УДК 581.1

2+-АТФаза СИМБИОСОМНОЙ МЕМБРАНЫ КОРНЕВЫХ КЛУБЕНЬКОВ БОБОВ: НОВЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ МЕХАНИЗМ ТРАНСМЕМБРАННОЙ ТРАНСЛОКАЦИИ Са2+

© 2019 г. И. М. Андреев, В. В. Крылова1, Р. Ф. Зартдинова, С. Ф. Измайлов

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва

Поступила в редакцию 09.04.2018 г.

 

На препаратах симбиосом, выделенных из корневых клубеньков бобов, исследована транспортная активность Са2+-АТФазы симбиосомной мембраны (СМ), выражаемая в ИТФ- и Са2+-зависимом щелочном сдвиге рН внутри этих структур как функция рН среды их инкубации и концентрации в ней кальция, соответственно. Найденные рН- и концентрационная зависимости рассматриваются как новые свидетельства в пользу тесной сопряженности каталитической и транспортной активностей Са2+-АТФазы и ее высокой аффинности для ионов Са2+. Показано, что ионы Cd2+ и Mn2+, добавленные к среде инкубации симбиосом вместо Са2+, но в той же концентрации, не вызывают диссипации ΔрН на СМ, генерируемого Н+-АТФазой, что может говорить о неспособности кальциевого насоса осуществлять их транслокацию через СМ. Все эти данные обсуждаются в свете результатов, ранее полученных нами и другими авторами.

 

Ключевые слова: Vicia faba  симбиосомная мембрана  транспорт Са2+  Са2+-АТФаза  Са2+/H+-обмен  Cd2+  Mn2+

__________________

Сокращения: АО – акридиновый оранжевый, СаМ – кальмодулин, СМ – симбиосомная мембрана, ИТФ – инозинтрифосфат, FCCP – карбонилцианид-n-трифторметоксифенилгидразон.

1Адрес для корреспонденции: Крылова Валерия Валерьевна. 126276, Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: krylovavv@list.ru, nitrogenexchange@mail.ru

 

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что биологическая фиксация азота в растениях происходит в симбиосомах, представляющих собой бактероиды, окруженные симбиосомным пространством и симбиосомной мембраной (СМ) [1, 2]. К настоящему времени установлено, что функционирование симбиосом в сильной степени зависит от транспорта через СМ различных ионов и метаболитов, среди которых существенную роль способны играть ионы кальция как мощные регуляторы самых разнообразных процессов в животных и растительных клетках [3, 4]. Достаточно давно показано, что СМ снабжена системами активного транспорта ионов, представленными Н+- и Са2+-АТФазой, транслоцирующими ионы Н+ и Са2+, соответственно, внутрь симбиосом [5, 6]. Совсем недавно в ходе наших исследований было установлено, что локализованная на СМ Са2+-АТФаза способна функционировать как Са2+/nH+ антипортер, прямо энергизуемый за счет гидролиза АТФ [7–9].

Получены первые результаты в пользу такого механизма функционирования данного фермента [8, 9]. В частности, было показано, что Са2+-индуцируемый щелочной сдвиг рН внутри симбиосом, развиваемый из-за активности Са2+-АТФазы на СМ, можно наблюдать независимо от способа предварительной генерации на этой мембране ΔрН, то есть снижения рН внутри симбиосом в присутствии FCCP или за счет работы на СМ протонного насоса, Н+-АТФазы. Кроме того, в исследованиях действия различных концентраций свободного кальция на гидролитическую активность этого фермента было установлено, что она характеризуется кажущейся Км для Са2+ в области 10-7 М [7], то есть величиной, как правило, свойственной Са2+-АТФазам, характеризующимся высокой аффинностью для ионов Са2+. Вместе с тем остается неясным вопрос о том, соответствует ли эта величина аффинности для Са2+ транспортной активности фермента, поскольку, несмотря на ожидаемую здесь тесную сопряженность ее с гидролитической активностью, в определенных условиях, например, диктуемых слишком низкой и высокой концентрациями Н+ и Са2+, соответственно, внутри симбиосом, эти две активности кальциевого насоса могут быть разобщены [10]. В этом случае они могут показывать различные концентрационные зависимости по отношению к Са2+. Следует также иметь ввиду то обстоятельство, что этот эффект может усугубляться действием ряда факторов внутри симбиосом, очевидно создающих экспериментальные трудности в изучении транспортных свойств такого рода ферментов в их нативном окружении in vivo. Другой важный аспект, касающийся транспортной активности исследуемой Са2+-АТФазы и остающийся еще далеко не полностью исследованным, состоит в ее модуляции величиной рН среды инкубации симбиосом. В работе Krylova с соавт. [9] соответствующая рН-зависимость была выявлена в результате слежения за Са-зависимой диссипацией ΔрН на СМ, генерируемого активностью Н+-АТФазы на той же мембране, и оказалась сходной с ИТФ-гидролазной активностью фермента. Однако представляется существенным также выяснить, согласуется ли она с рН-зависимостью ИТФ-энергизованного щелочного сдвига рН внутри симбиосом, развиваемого как диссипация FCCP-индуцированного ΔрН на СМ в бескалиевой среде. Очевидно, что из-за отсутствия в этом случае потенциально мешающего фактора в виде активности Н+-АТФазы интерпретация результатов экспериментов может быть более ясной и однозначной.

Принимая во внимание все сказанное выше, в настоящей работе, проведенной на симбиосомах, выделенных из корневых клубеньков бобов, мы попытались также проверить, в какой степени транспортная активность Са2+-АТФазы на СМ соответствует ее каталитической активности, если иметь в виду ее зависимость от концентрации свободного кальция в среде. Иначе говоря, выяснить, сравнимы ли аффинности фермента для Са2+, его каталитическая и транспортная активности как функции концентрации свободных ионов Ca2+ ([Ca2+]free). Другая цель проведенных экспериментов состояла в том, чтобы выяснить, способен ли этот фермент транспортировать через СМ наряду с Са2+ и другие катионы двухвалентных металлов, такие как Cd2+ и Mn2+, первый из которых по своему размеру очень близок к таковому Са2+, но обладает токсическим действием, тогда как второй представляет собой существенный, то есть необходимый растениям микроэлемент, способный в некоторых случаях выступать в качестве альтернативного субстратного иона, переносимого Са2+-АТФазами через клеточные мембраны [11, 12].

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты, проведенные в настоящей работе, выполнены на препаратах симбиосом, выделенных из корневых клубеньков кормовых бобов (Vicia faba L., сорт Русские черные), выращенных после инокуляции растений эффективным штаммом Rhizobium leguminosarum HWM VF 3a, полученным из Института биохимии РАН. Симбиосомы были выделены согласно методике, основанной на дифференциальном центрифугировании гомогената корневых клубеньков с последующей очисткой полученного материала в градиенте плотности перкола [5].

За щелочным сдвигом рН внутри симбиосом, развивающимся в результате активности Са2+-АТФазы на СМ, следили по изменению дифференциального (ΔА492–540) или абсолютного (А492) оптического поглощения акридинового оранжевого (АО), проникающего ΔрН-индикатора [13], предварительно индуцируя закисление симбиосомного пространства с использованием двух различных экспериментальных подходов. В первом из них к симбиосомам, инкубированным в бескалиевой среде, добавляли протонофор FCCP, вызывающий ускорение эндогенного К+/H+ обмена на СМ за счет увеличения ее протонной проводимости [14]. Второй экспериментальный подход включал в себя формирование ΔрН на СМ за счет активности на ней протонного насоса, Н+-АТФазы. Все измерения проводили на спектрофотометрах Hitachi-557 (Япония) или Specord M40 (Германия) в стандартных 1 см кюветах без непрерывного перемешивания образцов в процессе измерений. Инкубационная среда содержала 0.4 М сорбита, 20 мМ HEPES/BTP (pH 7.0), 2 мМ MgSO4, 9 мкМ АО и 200 мкг/мл общего симбиосомного белка. После достижения относительно стабильного градиента рН на СМ его диссипацию инициировали добавлением к симбиосомам 0.5 мМ ИТФ или СаCl2 в той или иной концентрации, причем среда инкубации в последнем случае была дополнена 20 мМ KNO3. За активностью Са2+-АТФазы следили, оценивая начальную скорость (Vo) Са2+-индуцируемой диссипации ΔрН, а ее зависимость от концентрации экзогенного кальция в среде использовали для оценки ее величины Км для Са2+. Концентрацию белка в препаратах оценивали согласно методу Бредфорда [15]. Исследования проводили в трех биологических и трех-пяти аналитических повторностях.

В работе использовали сорбит фирмы “Calbiochem” (США), ди- и тринатриевые соли АТФ и ИТФ, а также буферы HEPES и BTP фирмы “Sigma” (США), АО фирмы “Serva” (Германия). Ионы Са2+, Сd2+ и Mn2+ были добавлены к среде инкубации симбиосом в виде солей СаCl2, CdCl2 и MnCl2 квалификации ОСЧ.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Как было показано нами ранее [9], щелочной сдвиг рН, развиваемый внутри симбиосом в результате ИТФ-зависимой трансмембранной транслокации Са2+ в ходе функционирования на СМ Са2+-АТФазы, является одним из эффектов, отражающих транспортную активность этого фермента как Са2+/nH+ антипортера, связанную с выходом ионов Н+ из симбиосом в обмен на поступление в них ионов Са2+. В описанных здесь экспериментах для исследования кинетики развития такого эффекта следили за ИТФ- или Са-зависимой диссипацией градиента рН на симбиосомной мембране, создаваемого на ней в результате FCCP-ускоряемого трансмембранного К+/H+ обмена, имеющего место при инкубации симбиосом в бескалиевой среде, либо за счет активности на этой мембране протонного насоса, Н+-АТФазы, соответственно.

Первый из этих экспериментальных подходов был использован нами для выяснения эффекта рН среды инкубации симбиосом на транспортную активность Са2+-АТФазы. Принимая во внимание то обстоятельство, что при использовании АО как ΔрН-индикатора рН внутри симбиосом должен быть всегда ниже, чем рН наружной среды, выбранные значения рН последней (6.5, 7.0 и 8.0), судя по наблюдаемым эффектам, находились еще в области, приемлемой для его применения как индикатора. На рисунке 1 показана кинетика FCCP-индуцированного кислотного сдвига рН внутри симбиосом и его последующая ИТФ-индуцируемая диссипация при их инкубации в среде с рН 7.0. Наблюдаемый в данной работе эффект соответствовал тому эффекту, который был выявлен нами ранее [9]. При умеренно низком (6.5) и при высоком (8.0) значениях рН инкубационной среды кинетика процесса диссипации явно замедлялась, по меньшей мере, качественно отражая соответствующую рН-зависимость как скорости гидролиза ИТФ Са2+-АТФазой, так и Са-зависимой диссипации ΔрН на СМ, обусловленной активностью фермента. Эти данные подтверждают еще один сделанный ранее вывод о тесной сопряженности каталитической и транспортной активностей исследуемой Са2+-АТФазы [9]. Хорошо известная выраженная рН-зависимость такого типа кальциевых транспортеров как АТФ-энергизуемых Са2+/H+-обменников во многом объясняется наличием ряда протолитических групп в их Са2+-координирующих сайтах и, как следствие, модуляцией рН их Са2+-связывающей способности [16].

При использовании другого экспериментального подхода для выявления транспортной активности Са2+-АТФазы следили за Cа-зависимой диссипацией градиента рН, создаваемого на симбиосомной мембране в результате функционирования на ней Н+-АТФазы. За кинетикой развития такого эффекта следили при различных концентрациях экзогенного кальция в среде инкубации симбиосом с целью оценки аффинности Са2+-связывающего сайта фермента для этого катиона (рис. 2). Концентрационная зависимость кинетики рассматриваемого процесса, отражаемой в начальной скорости Са-зависимой диссипации ΔрН на СМ, представлена на рисунке 3. Можно видеть, что эта зависимость достигает насыщения, то есть стационарного уровня, уже при очень низких, а именно субмикромолярных, концентрациях кальция в среде и качественно сходна с соответствующей концентрационной зависимостью ИТФ-гидролазной активности фермента [7], тем самым снова указывая на высокое сродство его Са2+-связывающего сайта к этому катиону. Поскольку рассматриваемая зависимость, построенная как функция концентрации свободного кальция, обнаруживает признаки насыщения даже при более низких концентрациях этого катиона, отсутствие в экспериментах данного типа кальциевого буфера в среде инкубации симбиосом не дает оснований считать сделанное здесь заключение неправомерным. Иначе говоря, в этом случае мы имели бы только более сильный аргумент в пользу нашего вывода. На рисунке 3 можно также видеть, что активность Са2+-АТФазы заметно снижается при относительно высоких концентрациях кальция в среде, что вероятно обусловлено снижением скорости диссоциации Са2+ с Са2+-связывающих сайтов фермента, когда концентрация аккумулированного катиона внутри симбиосом приближается к их Кd для Са2+ или становится выше этой величины.

Довольно низкая величина кажущейся КМ Са2+-АТФазы для Са2+, следующая из анализа концентрационной зависимости кинетики Са-индуцируемой диссипации трансмембранного градиента рН на СМ, образованного Н+-АТФазой, подтверждает высокую аффинность исследуемого фермента для этого катиона, ранее установленную в результате определения его ИТФ-гидролазной активности [9]. В свою очередь это означает, что низкоаффинный Са2+/nH+ антипортер, энергизуемый трансмембранным протонным градиентом, отсутствует на СМ, что согласуется с результатами, полученными нами ранее [5]. В этой связи интересно отметить, что в отношении механизма аккумуляции кальция симбиосома как уникальный мембранный компартмент обнаруживает сходство с саркоплазматическим ретикулумом, мембрана которого снабжена Са2+-АТФазой, также функционирующей как Са2+/nH+-обменник и обеспечивающей эффективную загрузку этой органеллы ионами Са2+ [17]. Однако, как и в случае симбиосом, потенциальная физиологическая роль трансмембранной транслокации иона Н+ рассматриваемым ферментом остается пока неясной.

Принимая во внимание тот факт, что вопрос о возможной способности Са2+-связывающего сайта Са2+-АТФазы связывать другие катионы двухвалентных металлов и далее переносить их через СМ в ходе работы данного фермента в настоящее время остается открытым, в дальнейших экспериментах мы попытались выяснить, функционирует ли Са2+-АТФаза в присутствии ионов Cd2+ и Mn2+. Как показано на рисунке 4, добавление к симбиосомам субмилимолярных концентраций этих катионов после достижения относительно стационарной величины ΔрН на СМ в ходе функционирования на ней протонного насоса, оставляет ее фактически неизменной, причем кажущийся очень слабый диссипативный эффект, вызываемый катионами Cd2+, скорее всего является результатом ингибирования Н+-АТФазы, как вполне ожидаемого их сильного токсического действия. Хотя эти данные могут указывать на относительно высокую избирательность Са2+-связывающего сайта Са2+-АТФазы для ионов Са2+, такое заключение нельзя считать окончательным из-за явной ограниченности полученных экспериментальных данных. В частности, в случае Mn2+ сродство Са2+-связывающего сайта Са2+-АТФазы к этому катиону может быть гораздо меньше, чем к Са2+ [12], и тем самым обуславливать очень слабый эффект.

Среди представленных в настоящей работе результатов обращает на себя внимание тот факт, что выявленная величина кажущейся КМ Са2+-АТФазы для Са2+ оказывается сравнимой с той, что была найдена в клетках эукариотов для кальциевых АТФаз, активированных кальмодулином (СаМ) или другими факторами за счет снятия ими эффекта автоингибирования, свойственного этим ферментам [18]. Это обстоятельство предположительно указывает на то, что в выделенных симбиосомах Са2+-АТФаза СМ либо остается связанной с эндогенным СаМ или СаМ-подобным белком, либо претерпевает определенную модификацию в ходе их выделения и очистки симбиосомной мембраны, например, в результате активности эндогенных протеаз, приводящей также к диссоциации автоингибиторного домена от активного центра фермента и тем самым к увеличению доступности последнего для ионов Са2+. Однако вопрос о справедливости этой гипотезы остается пока открытым и является одним из важных аспектов наших будущих исследований.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

 

  1. Udvardi M.K. Metabolite transport across symbiotic membranes of legume nodules // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. V. 48. P. 493523.
  2. Udvardi M.K., Pool P.S. Transport and metabolism in legume-rhizobia symbioses // Ann. Rev. Plant Biol. 2013. V. 64. P. 781-805.
  3. Carafoli E. Calcium – a universal carrier of biological signals // FEBS J. 2005. V. 272. P. 1073-1089.
  4. Plieth C. Calcium: just another regulator in the machinery of life? Ann. Bot. 2005. V. 96. P. 108.
  5. Andreev I.M., Dubrovo P.N., Krylova V.V., Andreeva I.N., Koren’kov V.D., Sorokin E.M., Izmailov S.F. Characterization of ATP-hydrolyzing and ATP-driven proton-translocating activities associated with the peribacteroid membrane from root nodules Lupinus luteus L. // J. Plant Physiol. 1997. V. 151. P. 563-569.
  6. Andreev I.M., Dubrovo P.N., Krylova V.V., Izmailov S.F. Functional identification of ATP-driven Ca2+ pump in the peribacteroid membrane of broad bean root nodules // FEBS Lett. 1999. V. 447. P. 49-52.
  7. Krylova V.V., Andreev I.M., Zartdinova R., Izmailov S.F. Biochemical characteristics of the Ca2+ pumping ATPase in the peribacteroid membrane from broad bean root nodules // Protoplasma. 2013. V. 250. P. 531-538.
  8. Krylova V.V., Zartdinova R., Andreev I.M., Izmailov S.F. Ca2+/H+ antiport as a possible mechanism of the Ca2+-translocating ATPase functioning in vesicles of bean nodule’s symbiosome membrane // Biochemistry (Moscow) Suppl. Ser. A. Membr. Cell Biol. 2016. V. 10. P. 218-222.
  9. Krylova V.V., Andreev I.M., Zartdinova R.F., Izmailov S.F. Ca2+-ATPase in the symbiosome membrane from broad bean root nodules: further evidence for its functioning as ATP-driven Ca2+/H+ exchanger // Acta Physiol. Plant. 2017. V. 39. P. 247-254. DOI 10.1007/s11738-017-2546-y.
  10. Inesi G., Tadini-Buoninsegni F. Ca2+/H+ exchange, luminal Ca2+ release and Ca2+/ATP coupling ratios in the sarcoplasmic reticulum ATPase // J.Cell Commun. Signal. 2014. V. 8. P. 5-11.
  11. Ferreira-Gomes M.S., Mangialavori I.C., Ontiveros M.Q., Rinaldi D.E., Martiarena J., Verstraeten S.V., Rossi J.P. Selectivity of plasma membrane calcium ATPase (PMCA)-mediated extrusion of toxic divalent cations in vitro and in cultured cells // Arch. Toxicol. 2018. V. 92. P. 273-288.
  12. Ynekura S., Toyshima C. Mn2+ transport by Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum // FEBS Lett. 2016. V. 590. P. 2086-2095.
  13. Palmgren M.G. Acridine orange as a probe for measuring pH gradients across membranes: mechanism and limitations // Anal. Biochem. 1991. V. 192. P. 316-321.
  14. Andreev I., Krylova V., Dubrovo P. and Izmailov S. Passive potassium transport by symbiosomes from broad bean root nodules // Plant Science. 2005. V. 168. P. 1005-1010.
  15. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.
  16. Obara K., Miyashita N., Xu C., Toyashima I., Sugita Y., Inesi G., Toyashima C. Structural role of countertransport revealed in Ca2+ pump crystal structure in the absence of Ca2+ // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 14489-14496.
  17. Moller J.V., Nissen P., Sorensen T.L.-M., le Maire M. Transport mechanism of the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase pump // Curr. Opin. Struct. Biol. 2005. V. 15. P. 387-393.
  18. Dalghi M.G., Ferreira-Gomes M., Rossi J.P. Regulation of the plasma membrane calcium ATPase by the actin cytoskeleton // Biochem. Biophys. Res. Comm. 2017. P. 1–8. http:-//doi.org/10.1016/j.bbrc.2017.11.151.

 

подписи к рисункам

Рис. 1. Кинетика ИТФ-зависимой диссипации ΔрН на СМ, генерируемого FCCP при разных значениях рН 7.0 (1), 8.0 (2), 6.5 (3) среды инкубации симбиосом. Где указано, добавлено 2 мкМ FCCP, 0.5 мМ ИТФ и 5 мМ (NH4)2SO4.

Рис. 2. Генерация на СМ трансмембранного градиента рН Н+-АТФазой и его диссипация в присутствии ионов Са2+. Где указано, добавлено 1 мМ Na2АТФ, 0.1 (1), 0.2 (2), 0.3 (3) мкМ СаCl2, и 5 мМ (NH4)2SO4.

Рис. 3. Зависимость начальной скорости (Vo) Са2+-зависимой диссипации трансмембранного градиента рН на СМ, образованного Н+-АТФазой, от концентрации СаCl2 в среде инкубации симбиосом.

Рис. 4. Эффекты Ca2+, Cd2+ и Mn2+ на кинетику кислотного сдвига рН внутри симбиосом, запускаемого активностью Н+-АТФазы на СМ. Где указано, добавлено 1 мМ Na2АТФ, 100 мкМ СаCl2, CdCl2, MnCl2 и 5 мМ (NH4)2SO4.