. ABA, Ethylene and the Control of Shoot and Root Growth under Water Stress // J. Exp. Bot. 2002. V. 53. P. 33-37.
9. Benschop J.J., Millenaar F.F., Smeets M.E., van Zanten M., Voesenek L.A.C.J., Peeters A.J.M. Abscisic Acid Antagonized Ethylene-Induced Hyponastic Growth in Arabidopsis // Plant Physiol. 2007. V. 143. P. 1013-1023.
10. Grossmann K., Hansen H. Ethylene Triggered Abscisic Acid: A Principle in Plant Growth Regulation? // Physiol. Plant. 2001. V. 113. P. 9-14.
11. Chiwocha S.D.S., Cutler A.J., Abrams S.R., Ambrose S.J., Yang J., Ross A.R.S., Kermode A.R. The etr1-2 Mutation in Arabidopsis thaliana Affects the Abscisic Acid, Auxin, Cytokinin and Gibberellin Metabolic Pathways during Maintenance of Seed Dormancy, Moist-Chilling and Germination // Plant J. 2005. V. 42. P. 35-48.
12. Nambara E., Marion-Poll A. ABA Biosynthesis and Catabolism // Annu. Rev. Plant Biol. 2005. V. 56. P. 165-185.
13. Finkelstein R.R., Gampala S.S.L., Rock C.D. Abscisic Acid Signaling in Seeds and Seedlings // Plant Cell. 2002. V. 14 (Suppl.). P. S15-S45.
14. Himmelbach A., Yang Y., Grill E. Relay and Control of Abscisic Acid Signalling // Curr. Opin. Plant Biol. 2003. V. 6. P. 470-479.
15. Roelfsema M.R.G., Hedrich R. In the Light of Stomatal Opening: New Insights into “the Watergate” // New Phytol. 2005. V. 167. P. 665-691.
16. Israelsson M., Siegel R.S., Young J., Hashimoto M., Iba K., Schroeder J.I. Guard Cell ABA and CO2 Signaling Network Updates and Ca2+ Sensor Priming Hypothesis // Curr. Opin. Plant Biol. 2006. V. 9. P. 654-663.
17. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. Gene Networks Involved in Drought Stress Response and Tolerance // J. Exp. Bot. 2007. V. 58. P. 221-227.
18. Asselberg B., de Vleesschauwer D., Hofte M. Global Switches and Fine-Tuning – ABA Modulates Plant Pathogen Defense // Mol. PlantMicrobe Interact. 2008. V. 21. P. 709-719.
19. De Smet I., Zhang H., Inze D., Beeckman T. A Novel Role for Abscisic Acid Emerges from Underground // Trends Plant Sci. 2006. V. 11. P. 434-439.
20. Razem F.A., Luo M., Liu J.-H., Abrams S.R., Nill R.D. Purification and Characterization of a Barley Aleurone Abscisic Acid-Binding Protein // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 9922-9929.
21. Osakahe Y., Maruyama K., Seki M., Satou M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinase 1 Is a Key Membrane-Bound Regulator of Abscisic Acid Early Signaling in Arabidopsis // Plant Cell. 2005. V. 17. P. 1105-1119.
22. Nambara E., Suzuki M., Abrams S., McCarty D.R., Kamiya Y., McCourt P. A Screen for Genes That Function in Abscisic Acid Signaling in Arabidopsis thaliana // Genetics. 2002. V. 161. P. 1247-1255.
23. Macknight R., Bancroft I., Page T., Lister C., Schmidt R., Love K., Westphal L., Murphy G., Sherson S., Cobbett C., Dean C. FCA, a Gene Controlling Flowering Time in Arabidopsis, Encodes a Protein Containing RNA-Binding Domains // Cell. 1997. V. 89. P. 737-745.
24. Razem F., El-Kereamy A., Abrams S., Hill R. The RNA-Binding Protein FCA Is an Abscisic Acid Receptor // Nature. 2006. V. 439. P. 290-294.
25. Hirayama T., Shinozaki K. Perception and Transduction of Abscisic Acid Signals: Keys to the Function of the Versatile Plant Hormone ABA // Trends Plant Sci. 2007. V. 12. P. 343-351.
26. Risk J.M., Macknight R.C., Day C.L. FCA Does Not Bind Abscisic Acid // Nature. 2008. V. 456. P. E5-E6.
27. Jang Y.H., Lee J.H., Kim J.-K. Abscisic Acid Does Not Disrupt Either the Arabidopsis FCA-FY Interaction or Its Rice Counterpart In Vitro // Plant Cell Physiol. 2008. V. 49. P. 1898-1901.
28. Razem F.A., El-Kereamy A., Abrams S.R., Hill R.D. Retraction: The RNA-Binding Protein FCA Is an Abscisic Acid Receptor // Nature. 2008. V. 456. P. 824.
29. Shen Y.-Y., Wang X.-F., Wu F.-Q., Du S.-Y., Cao Z., Shang Y., Wang X.-L., Peng C.-C., Yu X.-C., Zhu S.-Y., Fan R.-C., Xu Y.-H., Zhang D.-P. The Mg-Chelatase H Subunit Is an Abscisic Acid Receptor // Nature. 2006. V. 443. P. 823-826.
30. Zhang D.-P., Wu Z.Y., Li X.Y., Zhao Z.X. Purification and Identification of a 42-Kilodalton Abscisic Acid-Specific-Binding Protein from Epidermis of Broad Bean Leaves // Plant Physiol. 2002. V. 128. P. 714-725.
31. MüllerA.H., Hansson M. The Barley Magnesium Chelatase 150-kDa Subunit Is Not an Abscisic Acid Receptor // Plant Physiol. 2009. doi: 10.1104/pp.109.135277.
32. Jones A.M., Assmann S.M. Plants: The Latest Model System for G-Protein Research // EMBO Rep. 2004. V. 5. P. 572-578.
33. Pandey S., Chen J.G., Jones A.M., Assmann S.M. G-Protein Complex Mutants Are Hypersensitive to Abscisic Acid Regulation of Germination and Postgermination Development // Plant Physiol. 2006. V. 141. P. 243-256.
34. Liu X., Yue Y., Li B., Nie Y., Li W., Wu W.-H., Ma L. A G Protein-Coupled Receptor Is a Plasma Membrane Receptor for the Plant Hormone Abscisic Acid // Science. 2007. V. 315. P. 1712-1716.
35. Liu X., Yue Y., Li W., Ma L. Response to Comment on “A G Protein-Coupled Receptor Is a Plasma Membrane Receptor for the Plant Hormone Abscisic Acid” // Science. 2007. V. 318. P. 914d.
36. Johnston C.A., Temple B.R., Chen J.-G., Gao Y., Moriyama E.N., Jones A.M., Siderovski D.P., Willard F.S. Comment on “A G Protein-Coupled Receptor Is a Plasma Membrane Receptor for the Plant Hormone Abscisic Acid” // Science. 2007. V. 318. P. 914.
37. Gao Y., Zeng Q., Guo J., Cheng J., Ellis B.E., Chen J.-G. Genetic Characterization Reveals No Role for the Reported ABA Receptor, GCR2, in ABA Control of Seed Germination and Early Seedling Development in Arabidopsis // Plant J. 2007. V. 52. P. 1001-1013.
38. Illingworth C.J.R., Parkes K.E., Snell C.R., Mullineaux Ph.M., Reynolds C.A. Criteria for Confirming Sequence Periodicity Identified by Fourier Transform Analysis: Application to GCR2, a Candidate Plant GPCR? // Biophys. Chem. 2008. V. 133. P. 28-35.
39. Guo J., Zeng Q., Emami M., Ellis B.E., Chen J.-G. The GCR2 Gene Family Is Not Required for ABA Control of Seed Germination and Early Seedling Development in Arabidopsis // PloS ONE. 2008. V. 3. e2982. doi: 10.1371/journal.pone.0002982.
40. Chen J.C., Ellis B.E. GCR2 Is a New Member of the Eukaryotic Lanthionine Synthetase Component C-Like Protein Family // Plant Signal. Behavior. 2008. V. 3. P. 307-310.
41. Pandey S., Nelson D.C., Assmann S.M. Two Novel GPCR-Type G Proteins Are Abscisic Acid Receptors in Arabidopsis // Cell. 2009. V. 136. P. 136-148.
42. Zhu H., Klemic J.F., Chang S., Bertone P., Casamayor A., Klemic K.G., Smith D., Gerstein M., Reed M.A., Snyder M. Analysis of Yeast Protein Kinases Using Protein Chips // Nat. Genet. 2000. V. 26. P. 283-289.
43. Manning G., Whyte D.B., Martinez R., Hunter T., Sudarsanam S. The Protein Kinase Complement of the Human Genome // Science. 2002. V. 298. P. 1912-1934.
44. Caenepeel S., Charydczak G., Sudarsanam S., Hunter T., Manning G. The Mouse Kinome: Discovery and Comparative Genomics of All Mouse Protein Kinases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 11 707-11 712.
45. The Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the Genome Sequence of the Flowering Plant Arabidopsis thaliana // Nature. 2000. V. 408. P. 796-815.
46. Kerk D., Bulgrien J., Smith D.W., Barsam B., Veretnik S., Gribskov M. The Complement of Protein Phosphatase Catalytic Subunits Encoded in the Genome of Arabidopsis // Plant Physiol. 2002. V. 129. P. 908-925.
47. Li J., Assmann S.M. An Abscisic Acid-Activated and Calcium-Dependent Protein Kinase from Guard Cells of Fava Bean // Plant Cell. 1996. V. 8. P. 2359-2368.
48. Li J., Wang X.-Q., Watson M.B., Assmann S.M. Regulation of Abscisic Acid-Induced Stomatal Closure and Anion Channels by Guard Cell AAPK Kinase // Science. 2000. V. 287. P. 300-303.
49. Li J., Kinoshita T., Pandey S., Ng C.K.-Y., Gygi S.P., Shimazaki K.-I., Assmann S.M. Modulation of an RNA-Binding Protein by Abscisic-Acid-Activated Protein Kinase // Nature. 2002. V. 418. P. 793-797.
50. Riera M., Redko Y., Leung J. Arabidopsis RNA-Binding Protein UBA2a Relocalizes into Nuclear Speckles in Response to Abscisic Acid // FEBS Lett. 2006. V. 580. P. 4160-4165.
51. Tillemans V., Leponcea I., Rausina G., Dispaa L., Motte P. Insights into Nuclear Organization in Plants as Revealed by the Dynamic Distribution of Arabidopsis SR Splicing Factors // Plant Cell. 2006. V. 18. P. 3218-3234.
52. Mustilli A.C., Merlot S., Vavasseurb A., Fenzia F., Giraudat J. Arabidopsis OST1 Protein Kinase Mediates the Regulation of Stomatal Aperture by Abscisic Acid and Acts Upstream of Reactive Oxygen Species Production // Plant Cell. 2002. V. 14. P. 3089-3099.
53. Yoshida R., Habo T., Ichimura K., Mizoguchi T., Takahashi F., Alonso J., Ecker J.R., Shinozaki K. ABA-Activated SnRK Protein Kinase Is Required for Dehydration Stress Signaling in Arabidopsis // Plant Cell Physiol. 2002. V. 43. P. 1473-1483.
54. Hrabak E.M., Chan C.W.M., Gribskov M., Harper J.F., Choi J.H., Halford N., Kudla J., Luan S., Nimmo H.G., Sussman M.R., Thomas M., Walker-Simmons K., Zhu J.-K., Harmon A.C. The Arabidopsis CDPK-SnRK Superfamily of Protein Kinases // Plant Physiol. 2003. V. 132. P. 666-680.
55. Johnson R.R., Wagner R.L., Verhey S.D., Walker-Simmons M.K. The Abscisic Acid-Responsive Kinase PKABA1 Interacts with a Seed-Specific Abscisic Acid Response Element-Binding Factor, TaABF, and Phosphorylates TaABF Peptide Sequences // Plant Physiol. 2002. V. 130. P. 837-846.
56. Fujii H., Verslues P.E., Zhu J.-K. Identification of Two Protein Kinases Required for Abscisic Acid Regulation of Seed Germination, Root Growth, and Gene Expression in Arabidopsis // Plant Cell. 2007. V. 19. P. 485-494.
57. Boudsocq M., Barbier-Brygoo H., Laurière C. Identification of Nine Sucrose Nonfermenting 1-Related Protein Kinases 2 Activated by Hyperosmotic and Saline Stresses in Arabidopsis thaliana // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 41 758-41 766.
58. Kobayashi Y., Yamamoto S., Minami H., Kagaya Y., Hattori T. Differential Activation of the Rice Sucrose Nonfermenting1-Related Protein Kinase 2 Family by Hyperosmotic Stress and Abscisic Acid // Plant Cell. 2004. V. 16. P. 1163-1177.
59. Boudsocq M., Droillard M.-J., Barbier-Bryguo H., Laurierc C. Different Phosphorylation Mechanism Are Involved in the Activation of Sucrose Non-Fermenting1 Related Protein Kinase 2 by Osmotic Stresses and Abscisic Acid // Plant Mol. Biol. 2007. V. 63. P. 491-503.
60. Blom N., Sicheritz-Ponten P., Gupta R., Gammerltolf S., Brunak S. Prediction of Post-Translational Glycosylation and Phosphorylation of Proteins from the Amino Acid Sequence // Proteomics. 2004. V. 4. P. 1633-1649.
61. Yoshida R., Umezawa T., Mizoguchi T., Takahashi S., Takahashi F., Shinozaki K. The Regulatory Domain of SRK2E/OST1/SnRK2.6 Interacts with ABI1 and Integrates Abscisic Acid ABA and Osmotic Stress Signals Controlling Stomatal Closure in Arabidopsis // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 5310-5318.
62. Furihata T., Maruyama K., Fujita Y., Umezawa T., Yoshida R., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. Abscisic Acid-Dependent Multisite Phosphorylation Regulates the Activity of a Transcription Activator AREB1 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 1988-1993.
63. Kobayashi Y., Murata M., Minami H., Yamamoto S., Kagaya Y., Hobo T., Yamamoto A., Hattori T. Abscisic Acid-Activated SNRK2 Protein Kinases Function in the Gene-Regulation Pathway of ABA Signal Transduction by Phosphorylating ABA Response Element-Binding Factors // Plant J. 2005. V. 44. P. 939-949.
64. Ptacek J., Devgan G., Michaud G., Zhu H., Zhu X., Fasolo J., Guo H., Jona G., Breitkreutz A., Sopko R., McCartney R.R., Schmidt M.C., Rachidi N., Lee S.-J., Mah A.S., Meng L., Stark M.J.R., Stern D.F., de Virgilio C., Tyers M., Andrews B., Gerstein M., Schweitzer B., Predki P.F., Snyder M. Global Analysis of Protein Phosphorylation in Yeast // Nature. 2005. V. 438. P. 679-684.
65. Shin R., Alvarez S., Burch A.Y., Jez J.M., Schachtman D.P. Phosphoproteomic Identification of the Targets of the Arabidopsis Sucrose Nonfermenting-Like Kinase SnRK2.8 Reveals a Connection to Metabolic Processes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 6460-6465.
66. Knetsch M.L.W., Wang M., Snaar-Jagalska B.E., Heimovaara-Dijkstra S. Abscisic Acid Induces Mitogen-Activated Protein Kinase Activation in Barley Aleurone Protoplasts // Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1061-1067.
67. Champion A., Picaud A., Henry Y. Reassessing the MAP3K and MAP4K Relationships // Trends Plant Sci. 2004. V. 9. P. 123-129.
68. Jonak C., Okresz L., Bogre L., Hirt H. Complexity, Cross Talk and Integration of Plant MAP Kinase Signaling // Curr. Opin. Plant Biol. 2002. V. 5. P. 415-424.
69. Burnett E., Desikan R., Moser R., Neill S. ABA Activation of an MBP Kinase in Pisum sativum Epidermal Peels Correlates with Stomatal Responses to ABA // J. Exp. Bot. 2000. V. 51. P. 197-205.
70. Bergmann D.C., Lukowitz W., Somerville C.R. Stomatal Development and Pattern Controlled by a MAPKK Kinase // Science. 2004. V. 304. P. 1494-1497.
71. Lu C., Han M.-H., Guevara-Garcia A., Fedoroff N.V. Mitogen-Activated Protein Kinase Signaling in Postgermination Arrest of Development by Abscisic Acid // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 15 812-15 817.
72. Desikan R., Cheung M.K., Bright J., Henson D., Hancock J.T., Neill S.J. ABA, Hydrogen Peroxide and Nitric Oxide Signaling in Stomatal Guard Cells // J. Exp. Bot. 2004. V. 55. P. 205-212.
73. Zhang A., Jiang M., Zhang J., Tan M., Hu X. Mitogen-Activated Protein Kinase Is Involved in Abscisic Acid-Induced Antioxidant Defense and Acts Downstream of Reactive Oxygen Species Production in Leaves of Maize Plants // Plant Physiol. 2006. V. 141. P. 475-487.
74. Petersen M., Brodersen P., Naested H., Andreasson E., Lindhart U., Johansen B., Nielsen H.B., Lacy M., Austin M.J., Parker J.E., Sharma S.B., Klessig D.F., Martienssen R., Mattsson O., Jensen A.B., Mundy J. Arabidopsis MAP Kinase 4 Negatively Regulates Systemic Acquired Resistance // Cell. 2000. V. 103. P. 1111-1120.
75. Asai T., Tena G., Plotnikova J., Willmann M.R., Chiu W.-L., Gomes-Gomes L., Boller T., Ausubel F.M., Sheen J. MAP Kinase Signaling Cascade in Arabidopsis Innate Immunity // Nature. 2002. V. 415. P. 977-983.
76. Ahlfors R., Macioszek V., Rudd J., Brosché M., Schlichting R., Scheel D., Kangasjärvi J. Stress Hormone-Independent Activation and Nuclear Translocation of Mitogen-Activated Protein Kinases in Arabidopsis thaliana during Ozone Exposure // Plant J. 2004. V. 40. P. 512-522.
77. Gudesblat G.E., Iusem N.D., Morris P.C. Guard Cell-Specific Inhibition of Arabidopsis MPK3 Expression Causes Abnormal Stomatal Responses to Abscisic Acid and Hydrogen Peroxide // New Phytol. 2007. V. 173. P. 713-721.
78. Plesch G., Ehrhardt T., Mueller-Roeber B. Involvement of TAAAG Elements Suggests a Role for Dof Transcription Factors in Guard Cell-Specific Gene Expression // Plant J. 2001. V. 28. P. 455-464.
79. Luan S. Protein Phosphatases in Plants // Annu. Rev. Plant Biol. 2003. V. 54. P. 63-92.
80. Strack S., Ruediger R., Walter G., Dagda R.K., Barwacz C.A., Cribbs J.T. Protein Phosphatase 2A Holoenzyme Assembly: Identification of Contacts between B-Family Regulatory and Scaffolding A Subunits // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 20 750-20 755.
81. Strack S., Cribbs J.T., Gomez L. Critical Role for Protein Phosphatase 2A Heterotrimers in Mammalian Cell Survival // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 47 732-47 739.
82. Thelin W.R., Kesimer M., Tarran R., Kreda S.M., Grubb B.R., Sheehan J.K., Stutts M.J., Milgram S.L. CFTR Is Regulated by a Direct Interaction with Protein Phosphatase PP2A // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 41 512-41 520.
83. Deruere J., Jackson K., Garbers C., Soll D., Delong A. The RCN1-Encoded A Subunit of Protein Phosphatase 2A Increases Phosphatase Activity In Vivo // Plant J. 1999. V. 20. P. 389-399.
84. Rashotte A.M., Delong A., Muday G.K. Genetic and Chemical Reduction in Protein Phosphatase Activity Alter Auxin Transport, Gravity Response and Lateral Root Growth // Plant Cell. 2001. V. 13. P. 1683-1697.
85. Kwak J.M., Moon J.-H., Murata Y., Kichitsu K., Leonhardt N., Delong A., Schroeder J.I. Disruption of a Guard Cell-Expressed Protein Phosphatase 2A Regulatory Subunit, RCN1, Confers Abscisic Acid Insensitivity in Arabidopsis // Plant Cell. 2002. V. 14. P. 2849-2861.
86. Larsen P.B., Cancel J.D. Enchanced Ethylene Responsiveness in the Arabidopsis eer1 Mutant Results from a Loss-of-Function Mutation in the Protein Phosphatase 2A Regulatory Subunit, RCN1 // Plant J. 2003. V. 34. P. 709-718.
87. Pernas M., Garcia-Casado G., Rojo E., Solano R., Sanchez-Serrano J.J. A Protein Phosphatase 2A Catalitic Subunit Is a Negative Regulator of Abscisic Acid Signalling // Plant J. 2007. V. 51. P. 763-778.
88. Huijser C., Kortstee A., Pedo J., Weisbeek P., Wisman E., Smeckens S. The Arabidopsis SUCROSE UNCOUPLED-G Gene Is Identical to ABSCISIC ACID INSENSITIVE-4: Involvement of Abscisic Acid in Sugar Responses // Plant J. 2000. V. 23. P. 577-585.
89. Zhu J.-K. Salt and Drought Stress Signal Transduction in Plants // Annu. Rev. Plant Biol. 2002. V. 53. P. 247-273.
90. Xiong L., Gong Z., Rock C.D., Subramanian S., Guo Y., Xu W., Galbraith D., Zhu J.-K. Modulation of Abscisic Acid Signal Transduction and Biosynthesis by an Sm-Like Protein in Arabidopsis // Dev. Cell. 2001. V. 1. P. 771-781.
91. Wang Y., Ying J., Kuzma M., Chalifoux M., Sample A., McArthur C., Uchacz T., Sarvas C., Wan J., Dennis D.T., McCourt P., Huang Y. Molecular Tailoring of Farnesylation for Plant Drought Tolerance and Yield Protection // Plant J. 2005. V. 43. P. 413-424.
92. Luo J., Shen G., Van J., He C., Zhang H. AtCHIP Functions as an E3 Ubiquitin Ligase of Protein Phosphatase 2A Subunits and Alters Plant Response to Abscisic Acid Treatment // Plant J. 2006. V. 46. P. 649-657.
93. Schroeder J.I., Allen G.J., Hugouvieux V., Kwak J.M., Waner D. Guard Cell Signal Transduction // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. V. 52. P. 627-658.
94. Merlot S., Mustilli A.-C., Genty B., North H., Lefebvre V., Sotta B., Vavasseur A., Giraudat J. Use of Infrared Thermal Imaging to Isolate Arabidopsis Mutants Defective in Stomatal Regulation // Plant J. 2002. V. 30. P. 601-609.
95. Merlot S., Leonhardt N., Fenzi F., Valon C., Costa M., Piette L., Vavasseur A., Genty B., Boivin K., Müller A., Giraudat J., Leung J. Constitutive Activation of a Plasma Membrane H+-ATPase Prevents Abscisic Acid-Mediated Stomatal Closure // EMBO J. 2007. V. 26. P. 3216-3226.
96. Kinoshita T., Shimazaki K. Biochemical Evidence for the Requirement of 14-3-3 Protein Binding in Activation of the Guard-Cell Plasma Membrane H+-ATPase by Blue Light // Plant Cell Physiol. 2002. V. 43. P. 1359-1365.
97. Nühse T.S., Sfensballe A., Jensen O.N., Peck S.C. Large-Scale Analyses of In Vivo Phosphorylated Membrane Proteins by Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography and Mass Spectrometry // Mol. Cell Proteom. 2003. V. 2. P. 1234-1243.
98. Fuglsang A.T., Tulinius G., Cui N., Palmgren M.G. Protein Phosphatase 2A Scaffolding Subunit A Interacts with Plasma Membrane H+-ATPase C-Terminus in the Same Region as 14-3-3 Protein // Physiol. Plant. 2006. V. 128. P. 334-340.
99. Abe H., Urao T., Ito T., Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2 (MYB) Function as Transcriptional Activators in Abscisic Acid Signaling // Plant Cell. 2003. V. 15. P. 63-78.
100. Schweighofer A., Hirt H., Meskiene I. Plant PP2C Phosphatases: Emerging Functions in Stress Signaling // Trends Plant Sci. 2004. V. 9. P. 236-243.
101. Saez A., Apostolova N., Gonzalez-Guzman M., Gonzalez-Garcia M.P., Nicolas C., Lorenzo O., Rodriguez P.L. Gain-of-Function and Loss-of-Function Phenotypes of the Protein Phosphatase 2C HAB1 Reveal Its Role as a Negative Regulator of Abscisic Acid Signaling // Plant J. 2004. V. 37. P. 354-369.
102. Yoshida T., Nishimura N., Kitahata N., Kuromori T., Ito T., Asami T., Shinozaki K., Hirayama T. ABA-Hypersensitive Germination3 Encodes a Protein Phosphatase 2C (AtPP2CA) That Strongly Regulates Abscisic Acid Signaling during Germination among Arabidopsis PP2Cs // Plant Physiol. 2006. V. 140. P. 115-126.
103. Nishimura N., Yoshida T., Kitahata N., Asami T., Shinozaki K., Hirayama T. ABA-Hypersensitive Germination1 Encodes a Protein Phosphatase 2C, an Essential Component of Abscisic Acid Signaling in Arabidopsis Seed // Plant J. 2007. V. 50. P. 935-949.
104. Saez A., Robert N., Maktabi M.H., Schroeder J.I., Serrano R., Rodriguez P.L. Enchancement of Abscisic Acid Sensitivity and Reduction of Water Consumption in Arabidopsis by Combined Inactivation of the Protein Phosphatase Type 2C ABI1 and HAB1 // Plant Physiol. 2006. V. 141. P. 1389-1399.
105. Himmelbach A., Hoffmann T., Leube M., Hohener B., Grill E. Homeodomain Protein ATHB6 Is a Target of the Protein Phosphatase ABI1 and Regulates Hormone Responses in Arabidopsis // EMBO J. 2002. V. 21. P. 3029-3038.
106. Miao Y., Lv D., Wang P., Wang X.C., Chen J., Miao C., Song C.P. An Arabidopsis Glutathione Peroxidase Functions as Both a Redox Transducer and a Scavenger in Abscisic Acid and Drought Stress Responses // Plant Cell. 2006. V. 18. P. 2749-2766.
107. Yang Y., Sulpice R., Himmelbach A., Meinhard M., Christmann A., Grill E. Fibrillin Expression Is Regulated by Abscisic Acid Response Regulators and Is Involved in Abscisic Acid-Mediated Photoprotection // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 6061-6066.
108. Mishra G., Zhang W., Deng F., Zhao J., Wang X. A Bifurcating Pathway Directs Abscisic Acid Effects on Stomatal Closure and Opening in Arabidopsis // Science. 2006. V. 312. P. 264-266.
109. Zhang W., Qin C., Zhao J., Wang X. Phospholipase Dα1-Derived Phosphatidic Acid Interacts with ABI1 Phosphatase 2C and Regulates Abscisic Acid Signaling // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 9508-9513.
110. Gupta R., Luan S. Redox Control of Protein Tyrosine Phosphatases and Mitogen-Activated Protein Kinases in Plants // Plant Physiol. 2003. V. 132. P. 1149-1152.
111. Reyes D., Rodriguez D., Nicolas G., Nicolas C. Evidence of a Role for Tyrosine Dephosphorylation in the Control of Postgermination Arrest of Development by Abscisic Acid in Arabidopsis thaliana // Planta. 2006. V. 223. P. 381-385.