УДК 581.1

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННОГО АММОНИЯ НА СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКА, ХЛОРОФИЛЛА И КОЛИЧЕСТВО РИБОСОМ В КЛЕТКАХ Chlamydomonas reinhardtii 

© 2012 г. А. П. Смолов*, Г. А. Семенова**, Н. Ю. Минакова*, А. М. Бутанаев*, 

Г. Н. Ширшикова*

* Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, Московская область 

** Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Московская область

Поступила в редакцию 10.08.2011 г.

Исследовали влияние экзогенного аммония на содержание общего белка, хлорофилла и количество рибосом в клетках зеленой водоросли хламидомонады (Chlamydomonas reinhardtii (Sager)). Отсутствие аммония в составе питательной приводило к двукратному снижению числа рибосом в цитоплазме. Содержание хлорофилла в клетках, выращенных на безаммонийной, нитрат-содержащей среде, незначительно увеличивалось. Увеличение числа рибосом в присутствии экзогенного аммония не сопровождалось повышением содержания общего белка в клетках и не зависело от содержания мРНК белка малой субъединицы рибосомы rps6 и содержания 18S рPHK. Обсуждаются возможные причины эффекта экзогенного аммония при формировании рибосомальных структур клетки.

 

Ключевые слова: Chlamydomonas reinhardtii - аммоний - белок - хлорофилл - рибосомы - рибосомальные гены

 

---------------------------------------

Адрес для корреспонденции: Смолов Александр Петрович. 142290 Московская обл., Пущино, Институтская ул., 2. Институт фундаментальных проблем биологии РАН. Электронная почта: smap49@mail.ru

Введение

Давно установлено, что именно аммоний является одной из составляющих процесса синтеза первых азотсодержащих органических соединений – аминокислот [1], тогда как утилизация нитрата в органические соединения возможна лишь только после восстановления его в аммонийную форму [2]. Следовательно, можно полагать, что главная роль аммония в жизнедеятельности растительной клетки сводится к его субстратной функции в реакциях аминирования кетокислот (т.е. синтеза аминокислот).

Ранее, исследуя влияние экзогенного аммония на миксотрофные каллусные клетки сои, мы обнаружили, что присутствие аммония в питательной среде даже в небольших концентрациях – меньше 0.1 мМ - вызывало многократное (в 5-10 раз) увеличение числа рибосом [3], способствовало увеличению количества мембранных образований в хлоропластах и митохондриях [4]. Это указывало на существование иной, “несубстратной“, функции аммония, которая связана с формированием и функционированием белок-синтезирующего аппарата клетки – рибосом. Однако культура клеток in vitro – искусственно созданная модельная система, метаболические процессы в которой не всегда полностью идентичны процессам, происходящим в растениях in vivo. Оставалось неясным, свойственна ли “несубстратная“ функция аммония другим растительным объектам.

Поскольку поглощенный корнями высших растений аммоний может транспортироваться в надземные органы как в ионной форме, так и в виде аминов органических соединений, образованных в клетках корня [1, 2], то сложно оценить его влияние на формирование и функционирование рибосом в надземной части растения.

Более подходящим объектом, с помощью которого можно подтвердить или опровергнуть гипотезу о “несубстратной” функции аммония, могла бы стать суспензия клеток зеленой одноклеточной водоросли Chlamydomonas reinhardtii. Кроме того, поскольку геном водоросли достаточно хорошо изучен, существует возможность оценить воздействие аммония на экспрессию генов, ответственных за синтез компонентов рибосомального комплекса.

Биогенез рибосомальных структур - многоступенчатый процесс [5]. Происходит он поэтапно в различных компартментах клетки: в ядрышке, нуклеоплазме ядра и цитоплазме клетки. На каждом этапе биогенеза рибосом, начиная с экспрессии соответствующих генов и до момента образования функционально способной органеллы, участвует множество различных составляющих, список которых периодически пополняется [6]. Возможно, обнаруженная нами способность экзогенного аммония вызывать многократное увеличение числа рибосом в клетке тоже вносит свой вклад в биогенез рибосомальных структур?

Таким образом, целью настоящей работы было исследование влияния экзогенного аммония на содержание белка, хлорофилла, количество рибосомальных структур в клетках C. reinhardtii, а также содержание мРНК, соответствующей гену, кодирующему белок малой субъединицы rps6, и содержание 18S рРНК как составных частей ряда компонентов рибосомального комплекса.

 

материалы и МЕТОДЫ

Культивирование клеток и определение их биохимических параметров. Объектом исследования служила одноклеточная зеленая водоросль Chlamydomonas reinhardtii (Sager). Штамм gr21 получили из Chlamydomonas Center и выращивали на средах ТАР [7] с различным составом компонентов минерального азота: вариант 1 – с NH4Cl, вариант 2 – с NH4NO3 и вариант 3 – с KNO3. Суммарное содержание азота в каждом варианте среды выравнивали, и оно не превышало 7 мМ. Для чистоты эксперимента безаммонийная питательная среда (вариант 3 - с KNO3) не должна была содержать следовых количеств аммония, поэтому аммоний-содержащий компонент микроэлементов Mo7O24(NH4)6 ´ 4H2O заменяли на Na2MoO4 ´ 2H2O во всех трех вариантах питательных сред. Другие компоненты соответствовали прописи стандартной среды ТАР [7].

Клеточную суспензию C. reinhardtii выращивали в 300-миллилитровых конических колбах со 100 мл питательной среды при температуре 25°С и слабой освещенности (около 1-2 клк) в течение 10-12 дней на безаммонийной среде (вариант 3). Затем равные количества инокулята клеток (100 мкл) из безаммонийной среды помещали на среды с разным составом минерального азота (варианты 1-3) и вновь культивировали в тех же условиях в течение 10-12 дней. Только после такой процедуры клетки использовали для анализа.

Подсчет числа рибосом осуществляли на электронно-микроскопических фотоснимках срезов клеток C. reinhardtii, фиксированных описанным ранее способом [8].

Для определения содержание белка и хлорофилла исходную 10-12-дневную суспензию (50 мл) центрифугировали (центрифуга ЦУМ-1) при 4000 об./мин (около 1000 g) в течение 10 мин до полного осаждения клеток. Затем полученный осадок ресуспендировали в 10 мл охлажденного ацетона и вновь центрифугировали при тех же условиях до полного осаждения клеточных фрагментов, образовавшихся после воздействия ацетона. Полученный cупернатант использовали для определения содержания хлорофилла [9], а осадок – для определения содержания белка [10].

Количественная ПЦР в реальном времени. Образцы для анализов представляли собой массу целых неразрушенных клеток хламидомонады, полученную после центрифугирования 1 мл суспензии 10-12-дневного возраста.

Выделение суммарной РНК проводили с использованием реагента TRIzol (“Invitrogen”, США), согласно инструкции производителя. Для синтеза первой цепи кДНК использовали набор First Strand cDNA Synthesis KitEnhanced (“Fermentas”) так, как рекомендовано производителем. Амплификацию кДНК, а также анализ продуктов амплификации в режиме реального времени проводили на приборе iCycler IQ5 (“Bio-Rad”, США) с использованием готовой реакционной смеси с интеркалирующим красителем SYBR Green I (SYBR Green JumpStart ReadyMix for Quantitative PCR, “Sigma”, США). В качестве внутреннего контроля использовали ген актина (ACTB) хламидомонады. Праймеры к нуклеотидным последовательностям исследуемых генов были подобраны с использованием программы Oligo.

Условия ПЦР в реальном времени: 95°C – 3 мин (1 цикл); 95°C – 30 с, 60°C – 30 с, 72°C – 30 с (50 циклов). В конце каждой реакции проводили анализ кривых плавления для контроля чистоты продукта и специфичности амплификации. Обработка результатов выполнялась так, как описано в инструкции к прибору iCycler IQ5. Статистический анализ данных осуществляли в программе Microsoft Exel 2003.

Во всех экспериментах использовали по два технических и не менее десяти биологических повторов.

Последовательности праймеров: RPS 6 (5’-TCCGCAAGATGTTCAACCTGG-3’, 5’-TCTCCTGCTGGCGCTTCTTC-3’); 18S rRNA (5’-GCGACCAACGAGCCTATCCTT-3’, 5’-CTTCACCAGCACACCCAATCG-3’); actin (5’-GATGTGGACATCCGCAAGGAC-3’, 5’-GACTTGGCGATCCACATTTGC-3’).

Базы данных. Вся информация о генах хламидомонады была получена из баз данных Chlamydomonas Center (http://www.chlamy.org) и National Center for Biotechnological Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

 

Действительно, присутствие NH4+- ионов в питательной среде (варианты 1 и 2) вызывало двухкратное повышение содержания рибосомальных структур в клетках C. reinhardtii, по сравнению с клетками C. reinhardtii, выращенными на среде лишенной этого компонента (вариант 3) (рисунок и таблица). Ядро и чашеобразный хлоропласт C. reinhardtii занимали бульшую часть объема клетки, так что цитоплазма располагалась узкой полосой между клеточной оболочкой и хлоропластом. Подсчет числа рибосом проводили в центральной части клетки, внутри чаши хлоропласта. Аналогичный результат был получен и на каллусных клетках сои [3]. Следовательно, есть основание ожидать, что этот эффект может проявляться и в клетках других видов растений. 

В клетках культуры варианта 1 рибосомы, хотя и распределялись неравномерно, но их плотность была высокой и составляла 1200 шт./мкм2. Рибосомы в клетках варианта 2 были плотно упакованы во всем пространстве цитоплазмы и имели плотность 1300 шт./мкм2. В клетках, выращенных на среде, не содержавшей аммония (вариант 3), цитоплазма имела низкую электронную плотность, а плотность находившихся там рибосом составляла 720 шт./мкм2 (таблица). Заметим, что бульшая часть рибосом у таких клеток группировалась в углах складок хлоропласта (на рисунке отмечено белым овалом).

Анализ содержания общего белка не обнаружил достоверных различий между вариантами клеток, выращенными в присутствии и в отсутствие аммония в питательной среде (таблица). В то же время, содержание хлорофилла в клетках, выращенных на среде без аммония, несколько повышалось по сравнению с клетками варианта 1, но не варианта 2, где присутствовали обе формы минерального азота (таблица). Такой результат указывает прежде всего на то, что в клетках C. reinhardtii, выращенных на безаммонийной среде, скорость восстановления нитрата в аммоний достаточно высока, а клетки по этой причине не испытывают дефицита аммонийного компонента в реакциях синтеза аминокислот и, далее, белков. Действительно, существование альтернативного пути восстановления нитрата в аммоний в фотосинтезирующих клетках [11] лишь подтверждает эту точку зрения. Кроме того, не исключено, что более высокое содержание хлорофилла у клеток варианта 3 (таблица) как раз и свидетельствует об адаптивном изменении пигментного состава в фотосинтезирующем аппарате, что могло быть вызвано необходимостью получения дополнительной энергии для фотовосстановления нитрата в аммоний.

Биогенез рибосом является крайне энергозатратным процессом и требует значительных клеточных ресурсов. Кроме того, поскольку рибосомальные белки должны присутствовать в клетке в эквимолярных количествах, их биосинтез должен находиться под строгим контролем. Уменьшение количества рибосом в клетках водоросли в отсутствие аммония является конечным результатом действия регуляторных механизмов, которые, в принципе, могут присутствовать на разных уровнях биогенеза эукариотической рибосомы. Поскольку известно, что основной регуляторный механизм экспрессии генов – регуляция транскрипции, то в настоящей работе мы исследовали уровень транскрипции гена одного из белков малой субъединицы рибосомы (rps6) в клетках водоросли, культивируемых на средах, содержавших разные формы минерального азота.

Для определения уровня экспрессии rps6 использовали ПЦР в реальном времени. Как показано в таблице, экспрессия гена не зависела от формы минерального азота в среде культивирования. Содержание мРНК rps6 на среде с аммонием (вариант 1), нитратом (вариант 3) и на среде со смешанными формами азота (вариант 2) статистически достоверно не различалось.

В этом же эксперименте определяли содержание в клетке другого компонента рибосом хламидомонады - 18S pРНК. Известно, что у эукариот последовательности 28S, 5.8S и 18S рРНК составляют единую транскрипционную единицу. В результате созревания единой пред-рРНК образуются соответствующие рибосомальные РНК, которые затем вовлекаются в биогенез рибосомы. Как и в случае с rps6, мы не нашли различий в содержании 18S рРНК в клетках, выращенных в средах с разными формами минерального азота (таблица).

Наличие (или отсутствие) аммония в составе питательной среды не влияло и на содержание мРНК, соответствующей белку малой субъединицы rps6, и на содержание 18S рРНК (таблица), что, по-видимому, справедливо и для других компонентов рибосомы. Известно, что в одних и тех же условиях содержание мРНК разных рибосомальных белков в клетках дрожжей может несколько варьировать, что, вероятно, связано с функциями, отличными от биогенеза рибосомы. Тем не менее, скорости трансляции этих белков близки по значению [12]. Авторы этой работы полагают, что эквимолярность рибосомальных белков достигается посредством разной скорости их деградации. По-видимому, хотя это и нельзя полностью исключать, возможность регуляции биосинтеза компонентов рибосом на уровне трансляции представляется маловероятной. 

Таким образом, на наш взгляд, эффект аммония на число рибосомальных структур в клетках водоросли может быть вызван неким фактором, участвующим в формировании (или стабилизации?) структуры рибосомы. Например: (а) изменяющимся при поглощении аммония рН в цитоплазме, (б) непосредственно NH4+-ионами или (в) некими аминированными соединениями, образованными при участии аммония.

Рассмотрим каждый из этих факторов. 

1. Известно, что поглощение экзогенного аммония растительной клеткой сопровождается выделением из нее Н+-ионов, тогда как поглощение NO3--ионов связывают с выходом из клетки ОН--ионов [13], т.е. наблюдается изменение цитоплазматического рН в щелочную или кислую сторону соответственно. Выход Н+-ионов из клетки при поглощении аммония должен приводить к повышению активности ФЭП-карбоксилазы, рН оптимум которой сдвинут в щелочную сторону [14]. Повышение активности этого фермента должно приводить к усилению гетеротрофной фиксации углекислоты [15] и увеличению образования органических кислот (например, малата), последующее превращение которых может, при наличии аммония, быть еще одним источником целого ряда аминокислот. Дополнительно образованные аминокислоты способны обеспечить и дополнительное образование белка. Такое явление наблюдалось в клетках Acer pseudoplatanus [16] и Paul’s Scarlet Rose [17]. Кроме того, показано, что в клетках листьев кукурузы эндогенный аммоний вызывал повышение содержания уровня не только белка, но и мРНК для ФЭП-карбоксилазы [18]. Однако при высокой скорости образования эндогенного аммония и его быстрой утилизации в аминокислоты эффект сдвига рН в щелочную сторону в цитоплазме клеток водоросли C. reinhardtii вряд ли может объяснить различия в количественном содержании рибосом (как белок-содержащих структур). Повышенный уровень образования белка еще не означает способность клетки формировать рибосомы. К тому же, в наших экспериментах с C. reinhardtii, содержание белка не зависело от формы использованного клеткой минерального азота (таблица).

2. Нельзя исключить и участие непосредственно NH4+-ионов в формировании (или стабилизации?) структуры рибосомы, поскольку, например, равнозарядные К+-ионы необходимы для связывания компонентов рибосомы [19]. И, может быть, совсем не случайно у клеток, выращенных на безаммонийной среде (вариант 3, рисунок), в местах образования складок у оболочки хлоропласта, где может быть повышена концентрация фотосинтетически образованного аммония, наблюдается большее скопление рибосомальных структур (?).

3. Еще одной причиной увеличения числа рибосом под действием экзогенного аммония может быть образование (при повышенных концентрациях аммония в клетках) большего количества аминированного компонента, необходимого для формирования (или стабилизации?) структуры рибосомы. Такими компонентами могли бы быть полиамины (путресцин, кадаверин, спермидин или др.). Их наличие в рибосомах клеток Escherichia coli было показано достаточно давно [19], но в растительных клетках такая возможность пока не рассматривалась. Какова природа воздействия этих соединений на формирование (или стабилизацию?) рибосомальной структуры в настоящее время неизвестно, как неизвестно и их участие в организации самой структуры.

Итак, проведенные на клетках C. reinhardtii исследования воздействия различных форм минерального азота на ряд показателей (содержание белка, хлорофилла, число рибосом в клетках и экспрессию некоторых рибосомальных генов) показало, что аммонийная форма азота способна воздействовать на формирование рибосомального комплекса. Однако такое воздействие, по-видимому, не связано с регуляцией активности генов, ответственных за синтез компонентов рибосом. На наш взгляд, более предпочтительна следующая версия: процесс биогенеза рибосом контролируется аммонийным фактором на более высоком регуляторном уровне, т.е. на уровне сборки и стабилизации всего рибосомального макромолекулярного комплекса.

Список ЛИТЕРАТУРы

Кретович В.Л. Усвоение и метаболизм азота у растений. Москва: Наука, 1987. 486 с.

Измайлов С.Ф. Азотный обмен в растениях. Москва: Наука, 1986. 320 с.

Смолов А.П., Семенова Г.А. Влияние концентрации аммония на содержание белка, хлорофилла и количество рибосом в клетках миксотрофного каллуса сои // Физиология растений. 2008. Т. 55. C. 397-403.

Cмолов А.П., Ладыгин В.Г., Семенова Г.А. Влияние экзогенного аммония на фотосинтетическое выделение О2 и ультраструктурную организацию клеток каллуса сои // Физиология растений. 2004. Т. 51. C. 658-665.

Leary D.J., Huang S. Regulation of Ribosome Biogenesis within the Nucleolus // FEBS Lett. 2001. V. 509. P. 145-150.

Fromont-Racine M., Senger B., Saveanu C., Fasiolo F. Ribosome Assembly in Eukaryotes // Gene. 2003. V. 313. P. 17-42.

Harris E.H. The Chlamydomonas Sourcebook: A Comprehensive Guide to Biology and Laboratory Use. San Diego: Academic, 1989. 780 p.

Ладыгин В.Г., Семенова Г.А. Влияние дефицита железа на состав хлорофилл-белковых комплексов и ультраструктуру хлоропластов гороха // Физиология растений. 1993. Т. 40. С. 841-849.

Arnon D.J. Copper Enzymes in Isolated Chloroplasts. Polyphenol Oxidase in Beta vugaris // Plant Physiol. 1949. V. 24. P. 1-15.

Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding // Ann. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

Escobar M.A., Geisler D.A., Rasmusson A.G. Reorganization of the Alternative Pathway of the Arabidopsis Respiratory Chain by Nitrogen Supply: Opposing Effects of Ammonium and Nitrate // Plant J. 2006. V. 45. P. 775-788.

Holstege F.C., Jenning E.G., Wyrick J.J., Lee T.I., Hengartner C.J., Green M.R., Golub T.R., Lander E.S., Young R.A. Dissecting the Regulatory Circuitry of a Eukaryotic Genome // Cell. 1998. V. 95. P. 717–728.

Marshner H. Mineral Nutrition of Higher Plants. London, Orlando, San Diego, New York, Austin, Boston, Sydney, Tokyo, Toronto: Academic, 1986. 674 p.

Романова А.К. Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганизмов. Москва: Наука, 1980. 159 с.

Wright K.M., Givan C.V. Regulation of Nonautotrophic Carbon Dioxide Assimilation by Ammonia in Cultured Cell of Acer pseudoplatanus L. // Plant Sci. 1988. V. 58. P. 151-158.

Goodchild J.A., Givan C.V. Influence of Ammonium and Extracellular pH on the Amino and Organic Acid Contents of Suspension Culture Cells of Acer pseudoplatanus // Physiol. Plant. 1990. V. 78. P. 29-37.

Mohanty B., Fletcher J.S. Ammonium Influence on Nitrogen Assimilating Enzymes and Protein Accumulation in Suspension Cultures of Paul’s Scarlet Rose // Physiol. Plant. 1980. V. 48. P. 453-459.

Sugiharto B., Sugiyama T. Effects of Nitrate and Ammonium on Gene Expression of Phosphoenolpyruvate Carboxylase and Nitrogen Metabolism in Maize Leaf Tissue during Recovery from Nitrogen Stress // Plant Physiol. 1992. V. 98. P. 1403-1408.

Спирин А.С., Гаврилова Л.П. Рибосома. Москва: Наука, 1971. 254 с.

 

ПОДПИСЬ К РИСУНКУ

 

Фрагменты клеток C. reinhardtii, выращенных на средах ТАР с различными формами минерального азота.

а - NH4Cl, б - NH4NO3, в - KNO3.