УДК: 581.1

Суспензионные культуры клеток растений как платформа для получения рекомбинантных белков

© 2017 г. А. А. Загорскаяa,1, Е. В. Дейнекоa,b

aФедеральное государственное бюджетное научное учреждение “Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук”, Новосибирск

bФедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования “Национальный исследовательский Томский государственный университет”, Томск

Поступила в редакцию 12.07.2016 г.

 

Производство рекомбинантных белков в суспензионных культурах генетически модифицированных растительных клеток является перспективной и быстро развивающейся областью биотехнологии растений. В предлагаемом обзоре рассматриваются преимущества использования растительных систем экспрессии рекомбинантных белков. Основной акцент сделан на освещение исследований, направленных на оптимизацию условий культивирования суспензионных культур растительных клеток с целью максимального выхода целевых белков. Приведены примеры успешного использования суспензионных культур растительных клеток для получения различных биофармацевтиков.

 

Ключевые слова: трансгенные растения суспензионные культуры системы экспрессии рекомбинантные белки биофармацевтики

_______________________

1Адрес для корреспонденции: Загорская Алла Алексеевна. 630090 Новосибирск, Лаврентьева пр. 10. Институт цитологии и генетики СО РАН. Электронная почта: zagorska@bionet.nsc.ru

 

 

ВВЕДЕНИЕ

Рынок фармацевтически ценных белков на сегодняшний день является наиболее быстро развивающимся сегментом экономики. Он растет быстрее, чем фармацевтический рынок в целом и по прогнозам специалистов будет достигать к 2020 году 278.2 млрд долларов США [1]. Более 200 биофармацевтиков уже представлены на рынке и еще большее их количество проходит доклинические испытания. Крупнейшие биотехнологические и фармацевтические компании, такие, как Epicyte, Ventria, Medicago, Greenovation, LSBC и Pfizer проявляют огромную заинтересованность и инвестируют в развитие научных исследований по разработке новых платформ для производства фармацевтически ценных белков и внедрение их в производство.

На сегодняшний день большая часть биофармацевтиков получена в клетках млекопитающих и микроорганизмов, однако обе системы обладают рядом недостатков. Растительные клетки сочетают в себе достоинства эукариотической системы наработки белка и простоту и дешевизну бактериальной, и использование растений для получения рекомбинантных белков является экономически значимым и перспективным направлением, развивающимся как альтернатива традиционным. Преимуществом растительных систем является более низкая стоимость культивирования клеток. Они свободны от нежелательных компонентов, таких как эндотоксины бактерий, гипергликозилированные белки, продуцируемые дрожжами, патогены животных и человека в клеточных культурах трансгенных животных. К тому же, растения являются высшими эукариотами, и поэтому в их клетках происходит полноценный фолдинг и образование сложных мультимерных белковых комплексов [2, 3], а также значительная часть посттрансляционных модификаций аналогично клеткам млекопитающих [4, 5].

Развиваемые ныне растительные системы экспрессии рекомбинантных белков чрезвычайно разнообразны и насчитывают более 100 различных технологий, основанных на разных видах растений, способах переноса генов, экспрессионных стратегиях, методах последующего извлечения целевого белка и пр. Это ядерная и пластидная трансформация, транзиентная [6, 7] и стабильная экспрессия при трансформации с помощью агробактериального переноса [8], бомбардировки или электропорации [9], культивирование целых наземных или водных растений, растительных тканей или суспензионных клеточных культур в качестве экспрессионных систем. Все эти технологии обладают своими достоинствами и недостатками. Культуры водных растений, например, водорослей, микроводорослей и ряски обладают высокими темпами роста на простых по составу и дешевых питательных средах или просто на воде, однако требуют наличия освещения. Преимущества хлоропластной трансформации связаны, во-первых, с высокой копийностью трансгена в связи с большим количеством хлоропластов в каждой фотосинтезирующей клетке, во-вторых, с отсутствием эффекта замолкания генов и, в-третьих, с накоплением целевых белков внутри хлоропласта, что защищает клетку от их возможного токсического влияния [10]. Тем не менее, транспластомные системы являются перспективными лишь в том случае, когда целевой белок не подвергается сложным посттрансляционным модификациям.

Транзиентная экспрессия может быть весьма эффективно использована для проверки созданных генетических конструкций, а также для наработки небольших количеств белков за короткий промежуток времени [11]. Однако сложности соблюдения регламента безопасности при проведении процедуры вакуумной инфильтрации в листья растения рекомбинантной культуры почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens или растительных вирусов в качестве экспрессионных векторов и необходимость быстрого выделения конечного продукта являются серьезными недостатками данной системы.

Большая часть уже существующих на сегодняшний день терапевтических белков получена с помощью стабильной ядерной трансформации с последующим выделением и их очисткой из трансгенных растений-регенерантов [12]. В качестве вектора, как правило, используется A. tumefaciens, способная трансформировать широкий спектр двудольных и однодольных растений. В настоящее время в растениях кукурузы, риса и ячменя синтезируются некоторые технические реагенты для диагностики [13, 14], а также существует ряд фармацевтических продуктов, находящихся на этапе клинических испытаний [15, 16, 17]. Несмотря на очевидные преимущества использования растительных систем, внедрение новых методических разработок в производство происходит довольно медленно, и только немногие рекомбинантные белки, полученные из целых трансгенных растений, достигли рынка. Одной из причин этого является негативное общественное мнение, сложившееся вокруг генномодифицированных растений, а также несовершенство законодательной базы, на основании которой данные продукты могут попасть к потребителю.

Данный обзор посвящен рассмотрению возможностей получения рекомбинантных белков на основе растительных систем экспрессии, в частности суспензионных клеточных культур, и анализу современного состояния биотехнологического производства биофармацевтиков.

ПРЕИМУЩЕСТВА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СУСПЕНЗИОННЫХ КУЛЬТУР

Перспективным направлением, позволяющим преодолеть существенные недостатки использования трансгенных растений в качестве биофабрик, представляется культивирование растительных клеток в ферментерах. Возможность получения рекомбинантных белков в суспензиях растительных клеток была показана более 25 лет назад, однако долгое время исследования были сосредоточены на использовании для синтеза целых растений. Отношение к использованию суспензий растительных клеток начало меняться после всплеска коммерческого интереса к получению рекомбинантных белков, столкнувшегося с отсутствием регулирующих законов и резкой настороженностью по отношению к генетически модифицированным организмам, особенно в Европе. Технология культивирования растительных клеток обеспечивает точное соблюдение условий выращивания клеток в отличие от полевых условий, где существует погодная, климатическая, почвенная составляющие, а также влияние вредителей, травоядных животных и различных микроорганизмов [18]. Выращивание суспензионных культур клеток в стерильных реакторах не только элиминирует риск заражения культуры клеток микотоксинами и пестицидами [19, 20], но также снижает до минимума возможность переноса генетически модифицированных клеток в окружающую среду.

Неоспоримым преимуществом системы культивирования суспензионных культур клеток по сравнению с выращиванием целых растений является также их быстрый рост. Время необходимое для удвоения клеток составляет 23 суток в экспоненциальной фазе роста, один цикл культивирования клеток BY-2 табака, например, составляет 1−2 недели, в то время как на получение растений уходит несколько месяцев [21].

Существенным достоинством культуры растительных клеток как экспрессионной системы является их способность продуцировать и секретировать биологически активные белки через мембрану и клеточную стенку в межклеточное пространство. Этот процесс является метаболически зависимым и может обеспечиваться специфическими лидерными последовательностями пептидов как растительного, так и животного происхождения [22, 23]. Благодаря накоплению рекомбинантных белков в среде при культивировании суспензий растительных клеток упрощается процесс их извлечения и очистки. Переработка растительных тканей и целых растений связана с трудоемкой и затратной процедурой экстракции, а выделение из среды облегчается в связи с возможностью быстрого отделения клеток, в которых содержится большее количество сопутствующих белков. Целевые белки, секретируемые в культуральную среду, характеризуются также высокой степенью целостности и однородностью, так как их транспорт из клетки происходит после полного процессирования, то есть после полного удаления сигнальных пептидов и присоединения гликановых структур, если конечный продукт является гликопротеином. В том случае, если рекомбинантные белки накапливаются в больших количествах внутри клеток, их получение связано с очисткой от непроцессированных, незрелых и сигнальных белков и гетерологичных гликанов. По неопубликованным данным (цитирование по [24]) антитела, извлеченные из культуральной среды при выращивании клеток табака BY-2, представляют собой гомогенный комплекс из трех гликоформ с доминирующей формой, представленной 87 %, в то время как эти же антитела из целых растений представлены шестью различными гликановыми формами.

Основные преимущества и недостатки использования суспензионных культур растительных клеток представлены в таблице 1.

Использование суспензий растительных клеток для производства рекомбинантных белков различного назначения сдерживается частично из-за недостаточно высокого уровня их накопления, который составляет, как правило, не более 1% от уровня общего растворимого белка [25]. В настоящее время усилия исследователей направлены на преодоление данной проблемы с помощью подбора оптимальных условий культивирования, разработки новых генетических конструкций, эффективно экспрессирующихся в растительных клетках, а также на снижение уровня деградации целевых рекомбинантных белков.

 

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК

Для увеличения производительности растительных клеточных культур при наработке рекомбинантного белка прибегают к оптимизации условий культивирования по ряду факторов. При этом основное внимание исследователей направлено на химические (состав питательной среды – органический, минеральный, гормональный, значение рН, внесение различных предшественников целевых продуктов и т.д.) и физические факторы (освещение, температура, интенсивность перемешивания и пр.).

Состав питательных сред для культивирования растительных клеток чаще всего основан на модификациях среды Мурашиге и Скуга (MS) [26], содержащей основные минеральные и органические компоненты питания. Рост культуры растительных клеток может быть улучшен добавлением малых количеств компонентов минерального питания, витаминов, аминокислот, являющихся предшественниками белкового синтеза, или регуляторов роста. Количества этих веществ варьируют в зависимости от вида растения, генотипа, синтетических возможностей экспланта и часто определяются экспериментальным путем. Изменения состава среды, специфичные для каждого вида растений, разработаны для клеток риса, сои или табака. Часто такие модификации влияют на прирост биомассы клеток, не оказывая воздействия на наработку рекомбинантного белка.

Основными компонентами среды, содержание которых коренным образом влияет на темпы роста суспензионных культур, являются источники азота, фосфора и углерода, и подбор их оптимальных концентраций имеет существенное значение для повышения продуктивности клеточной культуры.

Известно, что фосфаты являются важнейшим макроэлементом питания, принимающим участие практически во всех метаболических процессах. Многие метаболиты содержат в своем составе фосфор, в том числе и такие жизненно важные, как АТФ, участвующая в процессах переноса энергии от фото-, окислительного и др. фосфорилирования к энергозависимым клеточным процессам биосинтеза. Дефицит фосфатов негативно сказывается на приросте клеточной биомассы в результате отсроченного наступления экспоненциальной фазы роста. Соответственно показано, что адекватное повышение концентрации фосфатов связано с повышением темпа клеточного роста и увеличением биомассы [27].

Среди наиболее изучаемых параметров культивирования, существенно влияющих на формирование биомассы, находятся и источники углерода. Как известно, в качестве источников углерода при культивировании растительных клеток используются сахара, такие, как глюкоза, мальтоза, рафиноза или многоатомные спирты из группы сахаров, например, маннитол, служащий также в качестве осмотического агента и регулирующий морфогенез и клеточный метаболизм [28]. Показано, что сахароза является наиболее универсальным источником углерода для большей части культур. Низкие концентрации сахара в составе среды приводят к снижению уровня метаболизма клетки, нарушают осмотическое давление в среде, вызывают повреждение клеток и освобождение протеаз, разрушающих наработанные рекомбинантные белки. Необходимо отметить, что в связи с использованием некоторых специфических промоторов, действие которых основано на углеводном голодании, например RAmy3D-промотора, появляется необходимость использования альтернативных источников углерода, таких как, например, фумаровая кислота, позволяющих повысить в 3.8–4.3 раза выход рекомбинантного белка трипсина в суспензионной культуре клеток риса [29].

Критическим же фактором, влияющим на продуктивность рекомбинантного белка в культурах растительных клеток, является содержание в питательной среде источников азота и их доступность. Азот − макроэлемент, находящийся в среде в самой высокой концентрации по сравнению с другими компонентами, играющий определяющую роль в метаболизме растительной клетки и непосредственно связанный с биосинтезом нуклеиновых кислот и белка. Среда MS состоит из смеси основных источников азота: нитратов и аммония. Показано, что cоотношения аммония и нитратов имеют более существенное значение для эффективности культивирования клеток по сравнению с каждым источником, взятым в отдельности [30]. В целом же известно, что дополнительный азот в составе среды MS повышает продукцию рекомбинантных белков. Так, например, при культивировании клеток табака BY-2 в обогащенной по азотному составу среде добиваются 10−20 кратного увеличения продукции рекомбинантных антител [30, 31].

Растворы питательных веществ в различных концентрациях не только определяют питательную ценность среды, но и, как отмечено выше, влияют на рост клеток суспензии через осмотический потенциал. От осмотического давления культуральной среды, в формировании которого участвуют как неорганические, так и органические составляющие, зависит не только интенсивность клеточного лизиса, но и скорость клеточного деления в суспензионных культурах. Показано, что при повышении концентрации сахарозы, а, следовательно, осмотического давления среды, наблюдается прогрессивное ингибирование клеточного роста многих типов культур. Однако осмотический стресс используется и для повышения выхода рекомбинантного белка [32]. Данный факт объясняется тем, что маннитол, к примеру, в концентрации 8%, вызывая некоторую задержку роста клеток, удлиняет экспоненциальную фазу роста культуры, во время которой происходит активное деление клеток и синтез белков, в том числе и рекомбинантных и, как результат увеличения продолжительности синтетической фазы клеточного цикла возрастает накопление рекомбинантного белка [32]. Осмотический стресс, как известно, активирует серию генов осмотического ответа и митоген-активируемого протеинкиназного пути. Активация данных ответов и влияет, по-видимому, на повышение экспрессии белков при осмотическом стрессе.

 

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ

Особое внимание исследователями и разработчиками промышленных технологий производства рекомбинантных белков в растительных клетках уделяется совершенствованию генетических конструкций, используемых для трансформации. Усилия направлены на повышение эффективности транскрипции с помощью использования более мощных промоторов, оптимизации мРНК-процессинга и трансляции.

В настоящее время в растительных системах экспрессии применяются как конститутивные, так и индуцибельные промоторы. Конститутивные промоторы обеспечивают экспрессию целевых генов во время всех фаз роста суспензии и упрощают производство, так как реактор может быть оптимизирован в направлении интенсивного роста культуры. Промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMv 35S) является одним из самых широко используемых [33]. Данный промотор позволяет получить, с одной стороны, высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка, но с другой стороны, как и все вирусные промоторы, может приводить к супрессии трансгена [34]. Минимизировать подобные проблемы возможно с помощью конститутивных растительных промоторов, таких как промоторы генов “домашнего хозяйства”, например, генов синтеза компонентов цитоскелета (актина, тубулина), убиквитиновых генов или генов, вовлеченных в синтез белков основных путей метаболизма [35]. Однако при всем существующем разнообразии изученных конститутивных промоторов, только небольшое их число используется при создании генетических конструкций.

Несмотря на то, что условия культивирования специально разрабатываются для экспрессии целевого белка на высоком уровне, естественные ограничения накладывают процессы клеточного деления и роста. Кроме того, при постоянном синтезе целевые белки могут быть нестабильны и восприимчивы к деградации и ингибированию в связи с их длительным пребыванием в культуральной среде. Для разделения во времени фазы роста клеточной культуры и продукции рекомбинантного белка и запуска его синтеза в момент, когда культура достигла оптимальной биомассы, существует возможность использования индуцибельных промоторов, инициирующих экспрессию в ответ на специфические химические, метаболические или физические воздействия [36]. Кроме того, такая стратегия является оптимальной в том случае, если рекомбинантный белок негативно влияет на рост и жизнеспособность клеток.

В литературе описаны разнообразные индуцибельные промоторы, используемые при получении рекомбинантных белков. Для культур растительных клеток чаще всего используют химически индуцибельные промоторы, так как индукторы (спирты, сахара и пр.) могут быть внесены в среду для культивирования целенаправленно [37]. Например, сахаро-индуцибельные промоторы содержат элементы, отвечающие за чувствительность гетерологичных генов к сахарам (SURE), они обнаружены в спораминовом, амилазном и пататиновом промоторах [38, 39] и промоторе VvTHI [40]. Использование элементов α-амилазного промотора делает конститутивный рисовый промотор актина 1 (actin 1) чувствительным к присутствию сахара [41]. Данный вид промоторов активирует экспрессию целевых генов при наступлении сахарного голодания, то есть в то время, когда плотность клеток в суспензии достигает наивысшего значения. В настоящее время αAmy3-промотор широко используется при производстве рекомбинантных белков в культурах клеток риса [42].

Описан ряд генов с функцией защиты растений от биотических факторов, промоторы которых индуцируются специфическими веществами, продуцируемыми вредителями и патогенами, или образующимися в самом растении в ответ на повреждение. В соответствующих промоторах идентифицированы различные комбинации транс- и цис-активирующих факторов, ответственных за экспрессию генов. Они обнаруживаются в единичных или множественных копиях и различных сочетаниях. Цис-действующие элементы высоко консервативны у различных видов растений и могут быть использованы при создании патоген-индуцированных трансгенных систем [43, 44]. Показано, что данные элементы функционируют в разном нуклеотидном контексте промоторов. Число копий каждого элемента влияет на силу индукции промотора, что делает их применение удобным при использовании патоген-индуцированной экспрессии генов [45].

Промоторы, индуцируемые повышенными температурами, активируют так называемые HSP-гены, ответственные за синтез стабилизирующих белков (heat-shock proteins) и других клеточных компонентов, обеспечивающих термоустойчивость растений. Данные промоторы также высоко консервативны у разных видов растений [46], могут быть универсальными или тканеспецифичными [47] и активируют экспрессию генов при превышении температуры 25ºС. Преимущество промоторов, активируемых при повышении температуры, заключается в отсутствии вмешательства в химический состав среды и снижении риска дополнительной контаминации культуры.

На продукцию целевого белка также может влиять процессинг мРНК, то есть ее кэпирование, сплайсинг и полиаденилирование. Последовательности, расположенные непосредственно за стоп-кодонами, являются критическими для процессинга, содержат сигналы полиаденилирования и существенным образом влияют на уровень экспрессии в клетках [48].

Необходимо отметить, что роль интронов в экспрессии эукариотических генов не выяснена окончательно. Несмотря на это отмечено, что включение некоторых интронов в трансгены оказывает усиливающий эффект на экспрессию генов. Описано несколько растительных интронов, выделенных из нативных контекстов и введенных в состав гетерологичных трансгенов в виде синтетических интронов: интрон 1 гена актина риса, интрон 1 гена убиквитина кукурузы, интрон 1 гена алкогольдегидрогеназы кукурузы и некоторые другие [35]. Отмечено, что данные последовательности усиливают экспрессию трансгена по сравнению с его природными аналогами.

Не менее важное значение имеет стабильность транскрипта в цитозоле. Существуют специфические дестабилизирующие сайты, транскрипт-терминирующие последовательности, наличие которых может укорачивать срок жизни молекулы мРНК. Особенно актуальна эта проблема при экспрессии генов млекопитающих в растительных клетках, когда наличие подобных сайтов может существенным образом снизить выход целевого продукта [49]. Такие последовательности должны быть идентифицированы и модифицированы или удалены из последовательности гена.

Эффективность синтеза рекомбинантного белка на стадии трансляции также может быть повышена с помощью генно-инженерных подходов. Предполагают, что эффективность трансляции зависит от скорости инициации, которая у эукариот обеспечивается взаимодействием 40S рибосомальной субъединицы и кэпированного 5’-конца мРНК с последующим прохождением через нетранслирующиеся лидерные последовательности к первому AUG-кодону, который является инициирующим в 92% изученных растительных генов. На все этапы этого процесса может оказывать влияние нуклеотидный контекст и структура лидерных последовательностей. Консенсусные последовательности вокруг инициирующего кодона AUG у растений отличаются от последовательностей в системах животных. Их оптимизация для растительных систем приводит к повышению эффективности трансляции.

Аналогичное действие имеет оптимизация нуклеотидной последовательности кодирующей части гена применительно к системе, в которой будет осуществляться его экспрессия. Известно, что существуют кодоны, которые преимущественно опознаются тРНК, и более редкие, опознаваемые тРНК с более низкой эффективностью. “Предпочитаемые” кодоны отличаются у животных и растений, однодольных и двудольных, в ядерном и пластидном геноме одних и тех же растений. С использованием стратегии оптимизации кодонового состава исследователи добивались 100-кратного повышения экспрессии гена crylA Bacillus thuringiensis в трансгенном табаке и томатах и в экспериментах с gfp-геном в клетках табака [50].

 

ДЕГРАДАЦИЯ И АДСОРБЦИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА

Низкий выход рекомбинантных белков, продуцируемых в культуре растительных клеток, объясняется не только низкой экспрессией в растительной системе, но и в значительной степени уровнем деградации конечного продукта. Известно, что разрушение рекомбинантного белка внутри растительных клеток происходит под действием протеолитических ферментов [51, 52]. Протеолитическая деградация чаще всего происходит в цитозоле и, соответственно, может быть существенно снижена при накоплении целевого белка во внутриклеточных компартментах, таких как ЭПР, с помощью присоединения к целевому белку сигнального, ответственного за заякоревание продукта в ЭПР (например KDEL, HDEL). К тому же в ЭПР содержится большое количество молекулярных шаперонов, которые участвуют в фолдинге и образовании сложных белковых структур. Сообщается о многократном, на один и два порядка, увеличении выхода рекомбинантного белка только благодаря его компартментализации в ЭПР. Один из наиболее впечатляющих примеров – увеличение в десять тысяч раз выхода эпидермального фактора роста человека (EGF) в клетках растений табака при аккумуляции его в ЭПР [53]. Однако эта стратегия не всегда применима, так как в некоторых случаях важнейшие этапы пост-трансляционного процессинга белка и превращение его в функциональную форму проходит в аппарате Гольджи [54].

Для снижения уровня протеолитической деградации разрабатывают и другие стратегии: коэкспрессию рекомбинантных белков и ингибиторов протеаз [55], создание нокаутных мутаций по генам специфических протеаз [56], удаление из целевых белков сайтов связывания с протеазами, а также РНК-интерференцию для супрессии синтеза протеаз [57], добиваясь повышения продукции целевого белка более, чем вдвое. Однако данные методы не разработаны окончательно и требуют дальнейшего изучения.

Показано, что существенные потери белка происходят и в случае экспорта его в культуральную среду [58]. Рекомбинантные белки, секретируемые в культуральную среду, могут проявлять нестабильность или деградировать под воздействием протеолитических ферментов, выделяемых в процессе жизнедеятельности клеток. Однако по данным Doran при добавлении, например, иммуноглобулина IgG1 в стерильную среду для культивирования клеток при полном отсутствии в составе среды протеаз и растительной биомассы происходила практически полная деградация белка в течение первых 2 ч [59]. Добавление же в среду стабилизирующих агентов, таких, как поливинилпиролидон (PVP) значительно увеличивали долговечность антител в культуральной среде [51]. Стабильность антител также увеличивалась в среде, полученной после культивирования суспензий клеток табака или культуры бородатых корней. Предположительно, данные результаты объясняются протективным эффектом полисахаридов и протеинов, превышающим действие экстраклеточных протеаз [60].

В настоящее время разработаны и продолжают совершенствоваться методы, позволяющие увеличить выход целевого белка за счет использования в составе культуральных сред низкомолекулярных белков (желатина, БСА или других) [61], ингибиторов протеаз или протеин-стабилизирующих полимеров (PVP, полиэтиленгликоль, PluronicF-68 и других), а также c помощью регулирования осмотического давления в среде для минимизирования клеточного лизиса, приводящего к освобождению протеаз [62]. Данные протеин-стабилизирующие агенты отличаются отсутствием фитотоксичности, по крайней мере в используемых концентрациях, и не влияют на жизнеспособность клеток, на их рост и способность к делению.

Еще одной проблемой при производстве рекомбинантного белка является свойство белков адсорбироваться на любой поверхности вне зависимости от того, является ли данная поверхность гидрофобной или гидрофильной, положительно или отрицательно заряженной [63]. Взаимодействия белка и поверхности интенсивно изучаются последние 10−15 лет не только в связи с производством белка, но и с целью снижения протеиновой адсорбции при мембранной фильтрации, при хранении крови и плазмы, а также при использовании в медицине различных устройств и имплантов. Показано, что адсорбция белка приводит не только к снижению его количества в среде, но и к изменению его конформации, а, следовательно в конечном итоге, к денатурации и инактивации. Потери белка в результате адсорбции тем значительнее, чем большего размера его молекулы. Это объясняется силой взаимодействия крупных молекул с поверхностями и наличием большего количества сайтов связывания. В исследованиях Nakanishi с сотрудниками [63] и Imamura c cотрудниками [64] изучено взаимодействие белков с различными типами поверхностей оборудования, применяемого для культивирования клеток, а также для выделения и очистки целевого продукта. Показано, что самый высокий уровень адсорбции в стеклянных сосудах и самый низкий в сосудах из пластика. Использование БСА или желатина в качестве специального покрытия значительно увеличивает выход рекомбинантного белка не только благодаря снижению адсорбции, но и уменьшению деградации из-за протеолиза. Однако применение таких стабилизирующих агентов ограничено в связи с опасностью загрязнения культур факторами вирулентности животного происхождения.

 

КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ И СКРИНИНГ

Известно, что культивирование клеток растений in vitro вызывает повышение уровня генетической изменчивости, причем степень ее зависит от продолжительности культивирования. Молодым культурам в первые месяцы культивирования свойственно возрастание гетерогенности. Для длительно культивируемых клеток, как правило, характерна стабилизация генома с поддержанием определенного уровня плоидности и замедлением темпа мутирования [65]. Более того, после проведения генетической трансформации суспензионная клеточная культура существует в виде смеси трансгенных и нетрансгенных клеток. Следовательно, задачей исследователей является разработка эффективных методов отбора и поддержания максимально стабильной культуры трансформированных клеток. Селекция трансгенных клеток осуществляется обычно благодаря включению в генетические конструкции генов устойчивости к антибиотикам или гербицидам, вследствие чего трансгенные клетки способны выживать и делиться в среде, содержащей селективные агенты.

Интересным альтернативным методом селекции трансгенных растительных клеток является принцип “позитивной селекции”. В основе метода лежит использование производного цитокинина - глюкуронида в качестве селективного агента и ген β-глюкуронидазы (gus) E. coli в качестве селективного гена. Только трансформированные клетки, несущие ген gus, способны расщеплять глюкуронид цитокинина до его активной формы и способны расти в среде, не содержащей цитокинин. Коммерческая реализация данного метода сдерживается лишь высокой ценой используемого селективного агента [66].

Аналогичный метод селекции основан на использовании фосфоманнозизомеразы (PMI) в качестве селективного маркера [67]. В норме растительные клетки не способны метаболизировать маннозу. Однако трансгенные растительные клетки с геном PMI могут превращать маннозу во фруктозу и использовать ее в качестве источника углерода. Нетрансгенные же клетки гибнут от углеродного голодания.

После проведения трансформации культура растительных клеток представляет собой гетерогенную популяцию генетически и эпигенетически отличающихся клеток с разным уровнем экспрессии, разным количеством копий трансгенов и разными инсерционными сайтами, которые значительно влияют на их продуктивность. Только небольшая доля клеток из исходных трансформантов продуцирует рекомбинантный белок с высокой эффективностью, и селекция “элитных” высокопродуктивных клеток и использование их затем для основания моноклональных клеточных суспензионных культур представляется важной задачей. Однако именно высокопродуктивные клетки часто растут менее активно и могут быть вытеснены их низкопродуктивным окружением. Быстрый отбор продуктивных клеток может быть достигнут при использовании, например, методики флюоресцентно-активированного клеточного сортинга (FACS). Для этого в клетках должен экспрессироваться флюоресцентный маркер, слитый с целевым продуктом и метящий таким образом трансгенные клетки. Отобранные в результате сортинга единичные клетки с наиболее интенсивной флюоресценцией помещают в миникамеры вместе с нетрансгенными клетками, что позволяет достичь необходимой плотности суспензии для ее оптимального роста. Последующее применение селективного против нетрансгенных клеток фактора позволяет получить моноклональную клеточную суспензию с высокой продуктивностью рекомбинантого белка [68].

В последние годы разрабатываются новые методы для направленного редактирования геномов, в частности, сайт-специфической трансформации растительных клеток, такие как RMCE (от recombinase-mediated cassette exchange) и ZFN (от zinc finger nuclease), а также технологии использования TALEN и CRISPR/Cas [69]. Редактирование геномов растений с помощью системы TALEN к настоящему времени проведено на четырех модельных объектах [70]. Благодаря данным технологиям представляется возможным встраивание трансгенов в экспрессионно-активные сайты растительного генома, которое обеспечит стабильно высокую продукцию рекомбинантных белков.

Дополнительные различия могут возникать во время длительного культивирования и периодического субкультивирования и могут быть связаны с замолканием генов или рекомбинационными событиями, приводящими к снижению или даже полному исчезновению ожидаемой продукции. Хотя дедифференцированные растительные клетки морфологически стабильны, у них отсутствуют полнофункциональные плазмодесмы и редуцирована система пост-транскрипционного замолкания (PTGS), их отличает генетическая нестабильность. Причиной данной нестабильности возможно является сомаклональная вариабельность, потеря трансгенов или транскрипционное замолкание генов. Эпигенетическое замолкание считается основным фактором нестабильности трансгенов в длительно поддерживаемых в культуре растительных клетках. Благодаря генетической нестабильности клетки могут утратить способность к высокому уровню продукции рекомбинантного белка, и в культуре начнут преобладать клетки с низкой продуктивностью. Показано, что продукция IgG1 в культуре клеток табака остается постоянной в течение не более 3 лет или по другим данным в течение 250 пассажей [71]. Поэтому в настоящее время развивается технология сохранения элитных клеточных линий в так называемых клеточных банках, имеющих трехступенчатую систему и состоящих из клеточного банка, банка мастер-клеток и рабочего банка клеток. Одной из возможностей сохранения элитных клеточных линий является их криосохранение. Альтернативный подход – постоянное скринирование высокопродуктивных линий, подтверждающих сохранение в культуре высокого уровня экспрессии рекомбинантного белка, и создание математических моделей, характеризующих стабильность продукции и обеспечивающих планирование работ. В дополнение, разрабатываются методики ко-экспрессии супрессоров генетического замолкания, способных поддержать высокую продуктивность элитных клеточных линий [36].

 

СУСПЕНЗИИ ТРАНСПЛАСТОМНЫХ КЛЕТОК

Предполагалось, что одной из технологий производства рекомбинантных белков может стать культивирование суспензий транспластомных клеток. Технология трансформирования хлоропластов разрабатывалась как многообещающий подход в получении рекомбинантных белков. При трансформации пластид не наблюдается проблем характерных для ядерной трансформации, таких как замолкание генов, эпигенетические эффекты или вариабельность экспрессии трансгенов. Высокий уровень экспрессии генов, перенесенных в хлоропластный геном, или пластом, достигается высокой копийностью пластидной ДНК. Например, в клетках мезофилла листа A. thaliana содержится около 120 хлоропластов, что составляет приблизительно 1000−1700 копий 154 т.п.н. пластидного генома, а в клетках листа Nicotiana tabacum содержится 10000 копий 156 т.п.н. пластидного генома. Многочисленные исследования показали, что хлоропласты имеют огромные возможности для экспрессии чужеродных белков на уровне, достигающем 70% от общего растворимого белка [72, 73] и намного превышающим уровень экспрессии при ядерной трансформации. Однако при исследовании уровня экспрессии рекомбинантных белков в транспластомной листовой ткани, каллусе и клеточной суспензии на примере белка GFP, легко визуализируемого в растительных клетках методом флюоресцентной микроскопии [74], и белка TetC, являющегося фрагментом С токсина возбудителя столбняка и используемого в качестве компонента съедобной вакцины [75], показано, что экспрессия их в клетках суспензии хотя и высока, но все-таки достоверно ниже, чем в тканях листьев транспластомных растений. Этот факт побудил к созданию новых видов биореакторов временного погружения для индукции и культивирования листовой ткани с высокой продукцией рекомбинантного белка, инициированной из транспластомных клеточных суспензий [76]. Возможной причиной более высокого накопления рекомбинантных белков в биомассе, культивируемой в биореакторах временного погружения, является разница в числе пластид на клетку, нарушении развития хлоропластов в длительно культивируемых клеточных суспензиях и различия в активности промоторов: активность светорегулируемого промотора PsbА, использованного в исследовании, снижалась в суспензионной культуре, приводя к снижению экспрессии белка. Авторы считают интересным проверить уровни экспрессии в фотоавтотрофных суспензионных культурах в сравнении с классическими культурами клеток растений.

Создание фотоавтотрофных суспензионных культур имело бы дополнительные преимущества. Однако большинство культивируемых клеточных суспензий требуют присутствия сахара в составе среды и характеризуются сниженной фотосинтетической активностью или полным ее отсутствием. Создание фотоавтотрофных суспензионных культур представляет большую трудность. Существует лишь небольшое количество видов, например, Chenopodium rubrum, A. thaliana [77], для которых такие культуры созданы. Они используются исключительно для изучения различных аспектов фотосинтеза, формирования вторичных метаболитов и пр.

 

УСПЕХИ РАСТИТЕЛЬНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

Растительная биотехнология является современной интенсивно развивающейся отраслью, и получение фармацевтически ценных рекомбинантных белков в системе растительных клеток представляется альтернативой наработке белков в целом растении [78]. Наиболее удобными признаны клеточные линии табака BY-2 (Bright yellow-2), NT-1 (Nicotiana tabacum-1), а также клетки риса [79], сои [80], томатов [81]. Эти клеточные культуры отличаются высокими темпами роста, синхронизацией клеточного цикла и восприимчивостью к трансформации с помощью A. tumefaciens. В настоящее время активно развивается производство в растительных системах антител, вакцин, гормонов, ростовых факторов, цитокинов, терапевтических энзимов и др. (табл. 2).

Антитела являются важнейшим классом биофармацевтиков [82]. Они относительно стабильны и могут накапливаться при производстве в высоких концентрациях (до 100 мг/л). Антитела могут быть получены из среды или экстрагированы с помощью белковой аффинной хроматографии, а их биологическая активность легко тестируется. Таким образом, рекомбинантные антитела являются идеальным выбором для демонстрации достоинств растительных систем производства рекомбинантных биофармацевтиков.

С момента получения первых полноразмерных моноклональных антител 20 лет назад [83] не уменьшается интерес к наработке их в растительных клетках. Уже получен ряд функциональных иммуноглобулинов G (IgG, в первую очередь IgG1) и иммуноглобулин А [84]. Для некоторых сложных молекулярных форм иммуноглобулинов, например, секреторных IgA (sIgA) и IgG4, растения являются фактически единственной коммерчески осуществимой системой [54]. Интерес к производству моноклональных антител в растительных системах возрастает по мере роста озабоченности проблемами безопасности, например при получении антител к поверхностному антигену вируса гепатита В [85], человеческих моноклональных антител к вирусу бешенства [86] и к вирусу иммунодефицита человека [87]. Кроме полноразмерных моноклональных антител в растениях и растительных клетках могут успешно синтезироваться некоторые другие антитела, используемые в терапевтических целях: Fab-фрагменты, одноцепочечные Fvs (scFv), биспецифичные Fvs, тельца включения и однодоменные антитела [54]. В нашей стране осуществлена экспрессия генов рекомбинантных минимальных (мини-антител) антител к ферритину селезенки человека в виде слитого с барстаром белка в суспензионной культуре N. tabacum. [88].

В растительных системах производятся некоторые энзимы терапевтического или диагностического применения. Например, показана возможность получения в клетках BY-2 человеческой тканевой трансглутаминазы (htTG) – фермента, используемого для диагностики целиакии (глютеновой болезни) [89]. Человеческий лизоцим был синтезирован в клетках риса для потенциального использования в качестве антимикробной пищевой добавки [90]. Некоторые человеческие лизосомальные ферменты получены в клетках BY-2, включая α-идуронидазу, применяемую в заместительной терапии мукополисахаридоза I. Первым лекарственным препаратом для человека стала глюкоцереброзидаза (α-талиглюцефераза), синтезированная в генетически модифицированных клетках моркови компанией Protalix [91]. Крупнейшая фармацевтическая компания Пфайзер (Pfizer, США) стала первой из фармацевтических компаний, объявившей о выпуске на рынок препарата, синтезированного растительными клетками в биореакторах. Компания приобрела права на производство фермента α-талиглюцеферазы у израильской компании Protalix. По словам представителя компании [92], Пфайзер определила для себя стратегию по применению инновационной платформы для биосинтеза препаратов в культуре растительных клеток. Это важный шаг в направлении удешевления и увеличения эффективности производства биофармацевтических лекарств. На доклинический уровень уже вышли биологический аналог ингибитора фактора некроза опухоли альфа (этанерцепт) и кандидат для заместительной ферментной терапии болезни Фабри. Компания заинтересована в использовании данной платформы синтеза терапевтических агентов для лечения редких генетических заболеваний и других препаратов.

Разработаны способы получения различных цитокинов, ростовых факторов и гормонов в клетках томатов, табака, риса и картофеля. В клетках табака синтезированы биологически активные человеческие интерлейкины 2, 4, 18 и 12, а также человеческий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор [93, 94]. Гормон роста человека был синтезирован с высоким содержанием в клетках риса (57 мг/л) и табака (35 мг/л) [55, 95]. Показана возможность получения в растительных клетках некоторых других ростовых факторов, например эпидермального ростового фактора (hEGF) или инсулин-подобного ростового фактора (IGF-1), однако пока их продукция осуществляется на низком уровне [53, 96, 97].

В культурах растительных клеток, в частности, в клетках BY-2, синтезируются некоторые фармацевтические белки для диагностики и иммунотерапии, например аллерген пылевого клеща, в клетках риса – α1-антитрипсин и человеческий лактоферрин в клетках риса и моркови [41].

Особое значение имеют растительные системы для производства субъединичных вакцин, которые в отличие от традиционных вакцин, представлены только выбранными иммуногенными эпитопами возбудителя, способными вызвать иммунный ответ в организме. Уникальной особенностью вакцин, полученных в растительных системах, является тот факт, что одновременно растительные клетки могут служить и как средство доставки пероральных вакцин.

Первой вакциной для ветеринарии, полученной в растительной системе, стала вакцина против болезни Ньюкасла птиц, произведенная в культуре клеток табака NT-1 в Центре ветеринарной биологии в США (USDA Centre for Veterinary biologics) в 2006 году [98]. Многочисленные антигены были экспрессированы на основе платформы Concert™ Plant-Cell-Produced system, разработанной Dow AgroSciences, например термолабильный токсин E. coli, гемагглютинин нейраминидазы (HN), гемагглютенин (HA) птичьего гриппа и VP2 инфекционного бурсита (IBD). Эти полученные в растительных системах вакцины показали эффективный иммунный ответ у птиц и свиней и обеспечили высокую степень защиты животных от патогенов [98].

В ближайшем будущем получение рекомбинантного белка в суспензионных культурах растительных клеток, безусловно, станет наиболее часто используемой платформой из всех ныне применяемых растительных систем. Главенствующая поначалу идея использования целых растений была полностью пересмотрена после внедрения производства α-талиглюцеферазы в клетках моркови для применения взрослыми в 2012 году и для использования в педиатрии в 2014 году [91]. Этот успех открыл путь к полному принятию этой технологии. В настоящее время несколько новых продуктов проходят клинические испытания и, как ожидается, выйдут на рынок в ближайшем будущем. Еще одним фактором, способствующим продвижению растительных клеток в производство биофармацевтиков, является их более полное соответствие принципам GMP (“Good Manufacturing Practice” или “Надлежащая производственная практика”), по сравнению с целыми растениями, а также предпочтения обществом биопрепаратов производимых в культивируемых клетках, по сравнению с генетически модифицированными растениями.

Получение рекомбинантных белков в растительных системах по-прежнему сталкивается с одной из важнейших проблем – низкой продуктивностью по сравнению с культурами клеток млекопитающих. Однако это проблема существует главным образом вследствие более позднего появления растительных клеток как конкурентной платформы, а соответственно, меньшими инвестициями и меньшим опытом в направлении оптимизации процессов по сравнению с клетками млекопитающих. В настоящее время многие крупные фармакологические компании и исследовательские коллективы работают над решением этой проблемы. В связи с этим в ближайшее время ожидается серьезный прогресс в развитии производства и переработки рекомбинантных белков, включая оптимизацию питательных сред, инженерных процессов, биоинформационное и статистическое планирование эксперимента.

 

Данная работа выполнена в рамках бюджетного проекта № 0324-2016-0008 и проекта РФФИ №17-04-00452.

p, li { white-space: pre-wrap; }

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Persistence Market Research. Global Market Study on Biopharmaceuticals: Asia to Witness Highest Growth by 2020. New York, 2015.
  2. Twyman R.M., Stoger E., Schillberg S., Christou P., Fischer R. Molecular farming in plants: host systems and expression technology// Trends Biotechnol. 2003. V. 21. P. 570–578.
  3. Gomord V., Faye L. Posttranslational modification of therapeutic proteins in plants// Curr. Opin. Plant. Biol. 2004. V. 7. P. 171−181.
  4. Nagels B., Weterings K., Callewaert N., van Damme E.J.M. Production of plant made pharmaceuticals: from plant host to functional protein// Crit. Rev. Plant Sci. 2012. V. 31. P. 148−180.
  5. Schiermeyer A., Schillberg S. Plant molecular pharming – pharmaceuticals for human health //Encyclopedia of sustainability science and technology/ Ed. Meyers R.A.: Springer, 2012. P. 8126−8141.
  6. Huang T-K., McDonald K.A. Bioreactor engineering for recombinant protein production in plant cell suspension cultures // Biochemical Engineering Journal. 2009. V. 45. P. 168−184.
  7. Gleba Y., Klimyuk V., Marillonnet S. Viral vectors for the expression of proteins in plants// Curr. Opin. Biotechnol. 2007. V. 18. P. 134–141.
  8. Gelvin S.B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the “gene-jockeying” tool // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. V. 67. №1. P. 16−37.
  9. Rosales-Mendoza S., Tello-Olea M. A. Carrot cells: a pioneering platform for biopharmaceuticals production // Mol. Biotechnol. 2015. V. 57. P. 219–232.
  10. Daniell H., Chebolu S., Kumar S., Singleton M., Falconer R. Chloroplast-derived vaccine antigens and other therapeutic proteins // Vaccine 2005. V. 23. P. 1779–1783.
  11. Gleba Y., Klimyuk V., Marillonnet S. Magnifection − a new platform for expressing recombinant vaccines in plants // Vaccine. 2005. V. 23. P. 2042–2048.
  12. Desai P.N, Shrivastava N., Padh H. Production of heterologous proteins in plants: Strategies for optimal expression // Biotechnology Advances. 2010. V. 28. P. 427–435.
  13. Woodard S.L., Mayor J.M., Bailey M.R., Barker D.K., Love R.T., Lane J.R., Delaney D.E., McComas-Wagner J.M., Mallubhotla H.D., Hood E.E., Dangott L.J., Tichy S.E., Howard J.A. Maize (Zea mays)-derived bovine trypsin: characterization of the first large-scale, commercial protein product from transgenic plants // Biotechnol Appl. Biochem. 2003. V. 38. P. 123−130.
  14. Howard J.A. Commercialization of biopharmaceutical and bioindustrial proteins from plants // Crop Sci. 2005. V. 45. P. 468−472.
  15. Hollak C.E., vom Dahl S., Aerts J.M., Belmatoug N., Bembi B., Cohen Y., Collin-Histed T., Deegan P., van Dussen L., Giraldo P., Mengel E., Michelakakis H., Manuel J., Hrebicek M., Parini R., Reinke J., di Rocco M., Pocovi M., Sa Miranda M.C., Tylki-Szymanska A., Zimran A., Cox T.M. Force majeure: therapeutic measures in response to restricted supply of imiglucerase (Cerezyme) for patients with Gaucher disease // Blood Cells Mol. Dis. 2010. V. 44. P. 41−47.
  16. De Leede L.G., Humphries J.E., Bechet A.C., Van Hoogdalem E.J., Verrijk R., Spencer D.G. Novel controlled-release Lemna-derived IFN-alpha2b (Locteron): pharmacokinetics, pharmacodynamics, and tolerability in a phase I clinical trial // J. Interferon Cytokine Res. 2008. V. 28. P. 113−122.
  17. McCormick A.A., Reddy S., Reinl S.J., Cameron T.I., Czerwinkski D.K., Vojdani F., Hanley K.M., Garger S.J., White E.L., Novak J., Barrett J., Holtz R.B., Tusé D., Levy R. Plant-produced idiotype vaccines for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma: safety and immunogenicity in a phase I clinical study // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. P. 10131−10136.
  18. Fischer R., Schillberg S., Hellwig S., Twyman R.M., Drossard J. GMP issues for recombinant plant-derived pharmaceutical proteins // Biotechnol Adv. 2012. V. 30. P. 434−439.
  19. Hellwig S., Drossard J., Twyman R.M., Fischer R. Plant cell cultures for the production of recombinant proteins// Nat Biotechnol. 2004. V. 22. P. 1415–1422.
  20. Rybicki E.P. Plant-made vaccines for humans and animals // Plant Biotechnol J. 2010. V. 8. P. 620–637.
  21. Kaldis A., Ahmad A., Reid A., McGarvey B., Brandle J., Ma Sh., Jevnikar A., Kohalmi S.E., Menassa R. High-level production of human interleukin-10 fusions in tobacco cell suspension cultures // Plant Biotechnology Journal. 2013. V. 11. P. 535–545.
  22. Magnuson N.S., Linzmaier P.M., Reeves R., An G., HayGlass K., Lee J.M. Secretion of biologically active human interleukin-2 and interleukin-4 from genetically modified tobacco cells in suspension culture // Protein Expr. Purif. 1998. V. 13. P. 45−52.
  23. Firek S., Draper J., Owen M.R.L., Gandecha A., Cockburn B., Whitelam G.C. Secretion of a functional single-chain Fv protein in transgenic tobacco plants and cell suspension cultures // Plant Mol. Biol. 1993. V. 23. P. 861–870.
  24. Schillberg S., Raven N., Fischer R., Twyman R., Schiermeyer A. Molecular farming of pharmaceutical proteins using plant suspension cell and tissue cultures // Current Pharmaceutical Design. 2013. V. 19. P. 5531−5542.
  25. Пермякова Н.В., Уварова Е.А., Дейнеко Е.В. Состояние исследований в области создания растительных вакцин ветеринарного назначения// Физиология растений. 2015. Т. 62. № 1. С.28−44.
  26. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures // Physiol. Plantarum. 1962. V. 15. P. 473−497.
  27. Karwasara V.S., Dixit V.K. Culture medium optimization for camptothecin production in cell suspension cultures of Nothapodytes nimmoniana (J. Grah.) Mabberley // Plant Biotechnology Reports. 2013. V. 7. №3. P. 357–369.
  28. Steinitz B. Sugar alcohols display nonosmotic roles in regulating morphogenesis and metabolism in plants that do not produce polyols as primary photosynthetic products// J. Plant Physiol. 1999. V. 155. P. 1–8.
  29. Kim N.-S., Yu H.-Y., Chung N.-D., Kwon T.-H., Yang M-S. High-level production of recombinant trypsin in transgenic rice cell culture through utilization of an alternative carbon source and recycling system // Enzyme and Microbial Technology. 2014. V. 63. P. 21–27.
  30. Ullisch D.A., Müller C.A., Maibaum S., Kirchhoff J., Schiermeyer A., Schillberg S., Roberts J.L., Treffenfeldt W., Büchs J. Comprehensive characterization of Nicotiana tabacum BY-2 cell growth leads to doubled GFP concentration by media optimization // J. Biosci. Bioeng. 2012. V. 113. P. 242−248.
  31. Vasilev N., Gromping U., Lipperts A., Raven N., Fischer R., Schillberg S. Optimization of BY-2 cell suspension culture medium for the production of a human antibody using a combination of fractional factorial designs and the response surface method // Plant Biotechnology Journal. 2013. V. 11. P. 867–874.
  32. Lee J.H., Kim N.S., Kwon T.H., Yang M.S. Effects of osmotic pressure on production of recombinant human granulocyte-macrophage colonystimulating factor in plant cell suspension culture// EnzymeMicrobTechnol. 2002. V. 30. №6. P. 768–773.
  33. Glick B.R., Pasternak J.J. Molecular Biotechnology, third edition. Washtington: ASM Press, 2003, 784 p.
  34. Vaucheret H., Beclin C., Elmayan T., Feuerbach F., Godon C., Morel J.B., Mourrain P., Palauqui J.C., Vernhettes S. Transgene-induced gene silencing in plants// Plant J. 1998. V. 16. P. 651–659.
  35. Lessard P.A., Kulaveerasingam H., York G.M., Strong A., Sinskey A.J. Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants// Metab. Eng. 2002. V. 4. P. 67–79.
  36. Huang T.K., McDonald K.A. Bioreactor engineering for recombinant protein production in plant cell suspension cultures// Biochem. Eng. J. 2009. V. 45. P. 168–184.
  37. Santos R.B., Abranches R., Fischer R., Sack M., Holland T. Putting the spotlight back on plant suspension cultures // Front Plant Sci. 2016. 7:297.
  38. Grierson С., Du J.S., de Torres Zabala M., Beggs K., Smith C., Holdsworth M., Bevan M. Separate cis sequences and trans factors direct metabolic and developmental regulation of a potato tuber gene // Plant J. 1994. V. 5. P. 815−826.
  39. Zourelidou M., de Torres Zabala M., Smith C., Bevan M.W. Storekeeper defines a new class of plant-specific DNA-binding proteins and is putative regulator of patatin expression // Plant J. 2002. V. 30. P. 489−497.
  40. Atanassova R., Letterier M., Gaillard C., Agasse A., Sagot E., Coutos-Thevenot P., Delrot S. Sugar-regulated expression of a putative hexose transport gene in grape // Plant Physiol. 2003. V. 131. P. 326−334.
  41. Terashima M., Murai Y., Kawamura M., Nakanishi S., Stoltz T., Chen L., Drohan W., Rodriguez R.L., Katoh S. Production of functional human a1-antitrypsin by plant cell culture // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 52. P. 516−523.
  42. Kim N.S., Yu H.Y., Chung N.D., Shin Y.J., Kwon T.H., Yang M.S. Production of functional recombinant bovine trypsin in transgenic rice cell suspension cultures // Protein Expr Purif. 2011. V. 76. P. 121–126.
  43. Sasaki K., Yuchi O., Hiraga S., Gotoh Y., Seo S., MitsuharaI., Ito H., Matsui H., Ohashi Y. Characterization of two rice peroxidase promoters that respond to blast fungus-infection // Mol Genet Genomics. 2007. V. 278. P. 709−722.
  44. Yevtushenko D.P., Sidorov V.A., Romero R., Kay W.W., Misra S. Wound-inducible promoter from poplar is responsive to fungal infection in transgenic potato // Plant Sci. 2004. V. 167. P. 715−724.
  45. Rushton P.J., Reinstadler A., Lipka V., Lippok B., Somssich I.E. Synthetic plant promoter conteining defined regulatory elements provide novel insights into pathogen- and wound-induced signaling // Plant Cell. 2002. V. 14. P. 749−762.
  46. Saidi Y., Finka A., Chakhporanian M., Zry¨d J.P., Schaefer D.G., Goloubinoff P. Controlled expression of recombinant proteins in Physcomitrella patens by a conditional heat-shock promoter: a tool for plant research and biotechnology // Plant Mol. Biol. 2005. V. 59. P. 697–711.
  47. Sun A.Q., Yi S.Y., Yang J.Y., Zhao C.M., Liu J. Identification and сharacterization of a heat-inducible ftsH gene from tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) // Plant Sci. 2006. V. 170. P. 551–562.
  48. Lin H-H., Huang L-F., Su H.C., Jeng S.T. Effects of the multiple polyadenylation signal AAUAAA on mRNA 3′-end formation and gene expression // Planta. 2009. V. 230. №4. P. 699–712.
  49. Desai P.N., Neeta Sh., Harish P. Production of heterologous proteins in plants: Strategies for optimal expression // Biotechnology Advances. 2010. V. 28. P. 427–435.
  50. Вячеславова А.О., Бердичевец И.Н., Тюрин А.А., Шимшилашвили Х.Р., Мустафаев О.Н., Голденкова-Павлова И.В. Экспрессия гетерологичных генов в растительных системах: новые возможности // Генетика. 2012. Т. 48. №11. С. 1245–1259.
  51. Sharp J.M., Doran P.M. Strategies for enhancing monoclonal antibody accumulation in plant cell and organ cultures // Biotechnol. Prog. 2001. V. 17. P. 979–992.
  52. Outchkourov N.S., Rogelj B., Strukelj B., Jongsma M.A. Expression of sea anemone equistatin in potato. Effects of plant proteases on heterologous protein production // Plant Physiol. 2003. V. 133. P. 379–390.
  53. Wirth S., Calamante G., Mentaberry A., Bussmann L., Lattanzi M., Barañao L., Bravo-Almonacid F. Expression of active human epidermal growth factor (hEGF) in tobacco plants by integrative and non-integrative systems // Mol. Breed. 2004. V. 13. №1. P. 23–35.
  54. Shaaltiel Y., Hashmueli S., Bartfeld D., Baum G., Ratz T., Mizrachi E. System and method for production of antibodies in plant cell culture. United States Patent. Publication No. 20090082548. 2009.
  55. Kim T.G., Lee H.J., Jang Y.S., Shin Y.J., Kwon T.H., Yang M.S. Co-expression of proteinase inhibitor enhances recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor production in transgenic rice cell suspension culture // Protein Expr. Purif. 2008. V. 61. P. 117–121.
  56. Niemer M., Mehofer U., Torres Acosta J.A., Verdianz M., Henkel T., Loos A., Strasser R., Maresch D., Rademacher T., Steinkellner H., Mach L. The human anti-HIVantibodies 2F5, 2G12, and PG9 differint heir susceptibility to proteolytic degradation:down-regulation of endogenous serine and cysteine proteinase activities could improve antibody production in plant-based expression platforms // Biotechnol. J. 2014. V. 9. P. 493–500.
  57. Kim N.S., Kim T.G., Kim O.H., Ko E.M., Jang Y.S., Jung E.S., Kwon T.H., Yang M.S. Improvement of recombinant hGM-CSF production by suppression of cysteine proteinase gene expression using RNA interference in a transgenic rice culture // Plant Mol. Biol. 2008. V. 68. P. 263–275.
  58. Tsoi B., Doran P. Effect of medium properties and additives on antibody stability and accumulation in suspended plant cell cultures // Biotechnology and Applied Biochemistry. 2002. V. 35. №3. P. 171−180.
  59. Doran P.M. Loss of secreted antibody from transgenic planttissue cultures due to surface adsorption // Journal of Biotechnology. 2006. V. 122. P. 39–54.
  60. Calinski A., Classen B., Zoglauer K., Boehm R. IgG stability in fresh and conditioned medium of tobacco (Nicotiana tabacum) and larch (Larix decidu) embryogenic suspension cultures // Biotechnol. Lett. 2009. V. 31. P. 771–778.
  61. Gouda M.D., Thakur M.S., Karanth N.G. Stability studies on immobilized glucose oxidase using an amperometric biosensor − effect of protein based stabilizing agents // Electroanalysis. 2001. V. 13. P. 849–855.
  62. Lee J-H., Kim N-S., Kwon T-H., Jang Y-S., Yang M-S. Increased production of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (hGM-CSF) by the addition of stabilizing polymer in plant suspension cultures// J. Biotechnol. 2002. V. 96. P. 205–211.
  63. Nakanishi K., Sakiyama T., Imamura K. On the adsorption of proteins on solid surfaces, a common but very complicated phenomenon // J. Biosci. Bioeng. 2001. V. 91. P. 233–244.
  64. Imamura K., Shimomura M., Nagai S., Akamatsu M., Nakanish K. Adsorption characteristics of various proteins to a titanium surface // J Biosci. Bioeng. 2008. V. 106. P. 273–278.
  65. Седов К. А., Фоменков А. А., Соловьева А. И., Носов А. В., Долгих Ю. И. Уровень генетической изменчивости клеток в длительно культивируемой суспензии Arabidopsis thaliana // Известия РАН. Серия биологическая. 2014. №6. С. 565–572.
  66. Joersbo M. Advances in the selection of transgenic plants using non-antibiotic marker genes// Physiol. Plant. 2001. V. 111. №3. P. 269−272.
  67. Wang A.S., Evans R.A., Altendorf P.R., Hanten J.A., Doyle M.C., Rosichan J.L. A mannose selection system for production of fertile transgenic maize plants from protoplasts// Plant Cell Reports. 2000. V. 19. P. 654–660.
  68. Kirchhoff J., Raven N., Boes A., Roberts J. L., Russell S., Treffenfeldt W., Fischer R., Schinkel H., Schiermeyer A., Schillberg S. Monoclonal tobacco cell lines with enhanced recombinant protein yields can be generated from heterogeneous cell suspension cultures by flow sorting // Plant Biotechnology Journal. 2012. V. 10. P. 936–944.
  69. Bortesi L., Fischer R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond // Biotechnology Advances. 2015. V. 33. P. 41−52.
  70. Немудрый А.А., Валетдинова К.Р., Медведев С.П., Закиян С.М. Системы редактирования геномов TALEN и CRISPR/Cas – инструменты открытий // Acta naturae. 2014. Т. 6. №3. C.20–42.
  71. James E., Lee J. Loss and recovery of protein productivity in genetically modified plant cell lines // Plant Cell Reports. 2006. V. 25. №7. P. 723–727.
  72. Oey M., Lohse M., Scharff L.B., Kreikemeyer B., Bock R. Plastid production of protein antibiotics against pneumonia via a new strategy for high-level expression of antimicrobial proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. №16. P. 6579−6584.
  73. Ruhlman T., Ahangari R., Devine A., Samsam M., Daniell H. Expression of cholera toxin B-proinsulin fusion protein in lettuce and tobacco chloroplasts–oral administration protects against development of insulitis in non-obese diabetic mice // Plant Biotechnol. J. 2007. V. 5. P. 495–510.
  74. Scholtz O., Thiel A., Hillen W. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein // European Journal of Biochemistry. 2000. V. 267. №6. P. 1565−1570.
  75. Tregoning J.S., Clare S., Bowe F., Edwards L., Fairweather N., Qazi O., Nixon P.J., Maliga P., Dougan G., Hussell T. Protection against tetanus toxin using a plant-based vaccine // European Journal of Immunology. 2005. V. 35. P. 1320−1326.
  76. Michoux F., Ahmad N., Hennig A., Nixon P.J., Warzecha H. Production of leafy biomass using temporary immersion bioreactors: an alternative platform to express proteins in transplastomic plants with drastic phenotypes // Planta. 2013. V. 237. P. 903–908.
  77. Hampp C., Richter A., Osorio S., Zellnig G., Sinha A.K., Jammer A., Fernie A.R., Grimm B., Roitsch T. Establishment of a photoautotrophic cell suspension culture of Arabidopsis thaliana for photosynthetic, metabolic, and signaling studies // Mol Plant. 2012. V. 5. №2. P. 524−527.
  78. Hellwig S., Drossard J., Twyman R.M., Fischer R. Plant cell cultures for the production of recombinant proteins // Nat Biotechnol. 2004. V. 22. P. 1415–1422.
  79. Torres E., Vaquero C., Nicholson L., Sack M., Stoger E., Drossard J. Rice cell culture as an alternative production system for functional diagnostic and therapeutic antibodies // Transgenic Res. 1999. V. 8. P. 441–449.
  80. Smith M.L., Mason H.S., Shuler M.L. Hepatitis B surface antigen (HBsAg) expression in plant cell culture: kinetics of antigen accumulation in batch culture and its intracellular form // Biotechnol Bioeng. 2002. V. 80. P. 812–822.
  81. Kwon T.H., Kim Y.S., Lee J.H., Yang M.S. Production and secretion of biologically active human granulocyte-macrophage colony stimulating factor in transgenic tomato suspension cultures // Biotechnol Lett. 2003. V. 25. P. 1571–1574.
  82. Muynck B., de Navarre C., Boutry M. Production of antibodies in plants: status after twenty years // Plant Biotechnol J. 2010. V. 8. P. 529−563.
  83. Hiatt A., Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plants // Nature. 1989. V. 342. P. 76–78.
  84. Larrick J.W., Yu L., Naftzger C., Jaiswal S., Wycoff K. Production of secretory IgA antibodies in plants // Biomol Eng. 2001. V. 18. P. 87–94.
  85. Yano A., Maeda F., Takekoshi M. Transgenic tobacco cells producing the human monoclonal antibody to hepatitis B virus surface antigen // J. Med. Virol. 2004. V. 73. P. 208–215.
  86. Girard L.S., Fabis M.J., Bastin M., Courtois D., Petiard V., Koprowski H. Expression of a human anti-rabies virus monoclonal antibody in tobacco cell culture // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. V. 345. P. 602–607.
  87. Holland T., Sack M., Rademacher T., Schmale K., Altmann F., Stadlmann J. Optimal nitrogen supply as a key to increased and sustained production of a monoclonal full-size antibody in BY-2 suspension culture // Biotechnol. Bioeng. 2010. V. 107. P. 278–289.
  88. Семенюк Е.Г., Стремовский О.А., Орлова И.В., Баландин Т.Г., Носов А.М., Бурьянов Я.И., Деев С.М., Петров Р.В. Биосинтез миниантител к ферритину человека в растительных и бактериальных продуцентах // Молекулярная биология. 2003. Т. 37. C. 916−923.
  89. Sorrentino A., Schillberg S., Fischer R., Rao R., Porta R., Mariniello L. Recombinant human tissue transglutaminase produced into tobacco suspension cell cultures is active and recognizes autoantibodies in the serum of coeliac patients // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2005. V. 37. P. 842–851.
  90. Huang J.M., Wu L.Y., Yalda D., Adkins Y., Kelleher S.L., Crane M. Expression of functional recombinant human lysozyme in transgenic rice cell culture // Transgenic Res. 2002. V. 11. P. 229–239.
  91. Tekoah Y., Shulman A., Kizhner T., Ruderfer I., Fux L., Nataf Y., Bartfeld D., Ariel T., Gingis–Velitski S., Hanania U., Shaaltiel Y. Large-scale production of pharmaceutical proteins in plant cell culture − the protalix experience // Plant Biotechnology Journal. 2015. V. 13. P. 1199–1208.
  92. http://gmpnews.ru
  93. Gutierrez-Ortega A., Sandoval-Montes C., Olivera-Flores T.D., Santos-Argumedo L., Gomez-Lim M.A. Expression of functional interleukin-12 from mouse in transgenic tomato plants // Transgenic Res. 2005. V. 14. P. 877–885.
  94. Ma J.K., Drossard J., Lewi D., Altmann F., Boyle J., Christou P. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants // Plant Biotechnol. J. 2015. V. 13. P. 1106–1120.
  95. Xu J.F., Okada S., Tan L., Goodrum K.J., Kopchick J.J., Kieliszewski M.J. Human growth hormone expressed in tobacco cells as an arabinogalactan-protein fusion glycoprotein has a prolonged serum life // Transgenic Res. 2010. V. 19. №5. P. 849–867.
  96. Xu J., Zhang N. On the way to commercializing plant cell culture platform for biopharmaceuticals: present status and prospect // Pharm. Bioprocess. 2014. V. 2. №6. P. 499–518.
  97. Parsons J., Wirth S., Dominguez M., Bravo-Almonacid F., Giulietti A.M., Rodriguez Talou J. Production of human epidermal growth factor (hEGF) by in vitro cultures of Nicotiana tabacum: effect of tissue differentiation and sodium nitroprusside addition // Int J Biotechnol. Biochem. 2010. V. 6. P. 131–138.
  98. Mihaliak C.A., Webb S.R. Plant-cell-produced vaccines for animal health // Feedinfo News Serv. 2005. V. 9. P. 1–4.
p, li { white-space: pre-wrap; }

Таблица 1. Преимущества и недостатки суспензионных клеточных культур по сравнению с другими экспрессионными системами

 

Экспрессионная система

 

Культура растительных клеток

Достоинства

Недостатки

Целые растения

- Короткий цикл культивирования

- Простая процедура отделения и очистки продукта

- Улучшение качества белкового продукта

- Меньшее количество законодательных и экологических препятствий

- Сложности масштабирования процесса

- Более высокая стоимость культивирования

- Генетическая нестабильность клеток

 

 

 

 

Транзиентная экспрессия

- Более простая технология трансформации

- Простая процедура выделения и очистки продукта

- Более длительный период наработки продукта

- Более низкий выход продукта

Клетки млекопитающих/насекомых

- Более низкая стоимость культивирования

- Отсутствие опасности контаминации вирусами

- Более низкий выход продукта

- Специфическое гликозилирование

Дрожжи

Возможность синтеза сложных белков

- Более низкий выход продукта

- Более низкие темпы роста

E. coli

- Корректный фолдинг белковых молекул

- Наличие гликозилирования

- Отсутствие опасности контаминации эндотоксинами

- Более низкий выход продукта

- Более низкие темпы роста

Таблица 2. Некоторые биофармацевтические белки, синтезированные в растительных клетках

 

Продукт

Вид растения

Ссылка

Антитела

Иммуноглобулины sIgA, IgG4, IgG1

N. tabacum cv. BY-2

[84, 54]

Против поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg mAb)

N. tabacum cv. BY-2

[85]

Против вируса бешенства

N. tabacum cv. Xanthi

[86]

Против поверхностного антигена ВИЧ (2G12)

N. tabacum cv. BY-2

[87]

Терапевтические энзимы

Трансглютаминаза человека (htTG)

N. tabacum cv. BY-2

[89]

Лизоцим

O. sativa

[90]

Глюкоцереброзидаза

D. carota

[91]

ДНКаза I (DNase I)

D. carota

[96]

Гормоны и цитокины

Интерлейкины IL2, 4, 12, 18

O. sativa, N. tabacum cv. BY-2

[93, 94, 96]

Эпидермальный ростовой фактор человека (hEGF)

O. sativa, N. tabacum cv. BY-2

[53, 96]

Инсулиноподобный фактор-1 (IGF-1)

N. tabacum cv. BY-2

[96]

Гранулоцит макрофаг колониестимулирующий фактор человека (hGM-CSF)

O. sativa

[96]

Вакцины

Гемагглютинин-нейраминидазы (HN)

N. tabacum cv. BY-2

[98]

Гемагглютенин (HA)

N. tabacum cv. BY-2

[98]

E. coli термолабильный токсин

N. tabacum cv. BY-2

[98]

Другое

α1-антитрипсин

O. sativa

[41]

Лактоферрин

Acanthopanax senticosus

[41]

Бриодин-1 (BD1)

N. tabacum cv. BY-2

[96]