УДК 581.1

Индукция защитных реакций в каллусных культурах женьшеня при взаимодействии с патогеном человека

Yersinia pseudotuberculosis

© 2008 г. Е. В. Персиянова*, К. В. Киселев**, В. П. Булгаков**,

Н. Ф. Тимченко*, Г. К. Чернодед**, Ю. Н. Журавлев**

*

 

Поступила в редакцию 14.03.2008 г.

Исследовано влияние бактерий псевдотуберкулеза (Yersinia pseudotuberculosis), патогенных для человека и животных, на разные линии клеточных культур женьшеня Panax ginseng C.A. Mey. Показано, что бактерии Y. pseudotuberculosis вызывали быструю индукцию экспрессии защитных генов женьшеня (фенилаланинаммоний-лиазы и β-1,3-глюканазы), ингибировали рост обычной каллусной культуры женьшеня и не поражали культуры с высоким защитным статусом. Термостабильный и термолабильный белковые токсины этих бактерий, вызывающие смерть мышей при парентеральном введении, также индуцировали экспрессию защитных генов в культурах каллусов женьшеня. В свою очередь, клетки женьшеня полностью подавляли рост бактерий псевдотуберкулеза. Полученные данные указывают на то, что происходит распознавание иерсиний клетками женьшеня и развитие в них иммунного ответа на внесение патогена. Взаимодействие бактерий псевдотуберкулеза с клетками женьшеня сходно с реакцией гиперчувствительности, реализуемой при взаимодействии некоторых фитопатогенов с растениями.

------------------------------

 

 

Сокращения

: КОЕ – колониеобразующие единицы; ТЛТYp – термолабильный токсин Yersinia pseudotuberculosis; ТСТYp – термостабильный токсин Y. pseudotuberculosis; Avr – авирулентность (от avirulence); HR – гиперчувствительный ответ (от hypersensitive response); hrp – гены гиперчувствительного ответа и патогенности (от hypersensitive response and pathogenicity); PAL – фенилаланинаммоний-лиаза (от phenylalanine ammonia-lyase); Pg-glu1 – Panax ginseng β-1,3-глюканаза; PgPAL – P. ginseng PAL; Yop – Yersinia outer protein.

Адрес для корреспонденции

: Персиянова Елена Викторовна. 690028 Владивосток, ул. Сельская, 1. НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Электронная почта: Helen-pers@yandex.ru

 

Ключевые слова: Yersinia pseudotuberculosis – Panax ginseng – фенилаланинаммоний-лиаза – β-1,3-глюканаза – патогенез – взаимодействие микроорганизмов и растений.

ВВЕДЕНИЕ

 

Бактерии псевдотуберкулеза Yersinia pseudotuberculosis убиквитарно распространены в окружающей среде и способны вызывать заболевание у человека и животных. К настоящему времени выявлено, что существенную роль в экологии Y. pseudotuberculosis и в эпидемиологии псевдотуберкулезной инфекции играют растения [1- 3]. Известно, что человек не заражается Y. pseudotuberculosis прямо от человека или животного. Заражение происходит при употреблении в пищу инфицированных этими микроорганизмами продуктов и, прежде всего, овощей, в которых бактерии псевдотуберкулеза размножаются и накапливаются при пониженной температуре, приобретая высокую степень вирулентности [4].

Имеются сведения, что возможным резервуаром иерсиний могут быть древесные и травянистые формы растений [5, 6]. В экспериментальных условиях Y. pseudotuberculosis способны проникать в проростки салата, капусты, овса, гороха, картофеля, в водное растение Elodea canadensis [7- 9].

В последние годы укрепилось понимание того факта, что некоторые факторы патогенности бактерий, вызывающих заболевания у растений и животных, имеют общее древнее происхождение и функционально сходны [10- 12]. Молекулярное распознавание фитопатогенов в растениях происходит посредством взаимодействия белковых продуктов генов R-Avr, где R является геном устойчивости растений, а Avr (от avirulence) представляет ген патогенного микроорганизма [13]. Многие фитопатогенные микроорганизмы могут колонизировать поверхность листьев растений, не вызывая заболевания. При определенных условиях, бактерии проникают внутрь растения через устьица или при механическом повреждении, размножаясь в апопласте и устанавливая первый контакт с клетками. Первичный локус в бактериях, индуцируемый при таком контакте – это Hrp (от hypersensitive response and pathogenicity) локус, состоящий из кластера генов, которые кодируют III тип секреторной системы бактерий [12]. Активность многих генов Avr зависит от активности локуса Hrp. В свою очередь, локус Hrp сходен с соответствующими локусами, кодирующими III тип секреторной системы патогенов человека, таких как Yersinia, Shigella и Salmonella [14]. Впервые общность механизмов патогенеза была показана на примере Pseudomonas aeruginosa, когда клинический изолят этого патогена человека вызывал заболевание растений, нематод, насекомых и мышей [11, 12]. По-видимому, P. aeruginosa является естественным природным патогеном растений [11]. Полная гибель инфильтрированных листьев арабидопсиса наблюдалась через 4- 5 суток после обработки растений суспензией бактерий. Общие эволюционно-консервативные детерминанты патогенности – это ген dsbA, имеющий гомологи у патогенов человека (Shigella flexneri и Vibrio cholera) и растений (P. aeruginosa и Erwinia chrysanthemi), а также гены hrpM, gacS и gacA. О функции генов группы hrp мы уже упомянули; gacS кодирует двухкомпонентную сенсорную киназу, продукт gacA регулирует активность этой киназы.

Другим важным фактором патогенности являются белки семейства YopJ (изолированные первоначально из Yersinia), гомологи которых обнаруживаются в фитопатогенах (Erwinia, Pseudomonas и Xanthomonas) и даже в симбиотических бактериях Rhizobium [12]. Общая функция этих белков, действующих как цистеиновые протеазы, заключается в разрушении сигнальных систем хозяина, обеспечивающих защиту от патогенов [15]. В комплексе эти гены эволюционировали в древних грамотрицательных организмах, как адаптеры бактерий к окружающей среде, и именно они позволяют современным бактериям инфицировать столь широкий круг хозяев. При этом следует учесть, что у патогенов животных и растений многие факторы патогенности не совпадают [12].

Исходя из приведенных сведений, становится понятно, что при ко-культивации растительных клеток с Y. pseudotuberculosis можно было ожидать развития защитных реакций, которые свойственны фитопатогенам, вплоть до реакции гиперчувствительности. Ранее мы изучили влияние бактерий псевдотуберкулеза и их токсинов на рост каллусных культур капусты (Brassica oleracea), женьшеня (Panax ginseng), кирказона (Aristolochia manchuriensis) и воробейника (Lithospermum erytrorhizon) [16, 17]. В каллусах капусты бактерии быстро размножались, и с третьего дня культивирования их количество увеличивалось с 2 до 8 lgКОЕ/г сырой массы и оставалось неизменным до 60 суток наблюдения. При этом клетки капусты повреждались. Такой тип взаимодействия свидетельствовал о том, что патоген не распознавался растительными клетками, что хорошо согласовывалось с более ранними данными об этом растении как важном природном резервуаре иерсиний и факторе передачи возбудителя человеку. В каллусах воробейника, синтезирующих большое количество антимикробных фитоалексинов (штамм ВК-39) [18], иерсинии начинали размножаться только после 6 суток культивирования, их количество увеличилось с 4 до 7 lgКОЕ/г сырой массы и затем несколько понижалось с началом старения культуры (50 суток). В этом случае не отмечали видимого взаимодействия между растением и бактериями, а ослабление роста бактерий было связано с наличием фитоалексинов. Каллусы кирказона характеризовались более интересной динамикой взаимодействия – количество бактерий в них росло быстрее и увеличивалось с 4 до 9 lgКОЕ/г сырой массы. Однако с 11 суток культивирования происходило неуклонное снижение количества бактерий и к 39 суткам они не высевались. Каллусы женьшеня проявили бурную реакцию, вследствие которой клетки растения быстро погибали и в процессе этой реакции уничтожали инфицирующие их бактерии. Первоначальное увеличение количества бактерий с 4 до 6.5 lgКОЕ/г сырой массы заканчивалось к 3 суткам ко-культивации, затем происходило быстрое снижение этого показателя и к 11 суткам культивирования микроорганизмы не высевались. Эта реакция по динамике напоминала гиперчувствительный ответ (hr-синдром), реализуемый Xanthomonas campestris, P. aeruginosa и E. chrysanthemi посредством R-Avr взаимодействия [10, 12, 15, 19].

Целью настоящей работы было более подробно охарактеризовать защитные ответы клеток женьшеня при их взаимодействии с Y. pseudotuberculosis. Для этого использовали три клеточные культуры женьшеня – контрольную и две трансгенные, в которых был экспрессирован ген rolC на низком и высоком уровнях. Экспрессия гена rolС в этих культурах приводит к созданию устойчивого защитного статуса клеток, проявляющегося в высоком уровне синтеза вторичных метаболитов [20] и конститутивной экспрессии генов PR-2 (от pathogenesis-related) белков [21].

МЕТОДИКА

 

 

 

 

Бактерии и токсины.

В работе использовали вирулентный штамм Yersinia pseudotuberculosis (сем. Enterobacteriaceae) 512 I серовара из музея живых культур НИИЭМ СО РАМН. Иерсинии культивировали на питательном агаре при температуре 18- 20оС в течение 24 ч. Для опытов готовили десятикратные разведения микроорганизмов в стерильной дистиллированной воде, согласно стандарту мутности ГИСКБП им. Л.А. Тарасевича [16]. Использовали также белковые токсины бактерий псевдотуберкулеза, вызывающие смерть мышей при парентеральном введении: термостабильный токсин (ТСТYp) – из штамма 512 I серовара, несущего плазмиду вирулентности pYV, и термолабильный токсин (ТЛТYp) – из штамма 2517 III серовара, утратившего названную плазмиду. Токсины выделяли из бактериальных лизатов с помощью ионообменной и гельфильтрационной хроматографии [22]. Белок в образцах токсинов определяли по Bradford [23].

Клеточные культуры.

Каллусы женьшеня Panax ginseng C.A. Mey. GV, 2c2 и 2cR2 выращивали на агаризованной питательной среде W4cpа [20, 24]. Получение, морфологические и молекулярно-биологические особенности этих культур были описаны ранее [25]. Линия GV – это контрольная культура, полученная из каллусов штамма 1с (коллекционный номер ВСКК-ВР 41) путем трансформации "пустым" бинарным вектором pPCV002. Линии 2с2 и 2cR2 были получены из штамма 1с путем трансформации вектором pPCV002-CaMVC и представляют собой культуры с низким и высоким уровнем экспрессии гена rolC соответственно. В культуре 2cR2 количество транскриптов rolC примерно в 10 раз выше по сравнению с культурой 2с2 [21].

Ко-культивация.

В асептических условиях, на стадии экспоненциального роста клеток женьшеня (15-й день культивирования), на поверхность каллуса наносили по 10- 20 мкл ТЛТYp (60 мкг/мл), либо ТСТYp (2.5 мг/мл), либо бактериальную суспензию (105 бактерий/мл). Системы каллус–бактерии, каллус–токсин инкубировали при 24оС в темноте и относительной влажности воздуха 70%. В качестве контроля на каллусы женьшеня наносили стерильную дистиллированную воду. Для выявления жизнеспособных иерсиний в каллусах материал из проб высевали в динамике на дифференциально-диагностическую среду [4], посевы инкубировали при температуре 37оС в течение 36- 48 ч, подсчитывали число выросших колоний (lgKOE/г сырой массы каллуса).

Анализ дифференциальной экспрессии генов.

Для анализа дифференциальной экспрессии генов PAL и Pg-glu1 в каллусах женьшеня линии GV под влиянием бактерий и их токсинов на первые и третьи сутки эксперимента из растительных клеток выделяли тотальную РНК с помощью набора Yellow Solve ("Силекс", Россия). Комплементарную ДНК (кДНК) получали с помощью набора для обратной транскрипции с M-MLV ревертазой по рекомендациям производителя с небольшими изменениями [26]. Реакцию проводили в амплификаторе ("BioRad", США), запрограммированном на 37°C в течение 40 мин, 70°C в течение 10 мин и с охлаждением до 4°C. Образцы кДНК (0.2- 2.0 мкл) использовали в ПЦР для амплификации генов актина, PAL и Pg-glu1 по ранее описанной методике [21, 26].

Изучение экспрессии генов PAL женьшеня.

На основе известных нуклеотидных последовательностей PAL A. thaliana, Lactuca sativa, Rubus idaeus, L. erythrorhizon, Glycine max, Pisum sativum, Cicer arietinum, Phaseolus vulgaris (соответственно NM_129260, NM_115186, AF411134, AF299330, AF237955, X52953, Q01861, Q04593, Q9SMK9, P19143) были подобраны праймеры к консервативным участкам 5'ARGCYGCYGCYATYATGGA и 5'GGRGTGCCYTGRAARTT. Температура отжига праймеров к генам PAL составляла 53oС, что позволяло получить сигнал в нужной области (266 п.н.) без дополнительных сигналов, время элонгации - 25 с. Особенности определения экспрессии гена Pg-glu1 были описаны ранее [21].

Экспрессию генов PAL и Pg-glu1 нормализовали относительно экспрессии гена актина женьшеня [21]. Полученные ампликоны были выделены из геля при помощи набора Glass Milk ("Силекс") и клонированы в вектор pTZ57R/T, согласно протоколу фирмы-производителя ("Fermentas", Литва).

 

Секвенирование продуктов ОТ-ПЦР

. Процесс проводили с использованием набора реактивов Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1 ("Applied Biosystems", США) по методике производителя. Секвенирование осуществляли на секвенаторе ABI 310 Genetic Analyser на базе БПИ ДВО РАН ("Applied Biosystems") по описанной ранее методике [21].

Полученные нуклеотидные последовательности генов PAL и Pg-glu1 из женьшеня сравнивали c известными последовательностями генов из других организмов в программе BioEdit 7.0.8 и NCBI BLAST. Известно, что гены PAL в геноме растений обычно представлены в виде мультигенных семейств, поэтому в каждой культуре клеток в эксперименте было секвенировано от 20 до 30 клонов. Все полученные последовательности нумеровали в порядке секвенирования. На основе полученных данных о качественном составе генов PAL в пробах, и суммарной экспрессии генов PAL, полученных на вырожденных праймерах, определяли экспрессию каждого подсемейства генов PAL и выражали в относительных единицах. После нормализации относительно актина рассчитывали средневзвешенную экспрессию генов PAL для всех исследованных клогов [27]. Мы использовали данный подход для определения экспрессии генов, потому что ранее было показано, что он не уступает известному ПЦР в реальном времени [27]. Более того, этот подход позволяет определить экспрессию всех представителей исследуемого семейства генов.

Результаты обрабатывали при помощи программы Statistica, версия 8.0. Все данные представлены как средние значения и их стандартные ошибки. Полученные результаты проверены по спаренному t-критерию Стьюдента. Уровень значимости в 0.05 был выбран как минимальное значение статистической разницы во всех экспериментах.

РЕЗУЛЬТАТЫ

 

Рост клеточных культур женьшеня при добавлении иерсиний

 

В первой серии опытов были определены кривые роста растительных клеток при воздействии на них Y. pseudotuberculosis и способность бактерий размножаться в культурах клеток женьшеня. Клетки культуры GV в контроле активно росли, и к 40 дню культивирования их масса была в 15 раз больше по сравнению с массой инокулюма (рис. 1а, кривая 1). При внесении Y. pseudotuberculosis в культуру GV клетки практически прекращали рост (рис. 1а, кривая 2) по сравнению с контролем, к которому была добавлена стерильная вода без иерсиний.

Клетки культуры 2с2 также активно росли в контроле, и к 40 дню прирост их биомассы в культуре был в 15 раз больше по сравнению с исходной массой (рис. 1б, кривая 1). При внесении Y. pseudotuberculosis в культуру 2с2 клетки продолжали расти (рис. 1б, кривая 2), и их рост достоверно не отличался от контроля, к которому была добавлена стерильная вода без иерсиний. Напротив, клетки культуры 2сR2 отличались слабым ростом в контроле, и к 40 дню прирост их биомассы в культуре был больше в 3 раза по сравнению с исходной массой (рис. 1в, кривая 1). При внесении Y. pseudotuberculosis в культуру 2сR2 растительные клетки продолжали расти (рис. 1в, кривая 2), и их рост достоверно не отличался от контроля, к которому была добавлена стерильная вода без иерсиний.

Анализ жизнеспособности Y. pseudotuberculosis в зараженных каллусах показал, что уже к третьим суткам после внесения иерсиний во всех системах количество бактерий резко снизилось, и к седьмым суткам микроорганизмы в опытах не были выявлены (рис. 2).

Экспрессия генов PAL и Pg-glu1 в культурах клеток женьшеня

 

Во второй серии экспериментов проанализировали экспрессию генов PAL и Pg-glu1 в каллусах P. ginseng линии GV под влиянием Y. pseudotuberculosis и их токсинов. Важно отметить, что гены PAL растений – это мультигенное семейство, состоящее из 30- 40 генов [28]. В литературе нам не удалось обнаружить данных о генах PAL женьшеня, поэтому на основе известных генов PAL растений мы сконструировали вырожденные праймеры, которые работали со всеми возможными генами PAL женьшеня. Результаты секвенирования ПЦР продуктов, полученных с кДНК женьшеня, показали наличие около 30 генов PAL женьшеня, которые в соответствии с нуклеотидными последовательностями делили на 3 подсемейства. Мы назвали их в порядке секвенирования: PgPAL1, PgPAL2, PgPAL3. Все белки PAL женьшеня по выведенной производной аминокислотной последовательности секвенированного участка были близки к ранее описанным белкам PAL растений (идентичность 98- 99%). Семейство β-1,3-глюканаз в растениях также представлено несколькими формами генов, поэтому мы сконструировали вырожденные праймеры на основе известных последовательностей этих генов. Анализ секвенированых ПЦР продуктов с использованием кДНК женьшеня показал, что в культурах женьшеня в основном экспрессируется Pg-glu1. Было отмечено также наличие других генов глюканаз (Pg-glu2, Pg-glu3), но доля их транскриптов среди анализируемых клонов всегда была менее 10%.

Экспрессия генов PAL и Pg-glu1 была наименьшей в культуре клеток GV (рис. 3). Наибольшие значения экспрессии PAL и Pg-glu1 были выявлены в культуре клеток 2cR2. Экспрессия генов PAL в клетках 2сR2 была более, чем в 3 раза выше, по сравнению с клетками GV (рис. 3а). Экспрессия гена Pg-glu1 в клетках 2сR2 превышала таковую в клетках GV более, чем в 27 раз (рис. 3б). Количество транскриптов генов PAL и Pg-glu1 в культуре клеток 2с2 было промежуточным между значениями в культурах GV и 2cR2.

Установлено, что под влиянием Y. pseudotuberculosis и ТЛТYp в клетках женьшеня линии GV повышалась экспрессия генов PAL, которая возрастала в 2- 4 раза по сравнению с контролем уже в первые сутки культивирования (рис. 4). Повышенная экспрессия генов PAL сохранялась и на третьи сутки действия иерсиний, хотя уменьшались значения суммарной экспрессии в пробах. Больше всего возрастала экспрессия генов подсемейства PgPAL1 (рис. 5). Экспрессия гена глюканазы Pg-glu1 в первые сутки эксперимента также в 2- 3 раза достоверно возрастала по сравнению с контролем. Повышенная экспрессия гена Pg-glu1 сохранялась и на третьи сутки воздействия иерсиний (рис. 6). Описанная ранее динамика гибели клеток женьшеня [16, 17] свидетельствует о том, что к третьим суткам ко-культивирования иерсиний и каллусов женьшеня, доля погибших клеток составляла уже 50% от общей популяции. По-видимому, ослабление иммунного ответа к третьим суткам культивирования связано с массовой гибелью клеток. К пятым суткам ко-культивирования число погибших клеток составляло 65%, к седьмым суткам - 73%, к 18-м - 96% [16, 17]. Эти результаты были получены на штамме каллусов женьшеня R-1. Приведенная на рис. 1а динамика роста клеток линии GV в целом соответствует этим данным.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

 

В настоящей работе показано, что после добавления Y. pseudotuberculosis к культуре каллусов женьшеня линии GV в каллусах увеличивалась экспрессия генов фенилаланинаммоний-лиазы PgPAL1, PgPAL2, PgPAL3 и β-1,3-глюканазы Pg-glu1 уже в первый день совместного культивирования. Этот факт свидетельствует о быстром распознавании патогена и индукции защитного ответа клетками женьшеня. Общая динамика взаимодействия была такова, что уже через 7 суток ко-культивирования жизнеспособные бактерии в системе не обнаруживались, а клетки женьшеня прекращали рост. Описанные события соответствуют тем, которые развивались бы при внесении типичного патогена растений (например, P. aeruginosa) при индукции реакции гиперчувствительного ответа. Полученные данные четко указывают на то, что происходит распознавание иерсиний клетками женьшеня и развитие в них иммунного ответа на внесение патогена. Сделать заключение о типе реакции на этом этапе исследования не представляется возможным, поскольку для этого необходимо идентифицировать ген резистентности женьшеня R и фактор патогенности иерсиний Avr и показать их взаимодействие. Как отмечалось во ВВЕДЕНИИ, теоретического запрета на такое взаимодействие нет, так как факторы патогенности фитопатогенов Erwinia, Pseudomonas и Xanthomonas и патогена человека Yersinia сходны. По-видимому, Y. pseudotuberculosis является вторым известным бактериальным видом, после P. aeruginosa, который способен вызывать иммунный ответ как у животных, так и у растений.

В случае внесения бактерий в каллусы женьшеня с системной иммунной устойчивостью, индуцированной экспрессией гена rolC, бактерии погибали, а клетки женьшеня развивались нормально. Это свидетельствует о том, что индуцированная устойчивость, маркерами которой является экспрессия генов PAL и β-1,3-глюканазы, является достаточной для защиты клеток женьшеня от патогена. По какому пути происходит гибель каллусов женьшеня линии GV при взаимодействии с иерсиниями (некротическому или программируемому), пока неизвестно.

Токсины ТСТYp и ТЛТYp индуцировали сходный ответ клеток, как и Y. pseudotuberculosis. Это наблюдение показывает, что взаимодействие иерсиний с растениями может происходить посредством секретируемых токсинов. К сожалению, молекулярная структура ТСТYp и ТЛТYp неизвестна, поэтому соотнести эти токсины с известными токсинами Yersinia spp. на этом этапе не представляется возможным. Секвенирование этих токсинов, или соответствующих им генов, помогло бы идентифицировать ген(ы) Avr бактерий псевдотуберкулеза, участвующий во взаимодействии с растениями. Например, белки III системы секреции иерсиний семейства YopT имеют семь гомологов белков Avr в растительных патогенах P. syringae и Ralstonia, и три гомолога в растительных симбиотических бактериях Rhizobium и Bradyrhizobium [29]. В P. syringae pv. tomato, линии DC3000, были обнаружены Avr протеазы HopPtoN и HopPtoC, принадлежащие к тому же семейству белков иерсиний YopT [29]. Белок III системы секреции иерсиний YopJ/P, вызывающий апоптоз макрофагов, сходен с фактором авирулентности AvrRxv растительного патогена X. campestris, YopE гомологичен цитотоксину ExoS, секретируемому P. aeruginosa, а гомолог YopM найден в sym-плазмидах Rhizobium [30].

По-видимому, грань между животными и растительными патогенами будет стираться и далее. Недавно было показано, что патоген растений Agrobacterium tumefaciens способен трансформировать культивируемые клетки человека [31, 32] и эмбрионы морских ежей [33], используя факторы патогенности IV секреторной системы.

Таким образом, в настоящей работе показано, что Y. pseudotuberculosis вызывают быструю индукцию экспрессии защитных генов женьшеня, ингибируют рост обычных клеток женьшеня и не поражают культуры с высоким защитным статусом.

Работа поддержана грантами "Молекулярная и клеточная биология" Президиума Российской академии наук, Президента Российской Федерации (НШ-6923.2006.4) и Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 06-04-96008).

 

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Рожкова Л.П., Шарапова Т.А. Дальнейшее изучение эпидемиологии Дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки // Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка (псевдотуберкулез человека) / Под ред. Сомова Г.П. и др. Л.: Полиграфический комбинат "Ротапринт", 1978. С. 13-24.
  2. Сомов Г.П., Варвашевич Т.Н., Тимченко Н.Ф. Психрофильность патогенных бактерий. М.: Наука, Сибирское отделение, 1991. 203 с.
  3. Кузнецов В.Г., Багрянцев В.Н. Экология иерсиний и иерсиниозы // Окружающая среда и здоровье населения Владивостока / Под ред. Косолапова А.Б., Преображенского Б.В. Владивосток: Дальнаука, 1998. С. 154-164.
  4. Сомов Г.П. Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка. М.: Медицина, 1979. 184 с.
  5. Гордейко В.А., Шустрова Н.М. Иерсинии в растениях // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1990. № 11. С. 16-18.
  6. Маркова Ю.А., Романенко А.С., Игумнова Е.К., Саляев Р.К. Растения как возможные резервуары бактерий, патогенных для человека и животных // Докл. АН. 2002. Т. 386. С. 277-279.
  7. Шустрова Н.М., Мисуренко Е.Н., Литвин В.Ю. О возможности передачи Yersinia pseudotuberculosis по цепочке почва- растение- животное // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1992. № 4. С. 10-12.
  8. Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева В.И., Романова Ю.М., Боев Б.В. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. М.: Фармус-принт, 1998. 256 с.
  9. Маркова Ю.А., Романенко А.С., Климов В.Т., Чеснокова М.В. Взаимодействие Yersinia pseudotuberculosis с пробирочными растениями картофеля // Журн. стресс-физиологии растений. 2006. Т. 2. № 1. С. 22-27.
  10. Baker B., Zambryski P., Staskawicz B., Dinesh-Kumar S.P. Signaling in Plant- Microbe Interactions // Science. 1997. V. 276. P. 726-733.
  11. Rahme L.G., Ausubel F.M., Cao H., Drenkard E., Goumnerov B.C., Lau G.W., Mahajan-Miklos S., Plotnikova J., Tan M., Tsongalis J., Walendziewicz C.L., Tompkins R.G. Plants and Animals Share Functionally Common Bacterial Virulence Factors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 8815-8821.
  12. Staskawicz B.J., Mudgett M.B., Dangl J.L., Galan J.E. Common and Contrasting Themes of Plant and Animal Disease // Science. 2001. V. 292. P. 2285-2289.
  13. Hammond-Kosack K.E., Jones J.D.G. Resistance Gene-Dependent Plant Defense Responses // Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1773-1791.
  14. Scofield S.R., Tobias Ch.M., Rathjen J.P., Chang J.H., Lavelle D.T., Michelmore R.W., Staskawicz B.J. Molecular Basis of Gene-for-Gene Specificity in Bacterial Speck Disease of Tomato // Science. 1996. V. 274. P. 2063-2065.
  15. Orth K., Xu Z., Mudgett M.B., Bao Z.Q., Palmer L.E., Bliska J.B., Mangel W.F., Staskawicz B.J., Dixon J.E. Disruption of Signaling by Yersinia Effector YopJ, a Ubiquitin-Like Protein Protease // Science. 2000. V. 290. P. 1594-1597.
  16. Тимченко Н.Ф., Булгаков В.П., Булах Е.В., Яснецкая Е.Г., Журавлев Ю.Н. Взаимодействие Yersinia, Listeria и Salmonella с растительными клетками // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2000. № 1. С. 6-10.
  17. Timchenko N., Eliseikina M., Bulgakov V., Bulakh E., Yasnetskaya E., Nedashkovskaya E., Zhuravlev Y. Yersinia pseudotuberculosis, Its Toxins and Plant Cells // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. V. 529. P. 169-171.
  18. Bulgakov V.P., Kozyrenko M.M., Fedoreyev S.A., Mishenko N.P., Denisenko V.A., Zvereva L.V., Pokushalova T.V., Zhuravlev Y.N. Shikonin Production by p-Fluorophenylalanine Resistant Cells of Lithospermum erythrorhizon // Fitoterapia. 2001. V. 72. P. 394-401.
  19. Alfano J.R., Collmer A. Bacterial Pathogens in Plants: Life up Against the Wall // Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1683-1698.
  20. Bulgakov V.P., Khodakovskaya M.V., Labetskaya N.V., Chernoded G.K., Zhuravlev Y.N. The Impact of Plant rolC Oncogene on Ginsenoside Production by Ginseng Hairy Root Cultures // Phytochemistry. 1998. V. 49. P. 1929-1934.
  21. Kiselev K.V., Kusaykin M.I., Dubrovina A.S., Bezverbny D.A., Zvyagintseva T.N., Bulgakov V.P. The rolC Gene Induces Expression of a Pathogenesis-Related β-1,3-Glucanase in Transformed Ginseng Cells // Phytochemistry. 2006. V. 67. P. 2225-2231.
  22. Тимченко Н.Ф., Недашковская Е.П., Долматова Л.С., Сомова-Исачкова Л.М. Токсины Yersinia pseudotuberculosis. Владивосток: ОАО "Приморский полиграфкомбинат", 2004. 220 с.
  23. Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantites of Protein Utilizing the Principle of Protein- Dye Binding // Anal. Biochem. 1976. V. 86. P. 248-254.
  24. Яснецкая Е.Г., Булгаков В.П., Горбач В.И., Шевченко Н.М., Федореева Л.И., Журавлев Ю.Н., Киселев К.В. Этефон- и жасмонат-зависимая индукция внутриклеточных патоген-индуцируемых рибонуклеаз в культуре клеток женьшеня // Физиология растений. 2003. Т. 50. С. 554-560.
  25. Gorpenchenko T.Y., Kiselev K.V., Bulgakov V.P., Tchernoded G.K., Bragina E.A., Khodakovskaya M.V., Koren O.G., Batygina T.B., Zhuravlev Y.N. The Agrobacterium rhizogenes rolC-Gene-Induced Somatic Embryogenesis and Shoot Organogenesis in Panax ginseng Transformed Calluses // Planta. 2006. V. 223. P. 457-467.
  26. Bulgakov V.P., Veselova M.V., Tchernoded G.K., Kiselev K.V., Fedoreyev S.A., Zhuravlev Y.N. Inhibitory Effect of the Agrobacterium rhizogenes rolC Gene on Rabdosiin and Rosmarinic Acid Production in Eritrichium sericeum and Lithospermum erythrorhizon Transformed Cell Cultures // Planta. 2005. V. 221. P. 471-478.
  27. Kiselev K.V., Gorpenchenko T.Y., Tchernoded G.K., Dubrovina A.S., Grishchenko O.V., Bulgakov V.P., Zhuravlev Y.N. Calcium-Dependent Mechanism of Somatic Embryogenesis in Panax ginseng Cell Cultures Expressing the rolC Oncogene // Mol. Biol. 2008. V. 42. P. 275-285.
  28. Cramer C.L., Edwards K., Dron M., Liang X., Dildine S.L., Bolwell G.P., Dixon R.A., Lamb C.J., Schuch W. Phenylalanine Ammonia-Lyase Gene Organization and Structure // Plant Mol. Biol. 1989. V. 12. P. 367-383.
  29. Zhu M., Shao F., Innes R.W., Dixon J.E., Xu Z. The Crystal Structure of Pseudomonas Avirulence Protein AvrPphB: A Papain-Like Fold with a Distinct Substrate-Binding Site // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 302-307.
  30. Hueck C.J. Type III Protein Secretion Systems in Bacterial Pathogens of Animals and Plants // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 62. P. 379-433.
  31. Kunik T., Tzfira T., Kapulnik Y., Gafni Y., Dingwall C., Citovsky V. Genetic Transformation of HeLa Cells by Agrobacterium // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 1871-1876.
  32. Lacroix B., Tzfira T., Vainstein A., Citovsky V. A Case of Promiscuity: Agrobacterium's Endless Hunt for New Partners // Trends Genet. 2006. V. 22. P. 29-37.
  33. Bulgakov V.P., Kiselev K.V., Yakovlev K.V., Zhuravlev Y.N., Gontcharov A.A., Odintsova N.A. Agrobacterium-Mediated Transformation of Sea Urchin Embryos // Biotechnol. J. 2006. V. 1. P. 454-461.
  34.  

 

 

 

 

 

Подписи к рисункам

 

Рис. 1.

Показатели роста клеток женьшеня линии GV(а), 2с2 (б), 2cR2 (в) в норме и в ассоциации с Y. pseudotuberculosis (Y.p.).

1

- культура без бактерий, 2 - культура с бактериями. Стрелкой отмечен момент внесения иерсиний в каллус.

Рис. 2.

Число жизнеспособных Y. pseudotuberculosis в культурах клеток женьшеня линий GV (1), 2C2 (2), 2cR2 (3).

Рис. 3.

Показатели экспрессии генов PAL (а) и Pg-glu1 (б) в клеточных культурах женьшеня.

При расчетах за единицу принимали экспрессию гена актина женьшеня. * P < 0.05.

 

Рис. 4.

Изменение суммарной экспрессии генов PAL женьшеня в культуре клеток GV при добавлении Y. pseudotuberculosis и их токсинов на 1-й (а) и 3-й (б) день эксперимента.

Суммарная экспрессия в контрольных клетках GV (К), в клетках GV при добавлении токсина ТСТYp (ТСТ), ТЛТYp (ТЛТ) и бактерий (Y.p.). При расчетах за единицу принимали экспрессию гена актина женьшеня. * P < 0.05.

 

Рис. 5.

Экспрессия генов PAL женьшеня в контрольной культуре клеток GV в норме (а) и при добавлении Y. pseudotuberculosis (б).

При расчетах за единицу принимали экспрессию гена актина женьшеня.

 

Рис. 6.

Изменение экспрессии гена Pg-glu1 женьшеня в культуре клеток GV при добавлении Y. pseudotuberculosis и их токсинов на 1-й (а) и 3-й (б) день эксперимента.

Экспрессия Pg-glu1 в контрольных клетках GV в норме (К), в клетках GV при добавлении ТСТYp (ТСТ), ТЛТYp (ТЛТ) и бактерий (Y.p.). При расчетах за единицу принимали экспрессию гена актина женьшеня. * P < 0.05.