УДК 581.1

АППАРАТ ТРАНСКРИПЦИИ ПЛАСТОМА И ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ЕГО ГЕНОВ В ПРОЦЕССЕ ЦИТОКИНИН-ЗАВИСИМОЙ ДЕЭТИОЛЯЦИИ

Arabidopsis thaliana

© 2018 г. М. Н. Данилова1,*, А. С. Дорошенко1, Н. В. Кудрякова1, А. А. Андреева1,2, В. В. Кузнецов1

1Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва

2Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования “Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова”, Москва

Поступила в редакцию 29.11.2017 г.

 

Несмотря на огромные достижения последних десятилетий в изучении молекулярных основ действия цитокининов как ключевых активаторов биогенеза хлоропластов, роль этого фитогормона в регуляции экспрессии генов аппарата транскрипции пластома практически не исследована. С целью выяснения специфики действия компонентов сигнальной системы цитокинина на транскрипционный аппарат пластид в процессе деэтиоляции анализировали свето- и цитокинин-зависимую динамику экспрессии генов хлоропластных РНК-полимераз, РАР белков и транскрипционных факторов в процессе деэтиоляции 4-дневных проростков Arabidopsis thaliana дикого типа (Columbia-0) и нокаут-мутантов по восприятию и трансдукции сигнала цитокинина. Оба фактора оказывали избирательное воздействие на экспрессию различных генов аппарата транскрипции пластома. Позитивный эффект света и цитокинина на процесс деэтиоляции обеспечивался, вероятно, за счет функционирования рецепторов АНК3 и АНК4, а также генов регуляторов ответа АRR1, АRR10 и ARR12.

 

Ключевые слова: Arabidopsis thaliana деэтиоляция – свет – цитокинины – рецепторы – пластом – экспрессия генов – этиопласты – хлоропласт

______________________

Сокращения: ФСII – фотосистема 2; ЦК – цитокинины; ЭПР – эндоплазматический ретикулум; PEP – мультиcубъединичная РНК-полимераза пластидного кодирования; NEP – РНК-полимераза фагового типа ядерного кодирования.

*Адрес для корреспонденции: Данилова Мария Николаевна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: mariadanilova86@yandex.ru

 

ВВЕДЕНИЕ

Основополагающее значение света для жизнедеятельности растений хорошо известно. Для светозависимого роста и развития растений (фотоморфогенеза) необходимо быстрое формирование фотосинетического аппарата, которое сопровождается активацией транскрипции большого количества пластидных и ядерных генов. Особенно ярко это можно наблюдать при дифференцировке пропластид или этиопластов в хлоропласты [1]. Этиопласты – особый тип пластид, свойственный проросткам, рост и развитие которых происходят в условиях полной темноты, как правило, под поверхностью почвы. Процесс, при котором у проростков наблюдаются специфичные морфологические черты (удлинение гипокотиля, отсутствие настоящих листьев и наличие апикальной петельки), а также физиолого-биохимические признаки (отсутствие хлорофилла, гетеротрофный тип питания), называют этиоляцией (от фр. étioler – делать хилым), или скотоморфогенезом. Формирование этиопластов из пропластид происходит в темноте под влиянием функционирования в клетке систем эндогенного контроля развития, прежде всего гормональной [2].

Под воздействием света процесс этиоляции сменяется деэтиоляцией –кратковременным начальным этапом фотоморфогенеза. Он регулируется, прежде всего, функционированием в клетке фоторецепторов, которые посредством сложной сигнальной сети инициируют превращение бесцветных этиопластов в зеленые хлоропласты. Внешне деэтиоляция проявляется позеленением семядолей проростка за счет накопления фотосинтетических пигментов, а внутренне – запуском большого числа процессов, таких как перепрограммирование генома клетки, биосинтез и импорт белков в хлоропласты, что, в конечном счете, определяет запуск фотосинтеза и реализацию растением трофической функции света [2, 3].

Пластиды растительной клетки являются одной из важнейших клеточных мишеней действия света и гормонов, однако процесс биогенеза хлоропластов чрезвычайно сложен, и его молекулярные основы до сих пор расшифрованы не полностью. Так как функционирование хлоропластов требует координированного синтеза фотосинтетических белков и хлорофилла, регуляция транскрипции генов хлоропластных белков имеет большое значение для биогенеза хлоропластов. Роль света в этом процессе очень важна: известно, что под действием освещения одна треть генов ядерного генома изменяет свою активность [4, 5]. Значительная часть этих генов кодирует хлоропластные белки. Не менее значимы эндогенные факторы, среди которых особое место занимают цитокинины (ЦК), способные регулировать процесс деэтиоляции в том числе и за счет непосредственного связывания транс-факторов ARR типа В с цис-элементами промоторов генов хлоропластных белков [6]. Способность ЦК имитировать влияние света наиболее ярко была показана на проростках Arabidopsis thaliana дикого типа, выращенных в темноте на питательной среде с добавлением цитокинина. Такие проростки содержали этиопласты линзообразной формы и вместо проламеллярных тел формировали тилакоидные мембраны, как при деэтиоляции [7]. Сходный эффект цитокинина на ультраструктуру пластид был показан и на семядолях люпина желтого [8]. Доминирующая роль в ЦК-зависимом морфогенезе в темноте, по данным Riefler с соавт. [9], принадлежала сенсорной гистидинкиназе АНК3 – одному из трех мембранных рецепторов цитокинина. Ведущее значение этого рецептора в контроле экспрессии пластидных генов у этиолированных растений установлено нами ранее [10].

Несмотря на существенные морфологические и функциональные различия этиопластов и хлоропластов, в одном растении эти органеллы содержат одинаковую ДНК (пластом). Однако экспрессия генов в них различается вследствие формирования на свету более сложного транскрипционного аппарата. По современным представлениям транскрипция пластома осуществляется двумя типами полимераз: моносубъединичной РНК-полимеразой фагового типа ядерного кодирования (NEP; Nuclear-Encoded RNA-Polymerase), представленной в геноме A. thaliana двумя генами – RPOTp и RPOTmp, и мультиcубъединичной РНК-полимеразой бактериального типа PEP (Plastid-Encoded RNA-Polymerase), коровые субъединицы α, β, β' и β'' которой кодируются в пластоме генами rpoA, rpoB, rpoC1 и rpoC2. Для распознавания промоторных областей пластидных генов PEP необходимы транс-факторы семейства сигма (SIG1–SIG6), которые избирательно осуществляют связывание и инициацию транскрипции с PEP-специфичных промоторов [11–13]. В этиопластах “темновых” растений примерно равный вклад в транскрипцию пластома вносят полимеразы как NEP, так и PEP типа. РЕР представлена растворимой формой PEP-В, состоящей из четырех основных субъединиц (α, β, β' и β')' и одного из шести σ–факторов (SIG1–-SIG6). Под воздействием света с PEP-В связываются дополнительные PAP белки (Plastid-Associated Proteins), в результате чего формируется более сложный ферментный комплекс PEP-А [12, 13]. После этого РЕР становится основной полимеразой в зеленых пластидах и отвечает за транскрипцию большинства генов фотосинтеза. Особенности свето- и цитокинин-зависимой экспрессии ключевых генов аппарата транскрипции пластома в этот критичный для пластид этап практически не изучены.

Цель работы – исследование роли компонентов восприятия и трансдукции цитокининового сигнала в регуляции экспрессии генов аппарата транскрипции пластома в процессе деэтиоляции.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. Объектом исследования служили 4-дневные этиолированные проростки Arabidopsis thaliana дикого типа (Columbia-0), а также созданные на его основе инсерционные нокаут-мутанты по генам рецепции ahk2, ahk3, ahk4, ahk2/ahk3, ahk2/ahk4, ahk3/ahk4 и передачи цитокининового сигнала arr1/10/12.

Условия выращивания. Семена растений стерилизовали в растворе гипохлорита натрия и высевали на чашки Петри с половинной питательной средой Мурасиге-Скуга (“Duchefa”, Нидерланды) без сахарозы и гормона (0 мкМ транс-зеатина; контроль) и с добавлением цитокинина (1 мкМ транс-зеатина; опыт). Для синхронизации прорастания семян чашки Петри выдерживали 2 дня при +4ºC, после чего для стимуляции прорастания семян их освещали в течение 3 ч белым светом интенсивностью 120 мкмоль/(м2 c). Далее проростки выращивали в условиях полной темноты 4 дня при температуре 22ºC.

Условия эксперимента. Этиолированные проростки переносили в климатическую камеру MLR-352Н-PE (“Sanyo”, Япония) с интенсивностью освещения 120 мкмоль/(м2 c) и температурой 22ºC. Для исследования действия света и цитокинина на экспрессию генов хлоропластных белков в процессе деэтиоляции проростки дикого типа фиксировали в жидком азоте через 1, 3, 6, 9, 12 и 16 ч после начала освещения. Мутанты по сигналингу ЦК экспонировали на свету в течение 6 ч. Все манипуляции с этиолированными проростками проводились при зеленом свете низкой интенсивности. При определении длины гипокотилей для каждого варианта было измерено не менее 50 проростков.

Анализ пигментов. Содержание суммарного хлорофилла оценивали по методу, предложенному Lichtenthaler [14].

Экспрессия генов. Относительный уровень транскриптов определяли методом количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени после обратной транскрипции (ПЦР-РВ) на приборе LigthCyclerR96 (“Roche”, Швейцария) согласно методике, описанной ранее [15]. Уровень транскриптов целевых генов был нормализован к уровню транскриптов гена полиубиквитина (UBQ10). Для ПЦР-РВ анализа использовали праймеры, представленные в табл. 1.

Статистический анализ. Каждое исследование проводили в 3–4-кратной биологической повторности в ходе независимых экспериментов. На гистограммах приведены средние значения и стандартные ошибки. Для определения значимости различий средних значений использовали t-тест Стьюдента.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

Оптимизация модельной системы

На первом этапе работы в серии пилотных экспериментов оценивали изменение экспрессии двух маркерных ядерных генов, транскрипция которых положительно регулируется светом и ЦК: светорегулируемого гена LHCB2.4 и цитокининрегулируемого гена ARR4. Для этого 4-дневные этиолированные проростки дикого типа A. thaliana, выращенные с цитокинином и без гормона, переносили на свет и сравнивали экспрессию этих генов в темноте и при освещении в течение 16 ч. Параллельно определяли динамику накопления хлорофилла. Как следует из данных табл. 2, экзогенный цитокинин достоверно усиливал образование хлорофилла на свету в условиях используемой экспериментальной модели.

Перемещение этиолированных проростков A. thaliana на свет индуцировало рост матриц гена LHCB2.4 после 3 ч освещения, который достигал максимума через 6 ч (рис. 1а). Экзогенный цитокинин в процессе деэтиоляции проростков способствовал значительному усилению накопления матриц фотосинтетического гена LHCB2.4 по сравнению с образцами, экспонируемыми на свету без гормона. Аналогичные результаты получены для гена ARR4. Содержание его транскриптов в проростках, выращенных с добавлением гормона, было существенно выше по сравнению с контрольными образцами как в темноте, так и на свету (рис. 1б). Изменение экспрессии маркерных генов в этиолированных проростках в ответ на действие света и гормона и увеличение накопления хлорофилла подтверждает эффективность избранных экспериментальных условий. Поэтому для дальнейшей оценки экспрессии генов сигналинга цитокининов, а также аппарата транскрипции пластома была применена данная постановка эксперимента.

 

Экспрессия генов сигналинга цитокининов

Изменение экспрессии генов хлоропластных белков в процессе деэтиоляции может быть обусловлено уровнем эндогенных цитокининов, содержанием белков сигналинга или их активностью. Поэтому для определения возможных путей регуляции пластидных генов гормоном в процессе деэтиоляции анализировали экспрессию генов рецепторов ЦК в проростках дикого типа. Рецепторами цитокининового сигнала у A. thaliana являются три сенсорных гистидинкиназы AHK2, AHK3 и AHK4 (от англ. Arabidopsis Histidine Kinase). Связывание гистидинкиназ с ЦК приводит к фосфорилированию белков фосфотрансмиттеров (AHP), которые, в свою очередь, перемещаются в ядро и там передают фосфат на регуляторы ответа ARR типа B (транс-факторы) и типа А (регуляторы ответа на цитокинин) [16]. Сравнение уровня матриц генов трех рецепторов в этиолированных проростках дикого типа показало позитивное влияние света на мРНК АНК3 и AHK4, причем динамика их активации была сходной. Максимальное содержание транскриптов достигалось после 3 и 6 ч освещения (рис. 2а, 2б). Содержание транскриптов гена AHK2 существенно не отличалось от уровня матриц контрольных этиолированных проростков как на среде без гормона, так и при его наличии (данные не приводятся). В отличие от генов АНК2 и АНК3, уровень транскриптов гена рецептора АНК4, значительно повышался в ответ на ЦК в темноте, и после некоторого снижения в начале деэтиоляции оставался стабильно высоким на свету в течение всего эксперимента (рис. 2б). Таким образом, гены индивидуальных рецепторов ЦК избирательно регулируются светом и экзогенным цитокинином, что, вероятно, приводит к дифференцированному изменению активности сигнальной системы цитокининов при прорастании Arabidopsis в зависимости от влияния экзогенных и эндогенных факторов.

 

Экспрессия генов аппарата транскрипции пластома

Известно, что на разных этапах онтогенеза NEP и PEP отличаются по своему вкладу в процесс пластидной транскрипции. Экспрессия генов сигма-факторов также зависит от стадии развития растения и внешних условий, что предполагает дифференциальную регуляцию их активности факторами экзогенной и эндогенной природы. Для исследования свето- и цитокинин-индуцируемой регуляции экспрессии ключевых генов аппарата транскрипции пластид в ходе деэтиоляции проростков были выбраны ядерные гены моносубъединичных РНК-полимераз фагового типа (RPOTp и RPOTmp) и гены сложного комплекса мультисубъединичной РНК-полимеразы бактериального типа: rpoA, rpoB, rpoС1, rpoС2, SIG1-SIG6 и PAP5.

Накопление транскриптов RPOTp и RPOTmp с начала освещения увеличивалось, достигая максимальных значений к 6 и 9 ч соответственно (рис. 3а, 3б). Наибольший рост экспрессии под действием света наблюдался для гена RPOTp, кодирующего РНК-полимеразу пластид, поступающую только в пластиды (~ в 5 раз) (рис. 3а). Несколько меньше (~ в 3 раза) активировался ген RPOTmp, функционирующий в пластидах и митохондриях. Экзогенный цитокинин стимулировал накопление матриц генов обеих NEP на свету примерно в равной степени, за исключением точки световой экспозиции 1 ч, когда уровень транскриптов обоих генов резко падал, приближаясь к контрольным значениям без гормона. Примечательно, что максимальный активирующий эффект цитокинина отмечался через 16 ч световой экспозиции. Судя по полученным результатам (рис. 3), свет абсолютно необходим для активации экспрессии RPOTp и RPOTmp генов цитокинином.

Динамика экспрессии NEP-зависимых хлоропластных генов, кодирующих субъединицы ядра PEР, оказалась совершенно иной. Уровень мРНК этих генов снижался при переносе проростков на свет. Некоторый рост намечался лишь по истечении 6 ч световой экспозиции. Тем не менее, через 16 ч накопление матриц генов rpoВ, rpoС1, rpoС2, входящих в состав одного оперона, превосходило уровень мРНК этиолированных проростков от 1.5 до 4 раз (рис. 4б–4г), а мРНК гена rpoА, транскрибируемого с другого NEP-зависимого промотора, в 7 раз (рис. 4а). При этом регуляция экзогенным цитокинином для всех генов rpo практически отсутствовала как в темноте, так и на свету (рис. 4).

Деэтиоляция неоднозначно влияла на динамику накопления матриц шести различных членов семейства SIG. Освещение стимулировало накопление мРНК генов SIG1, SIG2 и SIG6 (до двух раз; рис. 5а, 5б, 5г), тогда как содержание матриц SIG3 и SIG4 практически не изменялось по сравнению с контрольным “темновым” уровнем (данные не приводятся). Накопление транскриптов гена SIG5 в этиолированных проростках резко возрастало (почти в 7 раз) в течение первого часа световой экспозиции и сохранялось на высоком уровне на протяжении последующих 12 ч (рис. 5в). При этом цитокинин негативно регулировал уровень матриц гена SIG5 на свету, однако содержание транскриптов этого гена при освещении, тем не менее, значительно превосходило уровень мРНК у этиолированных проростков, выращенных на гормоне в темноте. Цитокинин активировал экспрессию гена SIG2 на свету и поддерживал повышенное содержание транскриптов генов SIG2 и SIG6 в темноте (рис. 5в, 5г). Среди двенадцати РАР белков наибольший интерес при деэтиоляции представляет HEMERA/pTAC12/РАР5. Этот белок двойной локализации (ядро и пластиды) отвечает за быструю адаптацию проростков к свету, что требует четкой координации экспрессии пластидного и ядерного геномов [5].

Согласно полученным нами данным, в этиолированных проростках, перенесенных на свет, максимальное накопление транскриптов гена PAP5 отмечалось после 6-часового действия света. Количество матриц PAP5 также достоверно увеличивалось в ответ на ЦК на свету и в темноте, и на протяжении всего времени исследования превышало значения контрольных вариантов, культивируемых в отсутствии гормона (рис. 6).

 

Роль компонентов сигналинга цитокининов в регуляции экспрессии генов аппарата транскрипции пластид

Специфика морфогенетических ответов на цитокинин зависит, прежде всего, от систем восприятия и трансдукции сигнала, поэтому далее изучали участие генов сигналинга ЦК в гормон-зависимой регуляции генов аппарата транскрипции пластома при деэтиоляции. Функции индивидуальных рецепторов цитокинина и регуляторов ответа оценивали с использованием нокаут-мутантов Arabidopsis по генам рецепции и трансдукции гормонального сигнала.

Одним из стандартных тестов на чувствительность к ЦК является укорочение гипокотилей проростков, культивируемых в условиях полной темноты [7]. Сравнение длины гипокотилей 4-дневных проростков, выращенных на питательной среде с добавлением 1 мкМ транс-зеатина и без гормона, показало, что наименее выраженное укорочение гипокотилей наблюдалось у проростков мутантов ahk3, ahk4, ahk2/3 и ahk3/4, а также у тройного мутанта arr1/10/12 (рис. 7а, 7б). Эти данные позволяют сделать предварительное заключение о возможном вкладе всех изученных компонентов цитокининового сигналинга в ЦК-зависимый ответ в условиях нашей экспериментальной постановки.

Для исследования роли компонентов сигналинга цитокининов в контроле цитокинин-зависимой деэтиоляции нами была избрана 6-часовая экспозиция на свету. Это объясняется наличием после 6 ч стабильного ответа на свет и гормон большинства исследуемых генов. В работу были включены гены аппарата транскрипции, имеющие выраженную ответную реакцию у растений дикого типа. Ключевым компонентом в регуляции уровня транскриптов маркерного гена ответа на цитокинин ARR4 оказался ген AHK3: его инактивация приводила к существенному снижению содержания транскриптов как маркерного гена ARR4, так и гена-маркера фотоморфогенеза LHCB2.4 (рис. 8а, 8б). Анализ нокаут-мутантов обнаружил следующие закономерности. Светозависимый уровень накопления транскриптов генов RPOTp и RPOTmp у всех мутантов, за исключением ahk2, был ниже уровня дикого типа (рис. 8в, 8г). При этом максимальное падение содержания транскриптов по сравнению с образцами дикого типа наблюдалось у линии ahk3 (RPOTmp) и ahk4 (RPOTp). Цитокинин-зависимая активация генов NEP также была достоверно понижена у мутантов, в особенности у одинарных линий, дефектных по генам AHK3 и AHK4, а также двойного мутанта ahk3/4 (рис. 8в, 8г). Отсутствие рецепторов ЦК практически не сказывалось на светозависимом уровне матриц гена SIG2, за исключением линии с нокаутированным геном АHK4. В то же время цитокин-зависимый ответ гена SIG2 определялся генотипом проростков, прежде всего наличием активного рецептора АНК3 и генов регуляторов ответа. Экспрессия гена SIG5 почти не различалась у проростков дикого типа и мутантных линий по рецепторам ЦК (рис. 8е). Исключение составил мутант arr1/10/12: у него отмечено снижение свето-индуцируемой активации и двукратный рост накопления транскриптов SIG5 при обработке ЦК по сравнению с уровнем транскриптов дикого типа.

В целом, полученные результаты соответствуют представлению о позитивном влиянии компонентов сигналинга цитокинина на накопление мРНК генов аппарата транскрипции пластид при деэтиоляции. Однако ситуацию осложняют особенности экспрессии гена РАР5 у мутантов. Инактивация рецепторов АНК2 и АНК3 способствовала увеличению уровня свето- и гормонзависимого накопления транскриптов РАР5, что подразумевает негативную регуляцию его экспрессии ЦК, но противоречит выводу о позитивном влиянии экзогенного гормона на экспрессию гена РАР5 у растений дикого типа. Следовательно, особенности регуляции и “разделение труда” между отдельными членами семейства АНК определяются не только их функциональной специфичностью, но и генетическим фоном.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Превращение этиопласта в хлоропласт, происходящее под действием на проросток различных факторов экзогенной и эндогенной природы, требует координированной экспрессии генов в ядре и пластидах. Вследствие этого большой интерес вызывает исследование молекулярных механизмов, обеспечивающих взаимодействие ядра и пластид в растительной клетке во время дифференцировки хлоропласта. Масштабная активация транскрипции в ходе деэтиоляции, вероятно, обеспечивается интеграцией на молекулярном уровне систем сигналинга света и фитогормонов. Особое место в контроле этих процессов занимают цитокинины.

В данной работе изучали ЦК- и светорегулируемую экспрессию генов аппарата транскрипции пластома при деэтиоляции как один из возможных механизмов реализации сигнала ЦК в пластидах на стадии их дифференцировки в хлоропласты. Исследование показало, что экспрессия генов NEP (RPOTp и RPOTmp) и NEP-зависимых генов коровых субъединиц PEP (rpoА, rpoВ, rpoС1, rpoС2) активировалась с существенной разницей во времени. Накопление транскриптов генов коровых субъединиц PEP происходило примерно с 13-часовым отставанием от генов NEP. Профиль активации транскрипции генов обоих типов полимераз являлся отражением роли продуктов этих генов в процессе реализации генетической информации пластид при дифференцировке хлоропласта. Активация генов NEP через 3 ч освещения этиолированных проростков объясняется преимущественно NEP-зависимой транскрипцией в ходе начального этапа, при которой преобладает экспрессии генов домашнего хозяйства” [17]. По мере созревания хлоропласта увеличивается активность PEP и запускается транскрипция генов фотосинтеза [12]. Интересно, что экзогенный цитокинин активировал накопление транскриптов NEP только в присутствии освещения на протяжении всего исследованного периода, начиная с 3 ч после начала деэтиоляции, тогда как накопление транскриптов основных субъединиц PEP возвращалось к исходному темновому” значению только через 6 ч и позже.

Такая последовательность увеличения экспрессии генов двух различных РНК-полимераз в процессе светозависимого превращения этиопласта в хлоропласт хорошо согласуется с ранее предложенной моделью разделения труда РНК-полимераз: вначале активна NEP, а по мере созревания хлоропласта начинает преобладать PEP [18]. В переключении активности пластидных полимераз может принимать участие PEP-зависимая tRNAGLU, которая обладает ингибирующим действием на активность NEP [12]. Вероятно, повышение уровня матриц rpo на поздних часах освещения приводит к свето-зависимому формированию минимального комплекса PEP и в дальнейшем способствует росту PEP-зависимой транскрипции пластома. Вместе с тем для активной транскрипции PEP-зависимых генов фотосинтеза необходимы кодируемые ядром РАР белки и сигма-факторы, обеспечивающие специфичность функционирования PEP и узнавания промоторных областей генов.

Полученные нами данные по влиянию света и цитокинина на деэтиоляцию проростков Arаbidopsis свидетельствуют о дифференциальной регуляции транс-факторов семейства SIG этими двумя факторами. Установлено, что по регуляции светом шесть генов SIG можно разделить на две группы. Первая включает гены SIG1, SIG2 и SIG5, транскрипция которых активировалась светом. Светозависимая экспрессия этих генов ранее была продемонстрирована Liere с соавт. [1]. Вторая группа содержит гены SIG3, SIG4 и SIG6, экспрессия которых не изменялась в ответ на свет. По регуляции цитокинином сигма-гены делились на активируемые цитокинином на свету (SIG2) и ингибируемые в ответ на гормон (SIG5), а также гены, экспрессия которых практически не изменялась (SIG1, SIG3, SIG4 и SIG6). Такой сложный характер регуляции, по-видимому, способствует дифференциальной экспрессии пластома при превращении этиопласта в хлоропласт. Известно, что, несмотря на их перекрывающиеся функции в контроле PEP-зависимой транскрипции пластома, индивидуальные сигма-факторы обладают вариабельным регуляторным N-концом, обеспечивающий “разделение труда” между отдельными членами семейства [19]. Так, например, промоторы генов psbA (D1 белок реакционного центра ФСII) и rbcL (большая субъединица РБФК) узнаются SIG2 при раннем начальном развитии проростка, а стресс-индуцируемый SIG5 необходим для активации транскрипции оперона psbD (D2 белок реакционного центра ФСII) с промотора BLRP (Blue Light Responsive Promoter) [20, 21].

Активация гена SIG2 и подавление гена SIG5 при ЦК-зависимой деэтиоляции соответствовала результатам анализа экспрессии этих генов у растений, выращенных на свету [22]. Интересно, что видимый рост уровня транскриптов стресс-индуцируемого гена SIG5 по сравнению с “темновым” вариантом существенно уступал уровню светозависимой индукции и свидетельствовал об ингибирующем влиянии экзогенного ЦК. Подобное воздействие ЦК на ген SIG5 объясняется участием SIG5 в защитной реакции на фотоокислительный стресс, сопровождающий деэтиоляцию. Возможно, экзогенный цитокинин ограничивает окислительное повреждение, вызванное свободными фотоактивными пигментами при деэтиоляции и частично снижает стресс [23], уменьшая при этом экспрессию гена SIG5. С фотоокислительным стрессом, по-видимому, связано падение экспрессии целого ряда генов аппарата транскрипции в первые часы деэтиоляции. Такое падение может быть обусловлено корректировкой энергетического гомеостаза и реорганизацией транскрипционно-трансляционного аппарата в стрессовых условиях [24, 25].

Регуляция экспрессии ядерных и хлоропластных генов при деэтиоляции обеспечивается прямым участием компонентов цепи трансдукции сигнала ЦК. Результаты нашей работы продемонстрировали снижение уровня свето- и гормонзависимой активации экспрессии генов RPOTp и RPOTmp у мутантов по рецепторам ЦК и тройного мутанта по транс-факторам типа B. При этом активация экспрессии генов NEP светом и ЦК происходила главным образом за счет функционирования рецепторов AHK3 и AHK4. В пользу этого предположения свидетельствуют данные об активации экспрессии этих генов у проростков дикого типа и снижение реакции на свет и цитокинин у мутантов с инактивированными генами AHK3 и AHK4. В светозависимой регуляции экспрессии гена сигма-фактора SIG2 доминировал рецептор AHK4, а в ЦК-зависимой – AHK3. Экспрессия гена SIG5 почти не зависела от генотипа мутантов по рецепторам ЦК на свету, но изменялась у мутанта по генам-регуляторам ответа на этот гормон, тогда как ЦК-зависимая экспрессия гена SIG5 определялась индивидуальным вкладом всех трех рецепторов цитокинина.

Таким образом, анализ действия экзогенного цитокинина на мутантные линии показал, что влияние этого фитогормона на гены аппарата транскрипции определяется дифференциальным функционированием индивидуальных рецепторов и транскрипционных факторов. Этот вывод был сделан на основании сниженного ответа мутантов на гормон по сравнению с диким типом в опытах по цитокинин-зависимой деэтиоляции проростков. По способности контролировать транскрипционные изменения в экспрессии генов хлоропластных белков пластидного и ядерного кодирования рецепторы ЦК можно расположить в следующем порядке: АНК3 > AHK4 > АНК2. Регуляторы ответа оказались также чрезвычайно важны для гормонзависимой экспрессии генов аппарата транскрипции пластома Arabidopsis, которая лежит в основе морфогенетических изменений этиопластов при их трансформации в хлоропласты.

Механизмы регуляции, посредством которых мембранные рецепторы цитокининов участвуют в контроле биогенеза хлоропластов, могут быть различными. Наряду с изменением скорости транскрипции хлоропластных генов, компоненты сигналинга ЦК могли стабилизировать при участии РНК-полимераз уровень индивидуальных транскриптов. Изменение уровня транскриптов хлоропластных генов у мутантов по сигналингу ЦК при деэтиоляции могло объясняться также изменением содержания в проростках мутантных растений эндогенных цитокининов или соотношения цитокининов и других фитогормонов и трофических метаболитов и/или чувствительности к ним.

Цитокинины способны выступать посредниками в светорегулируемых процессах. Ряд исследований продемонстрировали существование интеграции систем сигналинга света и цитокининов на молекулярном уровне. Так, например, ЦК-зависимый транс-фактор ARR4 стабилизирует активную форму фитохрома в ядре [26]. О сложности взаимодействия света и цитокинина говорит также синергический эффект в действии этих факторов на уровень транскриптов большинства изученных генов у растений дикого типа (рис. 8, все гены, кроме SIG2). Синергический эффект предполагает наличие общих этапов в действии цитокинина и света. Это подтверждается нашими данными, которые убедительно показали, что свет и ЦК, по крайней мере, в регуляции экспрессии хлоропластного гена ядерного кодирования ATPC, действуют через один и тот же цис-элемент и, возможно, с участием одних и тех же транс-факторов [27].

В трансдукции светового сигнала ключевую роль играет COP1-зависимый протеолиз светорегулируемых транскрипционных факторов. В условиях темноты белок COP1 участвует в протеолизе светорегулируемых транс-факторов и подавляет экспрессию генов позитивных регуляторов фотоморфогенеза, таких как HY5, LAF1, HFR1, LZF1 [28]. Цитокинин способен снижать содержание белка COP1, косвенно приводя к стабилизации белка HY5 – одного из позитивных регуляторов фотоморфогенеза [29]. Наряду с COP1-зависимым путем деградации светорегулируемых транскрипционных факторов существует COP1-независимый путь, в котором принимает участие белок HEMERA/pTAC12/РАР5. Этот белок с двойной локализацией осуществляет протеолиз транскрипционных факторов PIF1 и PIF3 в составе фитохромных ядерных телец, что является важным этапом при переходе от скотоморфогенеза к фотоморфогенезу, и одновременно участвует в формировании РЕР комплекса в хлоропластах, активируя транскрипцию генов фотосинтеза [13, 28]. Экспрессия РАР5 усиливалась под действием света и цитокинина у проростков дикого типа и подавлялась у мутанта с нокаутированными генами регуляторов ответа на цитокинин (рис. 6, 8), что предполагает позитивную регуляцию РАР5 цитокинином. Однако линии с инактивированными рецепторами АНК2 и АНК3 (рис. 8) отличались более высокими уровнями транскриптов этого гена по сравнению с проростками дикого типа. т.е. особенности регуляции гена РАР5 определялись генетическим фоном. Это может быть отчасти связано с повышенной концентрацией эндогенных цитокининов у мутантов по рецепторам [9], способной компенсировать ослабление аппарата их рецепции. Снижение цитокининового сигналинга могло также компенсироваться сигналингом других сенсорных гистидинкиназ (CKI1 или ETR) или усилением чувствительности к гормону [30]. Таким образом, нарушение цитокининового гомеостаза спровоцировало изменение обратных связей, регулирующих ЦК-зависимую экспрессию гена РАР5, однако точные молекулярные механизмы этого процесса пока не ясны.

В целом наши исследования показали важную роль сигнального пути цитокинина в контроле развития хлоропластов при деэтиоляции, который осуществляется непосредственной регуляцией экспрессии генов аппарата транскрипции пластома. При этом позитивный эффект цитокинина на процесс деэтиоляции реализуется главным образом благодаря функционированию рецепторов АНК3 и АНК4, а также генов регуляторов ответа АRR1, АRR 10 и ARR 12.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента Российской Федерации № МК-1908.2017.4 и проекта Российского фонда фундаментальных исследований № 17-04-00301.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Liere K., Weihe A., Börner T. The transcription machineries of plant mitochondria and chloroplasts: Composition, function, and regulation // J. Plant Physiol. 2011. V. 168. P. 1345−1360.
  2. Pogson B.J., Ganguly D., Albrecht-Borth V. Insights into chloroplast biogenesis and development // Biochim Biophys Acta. 2015. V. 1847. P. 1017−1024.
  3. Jarvis P., López-Juez E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013. V. 14. P. 787−802.
  4. Ma L., Li J., Qu L., Hager J., Chen Z., Zhao H., Deng X.W. Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways // Plant Cell. 2001. V. 13. P. 2589−2607.
  5. Chen M., Galvão R.M., Li M., Burger B., Bugea J., Bolado J., Chory J. Arabidopsis HEMERA/pTAC12 initiates photomorphogenesis by phytochromes // Cell. 2010. V. 141. P. 1230−1240.
  6. Cortleven A., Marg I., Yamburenko M.V., Schlicke H., Hill K., Grimm B., Schaller G.E., Schmülling T. Cytokinin regulates etioplast-chloroplast transition through activation of chloroplast- related genes // Plant Physiol. 2016. V. 172. P. 464−478.
  7. Chory J., Reinecke D., Sim S., Washburn T., Brenner M. A role for cytokinins in de-etiolation in Arabidopsis // Plant Physiol. 1994. V. 104. P. 339−347.
  8. Kusnetsov V.V., Oelmüller R., Sarwat M.I., Porfirova S.A., Cherepneva G.N., Herrmann R.G., Kulaeva O.N. Cytokinins, abscisic acid and light affect the accumulation of chloroplast proteins in lupinus luteus cotyledons without notable effect on steady state mRNA levels // Planta. 1994. V. 194. P. 318–327.
  9. Riefler M., Novak O., Strnad M., Schmülling T. Arabidopsis cytokinin receptor mutants reveal functions in shoot growth, leaf senescence, seed size, germination, root development and cytokinin metabolism // Plant Cell. 2006. V. 18. P. 40–54.
  10. Дорошенко А.С., Данилова М.Н., Кудрякова Н.В., Соловьев А.А., Кузнецов В.В. Мембранные рецепторы цитокинина участвуют в регуляции экспрессии пластидного генома в процессе темнового развития растений // Доклады Академии наук. 2016. Т. 469. С. 631−634.
  11. Lysenko E.A. Plant sigma factors and their role in plastid transcription // Plant Cell Rep. 2007. V. 26. P. 845–859.
  12. Börner T., Aleynikova A.Y., Zubo Y.O., Kusnetsov V.V. Chloroplast RNA polymerases: Role in chloroplast biogenesis // Biochim. Biophys. Acta. 2015. V. 1847. P. 761−769.
  13. Pfannschmidt T., Blanvillain R., Merendino L., Courtois F., Chevalier F., Liebers M., Grübler B., Hommel E., Lerbs-Mache S. Plastid RNA polymerases: orchestration of enzymes with different evolutionary origins controls chloroplast biogenesis during the plant life cycle // J. Exp. Bot. 2015. V. 66. P. 6957−6973.
  14. Lichtenthaler H.K. Chlorophylls and Carotenoids: Pigments of Photosynthetic Biomembranes // Methods in Enzymology. 1987. V. 148. P. 350−382.
  15. Danilova M.N., Kudryakova N.V., Doroshenko A.S., Zabrodin D.A., Rakhmankulova Z.F., Oelmüller R., Kusnetsov V.V. Opposite roles of the Arabidopsis cytokinin receptors AHK2 and AHK3 in the expression of plastid genes and genes for the plastid transcriptional machinery during senescence // Plant Mol. Biol. 2017. V. 93. P. 533−546.
  16. Lomin S.N., Krivosheev D.M., Steklov M.Y., Osolodkin D.I., Romanov G.A. Receptor properties and features of cytokinin signaling // Acta Naturae. 2012. V. 4. P. 31−45.
  17. Hajdukiewicz P.T., Allison L.A., Maliga P. The two RNA polymerases encoded by the nuclear and the plastid compartments transcribe distinct groups of genes in tobacco plastids // EMBO J. 1997. V. 16. P. 4041−4048.
  18. Zoschke R., Liere K., Börner T. From seedling to mature plant: Arabidopsis plastidial genome copy number, RNA accumulation and transcription are differentially regulated during leaf development // Plant J. 2007. V. 50. P. 710−722.
  19. Ortelt J., Link G. Plastid gene transcription: promoters and RNA polymerases // Methods Mol. Biol. 2014. V. 1132. P. 47−72.
  20. Lerbs-Mache S. Function of plastid sigma factors in higher plants: regulation of gene expression or just preservation of constitutive transcription? // Plant Mol. Biol. 2011. V. 76. P. 235–249.
  21. Nagashima A., Hanaoka M., Shikanai T., Fujiwara M., Kanamaru K., Takahashi H., Tanaka K. The multiple-stress responsive plastid sigma factor, SIG5, directs activationof the psbD blue light-responsive promoter (BLRP) in Arabidopsis thaliana // PlantCell Physiol. 2004. V. 45. P. 357−368.
  22. Данилова М.Н., Дорошенко А.С., Забродин Д.А., Кудрякова Н.В.,.Оельмюллер Р., Кузнецов В.В. Мембранные рецепторы цитокинина регулируют накопление транскриптов хлоропластных генов // Физиология растений. 2017. Т. 64. С. 163−172.
  23. Cortleven A., Nitschke S., Klaumünzer M., Abdelgawad H., Asard H., Grimm B., Riefler M., Schmülling T. A novel protective function for cytokinin in the light stress response is mediated by the Arabidopsis histidine kinase2 and Arabidopsis histidine kinase3 receptors // Plant Physiol. 2014. V. 164. P. 1470−1483.
  24. Caldana C., Degenkolbe T., Cuadros-Inostroza A., Klie S., Sulpice R., Leisse A., Steinhauser D., Fernie A.R., Willmitzer L., Hannah M.A. High-density kinetic analysis of the metabolomic and transcriptomic response of Arabidopsis to eight environmental conditions // Plant J. 2011. V. 67. P. 869−884.
  25. Cramer G.R., Urano K., Delrot S., Pezzotti M., Shinozaki K. Effects of abiotic stress on plants: a systems biology perspective // BMC Plant Biol. 2011. V. 11. doi: 10.1186/1471-2229-11-163.
  26. Sweere U., Eichenberg K., Mira-Rodado V., Baurle I., Kudla J., Nagy F., Schafer E., Harter K. Interaction of the response regulator ARR4 with phytochrome B in modulating red light signaling // Science. 2001. V. 294. P. 1108−1111.
  27. Kusnetsov V., Landsberger M., Meuer J., Oelmuller R. The assembly of the CAAT-box binding complex at the AtpC promoter is regulated by light, cytokinin and the stage of the plastids // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 36009−36014.
  28. Смирнова О.Г., Степаненко И.Л., Шумный В.К. Механизм действия и регуляция активности конститутивного репрессора фотоморфогенеза cop1 // Физиология растений. 2012. Т. 59. С. 179−191.
  29. Vandenbussche F., Habricot Y., Condiff A.S., Maldiney R., Van Der Straeten D., Ahmad M. HY5 is a point of convergence between cryptochrome and cytokinin signaling pathways in Arabidopsis thaliana // Plant J. 2007. V. 49. P. 428–441.
  30. Романов Г.А. Как цитокинины действуют на клетку // Физиология растений. 2009. Т. 56. С. 295−319.

Подписи к рисункам.

Рис. 1. Влияние цитокинина и света на содержание транскриптов маркерных генов ответа на свет – LHCB2.4 (а) и цитокинин – ARR4 (б) в 4-дневных этиолированных проростках Arabidopsis дикого типа. 1 – 0 мкМ транс-зеатина, 2 – 1 мкМ транс-зеатина. Изменение уровня транскриптов всех опытных вариантов нормализовано относительно уровня транскриптов варианта дикого типа, выращенного в темноте без гормона. * достоверные различия между средними значениями экспрессии на свету без цитокинина vs экспрессии в темноте без цитокинина при p ≤ 0.05, ** при p ≤ 0.01. # – достоверные различия между средними значениями экспрессии с гормоном vs экспрессии без гормона при p ≤ 0.05, ## при p ≤ 0.01.

Рис. 2. Влияние цитокинина и света на содержание транскриптов генов рецепторов цитокинина AHK3 (а) и AHK4 (б) в 4-дневных этиолированных проростках Arabidopsis дикого типа. 1 – 0 мкМ транс-зеатина, 2 – 1 мкМ транс-зеатина. Изменение уровня транскриптов всех опытных вариантов нормализовано относительно уровня транскриптов варианта дикого типа, выращенного в темноте без гормона. * достоверные различия между средними значениями экспрессии на свету без цитокинина vs экспрессии в темноте без цитокинина при p ≤ 0.05, ** при p ≤ 0.01. # – достоверные различия между средними значениями экспрессии с гормоном vs экспрессии без гормона при p ≤ 0.05, ## при p ≤ 0.01.

Рис. 3. Влияние цитокинина и света на содержание транскриптов ядерных генов моносубъединичных РНК-полимераз RPOTp (а) и RPOTmp (б) в 4-дневных этиолированных проростках Arabidopsis дикого типа. 1 – 0 мкМ транс-зеатина, 2 – 1 мкМ транс-зеатина. Изменение уровня транскриптов всех опытных вариантов нормализовано относительно уровня транскриптов варианта дикого типа, выращенного в темноте без гормона. * достоверные различия между средними значениями экспрессии на свету без цитокинина vs экспрессии в темноте без цитокинина при p ≤ 0.05, ** при p ≤ 0.01. # достоверные различия между средними значениями экспрессии с гормоном vs экспрессии без гормона при p ≤ 0.05, ## при p ≤ 0.01.

Рис. 4. Влияние цитокинина и света на содержание транскриптов хлоропластных генов коровых субъединиц РНК-полимеразы PEPrpoА (а), rpoB (б), rpoC1 (в) и rpoС2 (г) в 4-х дневных этиолированных проростках Arabidopsis дикого типа. 1 – 0 мкМ транс-зеатина, 2 – 1 мкМ транс-зеатина. Изменение уровня транскриптов всех опытных вариантов нормализовано относительно уровня транскриптов варианта дикого типа, выращенного в темноте без гормона. * достоверные различия между средними значениями экспрессии на свету без цитокинина vs экспрессии в темноте без цитокинина при p ≤ 0.05, ** при p ≤ 0.01. # – достоверные различия между средними значениями экспрессии с гормоном vs экспрессии без гормона при p ≤ 0.05, ## при p ≤ 0.01.

Рис. 5. Влияние цитокинина и света на содержание транскриптов ядерных генов транс-факторов мультисубъединичной РНК-полимеразы пластид – SIG1 (а), SIG2 (б), SIG5 (в) и SIG6 (г) в 4-дневных этиолированных проростках Arabidopsis дикого типа. 1 – 0 мкМ транс-зеатина, 2 – 1 мкМ транс-зеатина. Изменение уровня транскриптов всех опытных вариантов нормализовано относительно уровня транскриптов варианта дикого типа, выращенного в темноте без гормона. * достоверные различия между средними значениями экспрессии на свету без цитокинина vs экспрессии в темноте без цитокинина при p ≤ 0.05, ** при p ≤0.01. # – достоверные различия между средними значениями экспрессии с гормоном vs экспрессии без гормона при p ≤ 0.05, ## при p ≤ 0.01.

Рис. 6. Влияние цитокинина и света на уровень транскриптов гена PAP5 в 4-дневных этиолированных проростках Arabidopsis дикого типа. 1 – 0 мкМ транс-зеатина, 2 – 1 мкМ транс-зеатина. Изменение уровня транскриптов всех опытных вариантов нормализовано относительно уровня транскриптов варианта дикого типа, выращенного в темноте без гормона. * достоверные различия между средними значениями экспрессии на свету без цитокинина vs экспрессии в темноте без цитокинина при p ≤ 0.05, ** при p ≤ 0.01. # – достоверные различия между средними значениями экспрессии с гормоном vs экспрессии без гормона при p ≤ 0.05, ## при p ≤ 0.01.

Рис. 7. Внешний вид (а) и длина гипокотилей (б) 4-дневных этиолированных проростков Arabidopsis дикого типа и нокаут-мутантов по сигналингу цитокининов. 1 – 0 мкМ транс-зеатина, 2 – 1 мкМ транс-зеатина. * достоверные различия между средними значениями длины гипокотилей проростков мутантов, выращенных с гормоном vs значений длины гипокотилей проростков дикого типа, выращенных с гормоном при p ≤ 0.05, ** при p ≤ 0.01.

Рис. 8. Влияние цитокинина и света на содержание транскриптов LHCB2.4 (а), ARR4 (б), RPOTp (в), RPOTmp (г), SIG2 (д), SIG5 (е) и PAP5 (ж) в 4-дневных этиолированных проростках Arabidopsis дикого типа и нокаут-мутантах по генам сигналинга цитокинина после 6 ч освещения. 1 – темнота без гормона, 2 – темнота + 1 мкМ транс-зеатина; 3 – освещение без гормона, 4 – освещение + 1 мкМ транс-зеатина. Изменение уровня транскриптов всех опытных вариантов нормализовано относительно уровня транскриптов варианта дикого типа, выращенного в темноте без гормона. достоверные различия между средними значениями экспрессии у мутантов в темноте с цитокинином vs экспрессии у дикого типа в темноте с цитокинином при p ≤ 0.05, ●● при p ≤ 0.01; * достоверные различия между средними значениями экспрессии у мутантов на свету vs экспрессии у дикого типа на свету при p ≤ 0.05, ** при p ≤ 0.01; # – достоверные различия между средними значениями экспрессии у мутантов на свету с цитокинином vs экспрессии у дикого типа на свету с цитокинином при p ≤ 0.05, ## при p ≤ 0.01.