УДК 581.1

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ПОВЫШЕНИЯ СОЛЕУСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ РАПСА БРАССИНОСТЕРОИДАМИ

© 2014 г. М. В. Ефимова*, **, А. Л. Савчук***, Дж. А. К. Хасан**, ****, 

Р. П. Литвиновская***, В. А. Хрипач***, В. П. Холодова**, Вл. В. Кузнецов**, *****

*Национальный исследовательский Томский государственный университет, Томск

**Федеральное государственное бюджетное учреждение науки 

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва

***Институт биоорганической химии НАНБ, Минск, Беларусь

****Российский университет Дружбы народов, Москва 

*****Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва

Поступила в редакцию 09.05.2014 г.

Исследовали способность брассиностероидов (на примере 24-эпибрассинолида, ЭБЛ) повышать устойчивость растений рапса (Brassica napus L.) к солевому стрессу (175 мМ NaCl) и возможные механизмы их защитного действия. Проростки рапса выращивали 3 недели на среде ХогландаСнайдера в стационарных условиях. К растениям опытных вариантов добавляли в среду (1) 175 мМ NaCl, или (2) 1010 М ЭБЛ, или (3) 175 мМ NaCl и 1010 М ЭБЛ. Продолжительность воздействия 7 и 14 дней. Засоление подавляло рост растений в высоту на 33–35% по сравнению с контролем, сокращало в 2.0–2.5 раза листовую поверхность, уменьшало сырую и сухую массу растений (в 2.5 и 2.0 раза по сравнению с контролем соответственно), снижало оводненность тканей, а также содержание хлорофиллов а и b на 26–31% и в 2.0 раза соответственно. На действие NaCl растения реагировали развитием окислительного стресса, падением осмотического потенциала клеточного содержимого (до –2 МПа), аккумуляцией пролина (в 43–52 раза) и низкомолекулярных фенольных соединений (в 1.9–2.7 раза). Установлено, что на засоление растения рапса отвечали увеличением эндогенного содержания стероидных гормонов: 24-эпибрассиностероидов (24-эпибрассинолида и 24-эпикастастерона), 24S-метилбрассиностероидов (брассинолида и кастастерона) и 28-гомобрассиностероидов (28-гомобрассинолида и 28-гомокастастерона), что косвенно подтверждает вовлечение брассиностероидов в процесс развития солеустойчивости. Добавление ЭБЛ в питательную среду в оптимальных условиях не оказывало достоверного воздействия на изученные показатели. При солевом стрессе ЭБЛ проявлял выраженный защитный эффект: полностью восстанавливался рост стебля, увеличивалась ассимилирующая поверхность растений до 67–76% от площади листьев контрольного варианта, в значительной степени восстанавливалась сырая и сухая масса (до 85–92% от контрольных значений), снималось ингибирующее действие NaCl на фотосинтетические пигменты. Экзогенный ЭБЛ тормозил развитие NaCl-зависимого перекисного окисления липидов и повышал осмотический потенциал клеточного содержимого листьев. Высказано предположение, что протекторный эффект ЭБЛ в условиях солевого стресса связан с его антиоксидантным действием, которое не обусловлено гормон-индуцируемой аккумуляцией пролина и низкомолекулярных фенольных соединений, а также со способностью регулировать водный статус за счет поддержания внутриклеточного ионного гомеостаза.

----------------------

Сокращение: ЭБЛ – 24-эпибрассинолид.

Адрес для корреспонденции: Ефимова Марина Васильевна. 634050 Томск, просп. Ленина, 36. Национальный исследовательский Томский государственный университет. Электронная почта: stevmv555@gmail.com

Ключевые слова: Brassica napus – 24-эпибрассинолид – засоление – эндогенные брассиностероиды – фотосинтетические пигменты – ионы калия и натрия – пролин  осмотический потенциал – низкомолекулярные фенольные соединения – малоновый диальдегид

 

ВВЕДЕНИЕ

Растения в отличие от животных лишены поведенческого уровня адаптации, поскольку они ведут неподвижный образ жизни. При подобной жизненной стратегии сохранение вида возможно лишь путем формирования в процессе эволюции эффективных механизмов адаптации, позволяющих растению выживать в неблагоприятных условиях, включая и условия засоления. Избыточное засоление, которому подвержены 25% почв земного шара, так же как и целый ряд других абиотических факторов, вызывает у растений водный дефицит и ионный дисбаланс. Последствия почвенного засоления проявляются в снижении продуктивности агро- и биоценозов, в нарушении генетического биоразнообразия и в серьезных экономических потерях [1]. Негативное воздействие засоления на растения обусловлено (1) падением водного потенциала почвенного раствора, что затрудняет водопоглотительную деятельность корня; (2) изменением структуры почвы, снижающим ее водо- и воздухопроницаемость и (3) увеличением внутриклеточной концентрации неорганических ионов, оказывающих токсический эффект на метаболизм растений [2].

Ключевую роль в регуляции клеточного гомеостаза в экстремальных условиях играют вещества гормональной природы. Одним из способов защиты растений от избыточного засоления может быть применение экзогенных фитогормонов, среди которых наибольший интерес представляют брассиностероиды, регулирующие деление и растяжение клеток, метаболизм, рост и развитие растений. Известно, что брассиностероиды изменяют активность многих ферментов, стимулируют синтез белков и нуклеиновых кислот, регулируют метаболизм аминокислот и жирных кислот, влияют на гормональный статус организма [3–6] и в итоге повышают продуктивность растений [7]. Среди преимуществ брассиностероидов можно отметить их экологическую безопасность и способность вызывать биологические эффекты в очень низких концентрациях по сравнению с другими группами растительных гормонов. Весьма существенно, что брассиностероиды повышают устойчивость ряда растений к неблагоприятным температурам, высокому содержанию в почве тяжелых металлов, избыточному засолению и др. [8]. Вместе с тем, механизмы стресс-протекторного, в том числе и солезащитного, действия стероидных фитогормонов в настоящее время изучены слабо.

В частности, остается открытым вопрос о том, способны ли брассиностероиды повышать солеустойчивость растений рапса – важной технической и пищевой культуры, активно используемой в качестве экспериментальной модели для изучения механизмов стресс-толерантности к факторам природного и техногенного происхождения. Предстоит также выяснить другой крайне важный вопрос, сопровождается ли адаптация растений к засолению изменением эндогенного уровня различных типов брассиностероидов (24-эпибрассиностероидов, 24S-метилбрассиностероидов и 28-гомобрассиностероидов). Положительный ответ на данный вопрос мог бы служить весомым аргументом в пользу вовлечения стероидных фитогормонов в повышение солеустойчивости рапса. И наконец, до сих пор остается не исследованной проблема регуляции брассиностероидами водного статуса растений в условиях избыточного засоления, поскольку одним из основных негативных проявлений солевого стресса является развитие водного дефицита. 

В настоящей статье предпринята попытка ответить на поставленные выше вопросы.

 

Материалы и методы

Исследования проводили на растениях Brassica napus L. сорта Вестар канадской селекции. Семена проращивали в перлите на дистиллированной воде в течение 7 суток, после чего проростки переносили на жидкую питательную среду ХогландаСнайдера для последующего культивирования (белый свет, плотность потока падающих квантов – 170 мкмоль/(м2 с); 16-часовой фотопериод; температура воздуха 22 ± 2°С) в течение 3 недель. Далее к растениям опытных вариантов в среду добавляли (1) 175 мМ NaCl, или (2) 1010 М 24-эпибрассинолида (ЭБЛ), или (3) 175 мМ NaCl и 1010 М эпибрассинолида. Используемые в данной работе концентрации NaCl и ЭБЛ были подобраны в предварительных опытах. Контрольные растения росли на стандартной среде ХогландаСнайдера в течение всего эксперимента. Питательную среду меняли каждую неделю. 

Фиксацию растительного материала проводили через одну и две недели после добавления в среду NaCl и(или) ЭБЛ и использовали его для проведения анализов. Оценку морфометрических показателей проводили не менее трех раз на 10 растениях в каждом варианте.

Для анализа пролина и оценки интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) листья 3–5 ярусов фиксировали жидким азотом; для измерения содержания фотосинтетических пигментов – 96% этанолом. Для оценки величины осмотического потенциала клеточного содержимого листья растений замораживали при 20ºС; для определения уровня эндогенных брассиностероидов листья фиксировали при 70ºС и лиофильно высушивали.

Экстракцию и определение свободного пролина проводили по методу Bates с соавт. [9]. 

Свежую и сухую биомассу растительного материала оценивали гравиметрическим методом. Сухую массу определяли после фиксации материала при 90ºС и его высушивания при 70ºС до постоянного веса. Содержание воды (% от сырой массы) рассчитывали, исходя из отношения разности сырой и сухой биомассы, отнесенной к сырой массе.

Для оценки содержания фотосинтетических пигментов листья растирали в 96% этаноле, и полученный гомогенат центрифугировали 10 мин при 8 тыс. об./мин (центрифуга MiniSpin, “Eppendorf”, Германия). Оптическую плотность раствора супернатанта измеряли на спектрофотометре (Genesys 10, “ThermoElectron”, США). Концентрацию пигментов в спиртовом экстракте рассчитывали согласно [10].

Осмотический потенциал клеточного экссудата определяли на криоскопическом осмометре Osmomat 030 (“Gonotec”, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Клеточный сок отжимали из размороженных образцов листьев растений.

Интенсивность ПОЛ оценивали спектрофотометрическим методом, основанным на образовании окрашенного комплекса  продукта малонового диальдегида (МДА) в реакции с тиобарбитуровой кислотой при нагревании [11].

Определение низкомолекулярных фенольных соединений проводили по методу ФолинаДениса [12], содержание флавоноидов  по методу Gage [13].

Экстракцию и определение уровня эндогенных брассиностероидов проводили следующим образом. Лиофилизированные образцы листьев рапса измельчали, после чего из них экстрагировали спирторастворимые соединения метанолом (15 мл) в течение 24 ч при комнатной температуре. Остаток отфильтровывали на стеклянном фильтре и дважды промывали метанолом (2 × 10 мл). Метанольный экстракт упаривали досуха, остаток порционно распределяли между циклогексаном (7 мл) и 80% водным метанолом (3 × 4 мл). Объединенную водно-метанольную фракцию упаривали досуха, остаток растворяли в 1 мл метанола и наносили на препаративную пластинку (20 × 20 см) с силикагелем. В качестве элюента использовали смесь хлороформ : метанол (88 : 12). Собирали зону с Rf = 0.4–0.6, переносили ее на фильтр, элюировали метанолом, после чего растворитель упаривали. Полученный остаток растворяли в 2 мл буферного раствора (0.05 M Трис, pH 7.4, содержавший 0.9% NaCl, 0.1% БСА, 0.02% ТвинTM 20). Буферный экстракт центрифугировали (12 000 об./мин, 10 мин), супернатант разводили в 24 раза и использовали для анализа.

Для определения содержания брассиностероидов использовали иммуноферментные тест-системы для 24-эпибрассиностероидов (суммарное содержание 24-эпибрассинолида и 24-эпикастастерона), 24S-метилбрассиностероидов (суммарное содержание брассинолида и кастастерона) и 28-гомобрассиностероидов (суммарное содержание 28-гомобрассинолида и 28-гомокастастерона) [14]. В полистирольные лунки c иммобилизованными антителами вносили по 50 мкл раствора калибровочных проб или анализируемых образцов в дубликатах, после чего добавляли по 100 мкл раствора конъюгата соответствующего брассиностероида с пероксидазой хрена и инкубировали 1 ч при 37°С. Лунки промывали соответствующим раствором (4 × 150 мкл), затем в них добавляли по 100 мкл хромоген-субстратного буфера и инкубировали при 37°С в течение 15 мин. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл раствора стоп-реагента (5% Н2SO4). Оптическую плотность раствора во всех лунках измеряли при 450 нм. Для расчетов использовали метод интерполяции по калибровочному графику. Для калибровочных проб в координатах “logit-log” строили график зависимости показателя B/B0  100% от концентрации брассиностероида в калибровочных пробах (нмоль/л), где B и B0  значения оптической плотности продукта ферментативной реакции в присутствии свободного брассиностероида (при наличии конкуренции нативного и меченого гормона за связывание с антителами) и в его отсутствие (происходит только связывание меченого гормона) соответственно.

Все эксперименты повторяли не менее трех раз. Полученные результаты представлены на рисунках в виде средней арифметической со стандартной ошибкой. Для сравнения независимых выборок, подчиняющихся закону нормального распределения, использовали параметрический критерий Стьюдента. Значения t-критерия находили для 95% уровня значимости (р < 0.05).

 

Результаты

Влияние NaCl и 24-эпибрассинолида на рост растений

 

Интенсивное засоление (175 мМ NaCl) подавляло рост растений рапса в высоту на 33–35% по сравнению с контролем (рис. 1) и вызывало значительное сокращение листовой поверхности (в 2.0–2.5 раза) (рис. 2). Сырая и сухая масса растений по сравнению с контролем уменьшалась примерно в 2.5 и 2.0 раза соответственно (рис. 3). Оводненность тканей при засолении снижалась, о чем судили по уменьшению содержания воды в единице сырой массы (рис. 4). Добавление ЭБЛ (1010 М) в питательную среду в оптимальных условиях выращивания растений не оказывало достоверного воздействия на изученные показатели (рис. 1–4). 

Напротив, в условиях солевого стресса (175 мМ NaCl) ЭБЛ (1010 М) заметно снижал степень ингибирования роста растений. Так, рост стебля полностью восстанавливался (рис. 1), ассимилирующая поверхность растений рапса увеличивалась до 67–76% от площади листьев контрольного варианта (рис. 2), сырая и сухая масса достигала 85–92% от контрольных значений (рис. 3). Тенденция к усилению протекторного эффекта ЭБЛ при засолении отмечена при увеличении продолжительности солевого воздействия (рис. 13).

 

Влияние NaCl и 24-эпибрассинолида на содержание фотосинтетических пигментов

Негативное воздействие NaCl проявлялось не только на ростовых характеристиках, но и на содержании фотосинтетических пигментов. В присутствии в среде 175 мМ NaCl содержание зеленых пигментов  хлорофилла а и b  снижалось на 26–31% и в 2 раза соответственно по отношению к контролю (рис. 5). Экзогенный ЭБЛ снимал ингибирующее действие засоления в отношении хлорофилла а; высокая эффективность защитного действия гормона для хлорофилла b была отмечена после недельного воздействия NaCl – уровень пигмента в данном случае в 2 раза превысил контрольные значения (рис. 5). Содержание каротиноидов в листьях растений рапса в присутствии в питательной среде 175 мМ NaCl, 1010 М ЭБЛ или обоих этих факторов одновременно практически не отличалось от контрольных растений.

 

Влияние NaCl и 24-эпибрассинолида на водный статус и аккумуляцию пролина

Как известно, засоление вызывает водный дефицит у растений. При действии на растения рапса 175 мМ NaCl содержание воды в расчете на единицу сырой массы листа достоверно снизилось уже на 7-й день засоления на 3.27%; на 14-й день воздействия различие с контролем уменьшилось (2.41%) (рис. 4). ЭБЛ достоверно не влиял на содержание воды в листьях рапса. Однако совместное с NaCl внесение ЭБЛ в среду приводило к повышению содержания воды в тканях до значений, несколько превосходящих аналогичные показатели контрольного варианта опыта (на 7-й день превышение составляло 0.33%, на 14-й – 1.08%).

Принципиально важным для поддержания оптимального водного статуса тканей растений при засолении является понижение их осмотического потенциала до уровня, способного обеспечить поток воды из среды в растение. Оказалось, что при засолении осмотический потенциал тканей листьев снизился почти до 2 МПа уже на 7 день воздействия 175 мМ NaCl и сохранялся на этом уровне до конца опыта, что было на 0.96 (1) и 1.11 (2) МПа ниже по сравнению с листьями растений контрольного варианта. Внесение ЭБЛ в среду не влияло достоверно на осмотический потенциал листьев, однако при совместном его действии с NaCl ЭБЛ частично снимал NaCl-индуцированное падение осмотического потенциала содержимого клеток листьев рапса (рис. 6).

Решающую роль в формировании осмотического потенциала играют неорганические ионы, прежде всего ионы калия; в условиях засоления особая роль принадлежит ионам натрия. Способность ЭБЛ повышать осмотический потенциал клеточного содержимого могла быть реализована через регуляцию клеточных транспортных систем, обеспечивающих трансмембранный перенос ионов натрия и калия. Полученные нами предварительные результаты подтверждают это предположение, поскольку в условиях солевого стресса ЭБЛ несколько снижал содержание ионов натрия в листьях и, напротив, повышал содержание ионов калия (данные не приведены).

При адаптации растений к токсическому действию избытка неорганических ионов, прежде всего натрия, и к нарушению водного статуса растений важная роль принадлежит совместимым осмолитам – аминокислотам, сахарам, сахароспиртам и бетаинам. Иминокислота пролин является универсальным совместимым осмолитом высших растений [15].

В листьях растений рапса контрольного варианта содержание пролина составляло около 0.4 мкмоль/г сырой массы; ЭБЛ увеличивал его содержание до 0.6–0.7 мкмоль/г сырой массы. Засоление значительно повышало накопление пролина; в течение 7 суток его уровень вырос в 43 раза, через 14 суток уровень пролина превышал контрольный в 52 раза (табл. 1). Добавление в питательную среду ЭБЛ совместно с NaCl приводило к снижению уровня пролина в растениях по сравнению с его содержанием в присутствии одного хлористого натрия. Несмотря на то, что через 7 суток совместного действия ЭБЛ и NaCl уровень пролина был в 1.6 раза ниже, а через 14 суток – в 3 раза ниже, чем в условиях лишь солевого стресса, содержание пролина в данном случае многократно превосходило его уровень в контрольных растениях.

 

Влияние NaCl и 24-эпибрассинолида на интенсивность перекисного окисления липидов и уровень низкомолекулярных фенольных соединений

Одним из последствий действия засоления на растения является окислительный стресс, связанный, прежде всего, с нарушениями процессов фотосинтеза и дыхания [16]. Для оценки интенсивности окислительного стресса в листьях рапса в условиях засоления была изучена степень проявления ПОЛ, измеряемая по содержанию малонового диальдегида в реакции с тиобарбитуровой кислотой. Как видно из данных, представленных на рис. 7, интенсивное засоление повышало уровень МДА на 42%, что свидетельствовало о развитии окислительного стресса, тогда как внесение ЭБЛ совместно с 175 мМ NaCl снижало содержание МДА практически до уровня контроля. На этом основании можно было предположить, что ЭБЛ стимулирует накопление антиоксидантных соединений.

Выраженными антиоксидантными свойствами обладают низкомолекулярные фенольные соединения. Внесение ЭБЛ в среду достоверно не влияло ни на общее содержание низкомолекулярных фенольных соединений, ни на содержание флавоноидов в растениях рапса. Напротив, при засолении содержание низкомолекулярных фенольных соединений, в том числе флавоноидов, возрастало в 1.9–2.7 раз над значениями контрольных растений (табл. 2). 

При совместном действии 175 мМ NaCl и ЭБЛ общее содержание низкомолекулярных фенольных соединений, в частности флавоноидов, также было повышенным в сравнении с контрольным уровнем, однако ЭБЛ не только не стимулировал, а напротив несколько снижал (на 43–64 %) NaCl-индуцированную аккумуляцию флавоноидов. 

 

Влияние NaCl и 24-эпибрассинолида на содержание эндогенных брассиностероидов 

Как следует из представленных выше экспериментальных данных, экзогенный ЭБЛ повышал солеустойчивость растений рапса, вовлекаясь в регуляцию водного статуса и окислительного стресса. Можно было ожидать, что на действие засоления растения отвечают изменением эндогенного содержания и баланса брассиностероидов, обеспечивающих формирование защитных систем. Для проверки этого предположения был проведен анализ содержания брассиностероидов с помощью иммуноферментных тест-систем.

Как видно на рис. 8, уровень брассиностероидов в листьях рапса в значительной степени зависел от возраста растений. Самое высокое содержание фитогормонов отмечено у растений в возрасте 26 суток (исходный контроль), тогда как через 7 и 14 суток после этого концентрация гормонов снижалась; при этом наибольшая степень варьирования была отмечена для 24-эпибрассиностероидов. Эпибрассинолиды были преобладающими в 4-недельных растениях рапса, где их содержание было в 3 и 4 раза выше, чем брассинолидов и гомобрассинолидов (рис. 8). На воздействие 175 мМ NaCl растения отвечали увеличением уровня всех анализируемых групп гормонов; наблюдаемый эффект значительно усиливался через 14 суток солевого воздействия. Внесение в питательную среду экзогенного ЭБЛ способствовало полному или частичному (через 7 и 14 суток воздействия соответственно) снижению эффекта NaCl на накопление эпибрассинолидов, брассинолидов и гомобрассинолидов в растениях рапса. Влияние экзогенного ЭБЛ в отсутствие засоления выражалось в увеличении его эндогенного уровня в два раза; содержание гормонов ряда брассинолида и 28-гомобрассинолида при этом почти не увеличивалось.

Обсуждение

Неблагоприятные факторы внешней среды, в частности засоление, могут снижать урожай на 50% и более [17]. Одним из быстрых негативных эффектов засоления является торможение роста растений, что достигается при использовании различных механизмов. Прежде всего, наличие соли в растворе уменьшает способность растений поглощать воду. Дополнительное негативное воздействие засоления, связанное с осмотическим эффектом, может быть обусловлено выходом воды из клеток из-за низкого водного потенциала почвенного раствора. В том случае, когда кратковременное (минуты или часы) воздействие соли вызывает лишь водный дефицит, при длительном действии фактора растение испытывает недостаток кальция и токсичность высоких концентраций ионов натрия [18]. Впоследствии может наблюдаться опадание листьев, т.е. сокращение транспирирующей и фотосинтетической поверхности.

В настоящей работе показана высокая чувствительность к действию NaCl фотосинтетической (ассимилирующей) поверхности рапса (рис. 2), в то время как ингибирование роста стебля было выражено значительно слабее (рис. 1). Подавление роста листьев и их ускоренное отмирание снижало биомассу растений (рис. 3). Внесение в питательную среду ЭБЛ не только снижало отрицательное воздействие засоления на площадь листовой поверхности и накопление биомассы, но и восстанавливало рост стебля (рис. 13).

Засоление оказывает негативное воздействие на процесс фотосинтеза и фотосинтетический аппарат растений. На снижение скорости фотосинтеза при засолении влияет ряд причин. Прежде всего, это уменьшение водного потенциала, потеря тургора замыкающих клеток и как следствие снижение доступности углекислоты [19]. Немаловажное значение имеет и накопление в хлоропластах ионов натрия и хлора. Если функционирование ЭТЦ фотосинтеза при данном типе стресса существенно не изменяется, то углеродный метаболизм и процесс фотофосфорилирования претерпевают значительные изменения [20]. Закрывание устьиц с целью снижения потерь воды в процессе транспирации влияет на функционирование свето-собирающего комплекса и системы преобразования энергии, а это, в свою очередь, изменяет активность хлоропластов [21].

Один из самых заметных эффектов NaCl на фотосинтетический аппарат растений связан с ингибированием синтеза фотосинтетических пигментов [22]. Способность брассиностероидов понижать негативное действие соли на рост растений связывают, прежде всего, со снижением ингибирующего действия NaCl на содержание пигментов. Полагают, что накопление ионов хлора в хлоропластах растений приводит к снижению уровня хлорофилла [23]. Наибольший негативный эффект в нашем исследовании, так же как и в растениях Oryza sativa [22], NaCl оказывал на хлорофилл b (рис. 5).

Отрицательное влияние засоления на фотосинтетический аппарат растений может быть частично снято накоплением эндогенного пролина. Защитное действие пролин реализует, выступая в качестве химического шаперона, через стабилизацию функциональных единиц II комплекса ЭТЦ, мембран, белков и ферментов, таких как РУБИСКО, а также проявляя антиоксидантные свойства и вовлекаясь в тушение активных форм кислорода [24]. Растения рапса предотвращают массовое разрушение хлорофилла a и b при засолении, очевидно, за счет интенсивной аккумуляции пролина (рис. 5, табл. 1). Несмотря на то, что при совместном действии NaCl и ЭБЛ гормон способствовал снижению содержания пролина по сравнению с воздействием одного NaCl, его уровень, тем не менее, в 17–29 раз превышал контрольный, что, вероятно, являлось достаточным для стабилизации метаболизма фотосинтетических пигментов (табл. 1). Более того, при солевом стрессе растения кроме пролина активно аккумулировали низкомолекулярные фенольные соединения, обладающие выраженными антиоксидантными свойствами, что, очевидно, делало излишним супераккумуляцию пролина.

Помимо осмотического стресса избыточное накопление токсичных для растения ионов и Na+ и Cl вызывает снижение поступления и нарушение внутриклеточного и межорганного распределения ионов калия и кальция. Ионы натрия конкурируют с К+ за общие транспортные системы, однако в условиях засоления содержание Na+ в среде значительно больше, чем К+, что и определяет преимущественное поступление в клетки ионов натрия. В соответствии с полученными нами предварительными данными, ЭБЛ снижал массовое поступление в растение Na+ и стабилизировал внутриклеточное содержание ионов калия (данные не приведены). Сходный эффект брассиностероидов при засолении был показан на растениях пшеницы. Опрыскивание листьев растений раствором ЭБЛ способствовало снижению содержания Na+, увеличению уровня ионов калия и кальция наряду с повышением соотношения K+/Na+, что в значительной мере определяло повышение солеустойчивости растений пшеницы [25]. На этом основании можно предположить, что брассиностероиды вовлечены в регуляцию функционирования транспортеров Na+ и K+, стабилизируя тем самым ионный гомеостаз в условиях стресса.

Как уже отмечалось выше, NaCl в высоких концентрациях оказывает не только прямое токсическое действие на клеточный метаболизм и вызывает осмотический стресс, но и стимулирует генерацию АФК и развитие окислительного стресса. Основная причина окислительного стресса в этом случае связана с закрыванием устьиц, снижением доступности СО2 и повышением энергии возбуждения электронов, что сопровождается интенсивной генерацией АФК [16, 26]. Другой причиной интенсивной генерации АФК при засолении является нарушение дыхания в условиях солевого стресса.

АФК вызывают повреждение белков и нуклеиновых кислот, окисление липидов, распад пигментов и инактивацию ферментов. Вызываемое АФК повреждение мембран является основной причиной интоксикации клеток растений [26].

Удобным и широко распространенным методом оценки интенсивности окислительного стресса растений и структурной целостности мембран является измерение уровня МДА, продукта реакции с тиобарбитуровой кислотой [11]. Содержание МДА у растений рапса, подвергнутых действию NaCl, было на 42% выше по сравнению с контрольным вариантом (рис. 7), что свидетельствует о развитии у растений окислительного стресса. Экзогенный ЭБЛ полностью нейтрализовал NaCl-зависимое ПОЛ, проявляя выраженный антиоксидантный эффект (рис. 7).

Как известно, для снижения негативного воздействия окислительного стресса в растениях активируются антиоксидантные защитные системы, действие которых направлено на гашение АФК. Повышенный интерес в этой связи могут представлять неферментативные системы антиоксидантной защиты  каротиноиды, низкомолекулярные фенольные соединения, пролин и т.д. [27].

Известно, что каротиноиды участвуют в тушении 1О2 и пероксид радикалов, которые генерируются при избыточном возбуждении хлорофилла [28]. Низкомолекулярные фенольные соединения, являясь водорастворимыми антиоксидантами, нейтрализуют АФК более эффективно по сравнению с липидорастворимыми каротиноидами. Наличие у фенольных соединений антиоксидантных свойств связано с их способностью выступать в качестве источников водорода, восстановителей и тушителей 1O2 [29]. 

Одной из стратегий снижения интенсивности окислительного стресса у галофитов, в отличие от гликофитов, является аккумуляция каротиноидов [30]. В растениях рапса, который относится к гликофитам, также не наблюдалось NaCl-зависимой аккумуляции каротиноидов (рис. 5), но происходило накопление низкомолекулярных фенольных соединений, включая флавоноиды (табл. 2). Экзогенный ЭБЛ понижал до контрольного уровня интенсивность ПОЛ при засолении, что свидетельствует о его вовлечении в регуляцию окислительного статуса организма (рис. 7). 

Отрицательная корреляция между содержанием МДА и уровнем низкомолекулярных фенольных соединений указывает на их антиоксидантную роль. Фенольные соединения участвуют в тушении АФК и связывании ионов металлов (например, железа), что препятствует их участию в реакции ГабераВейса, приводящей к окислительному стрессу. Антиоксидантная роль пролина при засолении выражается в тушении 1О2 и увеличении активности каталазы и пероксидазы [15]. Вместе с тем, увеличение в растениях рапса концентрации пролина под действием NaCl в 4050 раз направлено не только на снижение окислительного стресса (табл. 1), но и на поддержание осмотического равновесия между основными компартментами клетки.

Обращает на себя внимание тот факт, что добавление в питательную среду экзогенного ЭБЛ при солевом стрессе не только не сопровождалось дальнейшим накоплением пролина и низкомолекулярных фенольных соединений (табл. 1 и 2), а, напротив, даже несколько понижало их уровень. В то же самое время экзогенный ЭБЛ проявлял выраженный антиоксидантный эффект в условиях засоления (рис. 7). Отсюда следует предположение, что антиоксидантное действие ЭБЛ в условиях солевого стресса в растениях рапса реализуется не через регуляцию накопления низкомолекулярных фенольных соединений и(или) пролина, а через иные компоненты клеточной антиоксидантной системы.

Представленные выше данные демонстрируют солезащитный эффект экзогенного ЭБЛ на растениях рапса. Возникает вопрос, изменяется ли эндогенное содержание и баланс стероидных фитогормонов в рапсе при солевом стрессе? Нами проанализировано содержание основных групп брассиностероидов, отличающихся как по количеству атомов углерода в молекуле  С28 (брассинолид и 24-эпибрассинолид) и С29 (28-гомобрассинолид), так и по конфигурации заместителей в боковой цепи  24S-метил (брассинолид), 24R-метил (24-эпибрассинолид) и 24S-этил (28-гомобрассинолид) (рис. 8). Несмотря на то, что брассинолид является основным стероидным гормоном в растениях Brassica на начальных этапах онтогенеза, в листьях взрослых растений преобладал его изомер ЭБЛ. Повышение уровня брассиностероидов в ответ на засоление может косвенно свидетельствовать о том, что данная группа фитогормонов вовлекается в регуляцию солеустойчивости растений рапса (рис. 8). Экзогенный ЭБЛ стимулировал накопление в листьях рапса эндогенного ЭБЛ, практически не влияя на содержание других анализируемых брассиностероидов. Совместное воздействие NaCl и ЭБЛ снижало накопление брассиностероидов. Одним из возможных объяснений данного явления может быть подавление экзогенным гормоном биосинтеза эндогенных брассиностероидов по типу обратной связи. В пользу этого свидетельствует тот факт, что у брассиностероидов существует регуляция их биосинтеза по типу обратной связи на уровне четырех ферментов (CPD, DWF4, ROT3 и BR6ox). Кроме того, известно, что любой процесс в растительной клетке одновременно регулируется несколькими фитогормонами. Это делает крайне важным поддержание определенного гормонального баланса в организме, от которого зависит реализация специфики регуляторного действия каждого из фитогормонов [6].

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что брассиностероиды проявляют выраженный протекторный эффект на растениях рапса в условиях солевого стресса. Засоление стимулировало накопление в растениях анализируемых нами эндогенных брассиностероидных гормонов ряда эпибрассинолида, гомобрассинолида и брассинолида. В основе защитного действия брассиностероидов при солевом стрессе, очевидно, лежит их способность предотвращать разрушение фотосинтетических пигментов и снижать интенсивность окислительного стресса, не стимулируя при этом аккумуляцию пролина и низкомолекулярных фенольных соединений. Другой, весьма неожиданной способностью брассиностероидов явилось ограничение стероидными фитогормонами поступления ионов натрия в растение и сопряженное с ним поддержание повышенного уровня ионов калия, что является предметом наших дальнейших исследований.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 14-04-90032 Бел_а), БР ФФИ (грант № Х14Р-139) и Программы фундаментальных исследований Президиума РАН “Молекулярная и клеточная биология”.

Список литературы

1.Kuznetsov Vl.V., Shevyakova N.I. Polyamines and plant adaptation to saline environments // Desert Plants / Ed. Ramawat K.A. Heidelberg; Dordrecht; London; New York: Springer-Verlag, 2010. P. 261–298.

2.Shahid S.A., Rahman K. Soil salinity development, classification, assessment, and management in irrigated agriculture // Handbook of Plant and Crop Stress / Ed. Pessarakli M. Boca Raton: CRC Press, Taylor & Francis Group, 2011. P. 23–38.

3.Chory J., Nagpal P., Peto C.A. Phenotypic and genetic analysis of det2, a new mutant that affects light-regulated seedling development in Arabidopsis // Plant Cell. 1991. P. 445459.

4.Карначук Р.А., Головацкая И.Ф., Ефимова М.В., Хрипач В.А. Действие эпибрассинолида на морфогенез и соотношение гормонов у проростков Arabidopsis на зеленом свету // Физиология растений. 2002. Т. 49. С. 591–595.

5.Ефимова М.В., Кузнецов В.В., Кравцов А.К., Барташевич Д.А., Карначук Р.А., Ковтун И.С., Кузнецов Вл.В. Особенности экспрессии пластидного генома и развития растений Arabidopsis thaliana с нарушенным синтезом брассиностероидов // Физиология растений. 2012. Т. 59. С. 32–39.

6.Kudryakova N.V., Efimova M.V., Danilova M.N., Zubkova N.K., Khripach V. A., Kusnetsov V.V., Kulaeva O.N. Exogenous brassinosteroids activate the expression of the genes of cytokinin signaling pathway in transgenic Arabidopsis thaliana // Plant Growth Regul. 2013. V. 70. P. 6169.

7.Khripach V.A., Zhabinskii V.N., Khripach N.B. New practical aspects of brassinosteroids and results of their ten-year agricultural use in Russia and Belarus // Brassinosteroids. Bioactivity and Crop Productivity / Еds. Hayat S., Ahmad A. Dordrecht: Kluwer, 2003. Р. 189230.

8.Fariduddin Q., Yusuf M., Ahmad I., Ahmad A. Brassinosteroids and their role in response of plants to abiotic stresses // Biol. Plant. 2014. V. 58. P. 917.

9.Bates L.S., Waldran R.P., Teare I.D. Rapid determination of free proline for water stress studies // Plant Soil. 1973. V. 39. P. 205208.

10.Lichtenthaler H.K. Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes // Methods Enzymol. 1987. V. 148. P. 350382.

11.Buege J.A., Aust S.D. Microsomal lipid peroxidation // Methods Enzymol. 1978. V. 52. P. 302310.

12.Загоскина Н.В., Дубравина Г.А., Алявина А.К., Гончарук Е.А. Влияние ультрафиолетовой (УФ-Б) радиации на образование и локализацию фенольных соединений в каллусных культурах чайного растения // Физиология растений. 2003. Т. 50. С. 302308.

13.Gage T.B., Wendei S.H. Quantitative determination of certain flavonol 3-glycosides // Anal. Chem. 1950. V. 22. P. 708711.

14.Khripach V.A., Zhabinskii V.N., Litvinovskaya R.P. Immunoassays of brassinosteroids // Brassinosteroids: a Class of Plant Hormones / Eds. Hayat S., Ahmad A. Heidelberg: Springer Science + Business Media B.V., 2011. P. 375392.

15.Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция // Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 234243.

16.Schmitt Fr.-J., Renger G., Friedrich T., Kreslavski V.D., Zharmukhamedov S.K., Los D.A., Kuznetsov Vl.V., Allakhverdiev S.I. Reactive oxygen species: re-evaluation of generation, monitoring and role in stress-signaling in phototrophic organisms // Biochim. Biophys. Acta. 2014. V. 1837. P. 835848.

17.Hasanuzzaman M., Nahar K., Fujita M. Plant response to salt stress and role of exogenous protectants to mitigate salt-induced damages // Ecophysiology and Responses of Plants under Salt Stress / Eds. Ahmad P., Azooz M.M., Prasad M.N.V. Dordrecht: Springer Science + Business Media B.V., 2013. P. 2587.

18.Munns R. Salinity, growth and phytohormones // Salinity: Environment  Plants  Molecules / Eds. Lauchli A., Luttge U. Dordrecht: Kluwer, 2002. P. 271290.

19.Brugnoli E., Bjorkman O. Growth of cotton under continuous salinity stress: influence on allocation pattern, stomatal and non-stomatal components of photosynthesis and dissipation of excess light energy // Planta. 1992. V. 187. P. 335347.

20.Sudhir P., Murthy S.D.S. Effects of salt stress on basic processes of photosynthesis // Photosynthetica. 2004. V. 42. P. 481486.

21.Iyengar E.R.R., Reddy M.P. Photosynthesis in highly salt-tolerant plants // Handbook of Photosynthesis / Ed. Pessaraki M. New York: Marcel Dekker, 1996. P. 897909.

22. Chutipaijit S., Cha-um S., Sompornpailin K. High contents of proline and anthocyanin increase protective response to salinity in Oryza sativa L. spp. indica // Aust. J. Crop Sci. 2011. V. 5. P. 11911198.

23. Tavakkoli E., Rengasamy P., McDonald G.K. High concentrations of Na+ and Cl ions in soil solution have simultaneous detrimental effects on growth of faba bean under salinity stress // J. Exp. Bot. 2010. V. 61. P. 44494459.

24. Heuer B. Influence of exogenous application of proline and glycinebetaine on growth of salt stressed tomato plants // Plant Sci. 2003. V. 165. P. 693699.

25. Qasim A., Habib-ur-rehman A., Ashraf M. Influence of exogenously applied brassinosteroids on the mineral nutrient status of two wheat cultivars grown under saline conditions // Pak. J. Bot. 2006. V. 38. P. 1621–1632.

26.Ahmad P., Jaleel C.A., Salem M.A., Nabi G., Sharma S. Roles of enzymatic and non-enzymatic antioxidants in plants during abiotic stress // Crit. Rev. Biotechnol. 2010. V. 30. P. 161175.

27.Bose J., Rodrigo-Moreno A., Shabala S. ROS homeostasis in halophytes in the context of salinity stress tolerance // J. Exp. Bot. 2014. V. 65. P. 12411257.

28.Demmig-Adams B., Adams W.W., III. The role of xanthophylls cycle carotenoids in the protection of photosynthesis // Trends Plant Sci. 1996. V. 1. P. 21–26.

29.Sakihama Y., Cohen M.F., Grace S.C., Yamasaki H. Plant phenolic antioxidant and prooxidant activities: phenolics-induced oxidative damage mediated by metals in plants // Toxicology. 2002. V. 177. P. 67–80.

30.Ozgur R., Uzilday B., Sekmen A.H., Turkan I. Reactive oxygen species regulation and antioxidant defence in halophytes // Funct. Plant Biol. 2013. V. 40. P. 832–847.

Таблица 1. Влияние 1010 М 24-эпибрассинолида и 175 мМ NaCl на содержание свободного пролина в растениях рапса через 7 и 14 суток воздействия

 

 

 

Подписи к рисункам

 

Рис. 1. Влияние 24-эпибрассинолида (1010 М) и NaCl (175 мМ) на рост стебля растений рапса через 7 и 14 суток воздействия.

 

Рис. 2. Влияние 24-эпибрассинолида (1010 М) и NaCl (175 мМ) на листовую поверхность одного растения рапса через 7 и 14 суток воздействия.

 

Рис. 3. Влияние 24-эпибрассинолида (1010 М) и NaCl (175 мМ) на накопление сырой и сухой биомассы растениями рапса. 

Снятие показателей проводили через 7 и 14 суток воздействия. 1 – сырая масса, 2 – сухая масса.

 

Рис. 4. Влияние 24-эпибрассинолида (1010 М) и NaCl (175 М) на содержание воды в листьях в процентах от сырой биомассы через 7 и 14 суток воздействия. 

 

Рис. 5. Влияние 24-эпибрассинолида (1010 М) и NaCl (175 мМ) на содержание фотосинтетических пигментов в растениях рапса. 

Взятие растительного материала проводили через 7 и 14 суток от начала воздействия. 1 – хлорофилл а, 2 – хлорофилл b, 3 – каротиноиды. 

 

Рис. 6. Влияние 24-эпибрассинолида (1010 М) и NaCl (175 мМ) на осмотический потенциал клеточного содержимого растений рапса через 7 и 14 суток от начала воздействия. 

1 – 7 суток, 2 – 14 суток.

Рис. 7. Влияние 24-эпибрассинолида (1010 М) и NaCl (175 мМ) на интенсивность перекисного окисления липидов в растениях рапса через 7 и 14 суток от начала воздействия. 

1 – 7 суток, 2 – 14 суток.

 

Рис. 8. Влияние 24-эпибрассинолида (1010 М) и NaCl (175 мМ) на эндогенный уровень некоторых брассиностероидов в растениях рапса через 7 и 14 суток от начала воздействия. 

1 – ЭБ (эпибрассинолид), 2 – БЛ (брассинолид), 3 – ГБ (гомобрассинолид).