УДК 581.1.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КАРТИРОВАНИЕ QTL У ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ (Triticum aestivum L.) В КОНТРОЛИРУЕМЫХ УСЛОВИЯХ АГРОЭКОБИОПОЛИГОНА В ОТСУТСТВИИ И ПРИ ВНЕСЕНИИ АЗОТНОГО УДОБРЕНИЯ

© 2018 г. Ю. В. Чесноковa, 1,  Г. В. Мирскаяa, Е. В. Канашa, Н. В. Кочеринаb,
Д. В. Русаковa, У. Ловассерc, А. Бёрнерc

a Федеральное государственное бюджетное научное учреждение
“Агрофизический научно-исследовательский институт”, Санкт-Петербург, Россия
b Федеральное государственное бюджетное научное учреждение “Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова”, Санкт-Петербург, Россия
c Лейбниц-Институт генетики растений и исследования возделываемых культур,
Гатерслебен, Штадт Зееланд, Германия

Поступила в редакцию 16.01.2017 г.

В двух одновременно проведенных независимых экспериментах, на разных агрофонах по азоту (в отсутствии и при внесении минерального азотного удобрения), для установления эффектов физиолого-генетического взаимодействия “генотип-среда” проведено картирование локусов количественных признаков (QTL от quantitative trait loci) хозяйственно ценных признаков у яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.), проявляющих себя в контролируемых условиях регулируемой агроэкосистемы биополигона. Всего идентифицировано 94 QTL, определяющих проявление 31 физиологически и агрономически значимого признака. Установлена достоверность взаимосвязи между идентифицированными локусами хромосом и полиморфизмом по тому или иному признаку. Корреляционный и однофакторный дисперсионный анализы позволили определить характер сопряженности связи между признаками и внесением азотного удобрения. По результатам QTL, корреляционного и однофакторного дисперсионного анализов было установлено, что из 31 признака 15 статистически значимо варьировали, указывая на то, что их проявление зависит от того вносилось или нет азотное удобрение. Полученные результаты представляют интерес для последующего изучения физиолого-генетических механизмов реализации оцененных во взаимодействии “генотип-среда” признаков и для проведения маркер-опосредованной селекции у пшеницы.

Ключевые слова: Triticum aestivum  азотные удобрения  физиологически и агрономически значимые признаки  картирование QTL  контролируемые условия агроэкобиополигона  взаимодействие “генотип-среда”
______________________
Сокращения: ВОУ  вегетационные облучательные установки; РИЛ  рекомбинантные инбредные линии; сМ – сантиморганида; ITMI  Международная инициатива картирования Triticeae (от International Triticeae Mapping Initiative); LOD  логарифм шансов (от logarithm of odds); QTL  локус количественных признаков (от Quantitative Trait Loci).
1Адрес для корреспонденции: Чесноков Юрий Валентинович. 195220 Санкт-Петербург, Гражданский просп., 14, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение “Агрофизический научно-исследовательский институт”. Электронная почта: yuv_chesnokov@agrophys.ru
ВВЕДЕНИЕ
Пшеница (Triticum aestivum L.) − один из самых распространенных хозяйственно ценных видов растений по всему миру, является важнейшим источником белков и углеводов в питании человека. Азотные удобрения – критический элемент для повышения продуктивности и получения высоких урожаев зерна пшеницы, а также высокого содержания в нем белка. Согласно прогнозам IFA (International Fertilizer Industry Association) и FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations), мировая потребность в минеральных удобрениях достигнет к 2018 г. 200.5 млн. тонн [1]. Спрос на азотные удобрения, как ожидается, будет расти на 1.4 – 1.5% в год, достигая годового потребления в отдельных регионах мира более 1 млн. тонн [2], но при этом варьировать в зависимости от изменчивости климата и изменения цен на рынке. В этой связи, увеличение эффективности усвоения азотных удобрений для получения высокой продуктивности у пшеницы стало одной из основных целей для селекционеров. Эффективность усвоения азотных удобрений – сложный признак, контролируемый множеством генов, который зависит от взаимодействия “генотип-среда”. Определение влияния азотных удобрений на различные генотипы, является одним из наиболее перспективных подходов для достижения высокой продуктивности у растений [3]. Для улучшения свойств потребления азотных удобрений, в дополнение к условиям и количествам вносимых удобрений, необходимо принимать во внимание не только генотип культуры, но и эффекты действия окружающей среды, а также взаимодействие этих трех факторов [4].
Картирование локусов количественных признаков (QTL) предоставляет возможность выявления генетического контроля количественных признаков и генов, контролирующих сложные признаки. Целый ряд QTL был идентифицирован при низких и высоких дозах азотного питания в различных условиях выращивания. Например, у пшеницы были выявлены QTL как в контролируемых [5–7], так и в полевых условиях [8–10]. В работе международной группы исследователей [6] была предпринята попытка картирования QTL для 21 признака, связанных с ростом, урожайностью и ассимиляцией листьями азота при формировании зерна у гексаплиодной пшеницы, используя для этих целей картирующую популяцию, полученную в результате скрещивания Chinese Spring и SQ1 (селекционная линия, высоко экспрессирующая абсцизовую кислоту). В результате на хромосомах 2A, 4A и 6B выявили основные QTL, определяющие активность глутаминсинтетазы, число колосков в колосе, число цветков, число зерен и урожайность растений. Китайские ученые [11] провели картирование QTL урожайности и связанных с потреблением азота признаков у пшеницы и выявили на хромосомах 2D, 4B, 4D, 5A (2), 6A и 7A локусы, демонстрирующие существенную связь признаков зерна и проростков с концентрацией азота, а также эффективность использования азота. Несколько ранее французские исследователи [12] идентифицировали 54 района расположенных почти на всех хромосомах, влияющих на урожай и его компоненты, высоту растений, время колошения и концентрацию белка в зерне. Эти участки хромосом были предложены для использования в селекционных программах по улучшению существующих сортов пшеницы, адаптированных для усвоения современных азотных удобрений [13] и как источник для позиционного клонирования генов, вовлеченных в эффективное использование азотных удобрений.
В вегетационном опыте, выполненном в полевых условиях была проведена идентификация и хромосомное картирование локусов, отвечающих за экспрессию значимых физиолого-агрономических признаков, проявление которых зависит от эффективности поглощения вносимого в почву минерального азота [27]. Было продемонстрировано, что активность генетических детерминант, определяющих проявление физиолого-агрономических признаков, зависит от вносимой дозы минерального азота (нитратная и аммонийная формы азота). Эксперимент был реализован в полевых условиях Ленинградской области в 2009 году, характеризующимся нестабильными погодными условиями, что не позволяет исключить влияние перепадов температуры, неравномерного выпадения осадков и варьирования влажности почвы на локализацию QTL признаков, связанных с морфофизиологическими особенностями, темпами роста и продуктивностью растений пшеницы [27]. Однако все эти и иные опубликованные работы, не позволяют выполнить “тонкое” картирование локусов хромосом, вовлеченных в потребление азотных условий в различных условиях окружающей среды. Такую возможность предоставляет агроэкобиополигон со строго контролируемыми условиями выращивания растений [14]. В отличие от упомянутых выше работ [5–7], в которых контролируемые условия представляли собой либо гидропонную культуру, либо теплицы, агроэкобиополигон является изолированными от солнечного света и иного внешнего воздействия специализированными вегетационными помещениями [14]. Агроэкобиополигон оснащен системами строгого контроля и регуляции микроклимата и соответствующим вегетационно-облучательным оборудованием различного типа для круглогодичного интенсивного выращивания растений различной высоты (последнее особенно важно для работы с сельскохозяйственными культурами), а также аппаратурой для дистанционной и контактной диагностики физиологического и морфо-биологического состояния вегетирующих растений. Это позволяет проводить в строго контролируемых условиях регулируемой агроэкосистемы биополигона физиолого-генетические эксперименты с большим количеством растений, как в отдельных вегетационных сосудах, так и на специализированных наполненных торфогрунтом стеллажах, что выгодно отличает его как от гидропонной культуры, так и от различного рода теплиц, включая так называемые “феномикс-теплицы” [14]. Однако до сих не было проведено ни одного исследования, в котором проводилось бы выявление генетических детерминант, определяющих проявление количественных признаков, ответственных за поглощение и эффективность использования азотных удобрений в контролируемых условиях агроэкобиоплогона.
Целью настоящей работы было выявление количества и установление точной локализации QTL, вовлеченных в физиолого-генетический процесс реализации сложных агрономически важных признаков у яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.), проявляющих себя в контролируемых условиях регулируемой агроэкосистемы биополигона в отсутствии и при внесении азотного удобрения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. В качестве материала для исследований использовали рекомбинантные инбредные линии (РИЛ) картирующей популяции Международной инициативы картирования Triticeae (ITMI от International Triticeae Mapping Initiative) яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.). Картирующая популяция ITMI была создана путем опыления яровой мягкой пшеницы Triticum aestivum L. сорта Opata 85 пыльцой синтетического гексаплоида W7984, представляющего собой амфидиплоид, полученный скрещиванием Aegilops tauschii Coss. образец CIGM86.940 (DD) (мужской родитель) и тетраплоидной пшеницы T. turgidum var. durum сорта Altar 84 (ААВВ) (женский родитель), как это описано нами ранее [14–16].
Условия выращивания. Выращивание и оценку рекомбинатных инбредных линий ITMI проводили в условиях регулируемой агроэкосистемы биополигона ФГБНУ “Агрофизический научно-исследовательский институт” (АФИ) [14]. Изучение 114 линий картирующей популяции ITMI и их родительских форм Opata 85 и синтетического гексаплоида W7984 осуществляли в вегетационных облучательных установках (ВОУ), оснащенных лампами ДНаТ-400, дающих заданную облученность. Установки расположены в капитальном стационарном помещении, изолированном от естественного света, снабженном отопительной системой и приточно-вытяжной вентиляцией. При культивировании растений основные параметры жизнеобеспечения поддерживались на постоянном уровне. Температурный режим поддерживался на уровне 25–26ºC – день / 20–21ºC ночь. Фотопериодический режим включал 16-ти часовое ежесуточное освещение. Температурный и фотопериодический режимы выращивания растений подбирали по принципу создания условий нивелирующих различия исследуемых образцов по генетическим системам, определяющим реакцию на данные факторы. Облученность на уровне верхних листьев составляла 50 ± 0.5 Вт/м2 ФАР, по мере роста растений облученность ФАР корректировалась посредством изменения расстояния между светильниками и растениями и поддерживалась постоянной в течение всей вегетации. Растения выращивали в вегетационных сосудах объемом 2 л. В каждый сосуд высаживали по два растения, из расчета 100 растений на 1 м2. Повторность для каждой линии и каждой родительской формы – 2-кратная.
В опыте использовали дерново-подзолистую легко суглинистую почву с содержанием подвижного фосфора 198 мг/кг (ГОСТ Р 54650-2011), подвижного калия 112 мг/кг (ГОСТ Р 546650-2011), нитратного азота 18.2 мг/кг (ГОСТ 26951-86), аммонийного азота 34.6 мг/кг (ГОСТ 26489-85). В связи с повышенным содержанием в почве подвижного фосфора и калия дополнительного внесения этих макроэлементов не проводили. Опыт включал два варианта, отличающихся по уровню азотного питания. В первом (низкий уровень) – азотные удобрения во время вегетации растений не вносили, во втором (высокий уровень) – выполнена 2-кратная подкормка мочевиной (ГОСТ 2081-2010) перед посевом и в фазу онтогенеза “выход в трубку”. Всего в два приема при дополнительном удобрении внесено 0.321 мг мочевины на кг почвы. На протяжении всего периода вегетации растений влажность почвы поддерживали на оптимальном для пшеницы уровне 70−80% от полной влагоемкости при ежедневном поливе водой. Фенологические наблюдения проводили один раз в двое суток, а во время основных онтогенетических фаз – ежедневно. При завершении вегетационных опытов для каждого индивидуального растения определяли основные показатели продуктивности.
Анализ признаков. Анализ признаков проводили по принятым в ФГБНУ “Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова” (ВИР) методикам, как это было описано ранее [14–16]. При проведении экспериментов рассматривали только те признаки, которые проявляли достаточную для проведения оценки экспрессивность. Всего анализировали 31 признак, проявлявшийся на протяжении всего периода вегетации (табл. 1).
Статистический анализ. QTL-анализ был выполнен с помощью компьютерной программы MAPMAKER/QTL. Поскольку настоящая программа проводит вычисления, используя математическую формулу, выведенную J.B.S. Haldane [17], то данные по картированию, опубликованные в базе данных GrainGenes (gopher:http://www.greengenes.cit.cornell.edu), были использованы для пересчета расстояний на карте с помощью программы MAPMAKER/EXP 3.0 [18]. Полученные данные по фенотипическому анализу интегрировали в существующую базовую карту, созданную для популяции ITMI [19]. Идентификацию и локализацию на группах сцепления выполняли с помощью программы QGENE, как это было описано ранее [14, 20], при этом использовали только те маркеры, которые соответствовали функции картирования по D.D. Kosambi [21], учитывающей интерференцию.
Достоверность взаимосвязи между выявленными локусами и полиморфизмом по тому или иному признаку оценивали на основе порогового значения отношения правдоподобия логарифма шансов – LOD оценка (от logarithm of odds) [14, 22, 23]. Для каждого признака в каждом эксперименте проводился отдельный QTL-анализ и устанавливались степени варьирования признаков (R2), которые объясняются данным QTL. Значимость каждого LOD была установлена тестом пермутации (1000 повторений). Во внимание принимались только локусы с LOD ≥ 3.0 (p < 0.001), 2 < LOD < 3 (p < 0.01) и 1.5 < LOD < 2 (p < 0.1) [14, 15].
Для определения характера сопряженности между каждым из признаков и внесением азотного удобрения производили расчет коэффициентов корреляции rxy. Отношение rxy к своей ошибке служило критерием для проверки значимости (t-критерий Стьюдента) [24]. Для комплексной оценки сравниваемых средних значений признаков, определявшихся в разных условиях произрастания, применяли дисперсионный анализ с расчетом показателей варьирования, в частности средних квадратов отклонений, их дисперсионного отношения F, а также оценивали значимость результатов [25]. Значение p < 0.05 считали приемлемой границей статистической значимости, поскольку этот уровень включает вероятность ошибки 5%. Результаты, значимые на уровне p < 0.01, рассматривали как статистически значимые, а результаты с уровнем p < 0.001 – как высоко значимые. Все значения рассчитывали с использованием компьютерной программы STATISTICA 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ
В результате проведенных исследований было установлено, что варьирование проявления агрономически значимых признаков в строго контролируемых условиях агроэкобиополигона у одних и тех же генотипов линий картирующей популяции ITMI по некоторым параметрам QTL анализа было существенным и зависело от того производилась или не производилась подкормка растений пшеницы азотными удобрениями (табл. 1). Так, например, продолжительность периодов “всходы−выход в трубку”, “всходы−колошение”, “всходы−цветение” и “всходы−созревание” варьировало в зависимости от того производилось или не производилось внесение азотных удобрений. Следует отметить, что внесение удобрений было проведено дважды – первый раз удобрение было предпосевным, а во второй раз подкормка азотом была выполнена в фазу онтогенеза выход в трубку. Как видно из полученных данных, внесение удобрений сказалось на выявлении локализации идентифицированных QTL, определяющих эти четыре физиологически важных признака роста растений. Характерно, что QTL, определяющие периоды “всходы−выход в трубку”, “всходы−колошение” и “всходы–цветение” до подкормки азотом были выявлены на хромосоме 5А строго в позиции 89.0 сантиморганид (сМ), а после внесения удобрения на хромосоме 5D (130.8 сМ) в случае признака “всходы−выход в трубку” и на хромосоме 2D, в случае признаков “всходы−колошение” и “всходы–цветение” (оба в одной позиции – 266.5 сМ). Для признака продолжительности периода “всходы−созревание” QTL, определяющий этот признак, в случае эксперимента без внесения азотного удобрения, был идентифицирован на хромосоме 2D, что характерно в позиции 266.5 сМ, а при внесении азотного удобрения на хромосоме 7А (239.6 сМ). Все четыре признака проявляли высокую степень достоверности своей идентификации – LOD оценка варьировала в эксперименте без внесения азотного удобрения от 3.09 до 5.78, а в эксперименте с подкормкой азотным удобрением – от 2.36 до 3.38.
Признак “высота растений” в проведенных экспериментах показал нестабильность своего проявления. Так в варианте без азотного удобрения данный признак определялся QTL, располагавшимися на группах сцепления 3А и 6D, а в опыте с добавлением азотного удобрения – на 5А и 7D. Процент фенотипического проявления признака в эксперименте без внесения азотного удобрения достигал 22.18, а в эксперименте с внесением азотного удобрения – 15.60. Признаки “длины верхнего междоузлия”, “размера стеблевого узла”, “длины и ширины флагового листа”, также как и связанный с ними признак “высота растений”, проявили нестабильность локализации идентифицированных для каждого из данных признаков QTL. Варьирование LOD оценки для этих признаков в эксперименте без подкормки азотным удобрением составило от 2.14 до 3.16, а в эксперименте с подкормкой – от 2.15 до 3.64.
Интересный результат был получен для признака “опушение флагового листа”. В обоих экспериментах выявленные QTL располагались на хромосоме 4В, но в разных ее областях. Так в опыте без подкормки азотным удобрением локализации была выявлена почти в самом начале группы сцепления в позиции 40.2 сМ, а в опыте с внесением азотного удобрения на 71.2 сМ дальше, что позволяет считать эти два QTL различными.
В отличие от этого, QTL признаков “воскового налета на внутренней и внешней стороне листа”, а также на стебле и колосе были идентифицированы в обоих экспериментах не только на одной хромосоме 2D, но и в одной позиции – 300.0 сМ. Стабильность QTL этих признаков не вызывает сомнения, поскольку и LOD оценка, процент фенотипического проявления данных признаков были очень высоки, достигая, например, для признака “восковой налет на внешней стороне листа” 22.92 и 23.63, в случае LOD оценки, и 63.40 и 64.53, в случае процента фенотипического проявления признака, для экспериментов с добавлением и без добавления азотного удобрения, соответственно.
QTL окраски лигулы и ушек листа также были идентифицированы в одних и тех же местах на группах сцепления 7А (окраска лигулы), 1А, 1В и 5В (окраска ушек). Стабильность локализации выявленных для этих признаков QTL не вызывает сомнения, даже несмотря на относительно не высокую LOD оценку. В то же время процент фенотипического проявления этих признаков для такой LOD оценки был вполне высок и составлял для признака “окраски лигулы листа” 13.87 и 11.56, а для признака “окраска ушек листа” – 2.14−2.52 и 1.87−2.30, соответственно при низком и высоком агрофоне азота.
Признак “текстура колоса”, так же как и признак “опушение флагового листа”, проявил стабильность идентификации определяющих его QTL (2А), но при этом локализация варьировала в зависимости от того была ли (202.4 сМ) или нет (227.3 сМ) произведена подкормка азотным удобрением. Это на наш взгляд, указывает на то, что данный признак, также как и признак “опушения флагового листа” в каждом из экспериментов контролировался отдельным QTL.
Признаки “формы и ломкости колоса”, “формы и окраски колосковой чешуи”, а также “окраски зерновки”, определялись одними и теми же QTL, идентифицированными для каждого из этих признаков в одних на одних и тех же группах сцепления, и в одних тех же позициях в обоих экспериментах. Несколько отличается локализация QTL для признака “ломкость колоса”, идентифицированных на хромосоме 5D в обоих экспериментах. Разница в локализации для данного признака составила всего 1.4 сМ, что позволяет считать локус хромосомы, определяющий данный признак, единым для обоих экспериментов.
QTL признака “трудности обмолота”, также выявленные на хромосоме 5D как в опыте без, так и с внесением азотного удобрения, были идентифицированы в позиции 175.5 сМ (опыт без внесения удобрения) и в позиции 68.8 сМ (опыт с внесением удобрения). Разница в 106.7 сМ, также как и относительно высокая LOD оценка, позволяет нам считать эти два локуса независимыми, а проявление данного признака зависимым от внесения азотного удобрения.
Признаки, определяющие структуру урожая: “длина колоса”, “число колосьев” и “число колосков в колосе”, “число зерен в колосе и в колоске”, а также “масса зерна с колоса”, исследованные в нашей работе проявили очевидную зависимость от того было или нет внесено азотное удобрение. LOD оценка для этих признаков варьировала от 2.17 до 4.25 в опыте без внесения удобрения, и от 2.23 до 5.05, в опыте с внесением азотного удобрения. Процент фенотипической изменчивости варьировал от 11.83 (признак “длина колоса”) до 19.33 (“число зерен в колоске”), в случае эксперимента без внесения азотного удобрения, и от 12.21 до 27.12 (оба показателя признака “числа зерен в колосе”), в случае эксперимента с внесением азотного удобрения.
Еще один признак структуры урожая зерна – “масса 1000 зерен” проявил стабильность идентификации, определяющих его QTL, на группах сцепления (3В и 5D), но при этом локализация выявленных QTL существенно различалась в зависимости от того вносилось или нет азотное удобрение. Так для группы сцепления 3В QTL были определены в позиции 146.5 сМ (опыт без внесения удобрения) и в позиции 246.5 сМ (опыт с внесением удобрения), а для группы сцепления 5D – в позиции 130.8 сМ (опыт без внесения удобрения) и в позиции 240.7 сМ (опыт с внесением удобрения), что дает нам право говорить о том, что это различные локусы одних и тех же хромосом. Следовательно, признак “масса 1000 зерен”, так же как и все остальные исследованные нами признаки структуры урожая, зависит от внесения азотного удобрения, что явно указывает на важность азота для физиолого-генетического проявления признаков, определяющих структуру урожая у такой хозяйственно ценной культуры как пшеница.
Признак, который также проявлял стабильность своего проявления в обоих экспериментах – это “стекловидность зерна”. Высокие LOD оценка и процент фенотипического проявления данного признака подтверждают стабильность его проявления и дают основание полагать, что внесение азотного удобрения никак не сказывается на активности генетических детерминант, определяющих физиологические параметры признака “стекловидность зерна”.
Дополнительно проведенный корреляционный анализ выявил признаки, проявление которых варьировало в зависимости от внесения азотного удобрения (табл. 2). Как видно из данных таблицы 2 с дозами внесенного азотного удобрения достоверно и положительно коррелировали признаки структуры урожая: “длина колоса” (коэффициент корреляции был равен rxy = 0.59), “число колосьев” (rxy = 0.60) и “число колосков в колосе” (rxy = 0.59), “число зерен в колосе (rxy = 0.52) и в колоске” (rxy = 0.31), а также “масса зерна с колоса” (rxy = 0.54). Признаки начального роста и развития коррелировали с внесением азотного удобрения слабо, положительно, но достоверно. Так для признака продолжительность периода “всходы−выход в трубку” коэффициент корреляции составил rxy = 0.20, для признака продолжительность периода “всходы−колошение” – rxy = 0.28, для признака продолжительность периода “всходы–цветение” – rxy = 0.31, а для признака продолжительность периода “всходы–созревание” – rxy = 0.16. Признаки “длина верхнего междоузлия” и “размер стеблевого узла” проявили слабую (rxy = 0.16) и среднюю (rxy = 0.46) положительные корреляции, демонстрируя свою зависимость от внесения доз азотного удобрения. Признак “высота растений” в случае корреляционного анализа также проявил умеренную среднюю положительную корреляцию (rxy = 0.37), что совпадает с результатами как дисперсионного анализа, так и QTL анализа.
Сделанные выводы достоверно подтверждаются результатами однофакторного дисперсионного анализа о влиянии фактора на признак (табл. 3). В результате проведенных математических расчетов было установлено, что из 31 признака 15 статистически значимо варьировали в зависимости от того вносилось или нет азотное удобрение. В соответствии с общепринятыми правилами [25], значимость на уровне p < 0.05 указывает на то, что признаки с такими параметрами установленной значимости варьируют. Причем, чем больше уровень значимости стремится к нулю, тем сильнее изменчивость. В то же время, четыре признака: “опушение флагового листа”, “текстура колоса”, “трудность обмолота” и “масса 1000 зерен”, которые при проведении QTL анализа и сопутствующих ему статистических расчетов, выявили иную локализацию на хромосоме, но не изменение группы сцепления, при проведении однофакторного дисперсионного анализа не обнаружили статистически достоверной связи с уровнем азотного питания. Остальные 12 проанализированных признаков, у которых рассчитанный уровень значимости р дисперсионного отношения F больше или равен 0.05, обладали стабильностью, что указывает на физиолого-генетическую независимость проявления этих признаков от того вносилось или нет азотное удобрение. В целом, результаты однофакторного дисперсионного анализа подтверждают выводы из корреляционного и QTL анализов, что указывает на достоверность эффектов влияния внесения азотного удобрения на рост, развитие и формирование признаков продуктивности урожая у яровой мягкой пшеницы в строго контролируемых условиях агроэкополигона.

ОБСУЖДЕНИЕ
Картирование локусов количественных признаков, так называемых QTL, предоставляет исследователям возможность устанавливать не только конкретные локусы отдельных групп сцепления, вовлеченные в реализацию того или иного признака, но и инструмент с помощью которого можно дискриминировать между проявлением одного и того же признака в различных эколого-географических регионах мира или в различных условиях выращивания. В том числе это относится и к таким важным физиолого-генетическим признакам как усвоение азотных удобрений, вносимых на разных стадиях роста и развития растений. Увеличение эффективности поглощения азота, особенно у злаков, представляет собой одну из основных задач повышения продуктивности сельскохозяйственных растений. Растения, способные с большей отдачей поглощать и ассимилировать азотные удобрения, в перспективе могут дать больший урожай зерна с повышенным качеством белка. В современных условиях добиться такого результата можно только установив физиолого-генетические механизмы реализации процесса продуктивности растений и усовершенствовав физиолого-генетическую структуру генотипа растительного организма. Последнее можно достичь посредством идентификации генов или локусов хромосом, определяющих реализацию этих механизмов.
На сегодняшний день известно целый ряд исследований, в которых у такого важного хозяйственно ценного вида растений как гексаплоидная пшеница (Triticum aestivum L.), идентифицировали QTL усвоения азотных удобрений как в контролируемых [5−7], так и в полевых условиях [8−10]. Опубликованы также работы, в которых выявляли отдельные гены или геномные элементы, также вовлеченные в процесс усвоения минерального азота [10, 12, 26]. Однако, как известно, гетерогенность доступности находящихся в почве NO3− и NH4+ является одним из наиболее серьезных факторов нарушения минерального азотного питания. Кроме того, сезонные и повседневные изменения ростовых и иных физиологических процессов обуславливают градиентные потребности потребления питательных веществ поступающих из почвы в растение. В этой связи нами ранее была проведена работа по выявлению и локализации на группах сцепления QTL, отвечающих за проявление агрономически значимых количественных признаков, определяемых эффективностью поглощения азота (вносимого в почву в виде минеральных удобрений) у яровой мягкой пшеницы Triticum aestivum L., при доступности различных доз азотного удобрения в условиях Северо-Западного региона России [27]. Следует отметить, что в данном эксперименте анализ и выявление QTL выполняли в обычных полевых условиях, в которых ключевые абиотические факторы, определяющие рост и развитие растений не поддаются регуляции. В результате проведенных нами исследований было показано, что выявленные специфичные QTL признаков продуктивности проявляют более высокую физиолого-генетическую активность при низких дозах внесенного азотного удобрения, и на основании этого могут быть использованы для обеспечения стабильности урожая посредством комбинирования определяющих эти признаки QTL, проявляющихся в различных экологических условиях при низких концентрациях минерального азотного питания.
В опытах других ученых была выявлена генетическая изменчивость по признаку “урожайность зерна” при низких уровнях азота и, установлен тот факт, что физиолого-генетическое взаимодействие “генотип-уровень азота” является существенным для реализации физиолого-генетического потенциала растений [28]. Эти же авторы показали, что поглощение азота, в основном, объясняет изменчивость эффективности поглощения минерального азота при низкой концентрации этого элемента и его физиологическую значимость для признака урожайность зерна. Кроме того, установлено, что для пшеницы прямой отбор при низких дозах азотного удобрения является наиболее эффективным. В других работах, выполненных на линиях удвоенных гаплоидов, прямой отбор при низких дозах азотных удобрений, также был признан столь же эффективным, также как и при градиентной доступности почвенного азота [5]. Помимо этого, французскими учеными было установлено, что специфичные QTL признаков продуктивности, выявленные при низких дозах внесенного азотного удобрения, могут быть использованы для получения стабильных урожаев за счет комбинирования QTL, связанных с этими признаками, проявляющихся в различных экологических условиях низких концентраций минерального азотного питания [8].
Однако, необходимо отметить, что во всех приведенных выше работах выявление и анализ QTL проводили либо в обычных полевых условиях, характерных для того или иного экологического региона, без ограничительных почвенных барьеров, подобных тем, которые были использованы в наших исследованиях [27], либо растения выращивали в гидропонной культуре или вегетационных сосудах в условиях теплицы [5−7], что также коренным образом отличается от условий агроэкобиополигона, позволяющего проводить исследования большого количества растений в одинаковых, строго контролируемых условиях [14]. Основной отличительной чертой условий регулируемой агроэкосистемы является то, что она позволяет вычленить отдельные компоненты внешней среды при неизменности остальных факторов воздействия на вегетирующие растения и, тем самым, создаются предпосылки для последующего “тонкого” анализа физиолого-генетической активности идентифицированных локусов количественных признаков и установления взаимодействия типа “QTL-окружающая среда” в естественных условиях произрастания, по отношению к условиям регулируемой агроэкосистемы.
В настоящей работе нами впервые проведено выявление и локализация на группах сцепления QTL, определяющих проявление 31 количественного признака у гексаплоидной пшеницы в строго контролируемых условиях агроэкобиополигона в отсутствии и при внесении азотного удобрения. QTL 19 признаков, выявленные при изменении концентрации доступного минерального азота, меняли свое месторасположение на группах сцепления. Причина этого, по-видимому, кроется в характере проявления взаимодействия “генотип-среда”. Так, например, если локализация на хромосомах QTL признаков воскового налета оставалась стабильной во всех вариантах проведения экспериментов, то QTL признаков урожайности, наоборот, проявляли нестабильность и меняли свое месторасположение на группах сцепления в зависимости от того вносилось или нет азотное удобрение. Очевидно, что это связано с реализацией адаптивного потенциала растений в определенных условиях их произрастания [15, 27, 29]. По-видимому, комплексный характер действия факторов внешней среды во многом определяет особенности сформировавшихся в процессе эволюции блоков коадаптированных генов адаптации у каждого вида растений, в том числе и у пшеницы, а также специфику коадаптации ее генетической системы в целом. На такой же основе, как известно, формируется и специфичная для каждого вида растений эволюционная и онтогенетическая “память” генетических систем F и R [29].
В целом все выявленные QTL (табл. 1) условно можно разделить на две группы: зависимые и не зависимые от эффектов действия внесенного азотного удобрения, т.е. от целенаправленного воздействия окружающей среды. Как видно из результатов QTL анализа, в группу зависимых QTL попали все локусы хромосом, которые так или иначе вовлечены в процесс реализации продуктивности растений, а в группе независимых QTL, оказались признаки, на которые влияние азотного минерального удобрения ничтожно или полностью отсутствует. Кроме того, картирование QTL позволило установить распределение идентифицированных локусов по группам сцепления. Так, например, основные QTL признаков продолжительности периодов “всходы−выход в трубку”, “всходы−колошение”, “всходы–цветение” и “всходы−созревание”, в случае эксперимента без добавления азотного удобрения, формировали кластеры на 2D и 5А, а в случае эксперимента с внесением азотного удобрения – на 2D, 5D и 7А. Признаки воскового налета на внутренней и внешней стороне листа, а также на стебле и колосе в обоих экспериментах формировали единый кластер на хромосоме 2D, который к тому же располагался в одной и той же позиции, вне зависимости от того, вносилось или нет азотное удобрение.
В противоположность этому признаки урожая зерна формировали кластеры на группах сцепления в зависимости от того вносилось или нет азотное удобрение. Так в эксперименте без внесения азотного удобрения QTL признаков “длина колоса”, “число колосьев” и “число колосков в колосе”, “число зерен в колосе и в колоске”, а также “масса зерна с колоса” были идентифицированы на 2D, 4А, 4В, 5А и 7В, а в эксперименте с внесением азотного удобрения – на 1А, 1В, 3А, 4А, 7А и 7D группах сцепления. Еще один признак продуктивности – “масса 1000 зерен”, в обоих экспериментах образовывал по два кластера на хромосомах 3В и 5D, но в зависимости от того добавлялось или нет азотное удобрение в разных экспериментах выявленные кластеры на этих группах сцепления располагались в разных позициях. В целом наши результаты хорошо коррелируют с данными полученными ранее нами [16], а также китайскими [11] и французскими исследователями [12], которые выявили практически на тех же группах сцепления (например, 2D, 4B, 5A и 7A) QTL, определяющие эффективность использования минерального азота и влияющие на урожай и его компоненты. Вместе с тем следует отметить, что признаки “масса зерна” и “число семян с колоса”, как правило, идентифицируются на одних и тех же хромосомах, тогда как “масса 1000 зерен” контролируется QTL, выявленное месторасположение которых зависит от условий внешней среды: в контролируемых условиях агробиополигона – на хромосомах 3В и 5D, в условиях открытого грунта, характеризующихся существенным варьированием температуры и влажности, на хромосомах 5B, 6D и 7D [27].
Мы не можем сравнить результаты, полученные в условиях описываемого в данной статье эксперимента, с результатами, полученными ранее также в контролируемых условиях агробиополигона [14], поскольку схемы опытов весьма существенно отличались. Главное отличие двух вариантов постановки экспериментов заключается в резко отличающемся режиме питания растений. В опубликованной ранее работе [14] растения выращивали на торфе с добавками (мел, глина, суперфорсфат), полив водой чередовался с поливом раствором Кнопа с микроэлементами. В настоящей работе растения произрастали на дерново-подзолистой почве с достаточно высоким исходным содержанием азота, фосфора и калия. В варианте с высоким уровнем азотного питания были выполнены подкормки амидным азотом.
Следует отметить, что отличительной чертой условий регулируемой агроэкосистемы является то, что они позволяют вычленить отдельные компоненты внешней среды при неизменности остальных факторов воздействия на вегетирующие растения. Проявление выявленных в условиях регулируемой агроэкосистемы QTL может зависеть или не зависеть от исследуемого фактора воздействия. В настоящем исследовании все условия выращивания были постоянными кроме режима азотного питания, в отличие от предыдущей серии наших экспериментов, в которых менялись режимы температуры и освещенности культивирования растений [14]. Мы не ставили цели сравнить влияние условий выращивания в двух разных сериях экспериментах на идентификацию и локализацию на группах сцепления локусов хромосом, участвующих в реализации проявления исследуемых признаков. Следует учесть, что семена, которые использовали для опытов, были получены в разных почвенно-климатических условиях и корнеобитаемые среды в этих двух сериях экспериментов также существенно различались. В тоже время следует отметить, что признаки “всходы−выход в трубку”, “число колосьев” и “число колосков в колосе”, а также “масса зерна с колоса”, проявили очевидную зависимость как от режимов температуры и освещенности, так и от внесения азотного удобрения. Также выявлены признаки, такие как “восковой налет на внутренней стороне листа”, “восковой налет на внешней стороне листа”, “ломкость колоса”, проявление которых варьировало в зависимости от режимов температуры и освещенности и не зависело от дозы минерального азотного питания.
Помимо QTL анализа, для установления статистической связи между признаками и вариантом опыта, были проведены корреляционный и однофакторный дисперсионный анализы (табл. 2, 3). Отметим, что в случае метода QTL анализа также оценивалась стабильность идентификации на группах сцепления локусов хромосом, определяющих проявление изучаемых признаков. Кроме того, необходимо было убедиться в достоверности связи между интересующими величинами и в том, что фактор – вариант опыта, действительно оказывает существенное влияние на признак; первую задачу здесь выполняет корреляционный, а вторую – дисперсионный анализы. Все эти статистические подходы, в т.ч. QTL анализ, в настоящем исследовании продемонстрировали практически полностью совпадающие результаты. Исключение составили четыре признака: “опушение флагового листа”, “текстура колоса”, “трудность обмолота” и “масса 1000 зерен”. Причина этого, по-видимому, кроется в использовании во всех трех методах статистического анализа одних и тех же данных исходных варианс, а также в применении статистического критерия максимального правдоподобия и определении статистической достоверности в каждом из использованных математических подходов, которые отличались друг от друга тем, что при проведении QTL анализа пороговый уровень достоверности LOD оценки для всех признаков задавался изначально, а в случае однофакторного дисперсионного и корреляционного анализов уровень статистической достоверности для каждого признака рассчитывался отдельно. В целом, если при рассмотрении использованных математических подходов, исходить из полученных с их помощью результатов по признакам “опушение флагового листа”, “текстура колоса”, “трудность обмолота” и “масса 1000 зерен”, то можно прийти к заключению, что алгоритм статистических расчетов в методе QTL анализа имеет некоторые преимущества по сравнению с однофакторным дисперсионным и корреляционным анализами, особенно с учетом использованного экспериментального материала, а именно рекомбинантных инбредных линий картирующей популяции ITMI. Поскольку линии картирующей популяции насыщены молекулярными маркерами [19], то это дает возможность не только устанавливать позиции QTL, отвечающих за проявление того или иного признака, находить процент фенотипической изменчивости, определяемый каждым из идентифицированных QTL, но и выявлять молекулярные маркеры, генетически сцепленные с установленными QTL [14−16, 19, 27]. Такая информация позволяет не только производить расчеты, устанавливать их достоверность, но и выявлять с не меньшей степенью достоверности локализацию на хромосомах, даже на одних и тех же, идентифицированных QTL.
Таким образом, в настоящем исследовании впервые продемонстрирована зависимость физиологической активности генетических детерминант, определяющих проявление агрономически важных количественных признаков у гексаплоидной пшеницы, от дозы внесенных азотных удобрений в строго контролируемых условиях выращивания растений. Полученные результаты позволили выявить геномные районы, вовлеченные в реализацию метаболизма азота, включая признаки роста и урожайности у яровой мягкой пшеницы, что может позволить более точно выявлять локусы хромосом, особенно связанных с идентификацией и практическим переносом аллельных вариантов генетических детерминант, определяющих проявление физиологических хозяйственно значимых признаков, а в перспективе устанавливать отдельные этапы физиолого-генетических механизмов их реализации.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований 16-04-00311-а.

 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. FAO Statistical Pocketbook. World Food and Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Rome, 2015. 236 p.
2. Волкова А.В. Рынок минеральных удобрений. М.: Высшая школа экономики. 2015. 67 с.
3. Bogard M., Jourdan M., Allard V., Martre P., Perretant M.R., Ravel C., Heumez E., Orford S., Snape J., Griffiths S., Gaju O., Foulkes J, Le Gouis J. Anthesis date mainly explained correlations between post-anthesis leaf senescence, grain yield, and grain protein concentration in a winter wheat population segregating for flowering time QTLs // J. Exp. Bot. 2011.V. 62. P. 3621–3636.
4. Raun W.R., Johnson G.V. Improving nitrogen use efficiency for cereal production // Agron. J. 1999. V. 91. P. 357–363.
5. An D., Su J., Liu Q., Zhu Y., Tong Y., Li J., Jing R., Li B., Li Z. Mapping QTLs for nitrogen uptake in relation to the early growth of wheat (Triticum aestivum L.) // Plant Soil. 2006. V. 284. P. 73–84.
6. Habash D.Z., Bernard S., Schondelmaier J., Weyen J., Quarrie S.A. The genetics of nitrogen use in hexaploid wheat: N utilisation, development and yield // Theor. Appl. Genet. 2007. V. 114. P. 403–419.
7. Guo Y., Kong F.-M., Xu Y.-F., Zhao Y., Liang X., Wang Y.-Y., An D.-G., Li S.-S. QTL mapping for seedling traits in wheat grown under varying concentrations of N, P and K nutrients // Theor. Appl. Genet. 2012. V. 124. P. 851–865.
8. Quarrie S., Steed A., Calestani C., Semikhodskii A., Lebreton C., Chinoy C., Steele N., Pljevljakusić D., Waterman E., Weyen J., Schondelmaier J., Habash D.Z., Farmer P., Saker L., Clarkson D.T., Abugalieva A., Yessimbekova M., Turuspekov Y., Abugalieva S., Tuberosa R., Sanguineti M.C., Hollington P.A., Aragués R., Royo A., Dodig D. A high-density genetic map of hexaploid wheat (Triticum aestivum L.) from the cross Chinese Spring × SQ1 and its use to compare QTLs for grain yield across a range of environments // Theor. Appl. Genet. 2005. V. 110. P. 865–880.
9. Laperche A., Brancourt-Hulmel M., Heumez E., Gardet O., Hanocq E., Devienne-Barret F., Le Gouis J. Using genotype × nitrogen interaction variables to evaluate the QTL involved in wheat tolerance to nitrogen constraints // Theor. Appl. Genet. 2007. V. 115. P. 399–415.
10. Fontaine J.-X., Ravel C., Pageau K., Heumez E., Dubois F., Hirel B., Le Gouis J. A quantitative genetic study for elucidating the contribution of glutamine synthetase, glutamate dehydrogenase and other nitrogen related physiological traits to the agronomic performance of common wheat // Theor. Appl. Genet. 2009. V. 119. P. 645–662.
11. Xu Y., Wang R., Tong Y., Zhao H., Xie Q., Liu D., et al. Mapping QTLs for yield and nitrogen-related traits in wheat: influence of nitrogen and phosphorus fertilization on QTL expression // Theor. Appl. Genet. 2014. V. 127. P. 59–72.
12. Bordes J., Ravel C., Jaubertie J., Duperrier B., Gardet O., Heumez E., Pissavy A.L., Charmet G., Le Gouis J., Balfourier F. Genomic regions associated with the nitrogen limitation response revealed in a global wheat core collection // Theor. Appl. Genet. 2013. V. 126. P. 805–822.
13. Gupta P., Kumar J., Mir R., Kumar A. Marker-assisted selection as a component of conventional plant breeding // Plant Breed. Rev. 2010. V. 33. P. 145–217.
14. Чесноков Ю.В., Мирская Г.В., Канаш Е.В., Кочерина Н.В., Ловассер У., Бёрнер А. Картирование QTL у яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) в контролируемых условиях агроэкобиополигона // Физиология растений. 2017. Т. 64. №1. C. 55–68.
15. Чесноков Ю.В., Почепня Н.В., Козленко Л.В., Ситников М.Н., Митрофанова О.П., Сюков В.В., Кочетков Д.В., Ловассер У., Бёрнер А. Картирование QTL, определяющих проявление агрономически и хозяйственно ценных признаков у яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) в различных экологических регионах России // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2012. Т. 16. №4/2. С. 970–986.
16. Чесноков Ю.В., Гончарова Э.А., Ситников М.Н., Кочерина Н.В., Ловассер У., Бёрнер А. Картирование QTL водного режима у яровой мягкой пшеницы // Физиология растений. 2014. Т. 61. С. 855–863.
17. Haldane J.B.S. The recombination of linkage values and the calculation of distance between the loci of linkage factors // J. Genet. 1919. V. 8. P. 299–309.
18. Lander E.S., Green P., Abrahamson J., Barlow A., Daly M.J., Lincoln S.E., Newburg L. MAPMAKER: an interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations // Genomics. 1987. V. 1. P. 174–181.
19. Ganal M.W., Röder M.S. Microsattelite and SNP markers in wheat breeding // Genomics Assisted Crop Improvement: Genomics Applications in Crops / Eds R.K. Varshney, R. Tuberosa. Springer, 2007. V. 2. P. 1–24.
20. Börner A., Schumann E., Furste A., Goster H., Leithold B., Roder M.S., Weber W.E. Mapping of quantitative trait loci determining agronomic important characters in hexaploid wheat (Triticum aestivum L.) // Theor. Appl. Genet. 2002. V. 105. P. 921–936.
21. Kosambi D.D. The estimation of map distances from recombination values // Ann. Eugen. 1944. V. 12. P. 172–175.
22. Кочерина Н.В., Артемьева А.М., Чесноков Ю.В. Использование лод-оценки в картировании локусов количественных признаков у растений // Доклады Россельхозакадемии. 2011. №3. С. 14–17.
23. Чесноков Ю.В., Почепня Н.В., Бёрнер А., Ловассер У., Гончарова Э.А., Драгавцев В.А. Эколого-генетическая организация количественных признаков растений и картирование локусов, определяющих агрономически важные признаки у мягкой пшеницы // Доклады Академии наук (Россия). 2008. Т. 418. №5. С. 693–696.
24. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа. 1990. 352 с.
25. Фишер Р.Э. Статистические методы для исследователей. М.: Гоcстатиздат. 1958. 267 с.
26. Han M., Okamoto M., Beatty P.H., Rothstein S.J., Good A.G. The genetics of nitrogen use efficiency in crop plants // Annu. Rev. Genet. 2015. V. 49. P. 269–289.
27. Чесноков Ю.В., Гончарова Э.А., Почепня Н.В., Ситников М.Н., Кочерина Н.В., Ловассер У., Бёрнер А. Идентификация и картирование QTL физиолого-агрономических признаков яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) в градиенте доз азотного питания // Сельскохозяйственная биология. 2012. №3. C. 47–60.
28. Le Gouis J., Beghin D., Heumez E., Pluchard P. Genetic differences for nitrogen uptake and nitrogen utilization efficiencies in winter wheat // Eur. J. Argonomy. 2000. V. 12. P. 163–173.
29. Жученко А.А. Адаптивное растениеводство (эколого-генетические основы). Теория и практика. В 3 томах. М.: Изд-во Агрорус. 2008. 1008 с.


 Таблица 1. Признаки и QTL, выявленные у картирующей популяции ITMI в контролируемых условиях агроэкобиополигона, в отсутствии (Эксперимент 1) и при внесении (Эксперимент 2) азотного удобрения


 Таблица 2. Результаты корреляционного анализа