УДК 581.1

АКТИВНОСТЬ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ ПЕРОКСИД ВОДОРОДА ФЕРМЕНТОВ ПРИ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОМ ЗАКАЛИВАНИИ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ, ТРАНСФОРМИРОВАННОГО ГЕНОМ desA Δ12-АЦИЛ-ЛИПИДНОЙ ДЕСАТУРАЗЫ

© 2018 г. Н. В. Нарайкина, М. С. Синькевич*, А. Н. Дерябин, Т. И. Трунова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Поступила в редакцию 29.05.2017 г.

Изучали изменения активности ферментов, нейтрализующих пероксид водорода (H2O2), в условиях длительного действия низких закаливающих температур, а также влияние Δ12-ацил-липидной десатуразы на эти процессы. Объектом исследования служили нетрансформированные растения (контроль) типичного представителя группы холодостойких растений – картофеля клубненосного (Solanum tuberosum L., cорт Десница) и линия, трансформированная конструкцией, несущей целевой ген desA Δ12-ацил-липидной десатуразы цианобактерии Synechocystis sp. РСС (desA-licBM3 растения). Растения закаливали при температуре 5оС в течение 6 суток на свету интенсивностью 50 мкмоль квантов/(м2·с). Показано, что закаливание способствовало повышению устойчивости растений к последующим заморозкам, при этом desA-licBM3 растения по уровню устойчивости превосходили контрольные. У обеих линий среди изученных ферментов, нейтрализующих H2O2, наибольшей активностью в период закаливания отличались растворимые пероксидазы III типа (далее по тексту – гваякол пероксидазы), наименьшей – I типа (аскорбатпероксидаза). В первые сутки действия закаливающей температуры активность каталазы повышалась вдвое у контрольных и вчетверо у desA-licBM3 растений, однако двукратного повышения активности каталазы у контрольных растений, по-видимому, было недостаточно для того, чтобы скомпенсировать накопление H2O2 в этот период. Наблюдаемое у desA-licBM3 растений повышение активности каталазы, а также высокая активность гваякол пероксидаз способствовали снижению уровня H2O2 по сравнению с исходными значениями. С использованием электрофоретического анализа впервые выявлено в листьях обеих линий картофеля две изоформы каталазы – КАТ1 и КАТ2, при этом в период закаливания относительная значимость КАТ1 для суммарной активности была выше, чем КАТ2. Сделано заключение, что содержание H2O2 при длительном низкотемпературном закаливании растений картофеля определяется высокой активностью гваякол пероксидаз и каталазы класса 1, обеспечивающей энергонезависимое разложение H2O2. При этом активность нейтрализующих H2O2 ферментов у трансформантов, обогащенных мембранными липидами с преимущественным содержанием полиненасыщенных жирных кислот, существенно повышалась по сравнению с контролем, что обеспечило им более эффективную реализацию процесса закаливания.

 

Ключевые слова: десатураза – каталаза – картофель – низкие температуры – перекись водорода – пероксидазы – трансформированные растения – устойчивость

 

___________________________

Сокращения: СОД – супероксиддисмутаза; КАТ1, КАТ2 – изоформы каталазы.

*Адрес для корреспонденции: Синькевич Максим Сергеевич. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Электронная почта: sinkevich_m@mail.ru

 

ВВЕДЕНИЕ

Низкая температура оказывает влияние на все процессы жизнедеятельности растений, определяет их географическое распределение на Земле и является одним из основных экологических факторов, ограничивающих их сельскохозяйственную продуктивность. Несмотря на существенные достижения в области исследования физиологических и молекулярных основ низкотемпературной адаптации растений [13], изучение механизмов формирования устойчивости к низкой температуре остается актуальной проблемой физиологии растений. Принимая во внимание, что по уровню устойчивости к низкой температуре растения принято делить на три группы (теплолюбивые, холодостойкие и морозостойкие), следует отметить наибольшие успехи в изучении процессов закаливания теплолюбивых и, особенно, морозостойких растений [25], тогда как группа холодостойких растений в этом отношении остается менее изученной [6].

Ранее была показана важная роль Δ12-ацил-липидной десатуразы в повышении конститутивной (без низкотемпературного закаливания) холодоустойчивости растений картофеля, экспрессирующих ген desA, кодирующий Δ12-ацил-липидную десатуразу цианобактерий [7]. Демин с соавт. [7] предположили, что одним из механизмов влияния чужеродной десатуразы на устойчивость трансформированных растений к низкой температуре является изменение жирнокислотного состава мембранных липидов таким образом, что при понижении температуры мембраны, особенно относящиеся к электрон-транспортным цепям (ЭТЦ), сохраняют свою текучесть и функциональную активность, предотвращая избыток генерации активных форм кислорода (АФК) и развитие окислительного стресса.

Известно, что уровень окислительного стресса определяется равновесием между образованием АФК, главным образом в результате побочных процессов с участием ЭТЦ и различных окислительно-восстановительных реакций, и их утилизацией антиоксидантной системой. В составе антиоксидантной системы присутствуют как низкомолекулярные соединения, так и ферменты, при этом роль последних считается определяющей [8]. Важно отметить, что среди антиоксидантных ферментов только супероксиддисмутаза (СОД, КФ 1.15.1.1) перехватывает радикальную форму АФК – супероксидный анион-радикал (О2-), в то время как другие ферменты (каталаза, пероксидазы различных типов) нейтрализуют химически более стабильную форму АФК – пероксид водорода (H2O2). Ранее было показано, что в ответ на повышенную генерацию О2- в первые сутки закаливания при 5оС растений картофеля активность СОД возрастала и в дальнейшем колебалась в соответствии с изменениями генерации АФК [9]. В целом, низкотемпературное закаливание растений картофеля протекало при условии сохранения равновесия между образованием О2- и его утилизацией СОД, что позволяет избежать интенсификации перекисного окисления мембранных липидов [10]. Однако выявленный баланс между этими процессами не приводит к полной нейтрализации АФК, а лишь переводит более активный О2- в менее активную форму – H2O2. В связи с этим необходимо было изучить, как в период низкотемпературного закаливания изменяется содержание H2O2 и активность нейтрализующих его ферментов. Цель работы – исследование изменения активности антиоксидантных ферментов, нейтрализующих H2O2, в условиях продолжительного действия закаливающих температур, а также выявление роли Δ12-ацил-липидной десатуразы в этом процессе у растений картофеля.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служили нетрансформированные растения (контроль) типичного представителя группы холодостойких растений – картофеля клубненосного (Solanum tuberosum L., cорт Десница) и линия, трансформированная конструкцией, несущей ген desA Δ12-ацил-липидной десатуразы цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 (линия 3), мембраны которой, согласно ранее полученным данным, были обогащены липидами с высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) [11]. В данной конструкции последовательность гена десатуразы была трансляционно слита с последовательностью репортерного гена licBM3, кодирующего термостабильную лихеназу (далее desA-licBM3 растения). Наличие и экспрессия введенного гена desA ∆12-ацил-липидной десатуразы в desA-licBM3 растениях были подтверждены методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), в том числе с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), т.е. по образованию матричной РНК [11].

Растения выращивали в течение 8 недель на минеральной среде “перлит” с периодической подкормкой удобрением “Кемира-Люкс” (ЗАО “Кемира Агро”, Россия) при температуре 22оС и 16/8 ч фотопериоде с освещенностью 100 мкмоль квантов/(мс). Закаливание проводили при температуре 5 ± 0.5°С в течение 6 суток, согласно нашим предыдущим работам [10, 12]. Изменения устойчивости при закаливании растений картофеля определяли ежесуточно после промораживания при температуре –7°С в течение 20 мин путем измерения выхода электролитов из клеток листьев в соответствии с методом [13], подробно изложенным нами ранее [10]. Устойчивость выражали в процентах к максимальному выходу электролитов, измеренному после кипячения, по формуле (100 – EL)%, где EL = 100% (Eохл – Еисх) / Екип, что соответствует показателям выхода электролитов после охлаждения, до охлаждения и после кипячения образцов, соответственно. Содержание перекиси водорода (H2O2) измеряли по реакции с хлоридом титана (TiCl4), как описано ранее [10], и выражали в мкМ / г сырой массы.

Для выделения белка навеску листьев массой 500 мг гомогенизировали в жидком азоте, помещали в пробирку и затем приливали два объема среды выделения, содержащей 50 мМ Трис-НСl (рН 7.6), 3 мМ ЭДТА, 250 мМ сахарозу, 3.6 мМ цистеин, 5 мМ аскорбиновую кислоту, 3 мМ MgCl2, 2 мМ ДТТ, 2 мМ ФМСФ. Все последующие операции по выделению белка проводили при температуре 4оС. Образцы центрифугировали в течение 20 мин при 16000 g. Супернатант очищали на колонках PD-10 midiTrap G-25 (“GE Healthcare”, США). Колонки предварительно промывали 15 мл охлажденного 50 мМ Трис-НСl (рН 7.6), в них загружали 1 мл супернатанта, затем промывали 1.5 мл того же буфера и собирали 1.5 мл элюата. Полученный элюат использовали для определения общей активности каталазы и пероксидаз, а также изоферментов каталазы в геле нативного электрофореза.

Активность растворимых пероксидаз III типа, реагирующих с гваяколом (КФ 1.11.1.7, далее по тексту – гваякол пероксидазы), определяли по методу [14] с модификациями. Метод основан на окислении гваякола до тетрагваякола. Для этого навеску листьев (300 мг) гомогенизировали в 5 мл фосфатного буфера (50 мМ, pH 7.0). Полученный гомогенат центрифугировали 20 мин при 3000 g. К 0.3 мл супернатанта добавляли 0.3 мл 0.15 мМ гваякола и 0.9 мл фосфатного буфера (50 мМ, pH 5.5). Перед измерением оптической плотности в кювету добавляли 0.3 мл 0.1 мМ H2O2. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Genesys 10 (“Thermo Fisher Scientific”, США) при λ = 470 нм против фосфатного буфера (50 мМ, pH 5.5) с интервалом в 10 с. Активность гваякол пероксидазы рассчитывали по формуле:

А = ∆D n m / Е,

где А – активность, мкМ тетрагваякола / (г сырой массы мин); n – разведение; m – масса навески, г; Е – коэффициент экстинкции тетрагваякола, равный 5.6 105 моль-1 см-1; ΔD – изменение поглощения за 1 мин – в единицах оптической плотности.

Активность аскорбатпероксидазы (КФ 1.11.1.11) определяли по методу [15] с модификациями. Определение основано на измерении скорости убывания аскорбата в реакции, катализируемой аскорбатпероксидазой. В реакционную смесь входило 0.3 мл белкового экстракта, 50 мкл 5 мМ аскорбата, 50 мкл 0.1 мМ ЭДТА и 2.55 мл фосфатного буфера (60 мМ, pH 7.7). Перед измерением оптической плотности в кювету добавляли 100 мкл 0.1 мМ H2O2. Оптическую плотность измеряли при λ = 290 нм против буферного раствора с добавлением 100 мкл 0.1 мМ H2O2. Интервал в снятии показаний прибора составлял 10 с. Активность аскорбатпероксидазы рассчитывали по формуле A = (∆D Vcp) / (m E), где A – активность аскорбатпероксидазы (мМ аскорбата/(г сырой массы мин)); ∆D – скорость изменения оптической плотности при 290 нм (ед. опт. плотности / мин), Vcp – объем реакционной среды, m – сырая масса (г), Е – коэффициент молярной экстинкции аскорбата равный 2.8 мМ-1 см-1.

Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) измеряли по скорости реакции разложения H2O2, согласно методике [14]. Для этого навеску листьев (150 мг) гомогенизировали в 1 мл фосфатного буфера (50 мМ, pH 7.0), затем центрифугировали 20 мин при 3000 g. Брали 100 мкл супернатанта и добавляли 2.8 мл фосфатного буфера. Реакцию запускали добавлением 100 мкл 0.1 М H2O2 и измеряли оптическую плотность при λ = 240 нм через каждые 10 секунд. Контролем служил чистый фосфатный буфер (50 мМ, pH 7.0). Активность каталазы рассчитывали по формуле:

D n / (39.4 l m),

где ∆D – изменение поглощения за 1 мин в единицах оптической плотности, n – разведение, m – масса навески, l – длина кюветы (1 см), коэффициент молярной экстинкции H2O2 – 39.4 105 моль-1 см-1 [16], и выражали в мкМ разложившейся H2O2/(г сырой массы мин).

Для определения изоферментного состава каталазы проводили электрофорез по методу [17] в 10% полиакриламидном геле на приборе Mini PROTEAN Tetra (“Bio-Rad”, США); толщина геля – 0.75 мм. В лунки вносили образцы с нормированным содержанием белка – по 5 мкг, с добавлением сахарозы для “утяжеления” образца и 2 мкл 0.5% бромфенолового синего. Электрофорез проводили при температуре 4°С в течение 20 ч при напряжении 80 В. Для проверки эффективности выравнивания белковых проб один из гелей окрашивали в течение 1 ч 0.1% Кумасси G-250, предварительно зафиксировав его в течение 30 мин в растворе, в состав которого входили 10% (NH4)2SO4, 3% H3PO4 и 20% этанол, согласно процедуре [18].

Окрашивание геля проводили по методу, основанному на восстановлении гексацианоферрата (III) калия (K3(Fe(CN)6)) перекисью водорода до гексацианоферрата (II) калия (K4(Fe(CN)6)) и последующей реакцией гексацианоферрата (II) калия с хлоридом железа (III) (FeCl3) с образованием окрашенного соединения – берлинской лазури [19]. Каталаза разлагает H2O2, поэтому в местах ее расположения окрашивания не происходит. Для визуализации изоферментов каталазы гель инкубировали в 4 мМ растворе H2O2 в Трис-НСl буфере (50 мМ, рН 7.6) в течение 5 мин, промывали в буферном растворе и проводили специфическое окрашивание на активность каталазы в растворе, содержащем 1% гексацианоферрата (III) калия и 1% хлорида железа (III). Гели инкубировали в растворе до появления светлых полос на зеленом фоне (примерное время реакции 5 мин). Гели сканировали, инвертировали и анализировали с помощью программы One-DScan V. 1.3 (Scanalitics, CSP Inc.). Об активности каталазы судили по степени обесцвечивания фона.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы SigmaPlot 11 со встроенным анализом (применяли критерий Стьюдента для непарных выборок, Р = 0.05). На графиках представлены средние значения опыта, состоящего из трех-пяти биологических (по несколько растений) повторностей, и их стандартные ошибки. Аналитическая ошибка, согласно техническим паспортам приборов, не превышала 0.001.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для выявления изменений в холодоустойчивости растений картофеля в процессе длительного закаливания (5°С, 6 суток) был применен метод прямого кратковременного действия отрицательными температурами, не вызывающими гибели, но приводящими к внутриклеточным повреждениям, степень которых оценивали по выходу электролитов из тканей листьев. Установлено, что 20-минутная экспозиция растений при температуре –7°С была оптимальной для выявления различий в их устойчивости. С использованием такого режима было показано, что холодоустойчивость как контрольных, так и трансформированных растений в процессе закаливания постепенно повышалась, причем у последних она была выше и быстрее выходила на плато (рис. 1).

Содержание H2O2 у обеих линий растений в незакаленном состоянии почти не различалось (1.2 и 1.5 мкМ/г сырой массы у контрольных и desA-licBM3 растений, соответственно) (рис. 2). В первые сутки низкотемпературного закаливания содержание H2O2 в листьях контрольных растений возрастало примерно на 50%, затем к третьим суткам оно заметно снижалось, а к шестым суткам снова увеличивалось. В отличие от контроля, у desA-licBM3 растений в начале закаливания наблюдалось даже сильное снижение содержания H2O2, а к шестому дню оно несколько увеличилось.

Известно, что накопление H2O2 может приводить к образованию ряда более активных и, следовательно, более токсичных АФК, например, радикала ˙ОН [20]. Поэтому в клетке имеются ферменты пероксидазы и каталаза, нейтрализующие H2O2. Пероксидазы характеризуются высокой реакционной способностью и специфичностью к широкому спектру субстратов. Наиболее распространенными субстратами, на которые действуют пероксидазы, являются полифенолы в свободном состоянии и в форме различных сложных соединений (гликозиды, дубильные вещества), а также ароматические амины (для гваякол пероксидаз) и аскорбиновая кислота (для аскорбатпероксидазы) [8]. Независимо от относительного содержания субстратов, в клетках растений обычно обнаруживаются пероксидазы всех типов. Так, функции гваякол пероксидаз связывают не только с необходимостью защиты клеток растений от высокого уровня перекисных соединений, но и с синтезом биополимеров, например, лигнина и суберина. Некоторые пероксидазы участвуют в синтезе флавинов, антоцианов и других родственных им соединений, обладающих антиоксидантым действием [8]. В зависимости от места локализации в растительных клетках различают растворимые (вакуоль, цитоплазма), ионно-связанные (мембраны и клеточная стенка) и ковалентно-связанные (клеточная стенка) формы пероксидаз, каждая из которых представлена многими изоферментами [21]. Наличие изоферментов расширяет границы функционирования пероксидаз, что является приспособительным механизмом. Среди многочисленных форм пероксидаз растворимые гваякол пероксидазы характеризуются более выраженными антиоксидантными функциями [22]. Особо следует выделить компенсаторное влияние пероксидаз на уровень АФК в условиях действия различных неблагоприятных факторов, однако данных об активности пероксидаз в условиях низкотемпературного закаливания недостаточно [23, 24].

Как показали наши исследования, до закаливания в листьях desA-licBM3 растений суммарная активность растворимых гваякол пероксидаз была примерно в 2 раза выше, чем у контроля (рис. 3а). К третьим суткам закаливания у обеих линий было отмечено одинаково существенное повышение активности этих ферментов, но по абсолютной величине оно было выше у трансформантов. К концу закаливания у контрольных растений, в отличие от трансформантов, активность гваякол пероксидаз заметно снижалась, что совпадает с повышением у них содержания пероксида водорода (рис. 2). Таким образом, динамика активности гваякол пероксидаз у desA-licBM3 растений свидетельствует о том, что в течение всего периода закаливания они были способны нейтрализовать большее количество H2O2, чем контрольные растения, что могло быть одной из причин формирования ими более высокого уровня устойчивости. В литературе имеются данные о достаточно высокой положительной корреляции между активностью гваякол пероксидаз и степенью морозостойкости ряда генотипов более устойчивого, чем картофель, вида – озимой пшеницы [25]. Также следует учесть, что пероксидазы синтезируют множество веществ, являющихся низкомолекулярными антиоксидантами (флавины, антоцианы и др.). Кроме того, можно предположить, что после прохождения определенной стадии закаливания (3 суток) происходит увеличение пула или изоформ пероксидаз, являющихся одним из важных отличий закаленных и незакаленных растений. Активность аскорбатпероксидазы у обеих линий в незакаленном состоянии была на порядок ниже активности гваякол пероксидазы и не претерпевала существенных изменений в процессе низкотемпературного закаливания, за исключением ее снижения в первые сутки (рис. 3б).

Активность каталазы в период низкотемпературного закаливания у контрольных и desA-licBM3 растений имела сходную динамику (рис. 4а), но существенно различаясь по амплитуде колебаний. В первые сутки закаливания активность каталазы у контрольных растений возрастала с 2 до 5 мкМ H2O2/(г сырой массы мин), а у desA-licBM3 растений с 1.5 до 8.5 мкМ H2O2/(г сырой массы мин). Повышение активности каталазы в 4 и более раз, которое наблюдалось у desA-licBM3 растений, соответствовало снижению содержания H2O2, по сравнению с исходными значениями (рис. 2). Видимо, выявленное нами более чем двукратное повышение активности каталазы у контрольных растений было недостаточным для компенсации накопления H2O2 в начале закаливания. В целом, у обеих линий картофеля в процессе низкотемпературного закаливания динамика общей активности каталазы соответствовала изменениям содержания H2O2 (рис. 2 и 4а).

Известно, что каталаза обладает уникальным среди Н2О2-нейтрализующих ферментов свойством утилизировать H2O2 без участия восстановленных клеточных эквивалентов, т.е. клетки обеспечиваются энергоэффективным механизмом удаления Н2О2. В случае, когда при действии стрессорного фактора, например, низкой температуры, создается дефицит энергии и быстро происходит генерация Н2О2, ее разложение каталазой идет по энергосберегающему пути, что обеспечивает сохранение восстановленных эквивалентов и энергии, необходимых для синтеза протекторных белков и липидов [26–28]. Согласно литературным данным, в листьях растений выявлено несколько изоформ каталазы [29]. Для понимания их роли в утилизации Н2О2 в период низкотемпературного закаливания растений картофеля мы попытались определить активности каждой изоформы с помощью электрофореза в неденатурирующих условиях с последующим специфическим окрашиванием для их идентификации (рис. 4б).

Следует отметить, что современная номенклатура генов каталаз является потенциальным источником затруднений при сравнении разных видов растений, так как основывается на названии генов табака, предложенном Willekens с соавт. в 1995 г. [29]. Установлено, что гены каталаз класса 1 экспрессируются строго в фотосинтетических тканях, гены каталаз класса 2 связаны с тканями сосудов, а гены каталаз класса 3 особенно заметно экспрессируются в семенах и репродуктивных органах [30]. Наблюдаемые в таблице 1 небольшие расхождения в нумерации изоформ каталазы обусловлены тем, что их изоферментный спектр для каждого из приведенных видов растений изучался по отдельности различными исследовательскими группами, что обобщено в работе Mhamdi с соавт. [30]. Только в более поздних работах становится более общепринятым для разных авторов правилом называть первой (КАТ1) изоформу фотосинтетических тканей, второй (КАТ2) – изоформу, встречающуюся в сосудах, а третьей (КАТ3) – изоформу репродуктивных органов.

В картофеле нами было выявлено две изоформы каталаз, активность которых и предполагалось увидеть в листьях этих растений. Согласно данным литературы, у растений табака и арабидопсиса активность каталазы класса 1 составляет бóльшую долю общей активности фермента в листьях [30], поэтому полосу с большей активностью мы отнесли к каталазам класса 1 и обозначили ее как КАТ1, а полосу с меньшей активностью − КАТ2. Из рисунка 4б видно, что в первые и вторые сутки закаливания обеих линий наиболее интенсивно были окрашены полосы КАТ1, затем интенсивность ее окрашивания снижалась. Полосы КАТ2 были менее интенсивно окрашены и меняли свою окраску неоднократно в течение всего периода закаливания, причем у контрольных и desA-licBM3 растений в различном порядке. Краткосрочное усиление интенсивности окрашивания КАТ2 не приводило к существенным колебаниям общей активности каталазы, тогда как динамика изменений интенсивности окрашивания КАТ1 в целом с общей активностью совпадала. Оцифровка изображения в программе One-DScan (табл. 2) подтвердила визуальную оценку данных о том, что в первые двое суток низкотемпературного закаливания как контрольных, так и desA-licBM3 растений активность изоформы каталазы КАТ1 возрастала и поддерживалась на более высоком уровне по сравнению с активностью КАТ2 на протяжении всего периода закаливания. Таким образом, показано, что при закаливании обеих линий картофеля изоформа каталазы КАТ1 вносила определяющий вклад в общую активность фермента.

На основании полученных данных можно сделать заключение, что в период длительного низкотемпературного закаливания растений картофеля содержание Н2О2 регулируется, прежде всего, достаточно высокой активностью гваякол пероксидаз, а также каталазы класса 1. Более высокая, по сравнению с контрольными растениями, активность гваякол пероксидаз и каталазы при закаливании desA-licBM3 растений не только стабилизировали содержание Н2О2 в оптимальных пределах, но даже снижали ее количество. По-видимому, вследствие модифицированного липидного состава функциональных мембран [13], desA-licBM3 растения имели значительную преадаптацию к действию низкой закаливающей температуры, что позволило им в большей степени повысить активность антиоксидантных ферментов, нейтрализующих Н2О2.

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грант №16-34-01378 мол_а)

 

p, li { white-space: pre-wrap; }

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Туманов И.И. Физиология закаливания и зимостойкости растений. М.: Наука, 1979. 350 с.

2. Титов А.Ф., Акимова Т.В., Таланова В.В., Топчиева Л.В. Устойчивость растений в начальный период действия неблагоприятных температур. М.: Наука, 2006. 143 с.

3. Войников В.К. Энергетическая и информационная системы растительных клеток при гипотермии. Новосибирск: Наука, 2013. 212 с.

4. Лукаткин А.С. Холодовое повреждение теплолюбивых растений и окислительный стресс. Саранск: Изд-во Морд. ун-та, 2002. 208 с.

5. Levitt J. Responses of plants to environmental stresses. V.1. Chilling, freezing and high temperature stresses. N.Y.: Acad. Press, 1980. 426 p.

6. Трунова Т.И. Растение и низкотемпературный стресс. 64-е Тимирязевское чтение. М.: Наука, 2007. 54 с.

7. Дёмин И.Н., Дерябин А.Н., Синькевич М.С., Трунова Т.И. Введение гена desА Δ12-ацил-липидной десатуразы цианобактерии повышает устойчивость растений картофеля к окислительному стрессу, вызванному гипотермией // Физиология растений. 2008. Т. 55. С. 710–720.

8. Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance // Trends Plant Sci. 2002. V. 7. P. 405–410.

9. Нарайкина Н.В., Синькевич М.С., Демин И.Н., Селиванов А.А., Мошков И.Е., Трунова Т.И. Изменения активности изоформ СОД при низкотемпературной адаптации у растений картофеля (Solanum tuberosum L.) дикого типа и трансформированных геном Δ12-ацил-липидной десатуразы // Физиология растений. 2014. Т. 61. С. 359–366.

10. Синькевич М.С., Нарайкина Н.В., Трунова Т.И. Процессы, препятствующие повышению перекисного окисления липидов у холодостойких растений при гипотермии // Физиология растений. 2011. Т. 58. С. 875–882.

11. Demin I.N., Shimshilashvili C.R., Yur’eva N.O., Naraykyna N.М., Goldenkova-Pavlova I.V., Los D.A., Nosov A.M., Trunova T.I. Overexpression of the acyl-lipid Δ12-desaturase gene protects potato plants from low temperature damage // Acta Agronomica. Hungarica. 2011. V. 59. P. 87–99.

12. Астахова Н.В., Дёмин И.Н., Нарайкина Н.В., Трунова Т.И. Влияние гена desA Δ12-ацил-липидной десатуразы на структуру хлоропластов картофеля, в связи с устойчивостью к гипотермии // Физиология растений. 2011. Т. 58. С. 21–27.

13. Hepburn H.A., Nayllor F.L., Strokes D.I. Electrolyte leakage from winter barley tissue as indicator of winter hardiness // Ann. Appl. Biol. 1986. V. 108. P. 164–165.

14. Kumar G.N., Knowles N.R. Changes in lipid peroxidation and lipolytic and free-radical scavenging enzyme during aging and sprouting of potato (Solanum tuberosum L.) seed-tubers // Plant Physiol. 1993. V. 102. Р. 115–124.

15. Nakano Y., Asada K. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts // Plant and Cell Physiol. 1981. V. 22. P. 867–880.

16. Nelson D.P., Kiesow L.A. Enthalpy of decomposition of hydrogen peroxide by catalase at 25 degrees C (with molar extinction coefficients of H2O2 solutions in the UV) // Anal Biochem. 1972. V. 49. P. 474–478.

17. Davis B.J. Disc Electrophoresis. 2, Method and application to human serum proteins // Ann. New York Acad. Sci. 1964. V. 121. P. 404–427.

18. Candiano G., Bruschi M., Musante L., Santucci L., Ghiggeri G.M., Carnemolla B., Orecchia P., Zardi L., Righetti P.G. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis // Electrophoresis. 2004. V. 25. P. 1327–1333.

19. Zimmermann P., Heinlein Ch., Orendi G., Zentgraf U. Senescence-specific regulation of catalases in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh// Plant Cell and Environ. 2006. V. 29. P. 1049–1060.

20. Miller G., Shulaev V., Mittler R. Reactive oxygen signaling and abiotic stress // Physiol. Plant. 2008. V. 133. P. 481–489.

21. Cosio C., Dunand C. Specific function of individual class III peroxidase genes // J. Exp. Bot. 2009. V. 60. P. 391–408.

22. Shigeto J., Tsutsumi Y. Diverse functions and reactions of class III peroxidases // New Phytol. 2016. V. 209. P. 1395–1402.

23. Wyrwicka A., Sklodowska M. Influence of repeated acid rain treatment on antioxidative enzyme activities and on lipid peroxidation in cucumber leaves // Environ Exp. Bot. 2006. V. 56. P. 198–204.

24. Максимов И.В., Черепанова Е.А., Бурханова Г.Ф., Сорокань А.В., Кузьмина О.И. Структурно-функциональные особенности изопероксидаз растений // Биохимия. 2011. Т. 76. С 749–763.

25. Колупаев Ю.Е., Карпец Ю.В. Формирование адаптивных реакций растений на действие абиотических стрессоров. Киев: Основа, 2016. 350 с.

26. Мирошниченко О.С. Биогенез, физиологическая роль и свойства каталазы // Биополимеры и клетка. 1992. Т. 8. С. 2–25.

27. Feierabend J. Catalases in plants: molecular and functional properties and role in stress defence // Antioxidants and reactive oxygen species in plants / Eds. Smirnoff N., Blackwell Publishing, 2005. P. 101–140.

28. Scandalios J.G., Guan L., Polidoros A.N. Catalases in plant: gene structure, properties, regulation and expression // Oxidative Stress and the Molecular Biology of Antioxidant Defenses. 1997. P. 343–406.

29. Willekens H., Villarroel R., Inze D., Van Montagu M., Van Camp W. Molecular identification of catalases from Nicotiana plumbaginifolia // FEBS Lett. 1994b. V. 352. P. 79–83.

30. Mhamdi A., Queval G., Chaouch S., Vanderauwera S., Van Breusegem F., Noctor G. Catalase function in plants: a focus on Arabidopsis mutants as stress-mimic models // J. Exp. Bot. 2010. V. 61. P. 41–97.

Подписи к рисункам

Рис. 1. Изменение устойчивости (100 % – выход электролитов) в посуточной динамике закаливания при 5оС контрольных (1) и desA-licBM3 (2) растений картофеля после воздействия температурой –7 ± 0.5°С в течение 20 мин; %.

Рис. 2. Изменение содержания H2O2 у контрольных (1) и desA-licBM3 (2) растений картофеля в динамике закаливания при 5 ± 0.5°С в течение 6 суток.

Рис. 3. Активность гваяколовых (а) и аскорбат (б) пероксидаз у контрольных (1) и desA-licBM3 (2) растений картофеля в динамике закаливания при 5 ± 0.5°С в течение 6 суток.

Рис. 4. Общая активность (а) и изоферментный спектр (б) каталазы у контрольных (1) и desA-licBM3 (2) растений картофеля в динамике закаливания при 5 ± 0.5°С в течение 6 суток.